Tài liệu Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều merrf ở người việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------------------- Bùi Thị Khánh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU – MERRF Ở NGƯỜI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------------------- Bùi Thị Khánh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU – MERRF Ở NGƯỜI VIỆT NAM Chuyên ngành: Mã số: Sinh học thực nghiệm 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG Giáo viên hướng dẫn Chủ tịch hội đồng chấm luận văn thạc sĩ khoa học GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa PGS.TS. Bùi Phương Thuận Hà Nội - 2015 ỜI Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa, thầy đ tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hồng Loan, ThS. Nguyễn Văn Minh và CN. Phùng Bảo Khánh và các anh chị em làm việc tại phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên đ giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm. Tôi xin chân thành cám ơn Ban giám hiệu Trƣờng Cao đẳng Y tế Thái Bình, Trƣởng khoa Y học cơ sở và các anh em trong bộ môn Y học cơ sở đ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi đƣợc đi học nâng cao trình độ của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn đến toàn thể thầy, cô giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đ truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin g i lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học và các Phòng chức năng của Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đ tạo điều kiện cho tôi học tập, hoàn thành chƣơng trình học Cao học. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đ luôn động viên, khích lệ tôi hoàn thành khóa học. Hà Nội, tháng 12 năm 2015 HVCH: Bùi Thị Khánh i Ụ MỤ LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... i MỤC LỤC .............................................................................................................. ii D NH MỤC C C K HI U V CHỮ VIẾT TẮT ............................................. vi D NH MỤC C C BẢNG ..................................................................................... viii D NH MỤC C C HÌNH ....................................................................................... ix MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QU N T I LI U................................................................. 3 1.1. CẤU TRÚC V CHỨC NĂNG CỦ TY THỂ NGƢỜI ........................... 3 1.1.1. Cấu trúc của ty thể ................................................................................. 3 1.1.2. Chức năng của ty thể ............................................................................. 6 1.1.2.1. Ty thể hoạt động như một nhà máy năng lượng của tế bào ........... 6 1.1.2.2. Ty thể và quá trình lão hóa ............................................................. 7 1.1.2.3. Ty thể và quá trình tự chết của tế bào ............................................ 9 1.1.3. Hệ gen ty thể và đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể .......................... 10 1.1.3.1. Hệ gen ty thể ................................................................................... 10 1.1.3.2. Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể ............................................. 12 1.1.3.3. Tính chất dị tế bào chất và tốc độ đột biến của ty thể .................... 12 1.2. ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ V C C B NH LIÊN QU N ........................ 13 1.2.1. Các loại đột biến gen ty thể ................................................................... 13 1.2.1.1. Đột biến điểm .................................................................................. 14 1.2.1.2. Đột biến cấu trúc mtDNA ............................................................... 15 1.2.2. Các bệnh do đột biến gen ty thể ............................................................ 15 1.2.2.1. Hội chứng gây ra bởi các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa tRNA ................................................................................................ 17 1.2.2.2. Các hội chứng liên quan đến các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa protein ............................................................................................. 19 1.2.2.3. Các bệnh liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa rRNA ........ 21 1.2.2.4. Bệnh gây nên bởi các đột biến khác trên mtDNA ........................... 22 ii 1.3. HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU (MERRF) ............................................................................................................. 24 1.3.1. Các đột biến của hội chứng MERRF ..................................................... 24 1.3.1.1. Đột biến A8344G ............................................................................ 24 1.3.1.2. Đột biến T8356C ............................................................................. 25 1.3.1.3. Đột biến G8363A ............................................................................ 26 1.3.2. Những tác động của hội chứng MERRF trên ngƣời bệnh..................... 27 1.3.3. Các phƣơng pháp phát hiện đột biến MERRF ...................................... 29 1.3.3.1. Phát hiện đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng PCR kết hợp với RFLP ...................................................................................................... 29 1.3.3.2. Phân tích đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng xác định trình tự gen ................................................................................................... 30 1.3.3.3. Kỹ thuật đa dạng cấu hình sợi đơn SSCP (single-stranded conformational polymorphism) ................................................................... 30 1.3.3.4. Định lượng đột biến gen ty thể bằng phương pháp real-time PCR .............................................................................................................. 31 1.3.3.5. Phát hiện đột biến DNA ty thể bằng hệ thống cảm biến sinh học .. 31 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LI U V PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU ................. 33 2.1. NGUYÊN LI U ........................................................................................... 33 2.1.1. Mẫu bệnh phẩm ..................................................................................... 33 2.1.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác ............................................................. 33 2.2. M Y MÓC V TR NG THIẾT BỊ ........................................................... 33 2.3. PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU ................................................................ 34 2.3.1. Tách chiết DN tổng số ........................................................................ 34 2.3.2. Kiểm tra và định lƣợng DN tách chiết ............................................... 34 2.3.3. Nhân bản đoạn gen ty thể bằng kỹ thuật PCR ....................................... 35 2.3.4. Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn phân cắt giới hạn (PCR-RFLP) ....................................................................... 36 2.3.5. Điện di trên gel agarose ......................................................................... 36 iii 2.3.6. Điện di trên gel polyacrylamide ............................................................ 37 2.3.7. Kỹ thuật real-time PCR s dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu axit nucleic (LNA-locked nucleic acid) .......................................................... 38 2.3.8. Giải trình tự đoạn gen chứa đột biến ..................................................... 41 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ V THẢO LUẬN.......................................................... 42 3.1. THU THẬP MẪU M U B NH NHÂN V T CH CHIẾT DN TỔNG SỐ ............................................................................................................ 42 3.1.1. Một số đặc điểm của mẫu phân tích ...................................................... 42 3.1.2. Tách chiết DN tổng số của các mẫu ................................................... 42 3.2. S NG LỌC C C ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF Ở NGƢỜI VI T N M BẰNG PHƢƠNG PH P PCR-RFLP .............................. 43 3.2.1. Sàng lọc đột biến 8344G .................................................................... 43 3.2.1.1. Nhân bản đoạn gen từ 8155 - 8366 bằng PCR ............................... 43 3.2.1.2. Phân tích sự có mặt của đột biến A8344G bằng PCR-RFLP ......... 44 3.2.2. Sàng lọc đột biến T8356C ..................................................................... 46 3.2.2.1. Nhân bản đoạn gen từ 8166 - 8358 bằng PCR ............................... 46 3.2.2.2. Phân tích sự có mặt của đột biến T8356C bằng PCR-RFLP ......... 47 3.2.3. Sàng lọc đột biến G8363 .................................................................... 48 3.2.3.1. Nhân bản đoạn gen từ 8342 - 8582 ................................................ 48 3.2.3.2. Phân tích sự có mặt của đột biến G8363A bằng PCR-RFLP ......... 50 3.3. XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƢỢNG ĐỘT BIẾN 8344G BẰNG KỸ THUẬT RE L-TIME PCR ............................................................. 52 3.3.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA ........................................ 52 3.3.1.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA .................................. 52 3.3.1.2. Đánh giá tính đặc hiệu của mẫu dò đột biến A8344G ................... 54 3.3.2. Xây dựng đƣờng chuẩn và đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp real-time PCR để định lƣợng đột biến 8344G .............................................. 56 3.3.2.1. Định lượng số bản sao của plasmid mang đoạn gen đột biến và không đột biến A8344G ............................................................................... 56 3.3.2.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn đột biến A8344G.......................... 56 3.3.3. Th nghiệm khả năng phát hiện và định lƣợng đột biến 8344G ........ 60 iv 3.4. S NG LỌC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF BẰNG PHƢƠNG PH P GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP .................................. 61 Phân tích trình tự vùng gen mang đột biến MERRF 8155-9292 trên hệ gen ty thể ............................................................................................. 61 KẾT LUẬN ............................................................................................................. 63 T I LI U TH M KHẢO ...................................................................................... 64 PHỤ LỤC................................................................................................................ 73 v H Ụ HI U V H VI T TẮT APS Ammonium persulfate ANT Adenine nucleotide translocase ADP Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphosphate bp Base pair (cặp bazơ) BFQ Black fluorescence quencher (chất hấp phụ huỳnh quang) CoQ Coenzyme Q CPEO Chronic progressive external ophthalmoplegia (Bệnh liệt mắt cơ ngoài tiến triển kinh niên) Cyt c Cytochrome c Cyt b Cytochrome b D-loop Vòng chuyển vị dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate ddH2O Deionized distilled H2O (nƣớc cất loại ion, kh trùng) EtBr Ethidium bromide FAD+ Flavin adenine dinucleotide (dạng oxi hóa) FADH2 Flavin adenine dinucleotide (dạng kh ) IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside kb Kilobase KSS Kearns-Sayre syndrome (Hội chứng KSS) LB Luria Bertani LHON Leber’s hereditary optic neuropathy (Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber) LNA Locked nucleic acid (nucleotide dạng khóa) MELAS Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like Episodes (Hội chứng n o giật cơ, tăng acid lactic máu và giả tai biến mạch) vi MERRF Myoclonic epilepsy with ragged-red fibres (Hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều) MIDD Maternally inherited diabetes and deafness (Bệnh tiểu đƣờng và câm điếc di truyền theo mẹ) MRI Magnetic resonance image (Hình ảnh chụp cộng hƣởng từ) mtDNA Mitochondrial DN (DN ty thể) nDNA Nuclear DNA (DNA nhân) NAD+ Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng oxi hóa) NADH Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng kh ) NARP Neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos (Hội chứng gây liệt, mất sự điều hòa và viêm võng mạc OD Optical density (Mật độ quang học) PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PEO Progressive external ophthalmoplegia (Bệnh liệt cơ mắt ngoài tiến triển) RFLP Restriction fragment length polymorphism (Sự đa hình các đoạn phân cắt giới hạn) ROS Reactive oxygen species (dạng oxy phản ứng) SDS Sodium dodecylsulphate TAE Tris -Acetate-EDTA TBE Tris -Borate-EDTA TEMED N, N, N’, N’- Tetramethyl-Ethylenediamine Tm Melting temperature (Nhiệt độ tách chuỗi) vii H Ụ B G Bảng 1.1: Các biểu hiện và triệu chứng lâm sàng của 62 bệnh nhân MERRF ......... 28 Bảng 2.1: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR các đoạn gen mang đột biến MERRF ..................................................................................................................... 35 Bảng 2.2: Thành phần bản gel polyacrylamide 12% ................................................ 37 Bảng 2.3: Trình tự của mồi và mẫu dò dùng cho real-time PCR ............................. 40 Bảng 3.1: Trình tự mồi nhân đoạn gen 8155 - 8366 ................................................. 43 Bảng 3.2: Trình tự và sản phẩm cắt của enzyme BanII ............................................ 45 Bảng 3.3: Trình tự mồi cho phản ứng PCR đoạn gen 8166 - 8358 .......................... 46 Bảng 3.4: Trình tự mồi cho PCR đoạn gen 8342 - 8582 .......................................... 49 Bảng 3.5: Trình tự của mẫu dò dùng cho real-time PCR ......................................... 53 Bảng 3.6: Tƣơng quan giữa nồng độ DN plasmid mang đột biến và không đột biến 8344G ban đầu và số chu kỳ ngƣỡng đƣợc xác định bằng real-time PCR ........... 57 Bảng 3.7: Tỷ lệ phần trăm plasmid đột biến 8344G pha sẵn .................................... 58 Bảng 3.8: Kết quả thực nghiệm tỷ lệ phần trăm đột biến của mẫu chuẩn. ............... 59 viii H Ụ HÌ H Hình 1.1. Cấu trúc ty thể ............................................................................................. 3 Hình 1.2. Cấu tạo màng ty thể .................................................................................... 4 Hình 1.3. Hệ gen ty thể ............................................................................................. 10 Hình 2.1. Cấu trúc của nucleotide cải biến dạng LN ............................................. 38 Hình 2.2. Nguyên lý hoạt động của mẫu dò Taqman ............................................... 39 Hình 3.1. Điện di sản phẩm DN tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân ............. 42 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8155 - 8366 ............................. 44 Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8155 - 8366 của bệnh nhân ....... 45 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8166 - 8385 ............................. 47 Hình 3.5. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8166 - 8385 của bệnh nhân ....... 48 Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8342 - 8582 ............................. 49 Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8166 - 8385 của bệnh nhân ....... 50 Hình 3.8. Kết quả kiểm tra mẫu dò ........................................................................... 55 Hình 3.9. Biểu đồ khuếch đại đoạn gen mang đột biến và không mang đột biến 8344G bằng real-time PCR .................................................................................... 57 Hình 3.10. Sự tƣơng quan giữa tỷ lệ đột biến thực tế và tỷ lệ đột biến lý thuyết .... 59 Hình 3.11. Th nghiệm định lƣợng 5 mẫu bệnh phẩm không mang đột biến 8344G bằng real-time PCR .................................................................................... 60 Hình 3.12. Kết quả blast của trình tự 29 mẫu bệnh với trình tự chuẩn J01415.2 .. ...62 ix Ở ĐẦU Trong hầu hết các tế bào, ty thể là bào quan quan trọng đảm nhiệm chức năng cung cấp năng lƣợng dƣới dạng TP cho các hoạt động của tế bào. Ty thể sản xuất năng lƣợng bằng cách oxy hóa hoàn toàn các hợp chất trung gian của quá trình chuyển hóa thức ăn của cơ thể tạo thành sản phẩm cuối cùng là H 2O, CO2, và năng lƣợng dƣới dạng TP. Ty thể có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với hệ gen nhân. DNA ty thể ngƣời tồn tại ở dạng mạch vòng kép, có kích thƣớc 16.569 bp, với 37 gen, mã hóa cho 2 RNA ribosome, 22 RNA vận chuyển và 13 protein là thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi hô hấp. DNA ty thể dễ bị tổn thƣơng do ty thể là môi trƣờng giàu dạng oxy phản ứng và thiếu cơ chế s a chữa hiệu quả dẫn đến nhiều đột biến xuất hiện trong hệ gen ty thể. Hầu hết các hoạt động của tế bào đều dựa vào nguồn năng lƣợng ổn định do ty thể cung cấp, do đó những sai hỏng trong DN ty thể có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống ảnh hƣởng đến nhiều tế bào, mô và các tổ chức khác nhau. Năm 1988, Wallace và tập thể đ công bố đột biến điểm đầu tiên trên hệ gen ty thể ngƣời gây bệnh liên quan đến thần kinh thị giác di truyền theo Leber (Leber’s hereditary optic neuropathy - LHON). Cho đến nay, hơn 300 đột biến khác nhau trong hệ gen ty thể ngƣời đ đƣợc xác định, trong đó có hơn 250 đột biến có khả năng gây bệnh và kèm theo nhiều hội chứng khác nhau. MERRF (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres) là hội chứng động kinh giật cơ với sợi cơ không đều, ảnh hƣởng đến hệ thần kinh và cơ xƣơng cũng nhƣ các hệ thống khác của cơ thể, gây nên bởi những đột biến trên gen MT-TK của DN ty thể. Ngoài ra, ngƣời mang hội chứng MERRF có thể kèm theo động kinh, mất điều hòa vận động, suy nhƣợc và mất trí nhớ. Triệu chứng thƣờng khởi phát ở trẻ em sau một giai đoạn phát triển bình thƣờng, kết quả hay gặp là điếc, thấp bé, thoái hóa thần kinh thị giác, đôi khi quan sát đƣợc các u mỡ khu trú dƣới da. Tế bào cơ bất thƣờng và xuất hiện sợi cơ màu đỏ bị xé rách nham nhở khi nhuộm với Gomori trichrome và quan sát dƣới kính hiển vi. 1 Hiện nay, trên thế giới đ có nhiều công trình nghiên cứu về hội chứng MERRF để xác định nguyên nhân, cơ chế biểu hiện bệnh cũng nhƣ tính di truyền của bệnh. Tuy nhiên, do tính phức tạp trong tác động lâm sàng, mô bệnh học, cơ chế phát sinh và biểu hiện bệnh nên việc chẩn đoán bằng phƣơng pháp thăm khám lâm sàng hay bằng các xét nghiệm thƣờng quy là rất khó khăn, vì thế nhiều bệnh nhân MERRF vẫn chƣa đƣợc phát hiện và không có phƣơng pháp điều trị hiệu quả. Ở Việt Nam, gần nhƣ chƣa có công trình nào đi sâu nghiên cứu phát hiện và định lƣợng đột biến MERRF ở ngƣời Việt Nam. Nhằm góp phần vào việc chẩn đoán, điều trị và tƣ vấn di truyền đối với các bệnh nhân, gia đình bệnh nhân mang hội chứng MERRF chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều - MERRF ở người Việt Nam“. 2 HƯ ẤU TRÚ V 1.1. 1.1.1. G 1: TỔNG QUAN TÀI LI U HỨ Ă G Ủ TY THỂ GƯỜI ấu trúc của ty thể Ty thể là bào quan phổ biến đƣợc tìm thấy trong hầu hết các tế bào nhân chuẩn. Chức năng chính của ty thể là cung cấp năng lƣợng hóa học cần thiết cho các hoạt động sinh tổng hợp và vận động của tế bào. Ty thể đƣợc lần đầu tiên tìm thấy trong tế bào cơ năm 1857 bởi nhà giải phẫu học ngƣời Thụy Sĩ, Kollier. Đến năm 1890, nhà mô học ngƣời Đức, Richard ltmann, bằng phƣơng pháp nhuộm fuchsine đ quan sát đƣợc ty thể ở nhiều tế bào khác nhau dƣới kính hiển vi quang học [27].Ty thể có đƣờng kính khoảng 0,5-2 µm và chiều dài 7-10 µm. Hình dạng và số lƣợng ty thể tùy thuộc vào nhu cầu năng lƣợng của mỗi loại tế bào khác nhau, các tế bào mô cơ xƣơng hoặc thận cần một lƣợng ty thể lớn hơn các tế bào khác trong cơ thể. Ty thể có thể hình cầu, hình que hay hình sợi nhƣng đều có cấu trúc chung giống nhau. Ty thể có khả năng thay đổi hình dạng, kích thƣớc, có thể liên kết với nhau tạo ra những cấu trúc dài hơn hoặc phân ra thành những cấu trúc nhỏ hơn. Ngoài ra, ty thể có khả năng di chuyển để phản ứng với những thay đổi sinh lý bên trong tế bào [35]. Hình 1.1. ấu trúc ty thể [68] 3 Về cấu trúc, ty thể có cấu tạo dạng màng kép, gồm màng trong và màng ngoài, bao lấy khối chất nền bên trong, khoảng cách giữa hai màng đƣợc gọi là xoang gian màng. Cả hai màng đều có bản chất là lipoprotein tƣơng tự nhƣ màng sinh chất, nhƣng có sự khác biệt về hình dạng và các tính chất lý hóa chuyên trách cho việc thực hiện các chức năng sinh hóa của chúng [35]. Màng ngoài của ty thể có độ dày 6 nm, có tỷ lệ protein (P)/ lipid (L) lớn hơn hoặc bằng 1. Màng ngoài ty thể chứa tỷ lệ cholesterol thấp (bằng 1/6 so với màng tế bào hồng cầu), tỷ lệ phosphatidyl choline cao gấp hai lần so với màng tế bào. Màng ngoài có nhiệm vụ tiếp thu phần lớn protein sản xuất từ tế bào chất để xây dựng ty thể và kiến tạo màng. Đặc biệt, màng ngoài của ty thể có tính bán thấm rộng hơn với các ion và các phân t lớn cho phép các ion di chuyển tự do từ ngoài nguyên sinh chất vào xoang gian màng và ngƣợc lại. Màng ngoài ty thể còn chứa nhiều enzyme quan trọng nhƣ các transferase, các kinase, cytochrome-reductase, acyl CoA synthetase [35]. Hình 1.2. ấu tạo màng ty thể [67] Màng trong của ty thể có độ dày 6 nm, protein chiếm 80%, lipid chiếm 20%, và một lƣợng nhỏ cholesterol. Tỷ lệ giữa cholesterol/phospholipid là 1/53. Màng trong ăn sâu vào chất nền tạo nên các mào răng lƣợc. Cấu trúc “mào” làm tăng diện tích bề mặt của màng trong gấp ba lần so với màng ngoài và điều này liên quan đến chức năng của nó là tăng cƣờng vận chuyển điện t và tổng hợp 4 TP. Màng trong chứa nhiều protein vận chuyển chủ động TP, DP, acid béo và các protein kênh vận chuyển các ion Na +, K+, Ca2+ và H+. Màng trong là nơi bám của 5 phức hợp thuộc chuỗi hô hấp bao gồm chuỗi vận chuyển điện t (phức hợp I-IV), ATP synthase (phức hợp V, còn gọi là F 1F0-ATPase) và adenine nucleotide translocase (ANT) [9]. Xoang gian màng (khoảng xen kẽ giữa hai màng) là nơi trung chuyển các chất giữa hai màng, môi trƣờng cũng tƣơng tự và cân bằng với bào tƣơng của tế bào. Xoang gian màng chứa nhiều ion H+ từ chất nền đi ra do hoạt động của chuỗi vận chuyển điện t , chứa cytochrome c (Cyt c) là chất mang điện t cơ động cho chuỗi hô hấp, giải phóng Cyt c vào bào tƣơng sẽ hoạt hóa enzyme caspase có vai trò trong quá trình chết theo chƣơng trình của tế bào [32]. Chất nền (matrix) là một vùng vật chất không định hình chứa nhiều cấu trúc đặc biệt. Chất nền này là một phức hệ protein tan trong nƣớc, tƣơng đối đậm đặc và chứa các enzyme của chu trình Krebs, các enzyme của quá trình oxy hóa acid béo, acid amin và bộ máy di truyền riêng của ty thể. Nhƣ vậy, ở tế bào động vật, thực vật và ngƣời ngoài hệ gen nhân, còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể. Ty thể có vật chất di truyền và bộ máy của riêng nó để tổng hợp nên các RN protein của chúng. Các DN cũng nhƣ ngoài nhiễm sắc thể này m hóa một số các peptide của ty thể (ở ngƣời là 13 loại peptide). Các peptide này gắn vào lớp màng trong cùng với các protein khác đƣợc m hóa trong nhân tế bào [32]. Ty thể nhân lên theo phƣơng thức rất giống với tế bào vi khuẩn. Khi chúng trở nên quá lớn, chúng bắt đầu chia đôi. Quá trình này xảy ra sau khi bộ DN của ty thể đƣợc nhân đôi hoàn toàn, đƣợc thực hiện bằng sự tạo thành r nh bên trong và sau đó màng ngoài thắt lại hình thành hai ty thể con. Đôi khi các ty thể mới đƣợc tổng hợp ở các trung tâm giàu protein và polyribosome cần thiết. Tuy nhiên, nhiều ty thể không phân đôi và bị phân hủy trong lyzosome theo cơ chế tự tiêu (autophagy). Cơ chế này giúp duy trì số lƣợng ty thể đặc trƣng trong một tế bào [9]. 5 1.1.2. hức năng của ty thể 1.1.2.1. Ty thể hoạt động như một nhà máy năng lượng của tế bào Ty thể đóng vai trò trung tâm trong quá trình chuyển hóa năng lƣợng của tế bào. Quá trình hô hấp biến đổi hóa học và trao đổi chất tại ty thể đ giúp chúng chuyển đổi năng lƣợng hóa học tiềm tàng trong các hợp chất hữu cơ tạo ra CO2, H2O và giải phóng năng lƣợng vào phân t cao năng TP. TP đƣợc tạo thành từ quá trình phosphoryl hóa oxy hóa dựa trên các phức hệ hô hấp (gọi là chuỗi vận chuyển điện t ) nằm trên màng trong của ty thể. Quá trình oxy hóa của tế bào s dụng nguồn các đƣơng lƣợng kh N DH và F DH2 nhƣ nguồn điện t chính trong chuỗi vận chuyển điện t . Các thành phần của chuỗi vận chuyển điện t nằm ở màng trong của ty thể bao gồm bốn phức hợp I, II, III và IV và một số chất mang điện t . Các điện t đƣợc vận chuyển dọc theo chuỗi, ba trong bốn phức hợp hoạt động nhƣ máy bơm proton, đẩy proton từ chất nền tạo thành dòng chuyển proton. Nhờ gradient proton và sự chênh lệch điện thế qua màng, mà TP đƣợc tổng hợp từ ADP và Pi bởi phức hệ F0F1 synthase, do đó cho phép các proton trở lại chất nền. Sự kết hợp vận chuyển điện t và tổng hợp TP hoạt động theo cơ chế hóa thẩm. Có hai giai đoạn tạo ra TP ở ty thể, đó là chu trình Krebs diễn ra trong chất nền và quá trình phosphoryl hóa oxy hóa ở chuỗi vận chuyển điện t nằm ở màng trong ty thể với sự xúc tác của các phức hệ enzyme [23]. Nguồn tạo ra năng lƣợng trong ty thể là carbohydrate, chất béo và protein đƣợc lấy từ thức ăn, trong đó chủ yếu là carbohydrate. Các hợp chất carbohydrate, chủ yếu là glucose thông qua quá trình đƣờng phân (glycolysis) đƣợc phân cắt và biến đổi cuối cùng tạo thành pyruvate, chất kh N DH và một lƣợng TP. Pyruvate đƣợc đƣa vào ty thể và bị oxy hóa, decarboxyl hóa để tạo thành acetylCoA (acetyl-Co có thể tạo ra từ quá trình oxy hóa acid béo) và tiếp tục đƣợc oxy hóa hoàn toàn qua chu trình Krebs để tạo thành CO 2, H2O và năng lƣợng chủ yếu đƣợc tích trữ dƣới dạng TP. Trong chu trình Krebs, điện t và proton H + đƣợc tách ra và chuyển đến các phân t nhận điện t là N D + và F D trong chuỗi vận chuyển điện t để tạo thành N DH và F DH 2. Chuỗi vận chuyển điện t bao 6 gồm bốn phức hợp: nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase (NADH-CoQ reductase/ phức hệ I), succinate CoQ reductase (phức hệ II), ubiquinol cytochrome b reductase (phức hệ III), cytochrome c oxidase (phức hệ IV) và hai phân t vận chuyển điện t giữa các phức hệ là coenzyme ubiquinone (CoQ) và Cyt c. Phức hệ I và II có vai trò xúc tác cho sự nhận điện t của CoQ từ N DH và succinate. Sau đó phức hệ III xúc tác cho quá trình chuyển điện t từ CoQ đến Cyt c. Cuối cùng phức hệ IV xúc tác cho sự vận chuyển điện t từ Cyt c tới chất nhận cuối cùng là oxy phân t . Ở mỗi giai đoạn, điện t đi qua các phức hệ, năng lƣợng đƣợc giải phóng ra kèm theo việc bơm các proton (H +) từ chất nền qua màng trong ra xoang gian màng và làm xuất hiện điện thế màng. Do đó, hệ thống F0F1 synthase hoạt động và tổng hợp TP từ DP và phosphate vô cơ [35]. TP là nguồn năng lƣợng lớn đƣợc s dụng cho tất cả các quá trình trao đổi chất cần thiết bên trong tế bào. Vì vậy, khi ty thể bị tổn thƣơng, quá trình sản sinh ra năng lƣợng bị chậm lại, thậm chí là ngừng lại hoàn toàn. Pyruvate không đƣợc chuyển hóa tiếp, nên bị biến đổi thành lactate, vì vậy các bệnh nhân bị bệnh ty thể thƣờng có hàm lƣợng lactate trong máu và trong dịch n o tủy cao. Do gần nhƣ tất cả các tế bào đều dựa vào nguồn năng lƣợng ổn định do ty thể cung cấp nên khi ty thể bị tổn thƣơng có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống, ảnh hƣởng đến nhiều loại tế bào cũng nhƣ mô và các cơ quan [35]. 1.1.2.2. Ty thể và quá trình lão hóa Lão hóa là một quá trình sinh học phức tạp, là yếu tố nguy cơ lớn cho sự phát triển của ung thƣ, thoái hóa thần kinh và các bệnh tim mạch. Cơ chế phân t của sự l o hóa là vấn đề phức tạp, tuy nhiên quá trình oxy hóa và nitrate hóa protein trong tế bào đ đƣợc đề xuất là cơ sở cho việc suy giảm chức năng của tế bào và làm giảm khả năng chống chịu của cơ thể [60]. Các gốc tự do, chủ yếu là các dạng oxy phản ứng (ROS – Reactive oxygen species) đƣợc xem là những phân t tín hiệu của nhiều hoạt động sinh lý. Những năm 1990, hydrogen peroxide đƣợc phát hiện là có liên quan đến cytokine, insulin, 7 yếu tố tăng trƣởng, P-1 và tín hiệu NF-кB [48]. Sau đó, nhiều báo cáo chỉ ra rằng H2O2 có thể thúc đẩy sự bất hoạt phosphatase bằng sự oxy hóa cysteine làm ảnh hƣởng đến con đƣờng truyền tín hiệu [58]. Hệ quả của các phản ứng hô hấp trong ty thể là các điện t chƣa ghép cặp, sự tƣơng tác của các điện t này với oxy tạo thành các gốc superoxide rất hoạt động, các gốc tự do có hoạt tính cao. Có 8điểm trong ty thể có khả năng sản xuất O2-, superoxide đƣợc chuyển hóa thành hydrogen peroxide (H2O2) bởi superoxide dismutase (SOD) khi có sự tham gia của một điện t và 2 proton H+ [48]. Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy rằng ROS có thể gây ra những thay đổi trong quá trình dịch m protein. Cụ thể, H2O2 có thể oxy hóa nhóm thiol (-SH) trong cysteine để tạo thành axit sulphenic (-SOH), tiếp theo phản ứng với GSH sinh ra glutathionylate (-SSG) mang liên kết disulfide (-S-S-) hoặc amide sulfenyl (-SN). Mỗi sự thay đổi này có thể ảnh hƣởng đến hoạt động của một protein nhất định. Phosphorylase bị tác động khá nặng bởi ROS, làm ức chế hoạt động tách gốc phosphate [48]. Hơn nữa, các gốc tự do khác nhƣ các gốc hydroxyl (OH.) và hydrogen peoxyde (H2O2) cũng có thể tồn tại ở nồng độ tƣơng đối cao, gây nên nguy cơ oxy hóa lipid làm tổn thƣơng màng tế bào và ảnh hƣởng đến cấu trúc DN . Đáng chú ý rằng sự tác động của các gốc tự do này tới DNA ty thể sẽ lớn hơn DNA trong nhân do DNA ty thể không liên kết với Histone và không có cơ chế tự s a chữa. Khả năng tạo năng lƣợng TP của ty thể giảm và tăng quá trình oxy hoá làm hƣ hại cấu trúc tế bào. Gốc tự do có thể phá rách màng tế bào khiến chất dinh dƣỡng thất thoát, tế bào không tăng trƣởng, không đƣợc s a chữa và chết. ROS phá hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp protein, lipid, đƣờng, tinh bột, enzyme trong tế bào, làm cho collagen, elastin mất tính đàn hồi khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc [22]. ROS đƣợc cho là tác nhân chính gây ra những tổn thƣơng sinh lý của tế bào. Sự tích lũy ROS và các tác nhân oxy hóa có liên quan đến nhiều bệnh lý, bao gồm các bệnh thoái hóa thần kinh, tiểu đƣờng, ung thƣ và l o hóa sớm. ROS và các gốc 8 tự do gây ra các đột biến gen, tăng sự hình thành và tích lũy các đột biến DNA ty thể ở các mô trong quá trình l o hóa [48]. Theo thuyết ty thể về l o hoá, việc tích luỹ những tổn thƣơng ở các thành phần bên trong ty thể bao gồm mtDN , protein, lipid làm ảnh hƣởng đến chức năng của ty thể. Nói chung, những tổn thƣơng của mtDN trong phạm vi rộng với thời gian dài dẫn đến ty thể bị rối loạn, thậm chí ngừng hoạt động là nguyên nhân làm cho tế bào chết và cơ thể bị l o hoá [21]. 1.1.2.3. Ty thể và quá trình tự chết theo chương trình của tế bào “Chết theo chƣơng trình” (apoptosis) là một quá trình quan trọng giúp các sinh vật đa bào duy trì sự toàn vẹn và chức năng của mô và để loại bỏ những hƣ hại hoặc các tế bào không mong muốn. Ty thể đóng vai trò cốt lõi trong việc điều tiết sự chết của tế bào bằng cách cung cấp nhiều yếu tố quan trọng bao gồm cả sự hoạt hóa caspase và phân mảnh nhiễm sắc thể. Ty thể có vai trò quan trọng trong cơ chế tích tụ Ca2+ và rối loạn quá trình oxy hóa, sự tích lũy lƣợng Ca2+ đủ lớn trong ty thể dẫn đến chết theo chƣơng trình của tế bào. Nồng độ và khả năng hoạt động của Ca2+ trong ty thể đƣợc điều khiển bởi họ protein Bcl-2, yếu tố quan trọng tham gia vào quá trình chết theo chƣơng trình của tế bào [34]. Tín hiệu gây chết nội bào phụ thuộc vào sự phóng thích Cyt c. Tác động của Cyt c là liên kết với thụ thể protein hoạt hóa procaspase ( paf-1), tổ hợp lại với nhau tạo thành heptamer gọi là apoptosome. Apaf-1 trong apoptosome hoạt hóa procaspase mở đầu (procaspase-9), từ đó hoạt hóa dòng caspase sát thủ để điều dẫn sự chết tế bào. Bcl-2 điều hòa con đƣờng apoptosis nội bào bằng cách kiểm soát sự phóng thích Cyt c và các protein khác từ khoảng gian màng của ty thể vào tế bào chất. Bcl-2 có hai loại: pro-apoptosis Bcl-2 gia tăng sự giải phóng Cyt c và kích thích sự chết của tế bào; anti-apoptosis Bcl-2 có tác dụng ngƣợc lại, ức chế sự giải phóng Cyt c từ đó kìm h m sự chết của tế bào [32, 60]. Nồng độ Ca2+ trong ty thể cũng quyết định đến sự sống còn của tế bào. Sự kích hoạt nhóm protein pro-apoptosis Bcl-2 đòi hỏi nồng độ ion Ca2+ trong ty thể phải đủ lớn, từ đó dẫn đến các rối loạn về chức năng của ty thể, kích thích giải phóng Cyt c 9