Tài liệu Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÓA HỌC    PHẠM ĐỨC THỊNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN, CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU Ở VỊNH NHA TRANG Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 62.44.01.18 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Bùi Minh Lý 2. PGS. TS. Lê Lan Anh Hà Nội, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu nêu trong luận án là trung thực. Những kết luận khoa học của luận án là chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, 2015 Tác giả Phạm Đức Thịnh LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng bạn bè và đồng nghiệp. Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS Bùi Minh Lý và PGS.TS Lê Lan Anh đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành bản luận án này. Tiếp theo, tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ Nafosted (Đề tài nghiên cứu khoa học cơ bản, mã số: 104.01.59.09) và Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam (Đề tài hợp tác quốc tế, mã số: VAST.HTQT.NGA. 06/13-14) đã hỗ trợ kinh phí cho việc thực hiện Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của các cô chú, các anh chị em của phòng: - Phòng Hóa phân tích và Triển khai công nghệ nói riêng cũng như Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang nói chung. - Phòng Hóa phân tích, Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng - Viện Hóa học. Phòng thử nghiệm hoạt tính sinh học - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên. - Phòng Hóa enzym, Phòng cộng hưởng từ hạt nhân và khối phổ- Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương, Viện Hàn lâm Khoa học Nga, Chi nhánh Viễn Đông, Liên Bang Nga. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hóa học, Phòng Quản lý Đào tạo sau Đai học - Viện Hóa học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành các học phần của luận án và mọi thủ tục cần thiết. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày 20 tháng 04 năm 2015 Tác giả Luận án Phạm Đức Thịnh i MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC...................................................................................................................i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT........................................................................iv DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ.................................................................................viii DANH MỤC PHỤ LỤC............................................................................................ix MỞ ĐẦU ................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN..................................................................................3 2.3. RONG BIỂN..................................................................................................3 1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển .....................................................................3 1.1.2 Phân loại và phân bố của rong biển ............................................................4 1.1.3 Thành phần hóa học có trong rong biển .....................................................5 1.2 FUCOIDAN ...................................................................................................6 1.2.1 Giới thiệu chung về fucoidan ......................................................................6 2.3.1. Thành phần của fucoidan trong rong nâu ..................................................7 1.2.3. Đa dạng cấu trúc của fucoidan....................................................................9 1.2.4. Các phương pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu...................................13 1.2.5. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan ..........................................15 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN.....20 1.3.1 Phương pháp phân tích thành phần đường ..............................................20 1.3.2 Phương pháp phân tích liên kết.................................................................21 1.3.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)............................................................22 1.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)..................................23 ii 1.3.5 Phương pháp phổ khối lượng (MS)...........................................................26 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN...............................32 1.4.1. Tình hình nghiên cứu fucoidan trên thế giới. ...........................................32 1.4.2. Tình hình nghiên cứu fucoidan ở Việt Nam. ............................................34 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................36 VÀ THỰC NGHIỆM ..........................................................................................36 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .....................................................................36 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................................................37 2.2.1 Phương pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan .......................................37 2.2.2 Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate và thành phần đường ...............38 2.2.3 Phương pháp phân tích hàm lượng sulfate ...............................................38 2.2.4 Phương pháp khử sulfate ..........................................................................38 2.2.5 Phương pháp phân tích hàm lượng uronic axít ........................................38 2.2.6 Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa .....................................38 2.2.7 Phương pháp thủy phân tạo oligosacarit...................................................39 2.2.8 Phương pháp phổ hồng ngoại IR ..............................................................39 2.2.9 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ....................................39 2.2.10 Phương pháp phổ khối lượng MS .............................................................39 2.2.11 Phương pháp thử hoạt tính sinh học và xử lý số liệu................................39 2.3. THỰC NGHIỆM .........................................................................................40 2.3.1. Chiết tách và phân đoạn tinh chế fucoidan từ rong nâu ...........................40 2.3.2. Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate và thành phần đường ...............41 2.3.3. Phân tích hàm lượng sulfate .....................................................................41 2.3.4. Phân tích hàm lượng uronic axít...............................................................42 2.3.5. Khử sulfate.................................................................................................42 2.3.6. Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa .....................................42 iii 2.3.7. Thủy phân tạo fucoidan oligosacarit .........................................................43 2.3.8. Phổ khối MALDI-TOF/MS và ESI-MS của fucoidan oligosacarit ...........43 2.3.9. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan ........................................44 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................47 3.1. CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU................47 3.2. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN ..................48 3.3. TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN.............................................................................................51 3.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN ............................................62 3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của fucoidan.........................................62 3.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn fucoidan được phân lập từ rong Sargassum swartzii và Sargassum mcclurei ................................................64 3.5. ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN.........69 3.5.1. Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ IR................................................69 3.5.2. Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ NMR ...........................................72 3.6. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN SmF3 ĐƯỢC CHIẾT TÁCH TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI .........................77 3.7. ĐÁNH GIÁ MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN ....................................................97 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................99 1 MỞ ĐẦU Trong đa dạng và vô tận của thảm thực vật đại dương, rong nâu là một trong số các loài thực vật biển có thể tự tái tạo đáng lưu ý nhất mà con người đã phát hiện ra. Rong nâu chứa rất nhiều polysacarit sinh học quí như alginate, laminaran, fucoidan với khả năng ứng dụng hết sức rộng lớn [29,103]. Trong số đó fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do có nhiều hoạt tính sinh học quý như: hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối, chống virus, chống ung thư và điều biến miễn dịch, chống viêm, giảm lipid máu, chống oxy hóa và các đặc tính chống bổ thể (anticomplementary), chống lại các bệnh về gan, về đường tiết niệu (uropathy renalpathy), tác dụng bảo vệ dạ dày và khả năng điều trị trong phẫu thuật [69,88]. Fucoidan là một sulfate polysacarit có cấu trúc hóa học rất phức tạp bởi tính đa dạng của liên kết glycoside và khả năng phân nhánh với các vị trí nhóm sulfate được sắp xếp không theo quy luật trên mạch polymer. Thành phần của nó bao gồm nhiều loại đường, chủ yếu là fucose và một số các gốc đường khác như galactose, glucose, manose, xylose..., đôi khi còn có axít uronic [23,36,69,71]. Mặc dù có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc chi tiết của fucoidan, nhưng các kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của chúng về trật tự liên kết giữa các gốc đường, sự phân nhánh và vị trí các gốc sulfate vẫn còn rất hạn chế [23,34,35,36,48]. Mặt khác, mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ [88,36,38,48,69]. Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên các tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng fucoidan để làm dược liệu thì việc xác định chính xác thành phần và cấu trúc hóa học của fucoidan là điều tiên quyết và đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Nước ta có hơn 3.200 km bờ biển trải dài từ Bắc xuống Nam, với diện tích mặt nước rộng hơn 1.000.000 km2 được thiên nhiên ban tặng cho nguồn tài nguyên rong nâu rất đa dạng và phong phú, hiện tại đã có khoảng 147 loài rong nâu được phân loại [1,8], trong đó các loài rong thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất 2 với hơn 60 loài và sản lượng ước tính đạt tới 10.000 tấn rong khô/năm [58]. Tuy nhiên cho đến nay ở nước ta vẫn chưa có một công trình nghiên cứu có tính hệ thống về thành phần hóa học, cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan rong nâu Việt Nam. Do vậy, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang” nhằm hoàn chỉnh thêm những nghiên cứu về fucoidan của rong nâu Việt Nam theo định hướng tìm kiếm những nguồn dược liệu mới phục vụ sức khỏe cộng đồng và phát triển kinh tế xã hội. Mục tiêu của luận án: Chiết tách và phân đoạn fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam. Phân tích thành phần, xác định đặc điểm cấu trúc và mối quan hệ giữa cấu trúc với hoạt tính sinh học của fucoidan. Để đạt được mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm: - Thu thập các loài rong nâu có trữ lượng lớn ở vùng biển vịnh Nha Trang. - Tách chiết và phân đoạn fucoidan từ các loài rong thu được. - Phân tích thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của fucoidan và các phân đoạn của chúng. - Xác định cấu trúc của fucoidan có hoạt tính quan tâm. - Đánh giá mối tương quan giữa hoạt tính sinh học với đặc trưng cấu trúc của fucoidan 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2.3 RONG BIỂN 1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển Hàng năm đại dương cung cấp cho trái đất khoảng 200 tỷ tấn rong biển. Nhiều nhà khoa học cho rằng trên 90% cacbon trên trái đất được tổng hợp nhờ quang hợp, trong đó 20% có nguồn ngốc từ rong biển [83,97] Việc tiêu thụ sản phẩm từ rong biển (tảo đa bào ở biển) đã trải qua thời kì lịch sử rất lâu dài. Các dấu vết khảo cổ học cho thấy, người Nhật đã dùng rong biển từ hơn 10.000 năm trước. Trong nền văn hoá Trung Quốc cổ đại, rong biển được coi là đặc sản dùng trong các món ăn của triều đình và chỉ hoàng tộc hay khách của hoàng thân, quốc thích mới được thưởng thức. Dù rong biển được coi là món ăn đặc trưng của châu Á, nhưng trên thực tế các quốc gia có bờ biển trên thế giới như Scotland, Ireland, Newzealand, quần đảo nam Thái Bình Dương và các nước Nam Mỹ ven biển cũng đã sử dụng rong biển từ rất lâu. Rong biển cũng được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác. Chúng là nguồn nguyên liệu tự nhiên cho công nghiệp thực phẩm (Cải biển Ulva lactuca, bột rong biển, chất tạo gel E400, E401 Alginate–Agar E406, E407, Carrageenan...), mỹ phẩm (chất tạo kết cấu và hoạt hóa), công nghiệp (Phycocolloids, hydrocolloids tạo độ sánh, gel hoặc chất ổn định), thức ăn gia súc, nông nghiệp ... Qua các tài liệu tham khảo trong lịch sử và trong thời gian sử dụng lâu dài, không có nguy cơ gây hại sức khỏe nào được đề cập đến rong biển. Vì vậy, rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức năng ngày càng được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Hiện nay, Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc là những nước tiêu thụ rong biển thực phẩm lớn nhất và nhu cầu của họ là cơ sở của một nghề nuôi trồng thủy sản với sản lượng hằng năm trên toàn thế giới khoảng 6 triệu tấn rong tươi, trị giá lên đến 5 tỉ USD [97]. Các nước và lãnh thổ cung cấp rong biển thực phẩm chính là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan. Các nước cung cấp chính rong biển cho công nghiệp là Đan Mạch, Pháp, Na Uy, Tây Ban Nha, Mỹ và Nhật. 4 1.1.2 Phân loại và phân bố của rong biển * Phân loại và phân bố của rong biển trên thế giới Dựa vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái và màu sắc, rong biển có thể được chia thành 3 ngành rong chính [30]: 1. Ngành rong nâu (Phaeophyta) 2. Ngành rong đỏ (Rhodophyta) 3. Ngành rong lục (Chlorophyta) Trong số 03 ngành rong trên, rong nâu là ngành rong có trữu lượng lớn nhất và phân bố đa dạng nhất với hơn 1800 loài đã được phân loại. Trên thế giới hiện nay chỉ riêng các loài rong thuộc họ Sargassaseae, bộ Fucales đã phân loại được khoảng hơn 400 loài [1, 8]. Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chile, Achentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha. Trong đó bộ Fucales, đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu đại diện là họ Sargassaceae với hai loài Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận nhiệt đới. Sản lượng rong nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên 667.000 tấn khô, với 3 chi chính là Laminaria, Udaria, Ascophyllum. Hàn Quốc khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria. Nhật Bản khoảng 51.000 tấn Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile khoảng 27.000 tấn [5]. * Phân loại và phân bố các loài rong nâu ở Việt Nam Ở Việt Nam đến nay có khoảng 147 loài rong nâu đã được phân loại, trong đó các loài rong thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất với khoảng 68 loài phân bố dọc ven biển Việt Nam và sản lượng ước tính trên 10.000 tấn khô/năm [9]. Theo điều tra tới năm 2011 có 39 loài rong nâu thuộc chi Sargassum phân bố ở vùng biển Khánh Hòa, tập trung nhiều nhất và có trữ lượng lớn nhất là ở vịnh Nha Trang với 21 loài phổ biến và sản lượng ước tính gần 4.800 tấn khô/năm [1]. Rong nâu phân bố phổ biến ở các vùng biển Đà Nẵng (chân đèo Hải Vân, bán đảo Sơn Trà), Quảng Nam (Cù Lao Chàm, Núi Thành), Quảng Ngãi (Bình 5 Châu, đảo Lý Sơn, Sa Huỳnh), Bình Định (Phù Mỹ, Qui Nhơn), Phú Yên (vịnh Xuân Đài, Cù Mông), Khánh Hòa (vịnh Vân Phong, Hòn Khói, vịnh Nha Trang, vịnh Cam Ranh), Ninh Thuận (huyện Ninh Hải, Ninh Phước). Trong khi đó vùng bờ biển từ Bình Thuận đến Bà Rịa-Vũng Tàu không phát hiện sự có mặt của rong nâu. Đoạn bờ biển Tây Nam Bộ thuộc tỉnh Kiên Giang từ Hòn Chông, Hòn Trẹm (xã Bình An) đến thị xã Hà Tiên, Mỹ Đức, giáp biên giới Campuchia là vùng biển có nhiều điều kiện thuận lợi cho rong nâu phát triển [1]. Nhìn một cách tổng quan hai khu vực ở ven biển phía Nam Việt Nam rong nâu phân bố tập trung là vùng ven biển và đảo từ Đà Nẵng đến Vũng Tàu và huyện Hà Tiên (từ xã Bình An đến Mỹ Đức Hà Tiên) [8]. 1.1.3 Thành phần hóa học có trong rong biển Rong biển có chứa đa dạng các thành phần hoá học, chúng đều là các thành phần rất có giá trị về mặt dinh dưỡng cũng như dược liệu bao gồm: các axít amin, các axít béo nhiều nối đôi, các vitamin và khoáng chất, polyphenol, các hợp chất chứa iốt, laminaran, alginat và fucoidan (bảng 1.1). Trong số các hợp chất polysacarit của rong biển thì fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do chúng sở hữu rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị (kháng u, kháng đông tụ máu, kháng virus, kháng viêm, chống oxi hóa,…) với tiềm năng ứng dụng rất lớn để làm dược liệu [69, 132]. Từ kết quả các số liệu trong bảng 1.1, ta thấy fucoidan chỉ có trong thành phần của ngành rong nâu mà không có trong thành phần của hai ngành rong đỏ và rong lục [5]. Bảng 1.1: Thành phần hoá học (%) của một số loài rong biển. Ascophyllum Laminaria Alaria Palmaria Porphyra Porphyra Ulva nodosum digitata esculenta palmata sp. yezoensis sp. Ngành rong Nâu Nâu Nâu Đỏ Đỏ Đỏ Lục Nước 70-85 73-90 73-86 79-88 86 Nd 78 Tro 15-25 73-90 73-86 15-30 8-16 7,8 13-22 Alginic axít 15-30 20-45 21-42 0 0 0 0 0 0 0 29-45 0 0 0 Xylan 6 Laminaran 0-10 0-18 0-34 0 0 0 0 Mannitol 5-10 4-16 4-13 0 0 0 0 Fucoidan 4-10 2-4 nd 0 0 0 0 Floridosid 0 0 0 2-20 nd nd 0 Protein 5-10 8-15 9-18 8-25 33-47 43,6 15-25 Chất béo 2-7 1-2 1-2 0,3-0,8 0,7 2,1 0,6-0,7 Tannin 2-10 0,1 0,5-6,0 nd nd nd nd Kali 2-3 1,3-3,8 nd 7-9 3,3 2,4 0,7 Natri 3-4 0,9-2,2 nd 2,0-2,5 Nd 0,6 3,3 Magie 0,5-0,9 0,5-0,8 nd 0,4-0,5 2,0 nd nd Iod 0,01-0,1 0,3-1,1 0,05 0,01-0,1 0,0005 nd nd 1.2 FUCOIDAN 1.2.1 Giới thiệu chung về fucoidan Fucoidan là một anion polysacarit sulfate hóa nằm trong thành tế bào của rong nâu, hợp chất này được phân lập và mô tả lần đầu tiên bởi Kylin vào năm 1913 [67], khi đó nó được đặt tên là “fucoidin” theo tên gọi của gốc đường fucose là thành phần chính cấu tạo nên polysacarits này. Nhưng theo danh pháp carbohydrate nghiêm ngặt, thuật ngữ này là không chính xác, vì các polysacarit được tạo nên bởi fucose và sulfate được đặt tên là sulfate fucan. Các polysacarit như vậy trên thực tế chỉ có mặt trong ngành Da gai, cụ thể là cầu gai và hải sâm [125]. Ngược lại, thành phần và cấu trúc của các polysacarit rong nâu phức tạp hơn nhiều. Ngoài hai thành phần chính là fucose và sulfate, trong phân tử của fucoidan còn có thể chứa thêm các đường đơn khác như: galactose, xylose, manose, glucuronic axít , đồng thời có thể bị acetyl hóa một phần. Cấu trúc hóa học chi tiết của các polyme sinh học phức tạp này trong nhiều trường hợp còn chưa được biết đến. Chính vì vậy, tên gọi phổ thông “fucoidan” là thích hợp nhất nhằm dùng cho tất cả các polysacarit sulfate hóa 7 của rong nâu, nó không liên quan đến thành phần của chúng, nhưng hiển nhiên không được sử dụng cho fucan sulfate hóa có nguồn gốc động vật [125]. Nhờ sự đa dạng về thành phần và cấu trúc mà fucoidan sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị như: kháng đông tụ máu, kháng huyết khối, kháng virut, chống kết dính tế bào, chống tạo mạch (antiangiogenic), kháng viêm, kháng u, kháng bổ thể (anticomplementary), điều biến hệ miễn dịch, v.v... [69]. Nhờ vậy, fucoidan đã trở thành đối tượng thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các lĩnh vực như thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ dưỡng và dược liệu. Cùng với đó số các công trình nghiên cứu về fucoidan đã tăng vọt trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây (Hình 1.1) [81] Hình 1.1 Số các công trình công bố có liên quan đến fucoidan từ năm 1980-2010 Thành phần của fucoidan trong rong nâu Hàm lượng của fucoidan phụ thuộc vào loài rong, địa điểm và thời gian thu hoạch rong. Năm 1997, Park và cộng sự đã công bố hàm lượng fucoidan từ 1-20% trọng lượng rong khô và phụ thuộc vào loài rong [100]. Trước đó, công bố của Stewart và cộng sự (1961) cho rằng hàm lượng fucoidan của rong nâu không thay đổi nhiều khi thu rong ở các mùa vụ khác nhau [120]. Tuy nhiên, sau đó công bố 8 này đã được hiệu chỉnh lại trong nhiều nghiên cứu, theo các công bố [100,126] hàm lượng fucoidan phụ thuộc vào vùng địa lý, loài rong và thời điểm thu hoạch. Năm 1994, Koo đã công bố hàm lượng fucoidan được phân lập từ các loài rong L. religiosa, U. pinnatifida, H. fusiforme và S. fulvellum lần lượt là 2,7%; 6,7%; 2,5% và 1,6% [66]. Bảng 1.2. Thành phần hóa học của một số fucoidan [69] Rong nâu Thành phần hóa học (tỉ lệ mol) F. vesiculosus Fucose/sulfate (1/1,20) F. evanescens Fucose/sulfate/acetate (1/1,23/0,36) F. distichus Fucose/sulfate/acetate (1/1,21/0,08) F. serratus L. Fucose/sulfate/acetate (1/1/0,1) Lessonia vadosa Fucose/sulfate (1/1,12) Macrocytis pyrifera Fucose/galactose (18/1) Pelvetia wrightii Fucose/galactose (10/1) Undaria pinnatifida (Mekabu) Fucose/galactose (1/1,1) Ascophyllum nodosum Fucose/xylose/GlcA (4,9/1/1,1) Himanthalia lorea và Bifurcaria bifurcate Fucose/xylose/GlcA (2,2/1,0/2,2) Padina pavonia Fucose/xylose/mannose/glucose/galactose (1,5/1,5/1,2/1,2/1) Laminaria angustata Fucose/galactose/sulfate (9/1/9) Ecklonia kurome Fucose/galactose/mannose/xylose (1/0,67/0,03/0) Sargassum stenophyllum Fucose/galactose/mannose/xylose (1/0,2/0,02/0,24) Adenocytis utricularis Fucose/galactose/mannose (1/0,38/0,15) Hizikia fusiforme Fucose/galactose/mannose/xylose/GlcA (1/0,72/0,72/0,2/0,25) Dictyota menstrualis Fucose/xylose/uronic acid/galactose/sulfate (1/0,8/0,7/0,8/0,4) và (1/0,3/0,4/1,5/1,3) Spatoglossum schroederi Fucose/xylose/galactose/sulfate (1/0,5/2/2) Fucoidan là một sulfate polysacarit dị thể với thành phần cấu tạo hết sức phức tạp. Lần đầu tiên thành phần của fucoidan trong dịch chiết nước được xác định là một polysacarit có chứa L-fucose và D-xylose, trong khi đó D-galactose và 9 uronic axít được xem là các tạp chất [102]. Tuy nhiên, trong cô bố của Percival và Ross (1950) cho thấy fucoidan trong dịch chiết nước nóng của các loài rong Fucus vesiculosus, Fucus spiralis and Himanthalia lorea có chứa 38% ester sulfate, 56,7% fucose, 4% galactose, 1,5% xylose, 3% uronic axít và 8% khoáng [103]. Tỉ lệ fucose/galactose trong phân tử fucoidan cũng phụ thuộc vào các loài rong [80,92,102]. Dillon và cộng sự. (1953) đã phân lập được fucoidan từ loài rong Ascophyllum nodosum có tỉ lệ fucose: galactose là 8:1 [43], trong khi fucoidan được phân lập từ rong Macrocystis pyrifera có tỉ lệ fucose:galactose = 18:1 [69]. Ngoài ra, các thành phần đường khác (như xylose, mannose,...) cũng được xác nhận là hợp phần của fucoidan [102]. Thành phần của fucoidan từ rong F. vesiculosus là 44,1% fucose, 26,3% sulfate, 31,1% tro và một lượng nhỏ amino-glucose [69,103]. Như vậy, thành phần của fucoidan phụ thuộc vào các loài rong (bảng 1.2) [69,81]. Ngoài ra phương pháp chiết cũng có thể ảnh hưởng tới thành phần của fucoidan [81]. Theo công bố [81], tác giả Percival (1968) đã phân lập fucoidan từ rong Ascophyllum nodosum bằng cách chiết với nước nóng và dung dịch kiềm loãng nóng, kết quả thu được fucoidan có thành phần gồm fucose, xylose, sulfate và uronic axít , trong khi đó cũng với loài rong Ascophyllum nodosum tác giả Marais và Joseleau (2001) đã tiến hành chiết bằng dung dịch 0,01% NaCl và 1% CaCl2 thu được fucoidan có thành phần là fucose, glucose, galactose và sulfate [80]. 1.2.3. Đa dạng cấu trúc của fucoidan Việc phân tích cấu trúc của các polysacarit nói chung và fucoidan nói riêng là một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ có gốc đường. Cấu trúc của fucoidan rong biển là vô cùng phức tạp và không đồng nhất [23] với những thay đổi về mô hình liên kết (linkages), sự phân nhánh (branching), vị trí nhóm sulfate cũng như các gốc đường trong polysacarit này phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng [25,34,35]. Vì vậy, việc phân tích cấu trúc của chúng vẫn còn là vấn đề nan giải, ngay cả khi sử dụng các kỹ thuật phổ NMR phân giải cao mới nhất [88]. Đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc chi tiết của fucoidan được công bố, nhưng mới chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của fucoidan. 10 -L-fucp-4(SO3-)  3 2)--L-fucp-(12)--L-fucp-(12)--L-fucp-(12)--L-fucp-(12) 4 4 4 4     SO3 SO3 SO3 SO3Hình 1.2. Cấu trúc của fucoidan từ F. vesiculosus được mô tả vào năm 1950 [103] Percival và Ross (1950) đã mô tả cấu trúc fucoidan từ rong Fucus vesiculosus là một polysacarit có bộ khung mạch chính là -L-fucose(12), vị trí mạch nhánh là gốc đường -L-fucose(13) và nhóm sulfate chủ yếu gắn ở vị trí C4 của gốc đường L-fucospynanose (hình 1.2) [103]. Mô hình cấu trúc fucoidan này tồn tại hơn 40 năm. Năm 1993, cấu trúc fucoidan của rong F.vesiculosus đã được nghiên cứu lại bởi Patankar và công sự, kết quả cho thấy có sự khác nhau ở bản chất liên kết glycoside của fucoidan này với mạch chính là -L-fucose(13) thay vì L-fucose(12), nhóm sulfate được tìm thấy chủ yếu ở vị trí 4, phù hợp với mô hình đã công bố trước [101]. Sự khác nhau về cấu trúc fucoidan so với công bố của Percival và Ross được Pantakar giải thích như sau: đầu tiên là kỹ thuật chiết tách khác nhau, fucoidan được Percival và Ross chiết trong dung môi nước nóng, thay vì được chiết trong dung môi axít như Pantakar; thứ hai là sự khác nhau về phương pháp methyl hóa và cuối cùng là sự khác nhau về phương pháp phân tích cấu trúc. Percival và Ross phân tích cấu trúc fucoidan dựa trên các tính chất về sắc ký và hóa học của sản phẩm methyl hóa, trong khi đó các sản phẩm methyl hóa được Patankar phân tích bằng phương pháp GC-EI/MS. Cấu trúc fucoidan từ loài rong Ascopphyllum nodosum (A. nodosum) đã được công bố trong các nghiên cứu [34,35,40,42]. Năm 2001, Chevolt và cộng sự đã phân lập được fucoidan từ rong nâu Ascorphylum nodosum [35], cấu trúc fucoidan oligosacarit (bậc polyme hóa từ 8-14) của loài rong này được cấu thành bởi các liên kết luân phiên (13) và (14) (hình 1.3) [35]. Cấu trúc fucoidan từ A.nodosum cũng đã được Daniel và cộng sự nghiên cứu 11 khi sử dụng các enzym đặc hiệu làm xúc tác sinh học để thủy phân tạo fucoidan oligosacarit, kết quả cho thấy sự có mặt của lượng lớn các liên kết glycoside của gốc -L-fucose(13) và -L-fucose(14) [40]. [3)-α-L-Fucp (2SO3-)-(14)-α-L-Fucp (2,3SO3-)-1]n H CH3 H 1 H - H HO O3SO 3 H CH3 H H 1 4 - O3SO H OSO3 - H Hình 1.3. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan tách và phân lập từ rong nâu A. nodusum. H Cấu trúc fucoidan từ loài rong Ecklonia kurome đã được công bố năm 1991 bởi Nishino và Nagumo. Do tính dị thể trong phân tử của fucoidan nên phổ NMR của chúng quá phức tạp để có thể giải thích cấu trúc một cách trực tiếp. Cấu trúc phân tử trung bình của fucoidan này chủ yếu được tạo thành bởi liên kết α-Lfucose(13) với phần lớn nhóm sulfate gắn ở vị trí C-4 và một phần ở C-2 hoặc vị trí C-2 là các điểm chẻ nhánh (hình 1.4) [91]. H H H H - O3SO - O3SO CH3 H H CH3 H OH OH H H Hình 1.4. Cấu trúc fucoidan có sulfat ở vị trí 4 và liên kết 3-O-linked của loài rong E.kurome H Năm 1999, cấu trúc fucoidan của 3 loài rong Cladosiphon Okamuranus (Chordariales) [89], Chorda filum (Laminariales) và Ascophyllum nodosum (Fucales) [34,41] đã được công bố. Cấu trúc fucoidan của rong Cladosiphon 12 okamuranus và Chorda filum được tạo thành bởi các gốc α-L-fucose(13) lặp lại đều đặn, với một số nhóm sulfate ở vị trí C-2 (2-O-sulfateation) hoặc vị trí C-4 (4O-sulfateation) (hình 1.5). Sự xuất hiện của các nhóm O-acetyl và các mạch nhánh trong phân tử fucoidan càng làm tăng thêm tính dị thể về cấu trúc của chúng. H H H H H R2O H R2O R1O R1O H H R3O H CH3 H H CH3 H H R2O CH3 H R1 = SO3- hoặc H hoặc COCH3 R2 = SO3- hoặc HH H H H H H R2O R2O H R2O 1 RO H R1O OH H H H H CH3 H CH3 H CH3 R1O H Hình 1.5. Cấu trúc trung bình của fucoidan được phân lập từ rong Chorda filum [36] H Năm 2002, cấu trúc fucoidan trọng lượng phân tử cao được phân lập từ rong Fucus evanescens đã được nghiên cứu bởi Bilan và cộng sự, kết quả họ đã phát hiện thấy có sự tương đồng giữa cấu trúc fucoidan này với cấu trúc fucoidan của rong A.nodosum [23]. Sau đó vào các năm 2004 và 2006, nhóm tác giả này tiếp tục công bố thêm hai cấu trúc fucoidan từ rong Fucus distichus L và Fucus serratus được tạo thành bởi các gốc 1→3)α-L-Fucp và 1→4)α-L-Fucp liên kết lặp lại một cách tuần tự, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C-2 và C-2,4 (hình 1.6 và hình 1.7) [24,25]. 13 [3)--L-Fucp-(2,4 SO3-)-(14)--L-Fucp-(2SO3-)-(1]n 1 H H 2 H CH3 HO H OSO3- 4 - O3SO CH3 1 H H 3 H H 2 Hình 1.6. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan được phân lập từ rong Nâu Fucus distichus L. OSO3- 3)--L-Fucp(2R1,4R2)-(14)--L-Fucp(2SO3-)-(1 Trong đó: R1 = SO3-, R2 = H chiếm 50% và R1 = H, R2 = -L-fucp-(14)--L-fucp(2SO3-)-(13)-L-fucp(2SO3-)-(1 chiếm 50% Hình 1.7. Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus. Như vậy, mặc dù có mối liên hệ rõ ràng giữa các loài rong và cấu trúc fucoidan, nhưng chưa đủ bằng chứng để thiết lập bất cứ mối tương quan hệ thống giữa cấu trúc fucoidan với các Bộ rong (algal order). Hầu hết các công bố về cấu trúc của fucoidan được phân lập từ các loài rong ở vùng ôn đới, thành phần hóa học của các loại fucoidan này nhìn chung là đơn giản với chỉ một gốc đường fucose và sulfate. Tuy nhiên, fucoidan của các loài rong ở vùng nhiệt đới thì thành phần hóa học của chúng phức tạp hơn nhiều khi trong phân tử của chúng thường tồn tại đồng thời nhiều gốc đường khác nhau điều đó gây ra rất nhiều khó khăn cho việc phân tích cấu trúc của những loại fucoidan này. Đó cũng là lý do tại sao không có nhiều công bố về cấu trúc của fucoidan rong biển ở vùng nhiệt đới, cho dù hoạt tính sinh học của chúng vô cùng thú vị. 1.2.4. Các phương pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu Một số quy trình khác nhau đã được sử dụng để chiết fucoidan. Mối bận tâm chính trong quy trình tách chúng là nhiễu gây bởi các polysacarit khác như 14 laminaran và alginat. Những thử nghiệm chiết đầu tiên được tiến hành với dung môi là nước. Năm 1950, fucoidan từ rong Fucus vesiculosus và Fucus spiralis đã được Percival và Ross chiết tách bằng nước sôi trong 24 giờ, sau đó loại bỏ alginate và protein bằng Pb-acetate, tiếp theo fucoidan được kết tủa dưới dạng phức hydroxide khi cho phản ứng với Ba(OH)2. Phức thu được, đem thủy phân trong dung dịch H2SO4 loãng, fucoidan được tách ra và làm sạch bằng màng thẩm tách [103]. Năm 1952, Black đã khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, thời gian chiết và tỷ lệ dung dịch chiết với rong nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi fucoidan. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu để chiết fucoidan bao gồm khuấy huyền phù rong với dung dịch HCl ở pH: 2,0-2,5 (tỷ lệ 1:10) tại 70oC trong 1h. Bằng cách xử lý này chỉ 1 lần chiết có thể phân lập được cỡ 50% fucoidan trong khi 3 lần chiết có thể tách ra được hơn 80% fucoidan. Fucoidan còn có thể được chiết bằng đun nóng một phần rong khô với 10 phần H2O tại 100oC trong 3-7,5h, bằng cách này có thể thu được 55-60% fucoidan. Khi tăng tỉ lệ H2O : rong, thời gian chiết hoặc số lần chiết có thể tăng được hiệu suất chiết. Theo tác giả chiết nước đôi khi không thích hợp do khó tách cặn rong khỏi dung dịch nước. Fucoidan thô được tách khỏi dịch chiết axít bằng trung hòa và cho bay hơi đến khô, hòa tan lại trong nước và kết tủa thu các phân đoạn fucoidan với cồn ở nồng độ 30% và 60% (v/v). Phân đoạn 60%, fucoidan thô có chứa 30-36% fucose. Có thể tách được fucoidan với hàm lượng fucose lớn hơn 40% từ sản phẩm thô bằng cách xử lý rong nguyên liệu với formaldehyde [29]. Những nỗ lực đầu tiên nhằm đưa ra một phương pháp chiết fucoidan có hệ thống đã được thực hiện bởi Mian và Percival [84]. Họ đã tiến hành chiết tuần tự, đầu tiên là xử lý rong nguyên liệu với formaldehyde, tiếp theo xử lý với cồn ở nồng độ 80% để loại bỏ mannitol, các hợp chất màu và các sản phẩm khối lượng phân tử thấp, sau đó rong được chiết bằng cách khuấy trộn với dung dịch CaCl2 2% (ở nhiệt độ phòng và 70oC) để phân lập laminaran và fucoidan (alginate được cố định dưới dạng muối Ca-alginat không tan). Fucoidan được chiết tiếp với dung dịch HCl loãng (pH: 2). Sau cùng bã rong được chiết với 3% Na2CO3 để thu lại alginate dưới dạng muối tan Na-alginat. Hai dung môi bổ sung cuối cùng nhằm chiết ra thêm các