Tài liệu Nghiên cứu phân loại nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Đinh Đức Hiền NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI NẤM MEN MONILIELLA PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Đinh Đức Hiền NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI NẤM MEN MONILIELLA PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Vũ Nguyên Thành PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà `Lời cảm ơn Lời cảm ơn Hà Nội – 2014 Lời cảm ơn Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Vũ Nguyên Thành và PGS. TS Bùi Thị Việt Hà - những người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, tạo mọi điều kiện giúp em thực hiện luận văn này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp - Viện Công nghiệp Thực phẩm đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện, hỗ trợ kỹ thuật, chia sẻ tài liệu và kinh nghiệm nghiên cứu. Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian sinh viên và học viên cao học. Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân bạn bè những người luôn động viên, khích lệ em trên con đường học tập, và nghiên cứu khoa học. Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2014 Học viên Đinh Đức Hiền DANH MỤC HÌNH Hình 1. Hình thái tế bào đặc trƣng của Phaeococcus catenatus CBS 650. 76. Hình 2. Hình ảnh tế bào Exophiala salmonis CBS 157.67. Hình 3. Hình ảnh tế bào Aureobasidium pullulans. Hình 4. Hình ảnh tế bào Moniliella suaveolens CBS 120.63 (trái) và Moniliella acetoabuten CBS 169.66 (phải). Hình 5. Cây phả hệ mô tả mối quan hệ giữa các loài thuộc chi Moniliella. Hình 6. Hình ảnh tế bào của Geotrichum candidum (trái) và Trichosporon beigelii (phải). Hình 7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu phát hiện. Candida albicans và Candida dubliniensis. Hình 8. Một số mẫu hoa phân lập đƣợc Moniliella. Hình 9. Vị trí các địa điểm thu thập mẫu phân lập Moniliella tại Việt Nam. Hình 10. Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào một số chủng nấm men Moniliella phân lập đƣợc. Hình 11. Phổ fingerprinting của 126 chủng Moniliella phân lập đƣợc. Hình 12. Vị trí các chủng đại diện phân lập đƣợc thuộc chi Moniliella. Hình 13. Phổ PCR fingerprinting với mồi (GAC)5 của các chủng Moniliella carnis và Moniliella dehoogii. Hình 14. Phổ PCR fingerprinting với mồi (GAC)5 của các chủng Moniliella byzovii. Hình 15. Tế bào sinh dƣỡng của Moniliella carnis (KFP 246T) sinh trƣởng trên môi trƣờng YM ở 25C sau 5 ngày (trái) và trên môi trƣờng tinh bột ngô Dalmau agar sau 7 ngày (phải). Hình 16. Tế bào sinh dƣỡng của Moniliella dehoogii KFP 211T sinh trƣởng trong YM ở 25C sau 5 ngày (trái) trên môi trƣờng Dalmau tinh bột ngô sau 7 ngày (phải). Hình 17. Tế bào sinh dƣỡng của chủng TBY 2041.7T sinh trƣởng trên môi trƣờng Dalmau tinh bột ngô sau 5 ngày. Hình 18. Sự hình thành Chlamydospore ở chủng TBY 2041.7T sinh trƣởng trên môi trƣờng Yeast Cacbon Base agar không có nguồn nito. Hình 19. Hình thái khuẩn lạc của Moniliella byzovii TBY 2041.7T (trái) và TBY 2041.8 (phải) trên môi trƣờng Malt-Glucoseagar sau 45 ngày nuôi cấy ở 28C. Hình 20. Hình thái khuẩn lạc của M. dehoogii KFP 211T và TBY 2041.5 trên môi trƣờng Malt glucose 2°Bx sau 10 ngày nuôi cấy ở 28°C DANH MỤC BẢNG Bảng 1. So sánh đặc điểm của chi Moniliella và một số chi khác. Bảng 2. Phƣơng pháp trộn lẫn tế bào các chủng trong cùng 1 loài để phát hiện pha sinh sản hữu tính. Bảng 3. Các chủng nấm men đen Moniliella phân lập đƣợc. Bảng 4. Ký hiệu các chủng trong PCR fingerprinting. Bảng 5. Kết quả phân nhóm các chủng bằng fingerprinting. Bảng 6. Danh sách chủng Moniliella trong mô tả loài mới. Bảng 7. Danh sách các chủng thuộc 2 nhóm M. byzovii. Bảng 8. Sự khác nhau những đặc tính quan trọng giữa M. carnis, M. dehoogii, M. byzovii và những loài đã biết thuộc chi Moniliella. Bảng 9. Phân lập Moniliella tại Việt Nam và trên thế giới DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CBS – Centraalbureau voor Schimmelcultures (Bảo tàng giống Vi sinh vật Hà Lan) h – hour (giờ) NRRL-Northern Regional Research Laboratory (hiện là National Center For Agricultural Utilization Research) (Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ) DGGE-Denaturing gradient gel electrophoresis rDNA-Ribosomal DNA rRNA-Ribosomal RNA PCR – Polymerase Chain Reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi) RFLP-Restriction Fragment Length Polymorphism (đánh giá đa hình DNA theo phƣơng pháp cắt hạn chế) T – Type strain (chủng chuẩn) MỤC LỤC MỞ ĐẦU .............................................................................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN ......................................................................................................................... 2 1.1. NHÓM NấM MEN ĐEN ......................................................................................................... 2 Một số chi nấm men đen ...................................................................................................... 2 1.1.1. Chi Phaeococcomyces ............................................................................................... 2 1.1.2. Chi Exophiala ............................................................................................................ 3 1.1.3. Chi Aureobasidium .................................................................................................... 3 1.1.4. Chi Moniliella ............................................................................................................ 4 1.2. MộT Số PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOạI NấM MEN ...................................................................... 10 1.2.1. Các phương pháp phân loại truyền thống ............................................................... 10 1.2.2. Các phương pháp hóa phân loại và sinh học phân tử............................................. 12 1.3. MộT Số PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIệN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DạNG VI SINH VậT ............................. 14 CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 18 2.1. ĐốI TƢợNG ....................................................................................................................... 18 2.2. HÓA CHấT, DụNG Cụ, TRANG THIếT Bị MÁY MÓC ............................................................... 18 2.2.1. Hóa chất .................................................................................................................. 18 2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc ........................................................................ 19 2.3. THÀNH PHầN MÔI TRƢờNG Sử DụNG TRONG NGHIÊN CứU .................................................. 19 2.3.1. Môi trường làm giàu có nồng độ đường cao ........................................................... 19 2.3.2. Môi trường Malt-Glucose 2Bx có axit lactic 1‰ .................................................. 19 2.3.3. Môi trường Malt-Glucose 2Bx không có axit lactic .............................................. 20 2.3.4. Môi trường thử khả năng chuyển hóa các nguồn cacbon khác nhau ...................... 20 2.3.5. Môi trường thử khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau .............................. 20 2.3.6. Thử khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường và muối cao .......... 21 2.3.7. Môi trường xác định khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau. 2.3.8. Môi trường thử khả năng hình thành tinh bột ......................................................... 22 2.3.9. Môi trường đánh giá hoạt tính phân giải urea ........................................................ 22 2.3.10. Môi trường đánh giá khả năng sinh trưởng khi có mặt Cycloheximide ................ 23 2.3.11. Môi trường đánh giá khả năng chống chịu acid acetic 1 % ................................. 23 2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CứU ............................................................................................. 24 2.4.1. Phương pháp phân lập ............................................................................................ 24 2.4.3. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào ....................................................................... 25 2.4.4. Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm men ....................................................... 25 2.4.5. Phương pháp tinh chế DNA..................................................................................... 25 2.4.6. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting ........................................... 26 2.4.7. Phương pháp điện di ............................................................................................... 26 2.4.8. Nhuộn gel và đọc kết quả ........................................................................................ 27 2.4.9. Phương pháp phân loại nấm men dựa vào đọc trình tự rDNA ............................... 27 2.4.10. Đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau.......................................... 28 2.4.11. Đánh giá khả năng đồng hóa các nguồn nito khác nhau. ....................................... 28 2.4.12. Đánh giá khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường và nồng độ muối cao. ........................................................................................................................... 29 2.4.13. Đánh giá khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau ................ 29 2.4.14. Thử khả năng hình thành tinh bột ........................................................................... 29 2.4.15. Thử khả năng phân giải urea.................................................................................. 29 2.4.16. Thử khả năng chống chịu với cycloheximit ............................................................. 30 CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................................................. 32 3.1. KếT QUả PHÂN LậP ............................................................................................................ 32 3.2. QUAN SÁT HÌNH THÁI KHUẩN LạC, Tế BÀO ........................................................................ 36 3.3. PHÂN NHÓM BằNG Kỹ THUậT FINGERPRINTING ................................................................. 37 3.5. MÔ Tả CÁC NHÓM LOÀI MớI THUộC CHI MONILIELLA ........................................................ 44 3.5.1. Phân tích đặc tính di truyền của 3 loài mới ............................................................ 46 3.5.2. Đặc tính kiểu hình, sinh lý, sinh hóa của 3 loài mới ............................................... 48 3.6. Sự ĐA DạNG MONILIELLA PHÂN LậP TạI VIệT NAM ............................................................ 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................................................... 60 CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .................................................................... 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................................... 63 PHỤ LỤC Luận văn thạc sĩ MỞ ĐẦU Chi Moniliella đƣợc thiết lập bởi bởi Stolk và Dakin năm 1966 để xác lập vị trí phân loại cho 2 loài mới tìm đƣợc khi đó là Moniliella acetoabutens và Moniliella tomentosa. Năm 2009, căn cứ vào sự tƣơng đồng nhất định về di truyền cũng nhƣ một số đặc tính sinh lý, sinh hóa quan trọng, Rosa và cộng sự đã xếp một chi khác là Trichosporonoides vào Moniliella. Nhƣ vậy, trƣớc khi nghiên cứu của chúng tôi đƣợc thực hiện, chi Moniliella bao gồm 9 loài, đó là Moniliella acetoabutens, M. fonsecae, M. megachiliensis, M. mellis, M. nigrescens, M. oedocephalis, M. pollinis, M. spathulata và M. suaveolens. Phân loại của Moniliella thực sự vẫn chƣa rõ ràng. Trình tự gần nhất của Moniliella fonsecae trong Genbank là Phylloporia pectinata, một thành viên của Agaricomycotina. Với những trình tự khác, Moniliella thuộc Ustilagionomycotina. Hơn nữa, sự khác biệt về mặt di truyền giữa các loài thuộc chi Moniliella lại rất lớn, có thể tới 15-16% trong đoạn D1/D2. Do vậy việc tìm kiếm những loài trung gian giữa các loài đã biết sẽ góp phần làm sáng tỏ phân loại của Moniliella. Moniliella đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất erythriltol, một loại đƣờng chức năng có giá trị thƣơng mại cao. Gần đây, Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã phát hiện một số đặc tính công nghệ ít hoặc chƣa đƣợc biết tới của Moniliella nhƣ khả năng chuyển hóa thầu dầu thành γ-declactone (tinh dầu đào) với độ tinh khiết cao, khả năng sinh lipase, khả năng sinh một loại kháng sinh (zymocin) mới. Các nội dung nghiên cứu trong bản luận văn này đƣợc thực hiện nhằm đánh giá đa dạng nấm men Moniliella tại Việt Nam, góp phần củng cố hệ thống phân loại của chi và tạo cơ sở cho nghiên cứu công nghệ có sử dụng Moniliella, cụ thể những nội dung nghiên cứu bao gồm: - Phân lập nấm men Moniliella từ các nguồn mẫu khác nhau tại các địa điểm khác nhau ở Việt Nam. - Phân nhóm, phân loại Moniliella phân lập đƣợc bằng hình thái; PCR fingerprinting; giải trình tự DNA; phân tích cây phả hệ. - Phân tích sự đa dạng nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam về số loài, phân bố. K20 – Vi sinh vật học 1 Đinh Đức Hiền Luận văn thạc sĩ Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1.1. Nhóm nấm men đen Nấm men đen đƣợc phát hiện từ khoảng đầu thế kỷ 20 nhƣng khi đó ngƣời ta mới chỉ biết đến một vài chi trong số chúng. Nấm men đen sinh sản vô tính là chủ yếu, bằng nảy chổi, tạo sợi hay mô phân sinh. Điều tạo nên sự khác biệt giữa chúng và các nhóm nấm men khác là chúng có melanin trong thành tế bào làm cho khuẩn lạc có thể có màu vàng lục, màu ô liu đến nâu sẫm, đen. Ngoài ra, nấm men đen còn chứa carotenoid và mycosporines. Một trong các lý do khiến những hiểu biết về nấm men đen kém xa so với các vi sinh vật khác có lẽ là do sự sinh trƣởng chậm, khả năng cạnh tranh thấp với loài khác nên dễ bị bỏ qua trong các nghiên cứu, thêm nữa cấu trúc bào tử đính của chúng lại ít đặc điểm phân biệt, trong khi hiện tƣợng đa hình thái của cùng một chủng lại khá phổ biến và gây khó khăn trong quá trình phân loại [9]. Một số chi nấm men đen 1.1.1. Chi Phaeococcomyces Gồm 3 loài đã đƣợc công nhận là: P. exophialae, P. Catenatus, P.nigricans Đặc điểm hình thái: Khuẩn lạc sinh trƣởng chậm, nhầy, bề mặt có nhiều nếp nhăn, màu đen. Tế bào dạng hình cầu đến elip. Bào tử đính chuyển từ không màu sang nâu đậm hoặc đen [5, 7]. Hình 1. Hình thái tế bào đặc trƣng của Phaeococcus catenatus CBS 650. 76. (nguồn www.mycobank.org) K20 – Vi sinh vật học 2 Đinh Đức Hiền Luận văn thạc sĩ 1.1.2. Chi Exophiala Đƣợc mô tả đầu tiên vào năm 1966 bởi Carmichael với loài mới Exophiala salmonis [5]. Đến nay chi này gồm 28 loài: E. castellanii, E. jeanselmei, E. moniliae, E. pisciphila, E. salmonis, E. spinifera. E. jeanselmei.... Exophiala phân bố nhiều trong đất, nƣớc, thực vật, gỗ mục,..... và là nguyên nhân gây nhiều bệnh ở ngƣời. Exophiala có đặc điểm hình thái và sinh lý rất đa dạng, hình thái cơ bản có thể tóm tắt nhƣ sau: Chiếm ƣu thế trong môi trƣờng nuôi cấy là tế bào là dạng phân đốt, thon dần về phía ngọn, một vài đốt hợp với nhau ở bên trong, mỗi đốt là một tế bào, đôi khi gồm hai tế bào. Khi còn trẻ, các tế bào có dạng hình cầu, sinh sản bằng nảy chồi giống nhƣ nấm men thông thƣờng, xếp thành chuỗi dài. Sau một thời gian nuôi cấy, bắt đầu hình thành các vách ngăn bên trong sợi nấm, tạo thành đốt. Các đốt này có hình trụ, mọc kiểu tia và đặc trƣng bởi các eo thắt hẹp. Sau đó, từ các đốt sinh ra các bào tử hình elip kích thƣớc 1-3  3-6 μm. Các bào tử này thƣờng gồm một tế bào, tập trung ở đỉnh của đốt hay trên cuống bào tử đính [5, 7]. Hình 2. Hình ảnh tế bào của Exophiala salmonis CBS 157.67 (Nguồn www.cbs.knaw.nl) 1.1.3. Chi Aureobasidium Các loài thuộc Aureobasidium có phổ phân bố tƣơng đối rộng và đƣợc tìm thấy trong đất, xác thực vật, lá cây. Aureobasidium gồm 14 loài trong đó A. pullulans đƣợc biết đến nhiều nhất. Về mặt hình thái, Aureobasidium tạo khuẩn lạc lúc đầu màu trắng, sau chuyển sang màu sẫm hoặc đen. Đƣờng kính sợi nấm từ 2-10 μm. K20 – Vi sinh vật học 3 Đinh Đức Hiền Luận văn thạc sĩ Không phát hiện thấy cuống bào tử đính. Aureobasidium sinh sản vô tính với bào tử đơn bào, kích thƣớc 2-3  4-6 µm, không màu, hình bầu dục đến hình trụ, tập trung thành từng đám. Các bào tử này sau đó tiếp tục sinh sản bằng nảy chồi hoặc hình thành túi bào tử thứ cấp [7]. Hình 3. Hình ảnh tế bào chủng Aureobasidium pullulans (Nguồn www.mycobank.org) 1.1.4. Chi Moniliella Sau khi chi Moniliella đƣợc thiết lập bởi Stolk & Dakin (1966) cho hai loài mới là M. acetoabutens và M. tomemtosa. Tiếp theo hai loài Moniliella suaveolens và Moniliella mellis, đã đƣợc miêu tả bởi von Arx (1972) và Rao & de Hoog (1975), đến năm 1984, de Hoog miêu tả một loài mới là M. pollinis. Chi Trichosporonoides đƣợc coi là tƣơng tự nhƣ chi Moniliella, khác biệt chủ yếu bởi kích thƣớc khuẩn lạc và tế bào nhỏ hơn [8]. Trong các nghiên cứu sau đó, cho thấy hai chi này tƣơng đồng với nhau [8]. Năm 2009, Rosa và cộng sự đã xác định các giả thuyết này bằng so sánh trình tự vùng D1/D2 của rDNA 26S và đi đến kết luận Moniliella và Trichosporonoides đƣợc xếp vào cùng một chi, loài M. pollinis có trình tự vùng D1/D2 giống với Trichosporonoide madida, chỉ khác nhau bởi tỉ lệ G+C tƣơng ứng là 50.4 và 50.2, do đó hai loài này thống nhất tên là M. pollinis. M. pollinis đƣợc mô tả khác với M. tomemtosa về hình thái và mức độ chuyển hóa tạo erythritol, nhƣng về trình tự D1/D2 cho thấy chúng tƣơng đồng nhau. Nhƣ vậy cho đến trƣớc nghiên cứu này chi Moniliella gồm 9 loài nhƣ sau [24]. K20 – Vi sinh vật học 4 Đinh Đức Hiền Luận văn thạc sĩ Moniliella acetoabutens Stolk & Dakin (1966) Moniliella fonsecae Rosa, Jindamorakot, Limtong, Nakase, Lachance, FidalgoJiménez, Daniel, Pagnocca, Inácio & Morais (2008) Moniliella megachiliensis (Inglis & Sigler) Rosa & Lachance (2008) Moniliella mellis (Fabian & Quinet) V. Rao & de Hoog (1975) Moniliella nigrescens (Hocking & Pitt) Rosa & Lachance (2008) Moniliella oedocephalis (Haskins & Spencer) Rosa & Lachance (2008) Moniliella pollinis (Hennebert & Verachtert) de Hoog & Guého (1984) Moniliella spathulata (de Hoog) Rosa & Lachance (2008) Moniliella suaveolens (Lindner) von Arx (1972) Phần lớn các loài thuộc chi Moniliella phân lập đƣợc thƣờng phân bố ở những nơi có nhiều dầu mỡ hoặc nơi có nồng độ đƣờng cao nhƣ phấn hoa, mật ong…Ví dụ, M. acetoabutens cho tới nay chỉ gặp trên các mẫu thực phẩm lên men có độ chua cao nhƣ xốt hoa quả, dƣa muối, M. mellis từ mật ong, M. nigrescens từ jam, marmalade hỏng, M. spathulata từ sữa trâu, M. suaveolens từ sữa, bơ, phomat … M. fonsecae phân lập từ hoa Angelonia pilosella, M. megachiliensis phân lập từ côn trùng, M. oedocephalis từ mật ong, M. pollinis từ phấn hoa. Về mặt hình thái học, những loài thuộc chi Moniliella có khuẩn lạc màu hơi xám đến đen oliu, sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi và hình thành sợi nấm và bào tử đốt. Ngoại trừ M. fonsecae, những loài thuộc chi Moniliella mang những đặc tính đặc biệt trong số những nấm đảm (Basidiomycetous) với khả năng chịu áp suất thẩm thấu và lên men. Moniliella có những đặc trƣng về cấu trúc nhƣ thành tế bào gồm nhiều lớp và thiếu xylose, fucose. Vách tế bào có các cấu trúc lỗ, vách ngăn (dolispores) với các kênh hẹp [20]. Moniliella phản ứng dƣơng tính với Diazonium blue. Tất cả các loài có khả năng đồng hóa nitrat và sản sinh urease. Ubiquinone isoprenologue chính đƣợc xác định trong Moniliella là Co-Q9. Sự phân nhánh các loài của chi Moniliella đƣợc nghiên cứu bởi phân tích trình tự vùng D1/D2 của gen LSU rRNA, mức độ sai khác về mặt di truyền giữa các loài là cao. Trong đoạn D1/D2 của gen LSU rRNA, các loài có thể sai khác nhau đến K20 – Vi sinh vật học 5 Đinh Đức Hiền Luận văn thạc sĩ 15% thậm chí là hơn [22]. Di truyền không đồng nhất trong chi cũng đƣợc thể hiện qua hơn 16% sai khác về tỷ lệ G+C trong DNA [4]. Mặc dù các loài thuộc chi Moniliella biểu hiện một số hóa phân loại và siêu cấu trúc giống những loài thuộc ngành Ustilaginomycotina, thế nhƣng việc sắp xếp vào bậc phân loại cao hơn là không đảm bảo bởi phân tích D1/D2 LSU rRNA hoặc các đoạn gen rRNA khác [22]. Một sự hiểu biết rõ ràng hơn về sự tiến hóa của chi sẽ đƣợc xác định dựa trên việc phát hiện ra nhiều loài mới để lấp vào các khoảng trống giữa các đơn vị phân loại đã đƣợc thiết lập. Thêm nữa, nghiên cứu về chi Moniliella ngày càng đƣợc thúc đẩy do những đặc tính trong sinh trƣởng của chúng nhƣ ƣa lipit, chịu áp suất thẩm thấu, điều này hứa hẹn triển vọng cho các quá trình công nghệ sinh học. Thực tế, những loài thuộc chi Moniliella đang đƣợc dùng trong sản xuất erythritol thƣơng mại [23]. Hình 4. Hình ảnh tế bào Moniliella suaveolens CBS 120.63 (trái) và Moniliella acetoabuten CBS 169.66 (phải). (Nguồn www.mycobank.org) K20 – Vi sinh vật học 6 Đinh Đức Hiền Luận văn thạc sĩ Hình 5. Cây phả hệ mô tả mối quan hệ giữa các loài thuộc chi Moniliella. Phylloporia pectinata đƣợc sử dụng nhƣ nhóm ngoài. Mã số GenBank của trình tự rDNA đƣợc đƣa ra sau tên loài. Thanh chèn tƣơng ứng 5% khác biệt trình tự. Bảng 1. So sánh đặc điểm hình thái của chi Moniliella với một số chi thƣờng gặp có thể bị nhầm lẫn với Moniliella. Chi Đặc điểm Phân bố Moniliella Khuẩn lạc mịn, sau đó bông xù, thƣờng từ màu trắng rồi chuyển dần sang màu vàng xanh, xám, đen. Sinh sản bằng phƣơng thức này chồi hoặc phân đốt. Thành tế bào dày, có sắc tố đen. Phân bố ở những nơi có nhiều dầu mỡ hoặc những nơi có áp suất thẩm thấu cao nhƣ mật ong, phấn hoa. Geotrichum Khuẩn lạc màu trắng, bột hoặc lông xù giống Moniliella nhƣng khuẩn lạc không chuyển Phân bố trong đất, nƣớc sang màu xám đen. Chỉ sinh sản bằng phân và không khí. đốt, không nảy chồi. Tế bào to và dài, khoảng xấp xỉ 10µm. Trichosporon Khuẩn lạc màu kem, ƣớt hoặc khô, có hoặc không bông xù. Tế bào bé, mỏng. Sinh sản bằng nảy chồi hoặc phân đốt. Kích thƣớc từ 5-10µm. K20 – Vi sinh vật học 7 Phân bố trong đất hoặc nơi nhiều dầu mỡ. Đinh Đức Hiền Luận văn thạc sĩ Candida Tế bào hình tròn hay elip. Sinh sản vô tính theo kiểu nảy chồi Khuẩn lạc lúc đầu màu trắng, sau chuyển sang màu sẫm hoặc đen. Đƣờng kính sợi nấm Aureobasidium từ 2-10 μm. Sinh sản theo phƣơng thức nảy chồi. Phân bố nhiều trong tự nhiên, thƣờng ở những nơi có nồng độ đƣờng cao nhƣ mật mía, một số chi xuất hiện ở những nơi nhiều dầu mỡ nhƣ C. sake, C. haemulonii. Phân bố trong đất, xác thực vật, lá cây. Hình 6. Hình ảnh tế bào của Geotrichum candidum.(trái) và Trichosporon beigelii (phải) Từ khía cạnh công nghệ, nấm men Moniliella có nhiều ƣu điểm nhƣ khả năng sinh sản nhanh trong điều kiện hiếu khí, vi hiếu khí, phát triển dạng đơn bào trong môi trƣờng lỏng, phù hợp với công nghệ lên men chìm phổ biến hiện nay. Moniliella còn có khả năng phát triển trong điều kiện áp suất thẩm thấu cao tƣơng đƣơng với nồng độ glucose 60%. Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong sản xuất thƣơng mại khi cần nâng cao nồng độ cơ chất và sản phẩm. Tính ƣa áp suất thẩm thấu cũng góp phần giảm tạp nhiễm trong quá trình lên men. So với các nấm men khác cũng nhƣ vi khuẩn, tế bào nấm men Moniliella có kích thƣớc khá lớn thuận lợi cho công nghệ thu hồi sản phẩm (lọc, ly tâm). Ngoài ra, trên môi trƣờng cơ chất rắn, Moniliella có thể phát triển ở dạng sợi và thích hợp với công nghệ sản xuất lên men bề mặt [8]. Moniliella đƣợc quan tâm nhiều tới khả năng chuyển hóa glucose thành erythritol. Erythritol là loại đƣờng chứa 4 nguyên tử cacbon và có một số đặc tính quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, dƣợc phẩm nhƣ hàm lƣợng calo thấp K20 – Vi sinh vật học 8 Đinh Đức Hiền Luận văn thạc sĩ (1/10 so với sucrose), mát lạnh khi tan, độ ngọt dịu tƣơng đƣơng 70-80% sucrose, không gây sâu răng, và có ƣu điểm hơn so với các loại đƣờng chức năng khác nhƣ xylitol, maltitol vì không gây khó chịu cho đƣờng tiêu hóa (Munro và cộng sự, 1998). Trên quy mô công nghiệp, erythritol đƣợc sản xuất bởi hai phƣơng pháp khác nhau là: phƣơng pháp Misubishi/Nikken (phƣơng pháp M/N) và phƣơng pháp Cerestar (phƣơng pháp C). Đây thực chất là quá trình lên men nhờ vi sinh vật, trong đó, phƣơng pháp M/N sử dụng chủng nấm men Moniliella megachiliensis còn phƣơng pháp C lại sử dụng chủng Moniliella pollilis. Moniliella suaveolens còn đƣợc biết đến với khả năng chuyển hóa sinh γ-decalactone khi sử dụng bánh ép dầu (oil press cakes) nhƣ một cơ chất tạo ra tới 180 mg γ-decalactone trên 1 kg chất khô khi chƣa tối ƣu [13]. Tại Việt Nam, gần đây trong hoạt động bảo tồn gen Vi sinh vật công nghiệp, trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã phát hiện Moniliella có khả năng sinh zymocin, một loại kháng sinh kháng nấm men. Zymocin có thể đƣợc ứng dụng hiệu quả trong công nghiệp để bảo vệ các quá trình lên men khỏi sự xâm nhiễm và phá hoại của các loài nấm men hoang dại, trong bảo quản nƣớc hoa quả. Zymocin đồng thời cũng hứa hẹn nhiều khả năng đƣợc ứng dụng nhƣ một chất kháng sinh chống nấm trong y học. Ngoài ra, nhiều chủng Moniliella còn có khả năng sinh lipase, một enzyme đƣợc ứng dụng phổ biến trong công nghiệp tẩy rửa và công nghiệp thực phẩm… Hiện nay, Viện Công nghiệp Thực phẩm đang tiến hành thực hiện đề tài cấp Nhà nƣớc “Nghiên cứu công nghệ sản xuất đƣờng chức năng erythritol từ tinh bột” thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020, sử dụng nấm men Moniliella. Một trong những mục tiêu đƣợc đặt ra trong luận văn là đánh giá đa dạng nấm men Moniliella tại Việt Nam và cung cấp một số lƣợng lớn chủng giống phong phú về mặt di truyền, đáp ứng các yêu cầu của nội dung sàng lọc trong đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nƣớc. K20 – Vi sinh vật học 9 Đinh Đức Hiền Luận văn thạc sĩ 1.2. Một số phƣơng pháp phân loại nấm men Hệ thống phân loại của nấm men hiện nay gồm có 14 lớp, 5 phân lớp, 15 họ, 95 chi và khoảng 1500 loài [18]. Hệ thống phân loại nấm men đƣợc xây dựng dựa trên các sự tƣơng đồng và khác biệt giữa các taxa theo các đánh giá phân loại truyền thống với cơ sở là đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại hiện đại với cơ sở là thông tin di truyền. 1.2.1. Các phương pháp phân loại truyền thống Phƣơng pháp phân loại truyền thống dựa vào các đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa để phân loại nấm men [1, 18]. Dựa vào đặc điểm hình thái tế bào nấm men: nấm men là cơ thể đơn bào nhƣng rất đa dạng về hình thái tế bào. Thông thƣờng tế bào nấm men có hình elip, hình cầu, một số có hình kéo dài dạng que, đôi khi có hình quả chanh....Vì vậy, dựa vào sự khác nhau về hình thái ta có thể sơ bộ phân loại các giống nấm men khác nhau. Dựa vào đặc điểm nuôi cấy: Quan sát sự thay đổi của môi trƣờng lỏng trong quá trình nuôi cấy để phân loại nhƣ: độ đục, độ tạo váng, bọt khí... Nếu nuôi trên môi trƣờng thạch thì đánh giá bằng hình thái, kích thƣớc, màu sắc (trắng, kem, đục,...) và bề mặt khuẩn lạc (nhẵn, xù xì, lồi, lõm,...) Dựa vào đặc điểm sinh sản:  Sự nảy chồi: Quan sát số lƣợng chồi, vị trí nảy chồi, sự sắp xếp chồi trên tế bào mẹ, chồi có tách ra khỏi tế bào mẹ hay không nhằm phân biệt các chủng khác nhau.  Khả năng sinh bào tử: Sử dụng môi trƣờng tạo bào tử, theo dõi thời gian sinh bào tử, hình dạng, số lƣợng bào tử trong nang, hình dạng nang, khả năng phá vỡ nang. Dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa: sử dụng các kiểm tra về sinh lý sinh hóa nhƣ: khả năng lên men đƣờng, khả năng đồng hóa đƣờng và các hợp chất nitơ, khả năng tạo màng, khả năng tạo sắc tố, khả năng tiết một số enzym ngoại bào quan trọng (amylase, protease, lipase, kitinase, xenlulolase, cazeinase), khả năng tiết axit K20 – Vi sinh vật học 10 Đinh Đức Hiền