Tài liệu Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biến sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------------------- HỒ VĂN HOÀN NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN BIỂN SINH KHÁNG SINH PHÂN LẬP TỪ CÁC VÙNG VEN BIỂN VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI – 2013 i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------------------- HỒ VĂN HOÀN NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN BIỂN SINH KHÁNG SINH PHÂN LẬP TỪ CÁC VÙNG VEN BIỂN VIỆT NAM Chuyên ngành: Mã số: Di truyền học 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Phƣơng Nhuệ HÀ NỘI – 2013 ii CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CKS Chất kháng sinh CW Cell wall DAP Diaminopienat DNA Deoxyribose nucleic axit ĐHSP Đại học sƣ phạm KHKT Khoa học kĩ thuật KTCC Khuẩn ti cơ chất KTKS Khuẩn ti khí sinh NXB Nhà xuất bản PG Peptidoglycan RNA Ribonucleoic axit TNTĐCNG Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gene VKK Vòng kháng khuẩn v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển Bảng 2.1. Các thiết bị chính sử dụng trong đề tài Bảng 3.1. Hoạt tính đối kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn Bảng 3.2. Mầu sắc của các chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng ISP khác nhau Bảng 3.3. Khả năng sử dụng nguồn nitơ của các chủng xạ khuẩn Bảng 3.4. Khả năng sử dụng nguồn cacbon của các chủng xạ khuẩn Bảng 3.5. Khả năng sinh trƣởng của xạ khuẩn ở nồng độ NaCl khác nhau Bảng 3.6. Khả năng sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau Bảng 3.7. Khả năng sinh trƣởng của xạ khuẩn ở điều kiện pH khác nhau Bảng 3.8. So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn NA113 với chủng xạ khuẩn S. scabies ISP 5058 Bảng 3.9. So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn NA115 với chủng chuẩn S. tendae ISP 5101 Bảng 3.10. Kết quả so sánh trình tự gene mã hóa 16S-rRNA của chủng NA113 với gene tƣơng ứng của các chủng vi khuẩn đƣợc đăng ký trên GenBank Bảng 3.11. Kết quả so sánh trình tự gene mã hóa 16S-rRNA của chủng NA115 với gene tƣơng ứng của các chủng vi khuẩn đƣợc đăng ký trên GenBank Bảng 3.12. Khả năng sinh chất kháng sinh trên các môi trƣờng lên men khác nhau của các chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon và nitơ đến hoạt tính kháng khuẩn của chủng NA113 và NA115 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của pH ban đầu và độ thoáng khí đến hoạt tính kháng sinh Bảng 3.15. Phổ hoạt tính kháng sinh của hai chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 vi DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Cấu trúc của Abyssomicin C và Trioxacacin Hình 1.2. Cấu trúc của Diazepinomicin Hình 1.3. Cấu trúc của deoxynyboquinone (1) và pseudonocardian A-C (2-4) Hình 3.1. Tỉ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc của chủng NA113 trên môi trƣờng ISP2, ISP3 Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc của chủng NA115 trên môi trƣờng ISP2, ISP3 Hình 3.5. Cuống sinh bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng NA113 Hình 3.6. Cuống sinh bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng NA115 Hình 3.7. Khả năng sinh trƣởng của chủng NA113 trên môi trƣờng có pH khác nhau Hình 3.8. Khả năng sinh trƣởng của chủng NA115 trên môi trƣờng có pH khác nhau Hình 3.9. Kết quả điện di DNA tổng số của hai chủng xạ khuẩn trên gel agarose 1% Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% Hình 3.11. Cây phân loại của chủng NA113 và một số chủng xạ khuẩn Hình 3.12. Cây phân loại của chủng NA115 và một số chủng xạ khuẩn vii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ iv CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ................................................. v DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................. vi DANH MỤC HÌNH VẼ .................................................................................. vii MỤC LỤC ...................................................................................................... viii MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3 1.1. Tổng quan về xạ khuẩn .......................................................................... 3 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên ............................................. 3 1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn .................................................... 3 1.1.3. Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn .................................................... 6 1.2. Phân loại xạ khuẩn ................................................................................. 7 1.2.1. Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy .............. 7 1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) ................................... 8 1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa .............................................................. 8 1.2.4. Phân loại số (Numerical Taxonomy) .............................................. 9 1.2.5. Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gene 16SrDNA ......................................................................................................... 9 1.3. Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển.................................................. 10 1.3.1. Nhóm chất kháng sinh polyketide ................................................. 10 1.3.2. Nhóm kháng sinh Non-ribosomal peptide..................................... 11 1.3.3. Nhóm kháng sinh phức hợp Polyketide-Nonribosomal peptide ... 12 1.3.4. Nhóm kháng sinh isoprenoid......................................................... 12 1.3.5. Các chất kháng sinh khác ............................................................. 13 1.4. Sự tạo thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn ........................................... 15 1.4.1. Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn ........................... 15 1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn ....................................................................................................... 16 1.5. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh ....................... 17 1.5.1. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh ở trong nước ......................................................................................................... 17 1.5.2. Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh trên thế giới ................................................................................................................. 18 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 21 2.1. Vật liệu và hóa chất dùng trong nghiên cứu ........................................ 21 2.1.1. Vật liệu .......................................................................................... 21 2.1.2. Hóa chất và thiết bị ....................................................................... 21 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu...................................................................... 22 viii 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu ................................................................... 22 2.2.2. Phương pháp xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong mẫu .......................................................................................................... 22 2.2.3. Tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh kháng sinh .............................. 23 2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn ........... 24 2.2.5. Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử ............ 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 29 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn biển sinh kháng sinh ..... 29 3.2. Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn ........................................ 32 3.2.1. Đặc điểm nuôi cấy......................................................................... 32 3.2.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................ 34 3.3. Đặc điểm sinh lí - sinh hóa................................................................... 35 3.3.1. Khả năng sử dụng nguồn nitơ ....................................................... 35 3.3.2. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon ............................................... 36 3.3.3. Khả năng chịu muối NaCl ............................................................. 38 3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng ...................... 38 3.3.5. Ảnh hưởng của độ pH ................................................................... 39 3.4. Kết quả phân loại chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 ........................ 40 3.4.1. Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lí-sinh hóa ............... 40 3.4.2. Phân loại các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử.............................................................................................................. 43 3.5.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men ........................................................... 48 3.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nguồn nitơ ............................... 49 3.5.3. Ảnh hưởng của pH môi trường và độ thoáng khí ......................... 51 3.6. Phổ hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu ............... 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 53 KẾT LUẬN ................................................................................................. 53 ĐỀ NGHỊ..................................................................................................... 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 54 PHỤ LỤC 1: VỊ TRÍ LẤY MẪU VÙNG VEN BIỂN ................................... 58 PHỤ LỤC 2: CÁC LOẠI MÔI TRƢỜNG DÙNG TRONG ĐỀ TÀI............ 59 PHỤ LỤC 3: VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH..................................................... 61 PHỤ LỤC 4: TRÌNH TỰ GENE MÃ HÓA 16S-rRNA................................. 62 ix MỞ ĐẦU Vùng biển Việt Nam có diện tích khoảng 1.000.000 km2 và 3.260 km bờ biển (không tính các đảo), với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, tạo cho nƣớc ta tính đa dạng về cảnh quan tự nhiên và nguồn lợi thuỷ sinh vật. Với mong muốn khám phá, khai thác và sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên phong phú của biển, nhiều nghiên cứu khoa học gần đây, nhất là công nghệ sản xuất sinh học đã chuyển dần từ khai thác sang tìm hiểu, ứng dụng và đƣa vào sản xuất nguồn nguyên liệu từ những vùng nƣớc ngập mặn, biển xa bờ, thậm chí cả đáy biển sâu để sinh trƣởng bền vững dựa trên cơ sở của các công nghệ mới. Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Xạ khuẩn đƣợc quan tâm và nghiên cứu nhiều do có khả năng sản xuất các sản phẩm trao đổi chất quan trọng. Trong số hơn 8000 chất kháng sinh hiện đã đƣợc biết trên thế giới thì có trên 80% có nguồn gốc từ xạ khuẩn chủ yếu là từ các chi Streptomyces và Micromonospora. Giai đoạn những năm 1980 trở về trƣớc các nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung vào khám phá các chủng xạ khuẩn trên mặt đất. Từ vài thập kỷ trở lại đây các nhà khoa học đã phát hiện ra các chủng xạ khuẩn biển có nhiều đặc tính quý nhƣ: khả năng sản xuất kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế các tế bào ung thƣ… có ý nghĩa ứng dụng trong y học [1]. Cùng với sự sinh trƣởng của công nghệ sinh học hiện đại, các nghiên cứu về ứng dụng xạ khuẩn biển đã thu đƣợc rất nhiều thành tựu to lớn trong sản xuất sinh khối, dƣợc phẩm… đƣợc sử dụng trong các ngành công nghiệp, y dƣợc học, nông nghiệp… Trong lĩnh vực y dƣợc, sản xuất chất kháng sinh có ý nghĩa lớn trong đời sống, góp phần đẩy lùi bệnh tật và nâng cao sức khỏe cộng đồng. Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh đã dẫn đến hiện tƣợng nhờn thuốc làm ảnh hƣởng đến kết quả điều trị bệnh. Việc tìm ra các chất kháng sinh mới có hoạt tính kháng khuẩn cao từ các nguồn khác nhau, đặc biệt từ biển, trở thành nhu cầu cấp thiết hiện nay. Bên cạnh đó, nghiên cứu phân loại các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh cũng rất 1 quan trọng, các nghiên cứu cơ bản này giúp định hƣớng sản xuất các sản phẩm hữu ích từ các chủng xạ khuẩn biển, góp phần đánh giá sự đa dạng của các vi sinh vật biển. Xuất phát từ những định hƣớng trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam”. Mục tiêu: Tuyển chọn và phân loại các chủng xạ khuẩn biển có khả năng tổng hợp kháng sinh cao định hƣớng ứng dụng trong y dƣợc. Nội dung nghiên cứu: - Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn sinh kháng sinh từ nƣớc, bùn ở các vùng biển Bắc, Trung, Nam. - Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn lựa chọn. - Phân loại chủng xạ khuẩn tuyển chọn theo phƣơng pháp giải trình tự gene 16S-rRNA - Nghiên cứu một số điều kiện thu nhận chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong phòng thí nghiệm. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về xạ khuẩn 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nƣớc, một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà các vi sinh vật khác không sinh trƣởng đƣợc. Số lƣợng xạ khuẩn trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật. Đất giàu dinh dƣỡng và lớp đất bề mặt thƣờng có số lƣợng lớn xạ khuẩn. Trong 1 gam đất canh tác có thể phân lập đƣợc 5 triệu mầm xạ khuẩn, đất hoang hóa chỉ có 10 – 100 nghìn mầm. Số lƣợng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm [7]. Xạ khuẩn cũng thƣờng sống hoại sinh trên xác các sinh vật (cây chết, rơm rạ) nhƣng cũng có thể kí sinh trên thân, củ hoặc rễ cây. Xạ khuẩn biển thƣờng đƣợc phân lập từ cát biển, đất ngập mặn, trầm tích biển ở các độ sâu khác nhau hoặc ở trên các sinh vật khác nhƣ san hô, rong biển. Trƣớc đó, ngƣời ta tin rằng xạ khuẩn biển có nguồn gốc từ trên cạn. Tuy nhiên, sau đó có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nhiều nhóm xạ khuẩn có nguồn gốc từ biển. Xạ khuẩn biển thƣờng có khả năng chịu mặn cao, đặc biệt có những chủng Streptomyces ssp. có thể sinh trƣởng đƣợc ở nồng độ NaCl 16% và nhiều loài thuộc chi Streptomyces và Nocardia sinh trƣởng tốt khi ở nồng độ NaCl 10%, Micromonospora sp. và Salinospora sp. cũng có khả năng chịu mặn cao [24, 25]. 1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn Ở trên môi trƣờng đặc, xạ khuẩn sinh trƣởng thành những khuẩn lạc khô, kích thƣớc khuẩn lạc thay đổi tùy từng loài và điều kiện ngoại cảnh. Khuẩn lạc xạ khuẩn không trơn, ƣớt nhƣ ở vi khuẩn, nấm men mà thƣờng có dạng thô ráp, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ. Do đó mới có tên gọi là xạ khuẩn (Actinomycetes, 3 tiếng Hy Lạp: Aktis là “tia”, mykes là “nấm”). Mặt khuẩn lạc xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo [4]. Khuẩn lạc xạ khuẩn thƣờng có 3 lớp: lớp vỏ ngoài là các sợi bện chặt, lớp trong tƣơng đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Màu sắc của khuẩn lạc rất đa dạng: đỏ, da cam, vàng, lam, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện dinh dƣỡng. Xạ khuẩn giống nấm mốc ở chỗ có thể tạo thành hệ sợi, nhƣng lại là cơ thể đơn bào, không có nhân thực và kích thƣớc giống vi khuẩn. Trên môi trƣờng đặc, hệ sợi của xạ khuẩn sinh trƣởng thành 2 hƣớng tạo thành khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh. Khuẩn ti cơ chất sinh trƣởng cắm sâu vào trong môi trƣờng với chức năng chủ yếu là lấy nƣớc và thức ăn. Khuẩn ti cơ chất sinh trƣởng một thời gian thì dài ra trong không khí tạo thành khuẩn ti khí sinh. Ngƣời ta gọi khuẩn ti khí sinh là khuẩn ti thứ cấp để phân biệt với khuẩn ti sơ cấp là loại khuẩn ti sinh trƣởng từ các loại bào tử nảy mầm [4]. Nhiều loại chỉ có khuẩn ti cơ chất mà không có khuẩn ti khí sinh, nhƣng cũng có loại nhƣ chi Sporichthya lại chỉ có khuẩn ti khí sinh. Khi đó khuẩn ti khí sinh vừa làm nhiệm vụ dinh dƣỡng vừa làm nhiệm vụ sinh sản. Khuẩn ti của xạ khuẩn thƣờng mảnh hơn của nấm mốc, đƣờng kính thay đổi trong khoảng 0,2 – 1 m đến 2 – 3 m. Đa số xạ khuẩn có khuẩn ti không có vách ngăn và không tự đứt đoạn. Sau một thời gian sinh trƣởng, ở đầu các khuẩn ti khí sinh thƣờng hình thành các sợi bào tử. Khuẩn ti không mang bào tử gọi chung là khuẩn ti dinh dƣỡng. Thành tế bào xạ khuẩn (CW) có dạng kết cấu lƣới dày khoảng 10 – 20 nm, có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ti và bảo vệ tế bào. Căn cứ vào kết cấu hóa học ngƣời ta chia thành tế bào thành 4 nhóm: - Nhóm CW I: có chứa L, L-DAP và glycin. Thuộc nhóm này có Streptomyces, Streptoverticillium, Sporichthya, Nocardioides. - Nhóm CW II: có chứa mezo-DAP và glycin. Thuộc nhóm này có Micromonospora, Actinoplanes, Ampullariella. - Nhóm CW III: có chứa mezo-DAP. Gồm các chi Dermatophilus, Geodermatophilus, Frankia, Actinomadura, 4 Nocardiopsis, Microbispora, Thermoactinomyces, Thermomonospora, Planomonospora, Planobispora, Streptosporangium, Actinosynnema. - Nhóm CW IV: có chứa mezo-DAP, arabionose và galactose. Gồm các chi Nocaridia, Oerskovia, Promicromonospora, Pseudonocardia, Rhodococcus, Mycobacterium, Saccharomonospora, Saccharopopyspora, Actinopolyspora [4]. Thành tế bào xạ khuẩn chủ yếu gồm 3 lớp: lớp ngoài dầy 60 – 120 Å, khi già có thể dầy tới 150 Å; lớp giữa rắn chắc dầy 50 Å và lớp trong dầy 50 Å. Thành tế bào cấu tạo chủ yếu từ các lớp glycopeptid gồm các gốc N-acetylglucozamin liên kết với N-acetymuramic bởi liên kết 1,4-glicozit. Khi xử lí bằng lysozym, các liên kết này bị phát vỡ, thành tế bào bị phá hủy và màng nguyên sinh chất bao bọc phần còn lại của tế bào tạo thành tế bào trần. Cấu trúc sợi cũng mất đi khi xử lí bằng hỗn hợp ether và chloroform và các dung môi hòa tan lipit. Điều đó chứng tỏ lớp ngoài thành tế bào xạ khuẩn có cấu tạo bằng lipit. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose hay chitin [7]. Đối với xạ khuẩn phân lập từ các vùng ngập mặn, chúng có thành tế bào dầy và độ bền cơ học cao, có thể chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trƣờng (nồng độ muối từ 3 - 4%, pH từ 6,8 – 8,5 và nhiệt độ dao động từ 20 – 35oC). Thành tế bào của xạ khuẩn chịu kiềm ngoài peptidoglycan còn có chứa nhiều axit polyme nhƣ axit galacturonic, axit glutamic, axit aspartic và axit phosphoric. Với điện tích âm của các thành phần axit không thuộc peptidoglycan, bề mặt thành tế bào có thể hấp thụ các ion Na+, H+ trong khi đẩy các ion OH-. Bên cạnh đó, tuy cấu trúc lớp peptidoglycan là giống nhau ở xạ khuẩn trung tính và chịu kiềm nhƣng lại khác nhau về thành phần hợp chất cấu thành, xạ khuẩn ƣa kiềm chứa nhiều hesoamin và axit amin [20]. Màng sinh chất của xạ khuẩn dầy khoảng 7,5 – 10 nm gồm thành phần chủ yếu là phospholipit và protein, chúng có cấu trúc và chức năng tƣơng tự nhƣ màng sinh chất của vi khuẩn. Trên màng có nhiều enzym có vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển các chất qua màng [4]. 5 Thể trung gian hay mesosome nằm ở phía trong của màng sinh chất và có hình phiến, hình bọng hay hình ống. Tác dụng của thể trung gian là làm tăng diện tích tiếp xúc của màng tế bào và từ đó làm tăng cƣờng hoạt tính của enzyme, tăng chuyển điện tử…[4]. Các thể ẩn nhập trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm các hạt polyphosphat (hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Soudan III) và polysaccarit (bắt màu với dung dịch Lugol) [4]. Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dƣơng, đặc biệt khác với những vi sinh vật nhân sơ khác là tỉ lệ G – C cao (>70%) trong khi đó ở vi khuẩn là 25 – 45%. Một trong những đặc điểm đáng lƣu ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững về di truyền và thƣờng xảy ra sự đột biến trong phân tử DNA. Điều này tạo ra tính đa dạng về hình thái, tính kháng thuốc do sự xuất hiện các dị vòng. Hơn nữa, sự tự nhân lên của các đoạn DNA còn làm phức tạp thêm việc nghiên cứu di truyền ở xạ khuẩn [7]. 1.1.3. Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn Một trong những đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn là dựa vào hình thái và kích thƣớc của cuống sinh bào tử. Sợi bào tử có thể có nhiều hình dạng khác nhau tùy theo loài: thẳng-lƣợn sóng (Retiflexibilis), xoắn (Spirales) hoặc có móc, vòng (Retinaculiaperti)… có loại mọc vòng đơn cấp, có loại mọc vòng hai cấp. Một số xạ khuẩn có sinh nang bào tử, bên trong có chứa các bào tử nang. Bề mặt của bào tử có thể nhẵn (smooth), gai (spiny), tóc (hairy), xù xì (warty), nếp nhăn (rugose)… tùy thuộc vào loài xạ khuẩn [4, 5, 13]. Bào tử xạ khuẩn đƣợc hình thành theo 3 phƣơng thức sau đây: - Phƣơng thức sinh trƣởng toàn bộ: toàn bộ hay một bộ phận của khuẩn ti hình thành ra thành bào tử. - Phƣơng thức sinh trƣởng trong thành: thành bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa màng nguyên sinh chất và thành khuẩn ti. Trƣờng hợp này gặp ở Planomonospora. 6 - Phƣơng thức sinh trƣởng bào tử nội sinh thật: thành khuẩn ti không tham gia vào quá trình hình thành bào tử. Trƣờng hợp này gặp ở Thermoactinomycetes [4]. Muốn kích thích sự hình thành bào tử trƣớc hết phải kích thích hình thành khuẩn ti khí sinh. Nhiều tài liệu đã đề cập đến mối quan hệ giữa sự hình thành bào tử và môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng trong nuôi cấy xạ khuẩn. Một số tác giả còn cho rằng việc bổ sung CaCO3 và CaCl2 vào môi trƣờng cũng kích thích sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn. Tuy nhiên, việc bổ sung các nguyên tố vào môi trƣờng phải đƣợc nghiên cứu kĩ và chỉ sử dụng ở nồng độ nhất định. Nếu môi trƣờng giàu dinh dƣỡng thì quá trình hình thành bào tử thƣờng sẽ bị kìm hãm. Độ ẩm và nhiệt độ cũng ảnh hƣởng đến sự hình thành bào tử [7]. 1.2. Phân loại xạ khuẩn 1.2.1. Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy Trong phân loại ngƣời ta thƣờng chia xạ khuẩn thành 4 nhóm chính dựa trên các dấu hiệu hình thái: - Các nhóm xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt. Đặc trƣng của nhóm này là sinh sản bằng bào tử và phân hóa thành KTKS và KTCC. - Nhóm xạ khuẩn có bào tử nang. Đặc trƣng của nhóm này là khuẩn ti phân chia theo hƣớng vuông góc với nhau, tạo ra cấu trúc tƣơng tự nang bào tử. - Nhóm xạ khuẩn dạng Nocardia: sinh sản bằng cách phân đốt khuẩn ti. - Nhóm xạ khuẩn dạng tƣơng tự Corynebacter và dạng cầu: tế bào có hình chữ V, T hoặc dạng cầu, thông thƣờng không có khuẩn ti. Trƣớc kia, nhiều loại xạ khuẩn đƣợc phân chia tùy theo sự khác nhau về đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy nhƣ màu của KTCC, KTKS, sắc tố tan; sự có mặt của KTCC, hình dạng và kết cấu mặt bào tử; đặc điểm cuống sinh bào tử và sự phân đốt của khuẩn ti. Tuy nhiên, ngày nay chỉ tiêu này chỉ là bổ sung cho việc nghiên cứu phân loại bằng sinh lí, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử [7, 36]. 7 1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) Đặc điểm hóa phân loại đƣợc sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong một vài thập kỉ trƣớc và ngày nay vẫn còn là cơ sở quan trọng trong phân loại xạ khuẩn. Đây là phƣơng pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lƣợng thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật. Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau: - Typ thành tế bào: Dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần peptid và đƣờng trong thành tế bào hay các polysaccarid gắn vào thành tế bào. - Typ peptidoglycan (PG): dựa trên các thông tin về thành phần và cấu trúc của mạch tetrapeptid của PG, của cầu nối peptid và cách liên kết giữa các mắt xích của PG. - Axit mycolic: là các phần tử có mạch dài hay phân nhánh thuộc chi Nocardia, Rhodococcus, Mycobacterium và Corynebacter. Đây là đặc điểm phân loại cơ bản của các chi đó. - Axit béo: thƣờng đƣợc sử dụng trong phân loại là các axit béo bão hòa mạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso- và enteiso- đƣợc methyl hóa ở phân tử cacbon thứ 10. Sự có mặt của axit 10-methyloctadecanoid là đặc điểm phân loại đến chi. - Menaquinon: Xạ khuẩn giống vi khuẩn Gram dƣơng và khác vi khuẩn Gram âm ở chỗ tổng hợp menaquinon và dimethylmenaquinon, không tổng hợp ubiquinon. Phần lớn các chi xạ khuẩn có thành phần menaquinon xác định. - Photpholipid: có 5 typ photpholipid (PI, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc trƣng và có ý nghĩa trong phân loại xạ khuẩn [7]. 1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Khi phân loại xạ khuẩn ngƣời ta thƣờng sử dụng các đặc điểm sinh lý, sinh hóa cũng nhƣ khả năng đồng hóa các nguồn cacbon, nguồn nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trƣởng. Ngoài ra còn các chỉ tiêu khác cũng đƣợc xác định nhƣ pH, nhiệt độ, khả năng chịu muối, tính chất đối kháng và mẫn cảm với chất kháng sinh, 8 khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất khác đặc trƣng của xạ khuẩn. Tuy nhiên, do xạ khuẩn thƣờng xuất hiện nhiều biến dị nên các đặc điểm sinh lý, sinh hóa thƣờng có giá trị thấp về mặt phân loại. Nhƣng để phát hiện loài mới ngƣời ta thƣờng sử dụng các đặc điểm này dựa trên phân loại số [7, 34]. 1.2.4. Phân loại số (Numerical Taxonomy) Phân loại số đƣợc Williams và cs, (1983) sử dụng để phân loại chi Streptomyces và các chi có quan hệ gần gũi. Phƣơng pháp này dựa trên sự đánh giá về số lƣợng, mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một số lớn các đặc điểm, chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Để so sánh các chủng với nhau từng đôi một, Sneath (1973) đề nghị tính hệ số giống nhau S (Similarity) theo phƣơng trình sau: %S  N S x100 NS  Nd Ns: Tổng số các đặc điểm dƣơng tính (giống nhau) của 2 chủng so sánh. Nd: Tổng số các đặc điểm (khác nhau) dƣơng tính của chủng này và âm tính của chủng kia. Kết quả phân tích đƣợc biểu diễn bằng sơ đồ nhánh mà trên đó các chủng tùy theo mức độ giống nhau đƣợc nhóm thành từng cụm (Cluster). Bằng phân loại số ngƣời ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces thành 21 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện nhất định [7, 27, 31]. 1.2.5. Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gene 16S-rDNA Từ cuối thế kỷ XX, đặc biệt là những năm 80 trở lại đây, với sự sinh trƣởng mạnh mẽ của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã có một công cụ mới để phân loại sinh vật đó là phân loại học phân tử. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là thời gian ngắn và có độ chính xác cao. Phân loại học phân tử có thể dựa trên các gene, hoặc các sản phẩm của gene. Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay, thƣờng sử dụng 3 phƣơng pháp chính đó là lai DNA, lai RNA và phân tích trình tự gene mã hóa 16S-rRNA. 9 Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA là phƣơng pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại, vì rRNA có mặt trong tất cả các sinh vật, có chức năng xác định và có tính bảo thủ cao. Chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm sinh vật. Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này ngƣời ta có thể đánh giá đƣợc mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng vi sinh vật. Trong tế bào vi sinh vật nhân sơ, ribosome tồn tại trong tế bào chất. Ribosome có cấu trúc gồm 2 tiểu phần, mỗi tiểu phần gồm có rRNA và protein riêng rẽ. Ribosome vi sinh vật nhân sơ có hằng số lắng 70S gồm 2 tiểu đơn vị 50S (gồm rRNA 5S, rRNA 23S và 31 phân tử protein) và 30S (gồm rRNA 16S và 21 phân tử protein) [6]. Các gene mã hóa 5S-rRNA, 16S-rRNA và 23S-rRNA nằm cạnh nhau, có cùng một operon và có cơ chế điều hòa chung. Trong các loại rRNA, thì 16S-rRNA là phù hợp nhất cho nghiên cứu phân loại xạ khuẩn, vì gene mã hóa 16S-rRNA có kích thƣớc khoảng 1540 bp phù hợp cho các nghiên cứu phân loại; còn gene mã hóa 5S-rRNA có kích thƣớc khoảng 120 bp, dễ xác định trình tự nhƣng lại không đặc hiệu cho phân loại; còn gene mã hóa 23S-rRNA cũng là một gene tiềm năng cho phân tích so sánh trình tự để phân loại sinh vật nhân sơ nhƣng trình tự của gene này tƣơng đối lớn 2900 bp, gây khó khăn cho tách dòng và phân tích trình tự nên ít đƣợc sử dụng hơn [16]. Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tƣơng đồng giữa hai trình tự 16S-rRNA là 98,6% thì xác suất để mức độ giống trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99%. Vì thế giá trị tƣơng đồng 98,6% của trình tự 16S-rRNA đƣợc coi là ngƣỡng để phân biệt hai loài khác nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98% [21]. 1.3. Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển 1.3.1. Nhóm chất kháng sinh polyketide Polyketide là một họ các chất chuyển hóa bậc hai đƣợc hình thành bởi sự xúc tác của enzyme polyketide synthase (PKSs). Khung cacbon của polyketide đƣợc khử và biến đổi bởi những domain khác nhau trong PKSs cùng với các enzyme 10 ketoreductase, dehydratase và enoylreductase. Có 3 loại PKSs khác nhau đã đƣợc biết cho đến ngày nay: PKSs loại I là những enzyme đa chức năng. PKSs loại II là phức hợp của nhiều enzyme, cùng tạo nên cấu trúc của chuỗi polyketide và PKSs loại III [14, 24]. Hình 1.1. Cấu trúc của Abyssomicin C và Trioxacacin [14, 24] Abyssomicin C là kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn biển Verrucosispora sp. Abyssomicin C có khả năng kháng lại các vi khuẩn G+, bao gồm cả những vi khuẩn gây bệnh đã kháng vancomycin nhƣ Staphylococcus aureus [14, 22]. Daryamide là polyketide gây độc cho tế bào đƣợc phân lập từ dịch nuôi cấy của xạ khuẩn Streptomyces sp. chủng CNQ-085. Chất này có khả năng gây độc cho tế bào ung thƣ biểu mô ở ngƣời, dòng HCT-116 và có khả năng kháng nấm C. albicans [14, 17]. Trioxacarcin lần đầu tiên đƣợc phân lập vào năm 1981 từ S. bottropensis DO-45. Chúng có khả năng chống lại các tế bào ung thƣ khác nhau, có hoạt tính kháng vi khuẩn G- và G+ và kháng trùng sốt rét. Trioxacarcin A có khả năng tạo liên kết cộng hóa trị với đoạn DNA sợi kép d(AACCGGTT) [14]. 1.3.2. Nhóm kháng sinh Non-ribosomal peptide Proximicin là kháng sinh đƣợc tạo ra bởi xạ khuẩn Verrucosispora sp. MG37 và V. maris AB-18-032 chúng đƣợc phân lập từ các mẫu trầm tích dƣới độ sâu 11 250m ở Raune Fjord, Na-uy và ở biển Nhật Bản ở độ sâu 289 m. Proximicin (A, B, C) có khả năng kìm hãm sự sinh trƣởng của tế bào ung thƣ biểu mô dạ dày và ung thƣ biểu mô gan [14]. Mechercharmycin đƣợc sản xuất bởi xạ khuẩn Thermoactinomyces sp. YM3251; đƣợc phân lập từ bùn ở Macherchar nƣớc cộng hòa Palau (bắc Thái bình dƣơng). Mechercharmycin A có khả năng gây độc cho tế bào ung thƣ tuyến biểu mô phổi dòng A549 và tế bào ung thƣ bạch cầu [14]. 1.3.3. Nhóm kháng sinh phức hợp Polyketide-Nonribosomal peptide Salinosporamide A (NPI-0052) là kháng sinh mới có cấu trúc β-lactone-γlactam (C15H20O4NCl) tách từ dịch lên men của xạ khuẩn biển Salinispora tropica đƣợc phân lập từ các mẫu trầm tích biển ở độ sâu 1m tại biển Chab Cay, Bahamas. NPI-0025 là chất ức chế proteasome 20S gây ra hiện tƣợng appoptosis trong tế bào u tủy và kháng lại tế bào ung thƣ ruột kết. NPI-0025 đã đƣợc thử nghiệm lâm sàng bởi hãng dƣợc phẩm Nereus Pharmaceuticals vào năm 2006 và có tiềm năng là một chất kháng ung thƣ có giá trị trong tƣơng lai [14, 22, 26]. Lajollamycin là kháng sinh đƣợc tạo thành từ xạ khuẩn S. nodosus chủng NPS007994 phân lập từ các mẫu trầm tích biển ở Scripps Canyon, La Jolla, California. Lajollamycin có khả năng kìm hãm sự sinh trƣởng của tế bào u melanin dòng B16-F10 ở chuột; ngoài ra chất này còn đƣợc Manam và cộng sự (2005) xác định là có khả năng tiêu diệt nhiều tế bào vi khuẩn [14]. 1.3.4. Nhóm kháng sinh isoprenoid Altemicidin là kháng sinh có bộ khung vòng đơn terpen-alkaloid, đƣợc hình thành từ xạ khuẩn biển S. sioyaensis chủng SA1758 đƣợc phân lập từ mẫu bùn ở Gamo, Miyagi Prefecture, Nhật Bản. Chất này có khả năng kìm hãm sự sinh trƣởng của tế bào ung thƣ bạch cầu Lympho L1210 và ung thƣ biểu mô dòng IMC [14]. Marinone có cấu trúc một vòng rƣỡi terpen. Marinone và nhiều chất có hoạt tính khác đƣợc tạo ra từ xạ khuẩn chủng CNH099 phân lập từ độ sâu 1 m ở 12 Batiquitos Lagoon, Bắc San Diego, Califorlia. Những chất này có khả năng gây độc tế bào ung thƣ ruột kết ở ngƣời dòng HCT116 trong điều kiện in vitro [14]. Glaciapyrrole (A, B, C) là kháng sinh đƣợc hình thành từ xạ khuẩn Streptomyces sp. chủng NPS008187. Nhóm kháng sinh này đã đƣợc Macherla (2005) tìm ra có khả năng kháng khuẩn [17]. 1.3.5. Các chất kháng sinh khác Diazepinomicin (ECO-4601) đƣợc phát hiện vào năm 2004 bởi Charan và cộng sự. ECO-4601 có nguồn gốc từ Micromonospora sp., có hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm và kháng tế bào ung thƣ. ECO-4601 có phổ kháng rộng chống lại tế bào u vú, u thần kinh đệm và u tiền liệt tuyến. Đã đƣợc thử nghiệm lâm sàng tại Canada vào năm 2006 [18, 22]. Hình 1.2. Cấu trúc của Diazepinomicin [22] Chandrananimycin đƣợc hình thành từ xạ khuẩn Actinomadura sp. chủng M048 đƣợc phân lập từ vịnh Giao Châu, Trung Quốc. Chandrananimycin có khả năng chống lại tế bào khối u ruột kết, u melanin, u phổi, u vú, u tuyến tiền liệt và u tuyến thận. Ngoài ra chất kháng sinh này còn có khả năng kháng khuẩn và nấm [14]. Helquinoline (C12H15O3N) là kháng sinh hình thành từ Janibacter limosus. Chất kháng sinh này có khả năng kháng Bacillus subtilis, S. virdochromogenes Tu57 và Staphylococcus aureus [17, 22]. Bảng 1.1. Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển [14, 18, 22, 24] Nhóm Chất kháng sinh Abyssomicin Marinomycin Xạ khuẩn Hoạt tính Verrucosispora sp. Kháng khuẩn Marinispora sp. Kháng khuẩn, kháng ung CNQ140 thƣ 13