Tài liệu Nghiên cứu phân tích một số hợp chất hữu cơ vòng bé bằng phương pháp hplc-ms và nmr

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC NGUYỄN TIẾN DŨNG NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC-MS VÀ NMR LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC NGUYỄN TIẾN DŨNG NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC-MS VÀ NMR Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH Mã số: CH. 1001190 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. NGUYỄN VĂN TUYẾN Hà Nội - năm 2012 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CÁC HÌNH .................................................................................................. i DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ........................................................................................................ ii MỞ ĐẦU .................................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................................... 2 1.1. BETA LACTAM ............................................................................................................. 2 1.2. TỔNG HỢP BETA LACTAM ........................................................................................ 3 1.2.1. Phản ứng Staudinger ................................................................................................. 3 1.2.2. Cơ chế phản ứng và điều khiển độ chọn lọc lập thể ................................................. 4 1.3. PHÂN TÍCH CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG ........................................................... 7 1.3.1. Phƣơng pháp tách các đồng phân đối quang bằng enzym ........................................ 7 1.3. 2. Tách các đồng phân đối quang nhờ tác nhân bất đối bổ trợ .................................... 8 1.3.3. Tách đồng phân đối quang bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại .......................... 8 1.3.4. Phân tích các đối quang nhờ phƣơng pháp NMR ..................................................... 9 1.4. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) .............................................................. 17 1.4.1. Khái niệm ............................................................................................................... 17 1.4.2. Phân loại ................................................................................................................. 17 1.4.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo ................................................................................. 17 1.4.4. Pha động trong sắc ký pha đảo ............................................................................... 18 1.4.5. DETECTOR DAD.................................................................................................. 19 1.4.6. DETECTOR MS .................................................................................................... 20 CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM ................................................................................................ 22 2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu và trang thiết bị. ................................................................... 22 2.1.1. Các phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ......................................................................... 22 2.1.2. Dụng cụ và hóa chất. .............................................................................................. 22 2.1.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc kí lớp mỏng. 23 2.1.4. Các phƣơng pháp phân tích cấu trúc. ..................................................................... 23 2.2 Tổng hợp các hợp chất β-lactam..................................................................................... 25 2.2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic .......................................................... 25 2.2.2. Tổng hợp dẫn xuất imine ........................................................................................ 26 2.2.3. Tổng hợp các dẫn xuất β- lactam........................................................................... 27 2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H và 13C của các hợp chất 9a, 9b, 9c, 9d, 9e, 9f........ 28 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 31 3.1. TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT β-LACTAM ................................................................ 31 3.2. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤTcis-β-LACTAM .............................................. 32 3.2.1. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9a ................................................................ 32 3.2.2. Phân tích phổ 1H –NMR của hợp chất 9b .............................................................. 33 3.2.3. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9c ................................................................ 33 3.2.4. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9d ................................................................ 34 3.2.5. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9e ................................................................ 35 3.2.6. Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9e ................................................................ 35 3.3. XÁC ĐỊNH TỈ LỆ CÁC ĐỒNG PHÂN LẬP THỂ BẰNG HPLC-MS ....................... 37 3.3.1. Khảo sát bƣớc sóng hấp thụ đối với các chất nghiên cứu ...................................... 37 3.3.2. Khảo sát phổ MS .................................................................................................... 40 3.3.3. Khảo sát chƣơng trình dung môi cho quá trình sắc ký ........................................... 41 3.4.4. Kết quả và thảo luận quá trình phân tích sắc ký. .................................................... 43 KẾT LUẬN .............................................................................................................................. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 49 PHỤ LỤC ................................................................................................................................. 51 DANH MỤC CÁC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc cơ sở β-lactam .............................................................................. 3 Hình 1.2. Phổ 1H-NMR của hỗn hợp este Mosher (S)-1-phenylbutan-1-ol và (R)-1phenylbutan-1-ol............................................................................................ 10 Hình 1.3. Phổ 1H-NMR của este Mosher (R)-1-phenylbutan-1-ol và (S)-1phenylbutan-1-ol............................................................................................ 10 Hình 1.4. Phổ 1H-NMR của (-)-enriched và hỗn hợp (-)-enriched với CSA ........... 12 Hình 1.5. Tín hiệu 1H-NMR của CH3 trong một số trƣờng hợp .............................. 13 Hình 1.6. Cặp tín hiệu Fiedel.................................................................................... 14 Hình 1.7. Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích cấu trúc bằng phƣơng pháp X-Ray ..... 14 Hình 1.8. Phổ CD của hợp chất A và B .................................................................... 16 Hình 1.9. Cấu trúc của cột ODS ............................................................................... 18 Hình 1.10. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang ............................................................... 19 Hình 1.11. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector (cải tiến flowcell). .... 20 Hình 3.1. Phổ 1H của hợp chất 9a ............................................................................ 32 Hình 3.2. Phổ 1H của hợp chất 9b ............................................................................ 33 Hình 3.3. Phổ 1H của hợp chất 9c............................................................................. 33 Hình 3.4. Phổ 1H của hợp chất 9d ............................................................................ 34 Hình 3.5. Phổ 1H của hợp chất 9e............................................................................. 35 Hình 3.6. Phổ 1H của hợp chất 9f ............................................................................. 35 Hình 3.7. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9a ....................................................... 37 Hình 3.8. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9b ...................................................... 38 Hình 3.9. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9c ....................................................... 38 Hình 3.10. Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9d .................................................... 38 Hình 3.11. Phổ MS của hợp chất 9c khi để chế độ Positive..................................... 40 Hình 3.12. Phổ MS của hợp chất 9c khi để chế độ Negative ................................... 40 Hình 3.13. Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 1 ............... 42 Hình 3.14. Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 2 ............... 42 Hình 3.15. Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 3 ............... 42 Hình 3.16. Sắc ký đồ của hợp chất 9a ...................................................................... 43 Hình 3.17. Phổ MS của pic 1 (hợp chất 9a) .................................................... 44 Hình 3.18. Phổ MS của pic 2 (hợp chất 9a) .................................................... 44 Hình 3.19. Sắc ký đồ của hợp chất 9b ...................................................................... 45 Hình 3.20. Sắc ký đồ của hợp chất 9c ...................................................................... 46 Hình 3.21. Sắc ký đồ của hợp chất 9d ...................................................................... 47 i DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1. Phản ứng Staudinger ................................................................................. 3 Sơ đồ 1.2. Cơ chế phản ứng Staudinger ..................................................................... 4 Sơ đồ 1.3. Con đƣờng hình thành β –lactam .............................................................. 5 Sơ đồ 1.4. Sử dụng muối (12) tổng hợp β-lactam ...................................................... 6 Sơ đồ 1.5. Sorbyl clorua (16) tổng hợp β-lactam ....................................................... 6 Sơ đồ 1.6. Tổng hợp β-lactam từ imine và vinylketene ............................................. 7 Sơ đồ 2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic ........................................... 26 Sơ đồ 2.2. Tổng hợp dẫn xuất imin .......................................................................... 26 Sơ đồ 2.3. Tổng hợp dẫn xuất cis-β-lactam ............................................................. 27 Sơ đồ 3.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic ........................................... 31 Sơ đồ 3.2. Cơ chế hình thành chất 5a,b .................................................................... 32 ii BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Chú thích 1 SKPB Sắc ký phân bố 2 SKPD Sắc ký pha đảo 3 SKPT Sắc ký pha thuận 4 HPLC High-performance liquid chromatography 5 MS Mass spectrometry 6 NMR Nuclear magnetic resonance iii iv MỞ ĐẦU Với sự biến đổi không ngừng của vi khuẩn, hàng loạt thuốc kháng sinh không còn sử dụng đƣợc hoặc phổ tác dụng hẹp lại do khả năng kháng thuốc của vi khuẩn. Làm giảm hiệu quả điều trị bệnh và gây ra những biến chứng không mong muốn cho ngƣời bệnh. Azetidin-2-ones (β-lactams) đại diện cho nhóm thuốc kháng sinh quan trọng [9] và ứng dụng làm các synthon trong tổng hợp hữu cơ [13]. Để tạo ra những loại thuốc mới, có hiệu lực điều trị cao và chƣa bị vi khuẩn kháng lại, thì việc tổng hợp và bán tổng hợp β-lactam mới là một việc làm rất quan trọng. Mặt khác, nhƣ ta đã biết hoạt tính sinh học của các đồng phân quang học (đồng phân đối quang hoặc đồng phân lập thể không đối quang) là rất khác nhau và việc tách các đồng phân đó thì rất tốn kém, tốn rất nhiều thời gian. Vì vậy việc tổng hợp chọn lọc lập thể các đồng phân quang học là rất quang trọng, làm giảm chi phí cho thực hiện quá trình tách, tăng hiệu quả điều trị. Vì vậy trong luận văn này, chúng tôi tập trung vào việc phân tích cấu trúc và xác định độ chọn lọc lập thể của các hợp chất β-lactams, thu đƣợc từ phản ứng tổng hợp theo phƣơng pháp Staudinger, bằng các phƣơng pháp hiện đại nhƣ HPLC-MS và NMR. 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. BETA LACTAM β-lactam đƣợc phân loại dựa theo cấu trúc vòng cơ sở và đƣợc chia thành 4 nhóm:     β-lactam kết hợp với vòng 5 cạnh bão hòa. o β-lactam có chứa vòng thiazolidine đƣợc gọi tên là penams (A) o β-lactam có chứa vòng pyrrolidine đƣợc gọi tên là carbapenams (B) o β-lactam hợp nhất để oxazolidine vòng đƣợc gọi tên là oxapenams hoặc clavams (C) β-lactam kết hợp với vòng năm cạnh không bão hòa: o β-lactam có chứa vòng thiazol 2,3-dihydro đƣợc gọi tên là penems (D) o β-lactam có chứa vòng 2,3-dihydro-1H-pyrrole đƣợc gọi tên là carbapenems (E) β-lactam kết hợp với vòng 6 cạnh chƣa bão hòa: o β-lactam có chứa vòng 3,6-dihydro-2H-1,3-thiazine đƣợc gọi tên là cephems (G) o β-lactam có chứa vòng 1,2,3,4-tetrahydro pyridin đƣợc gọi tên là carbacephems (H) o β-lactam có chứa vòng 3,6-dihydro-2H-1,3-oxazine đƣợc gọi tên là oxacephems (I) β-lactam không kết hợp với bất kỳ một vòng nào đƣợc gọi tên là monobactams 2 Hình 1.1. Cấu trúc cơ sở β-lactam Hợp chất chứa vòng β-lactam đƣợc ứng dụng chủ yếu trong thực tế là làm thuốc kháng sinh. 1.2. TỔNG HỢP BETA LACTAM Azetidin-2-ones(β-lactams) đại diện cho một nhóm các hợp chất rất quan trọng do hoạt tính sinh học nổi tiếng của chúng [9] và là hợp chất trung gian trong tổng hợp hữu cơ [13]. Nhiều phƣơng pháp tổng hợp β-lactam đã đƣợc phát triển nhƣ: phản ứng cộng vòng [2+2], phản ứng tạo vòng, phản ứng gắn thêm carbene, và phản ứng sắp xếp lại các hợp chất dị vòng [14],[9]. 1.2.1. Phản ứng Staudinger Phản ứng Staudinger, phản ứng của ketene với các hợp chất chứa chức imine, là phƣơng pháp tổng hợp quan trọng nhất điều chế β–lactam. Kể từ khi đƣợc phát hiện ra bởi Staudinger [15], phản ứng này từ lâu đã đƣợc nghiên cứu thực nghiệm và lý thuyết để hiểu cơ chế của nó và là cơ sở cho việc chọn lọc lập thể. Nó đƣợc áp dụng để tổng hợp một loạt các cấu trúc β-lactam (Sơ đồ 1.1). Hiện nay phản ứng này vẫn là một trong những phƣơng pháp tốt nhất cho quá trình tổng hợp β –lactam [14]. Sơ đồ 1.1. Phản ứng Staudinger 3 1.2.2. Cơ chế phản ứng và điều khiển độ chọn lọc lập thể Cơ chế của phản ứng Staudinger đƣợc đƣa ra bởi Hegedus là cơ chế mô tả tốt nhất [15]. Imine, tác nhân nucleophile tấn công orbital nguyên tử trống (LUMO) của nhóm đồng phẳng carbonyl ketene tạo ketene thế. Quá trình tấn công xảy ra ở bên phía ít cản trở (cách tiếp cận exo), với mặt phẳng của imine vuông góc với ketene, tạo ra các trung gian zwitterion (5) (sơ đồ 1.2). Sơ đồ 1.2. Cơ chế phản ứng Staudinger Hợp chất trung gian này đã đƣợc phát hiện và đặc trƣng bởi quang phổ IR [22]. Chuyển động quay của các imine đi vào mặt phẳng của ketene xảy ra đồng thời với việc đóng vòng conrotatory tạo ra sản phẩm β –lactam (6) trong đó nhóm imine R1 và nhóm L của ketene là cis. Khi nhóm thế trên carbon sp2 của imine (R1 trong sơ đồ) ổn định điện tích dƣơng, hợp chất trung gian zwitterioncó thể bị đồng phân hóa tạo thành dạng cis của liên kết iminium vàtạo ra sản phẩm trans-β-lactam (9). Tỷ lệ tƣơng đối của các quá trình sẽ xác định sản phẩm hóa học lập thể của phản ứng ketene/imine. Tính toán ab initio xác định sự có mặt của hợp chất trung gian zwitterion và đóng vòng conrotatory [25]. Nghiên cứu tiếp theo [9] khẳng định bản chất hai bƣớc của quá trình và chứng minh một số điểm tƣơng đồng với mô hình đề xuất bởi Houk cho phản ứng conrotatory của cyclobutenes [18]. Gần đây, nghiên cứu mới của nhóm Xu [9] đề xuất một cơ sởđể giải thích kết quả lập thể của phản ứng, xem xét lại mô hình đƣợc mô tả bởi Hegedus và chỉ ra nguồn gốc động học của tỷ lệ cis/trans của sản phẩm β –lactam. Con 4 đƣờng đƣợc đề xuất cho sự hình thành β –lactam đƣợc mô tả dƣới đây (Sơ đồ 1.3). Sơ đồ 1.3. Con đƣờng hình thành β –lactam Khi sử dụng ketene dẫn xuất một lần thế thƣờng cho tấn công exo là ƣu thế. Sản phẩm hóa học lập thể cuối cùng chịu ảnh hƣởng bởi bản chất của các ketene và các hợp chất chức imine, vì nó là kết quả của sự cạnh tranh phản ứng đóng vòng (k1) và phản ứng đồng phân hóa imine (k2). Tỷ lệ k1/k2 xác định tỷ lệ cis/trans của sản phẩm β –lactam. Các tác giả đề xuất [9], bƣớc đóng vòng có thể xảy ra dễ dàng hơn khi thêm vào một tác nhân nucleophile của một enolate nhóm chức của imine hơn là quá trình electrocyclic. Tăng mật độ điện tử cho ketene thế và giảm mật độ điện tử cho imine thế làm tăng phản ứng đóng vòng (tăng k1), dẫn đến hình thành chủ yếu cis- β –lactam. Mặt khác, làm giảm mật độ electron của ketene thế và làm tăng mật độ electron imine sẽ làm giảm giá trị k1 và có lợi cho phản ứng đồng phân hóa, dẫn đến hình thành chủ yếu trans- β – lactam. Các hiệu ứng điện tử của các nhóm thế trên đồng phân là một yếu tố nhỏ trong chọn lọc lập thể. Cuối cùng, sau khi so sánh các phản ứng tƣơng tự thực hiện trong các điều kiện khác nhau, các tác giả cũng thừa nhận rằng không có ảnh hƣởng của sóng viba [15] hoặc ánh sáng trong độ chọn lọc lập thể của phản ứng Staudinge [21]. Độ chọn lọc lập thể cũng chịu ảnh hƣởng bởi tính chất của dung môi, các dung môi không phân cực có lợi cho sự hình thành cis- β –lactam, trong khi dung môi phân cực thuận lợi cho sự hình thành trans. Ngoài ra, cách ketene 5 đƣợc hình thành và thứ tự của bổ sung các tác nhân, cũng ảnh hƣởng đến độ chọn lọc lập thể của sản phẩm [27]. Sự xuất hiện của các orbital liên hợp giữa ketene và tác nhân imine ảnh hƣởng đến độ chọn lọc lập thể của sản phẩm tƣơng tự nhƣ nhiệt độ [19]. Một phƣơng pháp rất hiệu quả để thu đƣợc trans- β -lactam đƣợc phát triển bởi Lectka và đồng nghiệp bằng cách sử dụng muối (12) nhƣ một anion xúc tác ái nhân (Sơ đồ 1.4). Trên thực tế, biện pháp này không hiệu quả với acyl clorua béo [28]. Sơ đồ 1.4. Sử dụng muối 12 tổng hợp β-lactam Việc sử dụng sorbyl clorua (16) nhƣ một một tiền chất của butadienylketene thu đƣợc một số kết quả thú vị liên quan đến đồng phân lập thể không đối quang. Khi phản ứng Staudinger đƣợc thực hiện với N-aryl imine, thu đƣợc chủ yếu là sản phẩm trans, trong khi sử dụng N-akyl imine thu đƣợc chủ yếu là cis- β –lactam (Sơ đồ 1.5)[24]. Sơ đồ 1.5. Sorbyl clorua (16)tổng hợp β-lactam 6 Việc chọn lọc trans cũng thu đƣợc trong phản ứng Staudinger giữa imine và vinylketene chứa một γ – heteroatom. Cấu hình Z của nhánh vinyl của đồng đồng phân lập thể có tác dụng ổn định vinylketene và sản phẩm chính là trans-3vinyl - β –lactam (Sơ đồ 1.6) [23]. Sơ đồ 1.6. Tổng hợp β-lactam từ imine và vinylketene 1.3. PHÂN TÍCH CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG Phân tích các đồng phân đối quang là tách một hỗn hợp raxemic bằng các phƣơng pháp vật lý và hóa học. Thông thƣờng, sự tách đƣợc thực hiện sau khi chuyển từ đồng phân đối quang sang đồng phân “dia”; do các đồng phân đối quang có các tính chất vật lý và hóa học giống nhau nên chúng không thể tách bằng cách trực tiếp. Trong khi đó, các đồng phân “dia” có thể tách đƣợc bằng các phƣơng pháp kết tinh chọn lọc, phƣơng pháp sắc ký hoặc phƣơng pháp NMR. 1.3.1. Phƣơng pháp tách các đồng phân đối quang bằng enzym Hầu hết các enzym có tính đặc hiệu với một loại cơ chất nhất định. Dựa vào tính chất này, ngƣời ta đã sử dụng các enzym để chuyển hóa chọn lọc một trong hai đối quang trong hỗn hợp. Ví dụ phản ứng thủy phân hỗn hợp raxemic của este bằng enzym pig liver estease. Dƣới tác dụng của enzym này, chỉ có đồng phân S đƣợc thủy phân. Nhờ đó mà ngƣời ta tách đƣợc hai đồng phân này ra khỏi nhau. 7 1.3. 2. Tách các đồng phân đối quang nhờ tác nhân bất đối bổ trợ Hỗn hợp raxemic hoặc hai đồng phân của các hợp chất đối quang có một tâm bất đối thƣờng không thể tách ra khỏi nhau. Tuy nhiên, khi tham gia phản ứng với các chất bổ trợ chiral có từ một hoặc nhiều tâm bất đối, tạo thành sản phẩm có từ hai tâm bất đối trở lên, có thể tách đƣợc bằng các phƣơng pháp hóa lý khác nhau. Dựa vào tính chất quan trong này năm 1953, Pasteur đã tách đƣợc đôi đồng phân đối quang của axit tactaric nhờ sự tạo muối “dia” của hỗn hợp hai đối quang với (+)-cinchotoxin, có độ tan khác nhau nên có thể tách ra khỏi nhau bằng phƣơng pháp kết tinh. Phƣơng pháp này vẫn đƣợc sử dụng hiệu quả để tách hỗn hợp hai đồng phân đối quang ra khỏi nhau. Ngoài ra, có thể chuyển hóa các đối quang của các hợp chất có một tâm bất đối thành các đồng phân “dia” nhờ phản ứng với tác nhân bất đối bổ trợ khác. Các đồng phân “dia” nhận đƣợc có thể tách ra bằng các phƣơng pháp hóa lý khác nhau. Cuối cùng các tác nhân bất đối bổ trợ đƣợc loại bỏ, thu đƣợc các đồng phân đối quang tinh khiết. 1.3.3. Tách đồng phân đối quang bằng các phƣơng pháp hóa lý hiện đại Các đối quang có thể đƣợc tách nhờ các phƣơng pháp sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có sử dụng các cột chiral. Bản chất của các phƣơng pháp này là các hỗn hợp đối quang tƣơng tác với pha tĩnh (tâm bất đối trên cột chiral), nghĩa là chỉ một trong các đối quang có tƣơng tác mạnh hơn với 8 tâm bất đối của cột. Đối quang có tƣơng tác yếu sẽ đƣợc rửa giải nhanh nhờ pha động, kết quả là hai đối quang đƣợc tách ra khỏi nhau. Phƣơng pháp này thƣờng đƣợc sử dụng để xác định độ chọn lọc đối quang trong của các phản ứng. Nếu phản ứng nhận đƣợc hỗn hợp có hai đồng phân đối quang A và B (ee=enantiomer excess, de=diasteroisomer excess), độ chọn lọc đối quang đƣợc xác định theo công thức: ee  de  %enantiomerA  %enantiomerB %enantiomerA  %enantiomerB %diasteroisomerA  %diasteroisomerB %diasteroisomerA  %diasteroisomerB 1.3.4. Phân tích các đối quang nhờ phƣơng pháp NMR Để xác định tỉ lệ các đồng phân lập thể có thể sử dụng nhiều phƣơng pháp khác nhau, nhƣng phổ NMR là một phƣơng pháp hữu ích và phổ biến, vì nó không làm thay đổi tỉ lệ của các đồng phân trong hỗn hợp và chỉ cần lƣợng nhỏ hỗn hợp hai đồng phân đối quang. Các đồng phân khác nhau đƣợc xác định nhờ độ dịch chuyển hóa học và hằng số tƣơng tác spin-spin của những nguyên tử hydro trong từ trƣờng. Trong phổ NMR, phần lớn hạt nhân của 1H và 13C của hai đồng phân “dia” sẽ có tín hiệu chuyển dịch hóa học khác nhau. Tỉ lệ của các đồng phân có mặt trong hỗn hợp có thể tính toán đƣợc bằng sự phân tích các tín hiệu này. Nếu trong hỗn hợp có nhiều hơn hai đồng phân “dia” thì việc xác định tỉ lệ các đồng phân bằng phổ NMR sẽ gặp khó khăn hơn, đặc biệt là các đồng phân chiếm tỉ lệ nhỏ. a). Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch (Shift reagent) Mosher Đối với các hợp chất có một tâm bất đối thì hai cấu hình của chúng sẽ không phân biệt đƣợc bằng phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân, do tín hiệu của chúng không đƣợc phân tách trong từ trƣờng. Để phân biệt đƣợc hai cấu hình của các hợp chất có một tâm bất đối, ngƣời ta phải chuyển hợp chất nghiên cứu thành đồng phân dia. Cơ sở của phƣơng pháp Mosher là chuyển hợp chất có một tâm bất đối thành đồng phân dia bằng cách thực hiện phản ứng của hợp chất nghiên cứu với axit R-Mosher để tạo thành este hoặc thành amit… Sau đó, nghiên cứu cấu hình của các hợp chất dia này sẽ đƣa ra đƣợc cấu hình của chất ban đầu. Ví dụ, để xác định cấu hình tuyệt đối của hợp chất 1-phenylbutan9 1-ol có một tâm bất đối, Mosher đã tổng hợp este của nó với axit R-Mosher để tạo ra hai đồng phân dia nhƣ mô tả trong sơ đồ dƣới đây. Hai đồng phân dia này sẽ đƣợc phân biệt rõ trên phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton. Tín hiệu của proton bậc ba tại trung tâm bất đối của dẫn xuất este Mosher của (R)-1-phenylbutan-1-ol sẽ dịch chuyển về phía trƣờng cao, trong khi tín hiệu proton bậc ba tại tâm bất đối của dẫn xuất (S)-1-phenylbutan-1-ol sẽ dịch chuyển về phía trƣờng thấp. Nhƣ vậy, ngƣời ta có thể xác định đƣợc cấu hình tuyệt đối của hợp chất 1-phenylbutan-1-ol ban đầu. Hình 1.2. Phổ 1H-NMR của hỗn hợp este Mosher (S)-1-phenylbutan-1-ol và (R)-1-phenylbutan-1-ol Hình 1.3. Phổ 1H-NMR của este Mosher (R)-1-phenylbutan-1-ol và (S)-1phenylbutan-1-ol 10 Ngoài axit R-Mosher, hiện nay ngƣời ta đang nghiên cứu sử dụng một số tác nhân bổ trợ khác để xác định cấu hình tuyệt đối của một số hợp chất ancol, amin và axit cacboxylic có một tâm bất đối, ví dụ nhƣ các tác nhân bổ trợ sau. b). Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch Chiral Pirkle ancol (CSA) Chiral aryltrifluorometyl carbinol (chiralPirkle ancol) là những tác nhân hữu dụng nhất, cho phép xác đinh ̣ nhanh tỷ lê ̣ của các đồ ng phân lâ ̣p thể . Khi có mă ̣t của chấ t này , các đối quang của lacton, amin và ancol trong tƣ̀ trƣờng tạo ra phổ không tƣơng đƣơng. Có thể là do cả hydroxyl và các hydro cacbinyl của chấ t CSA tạo ra các tƣơng tác với các tâm bazơ. Ƣu điểm của của phƣơng pháp này là không cần phải thực hiện các phản ứng chuyển hóa thành các dẫn xuất với tác nhân bổ trợ nên hạn chế đƣợc quá trình raxemat hóa, đặc biệt là có thể sử dụng để xác định cấu hình của các chất có hàm lƣợng nhỏ. Ví dụ, để nghiên cứu cấu hình của hai đối quang oxaziridin nhờ tác nhân bổ trợ CSA, kết quả do tƣơng tác cầu hydro của oxazirindin với CSA tạo thành phức dia, dẫn đến một số tín hiệu của hai đối quang đƣợc tách biệt trong từ trƣờng. Nghiên cứu của phổ 1H-NMR của hỗn hợp hai đồng phân (-)-oxaziridin khi không có tác nhân chuyển dịch CSA thì các tín hiệu proton không phân biệt đƣợc trong từ trƣờng, nhƣng khi cho kết hợp với (S)-(+)-CSA thì các tín hiệu của metyl, metin đƣợc tách ra. Dựa vào phổ này, ngƣời ta có thể xác định đƣợc tỷ lệ hai đồng phân đối quang của oxaziridin. 11 Hình 1.4. Phổ 1H-NMR của (-)-enriched và hỗn hợp (-)-enriched với CSA c). Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch Eu(hfc)3) Tác nhân Eu(hfc)3 là phức của kim loại thuận từ với ligand hữu cơ có tâm bất đối. Khi tác nhân Eu(hfc)3 kết hợp với nhóm chức (NH2, OH, SH …) trong phân tử có một trung tâm bất đối sẽ tạo thành đồng phân “dia”. Phức dia tạo thành có một số proton đƣợc tách ra trong từ trƣờng và chuyển về trƣờng thấp. Sự tách biệt và độ chuyển dịch về phía trƣờng thấp của một số proton phụ thuộc vào nồng độ của tác nhân phức Eu(hfc)3. Ví dụ, nghiên cứu phổ 1H-NMR của hỗn hợp hai đối quang (R,S)-1axetyl-1-phenylbutan, các tín hiệu proton của hai đối quang không phân biệt đƣợc trong từ trƣờng. Tuy nhiên, khi đƣợc tạo phức với tác nhân chuyển dịch Eu(hfc)3 thì có sự tách tín hiệu. Nhóm metyl (triplet) đƣợc tách thành hai triplet có cƣờng độ tƣơng đƣơng nhau. Sự tách tín hiệu của proton trong từ trƣờng phụ thuộc vào bản chất của chất nghiên cứu và nồng độ của tác nhân chuyển dịch. Qua ví dụ trên ta thấy, tín hiệu proton ở nhóm CH3 của hỗn hợp (R,S)-1axetyl-1-phenylbutan khi tạo phức với Eu(hfc)3 đều đƣợc tách ra và có độ 12