Tài liệu Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen ssiv mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột​

Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ---------------------- NGUYỄN MẬU HƢNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN SSIV MÃ HÓA ENZYME STARCH SYNTHASE TĂNG CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 1 http://www.lrc.tnu.edu.vn BỘThạc GIÁO Luận văn sỹ DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ Mậu Hưng Nguyễn CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ---------------------- LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN SSIV MÃ HÓA ENZYME STARCH SYNTHASE TĂNG CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT Chuyên ngành: Mã số: Sinh học thực nghiệm 60420114 Học viện: Hƣớng dẫn khoa học: Nguyễn Mậu Hƣng TS. Phạm Bích Ngọc Hà Nội - 2016 LỜI CAM ĐOAN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 2 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận văn này hoàn toàn được hoàn thiện bằng quá trình nghiên c ứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS . Phạm Bích Ngọc cùng v ới cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Các số liệu hình ảnh, kết quả được trình bày, trong luận văn này là trung thực, không sao chép bất cứ tài liệu, công trình nghiên cứu của người khác mà không chỉ rõ nguồn tham khảo. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước hội đồng khoa học. Hà Nội, tháng 1 năm 2016 Học viên Nguyễn Mậu Hƣng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 3 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình để tôi hoàn thành luận văn này: TS. Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng Công nghệ Tế bào Thực vật Viện Công nghệ Sinh học, đã hướng dẫn và hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài. PGS.TS. Chu Hoàng Hà - Viện trưởng Viện công nghệ sinh học, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã chỉ bảo tận tình về chuyên môn, luôn theo sát thí nghiệm của tôi để có những lời khuyên bổ ích và kịp thời. ThS. Lê Thu Ngọc, CN. Nguyễn Khắc Hưng, CN. Phạm Thanh Tùng đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập vừa qua. Bằng tình cảm chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn ở bên, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này. Hà Nội, tháng 1 năm 2016 Học viên Nguyễn Mậu Hưng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 4 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng MỤC LỤC MỞ ĐẦU ..................................................................................................................................................... 11 1. Đặt vấn đề ....................................................................................................................................... 11 2. Mục đích nghiên cứu ....................................................................................................................... 12 3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................................................... 12 4. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................................................. 13 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................................................... 14 1.1. Tổng quan về tinh bột và sinh tổng hợp tinh bột ............................................................................. 14 1.1.1. Giới thiệu về tinh bột ....................................................................................................................... 14 1.1.2. Cấu trúc của tinh bột........................................................................................................................ 15 1.1.3. SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT ........................................................................................................ 16 1.1.4. HÌNH DẠNG TINH BỘT ............................................................................................................... 17 1.1.5. Các loại hạt tinh bột hay gặp ........................................................................................................... 17 1.1.6. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan ........................................................................ 18 1.1.7. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến quá trình trao đổi tinh bột. ..................... 21 1.2. Cây sắn và tình hình sản xuất cây sắn trên thế giới và Việt Nam .................................................... 22 1.3. Rễ tơ và ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất protein tái tổ hợp ............................................ 26 1.4 Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – phƣơng pháp tạo rễ tơ ở tế bào thực vật ................. 28 1.5 Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật ............................................................... 29 1.6 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ................................................................................................................... 30 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 32 2.1. Vật liệu , hóa chất và thiết bị ........................................................................................................... 32 2.1.1 Thực vật .......................................................................................................................................... 32 2.1.2 Chủng khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng ..................................................................................... 32 2.1.3 Hóa chất .......................................................................................................................................... 33 2.1.4. Thiết bị ............................................................................................................................................ 33 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................................................. 34 2.2. Phƣơng pháp thu thập mẫu, phân lập, xác định trình tự gen SSIV ............................................. 34 2.2.1. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140 ........................................................................ 34 2.2.2. Phản ứng RT-PCR ........................................................................................................................... 34 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 5 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng 2.2.3. Tách dòng sản phẩm bằng vector pENTR™/D-TOPO ................................................................... 36 2.2.4. Kiểm tra các khuẩn lạc bằng phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc ......................................................... 37 2.2.5. Tách chiết plasmid ........................................................................................................................... 38 2.2.6. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu đƣợc với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank. ....... 39 2.2.7. Thiết kế vector pK7GWIWG2(II) mang đoạn gen SSIV bằng kỹ thuật Gateway. .................... 39 2.2.8. Phƣơng pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở khoai lang nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ...... 42 2.2.9. Phƣơng pháp đánh giá mô chuyển gen trên môi trƣờng chọn lọc ............................................... 43 2.2.10. Phƣơng pháp xử lí số liệu .............................................................................................................. 43 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................................. 44 3.1. Phân lập, giải trình tự gen SSIV mã hóa cho enzyme Starch Synthase ở sắn .................................. 44 3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140. ....................................................................... 44 3.1.2. Thiết kế mồi đặc hiệu nhân gen SSIV của sắn và tổng hợp cDNA............................................. 44 3.1.3. Phân lập, tách dòng, giải trình tự gen SSIV của sắn .................................................................... 45 3.2. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV và tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes tƣơng ứng ................................................................................................................................. 46 3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV bằng kỹ thuật Gateway ............................. 46 3.2.2. Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc vector chuyển gen đã thiết kế ......................... 47 3.3. Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ khoai lang mang gen SSIV ............................................................... 48 3.5. Phân tích các dòng rễ tơ khoai lang chuyển gen SSIV bằng kỹ thuật PCR ..................................... 50 3.6. Phân tích cây chuyển gen SSIV bằng kỹ thuật RT-PCR ............................................................. 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................................................................... 55 KẾT LUẬN: ................................................................................................................................................ 55 ĐỀ NGHỊ:.................................................................................................................................................... 55 Tài Liệu Tham Khảo .................................................................................................................................. 56 Phụ Lục: ........................................................................................................................................................ 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 6 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cấu trúc phân tử của amylopectin và amylose .................................. 15 Hình 2. Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzyme liên quan ................ 19 Hình 3. Cây Sắn .............................................................................................. 23 Hình 4. Sản lƣợng sắn theo châu lục, năm 2006-2011Error! Bookmark not defined. Hình 5. Tỷ lệ sản lƣợng sắn các nƣớc trên thế giới, 2012Error! Bookmark not defined. Hình 6. Vector pK7GWG2D ........................................................................... 40 Hình 7. RNA tổng số tách chiết từ củ giống sắn KM140 ............................... 44 Hình 8. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen SSIV từ cDNA sắn 45 Hình 9. Colony-PCR chọn lọc các dòng khuẩn mang vector pENTR/SSIV.. 46 Hình 10. Kết quả colony-PCR sử dụng mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F/R và kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pK7WG2D/SSIV bằng EcoRI. ......................................... 47 Hình 11. Kết quả điện di colony-PCR các dòng khuẩn lạc ......................... 48 Hình 12. Hình ảnh các mảnh lá và thân mẫu khoai lang in vitro trên môi trƣờng đồng nuôi cấy sau 2 ngày lây nhiễm A.rhizogenes ............................ 49 Hình 13. Hình ảnh các mảnh lá và thân mẫu khoai lang in vitro bắt đầu ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc sau khi chuyển gen 30 ngày ................................... 49 Hình 14. Kết quả tách chiết DNA tổng số một số rễ tơ .................................. 50 Hình 15. Sản phẩm PCR nhân gen SSIV từ DNA tổng số tách chiết từ một số dòng rễ tơ chuyển gen và không chuyển gen .................................................. 51 Hình 16. Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen actin trong các dòng rễ tơ chuyển gen M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 15: sản phẩm RT-PCR các cây chuyển gen ................................................................. 52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 7 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng Hình 17. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen ......................................................................................................................... 52 DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Diện tích, năng suất và sản lƣợng sắn của thế giới từ năm 2000-2012 ......................................................................... Error! Bookmark not defined. Bảng 2. Trình tự các cặp mồi sử dụng ............................................................ 32 Bảng 3. Kích thƣớc các phân đoạn thu đƣợc khi cắt plasmid tái tổ hợp pK7GWG2D/SSIV bằng EcoRI ...................................................................... 41 Bảng 4: Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ mang cấu trúc gen tăng cƣờng tổng hợp tinh bột SSIV ở cây khoai lang ....................................................................... 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 8 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU STT KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT 1 A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens 2 DNA Acid Deoxiribonucleic 3 BA 6-benzyl adenine 4 bp Base pair 5 cDNA Complementary DNA 6 E.coli Escherichia coli 7 EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid 8 Etal Đồng tác giả 9 EtBr Ethidium Bromid 10 GFP Green Fluorescent Protein 11 HSPs Heat shock proteins 12 Hyg Hygromycine resistant 13 LB Luria Bertani 14 M Thang Marker chuẩn 15 mRNA RNA thông tin 16 MT Môi trường 17 MS Murashige and Skoog, 1962 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 9 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng 18 MT-sHSP Mitochondrial small Heat shock protein 19 MUG 4-methyl-umBelliferyl-β -D-glucoronide 20 µl Micro litte 21 µM Micromolar 22 NAA 1-Naphthaleneacetic acid 23 PCR Polymerase Chain Reaction 24 RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction 25 RAPD Random Amplified Polymorphic DNA 26 SOD Superoxide dismutase 27 SSIV Starch synthase IV 28 T-DNA Transfer-DNA 29 TAE Tris-acetate –EDTA 30 Ti-plasmid Tumor-Inducing Plasmid 31 TP Transit peptide 32 Vir Virulence 33 WT Dòng không chuyển gen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 10 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Tinh bột là nguồn carbohydrate dự trữ chính của cây trồng, là hợp chất cao phân tử có hàm lƣợng lớn trong tự nhiên và có ý nghĩa quan trọng đối với đời sống nhân loại. Tinh bột là chất rắn không hoà tan, có cấu trúc dạng polymer đƣợc tạo ra các monomer là glucose. Tùy thuộc vào dạng liên kết của các phân tử glucose mà tạo thành dạng mạch thẳng amylose, hoặc dạng mạch nhánh amylopectin. Tinh bột đƣợc tích lũy chủ yếu ở cơ quan củ của thực vật: củ sắn, củ khoai tây, củ khoai lang, củ rong giềng … Tinh bột có vai trò quan trọng trong đời sống, đây là nguồn cung cấp cacbonhydrat hay năng lƣợng chính cho con ngƣời. Ngoài ra, tinh bột còn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp nhƣ thực phẩm, dƣợc. Trung bình trên thế giới sử dụng tới 60 triệu tấn tinh bột hàng năm bao gồm bột mỳ, bột ngô, bột khoai tây, bột gạo, bột sắn, bột khoai lang. Hầu hết tinh bột đƣợc sử dụng cho các ngành công nghiệp chế biến nhƣ: sử dụng làm chất nền cho quá trình lên men của vi sinh vật (chủ yếu cho sản xuất mỳ chính), công nghiệp dệt vải sợi, công nghiệp giấy và nhiều ngành công nghiệp khác. Hàm lƣợng tinh bột, kích thƣớc hạt tinh bột và hàm lƣợng amylose là những tính chất quan trọng của tinh bột có ảnh hƣởng nhiều đến các sản phẩm trong các ngành công nghiệp thực phẩm (mì sợi, bánh bì và bánh cookies) và phi thực phẩm (dệt, giấy, và dƣợc phẩm). Các tính chất này quyết định độ nở của bột mì và tinh bột lúa mì, đó là các chỉ số quan trọng liên quan đến các sản phẩm thực phẩm giàu tinh bột nhƣ mì sợi và mì ăn liền (McCormick et al., 1991; Konik et al., 1993; Sasaki & Matsuki 1998; Dennett et al., 2009; Salman et al., 2009). Đặc tính tinh bột chịu ảnh hƣởng của gen cũng nhƣ môi trƣờng tăng trƣởng (Rharrabti et al., 2001; Kindred et al., 2008; Weightman et al., 2008). Sự hiểu biến đổi của tính chất tinh bột đƣợc quyết định bởi hai yếu tố là giống và điều kiện môi trƣờng xung quanh. Cùng một điều kiện, tính chất tinh bột có thể thay đổi ở các giống khác nhau. Tƣơng tự, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 11 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng cùng một giống trồng ở môi trƣờng khác nhau tính chất tinh bột cũng thay đổi, từ đó sẽ gây khó khăn cho các nhà dinh dƣỡng và nhà chế biến thực phẩm trong việc dự đoán thành phần hóa học và quá trình chế biến. Các nghiên cứu về chọn lọc các giống cho hàm lƣợng tốt đã và đang đƣợc đẩy mạnh nghiên cứu. Tuy nhiên, hầu hết chỉ dừng lại ở mức độ chọn lọc giống cho chất lƣợng tinh bột tốt và ổn định. Các nghiên cứu sâu hơn về hoạt động của gen liên quan đến các giống tại Việt Nam đang còn ít và chƣa cụ thể. Xuất phát từ thực tiễn đó, cùng với sự phát triển công nghệ và các nghiên cứu lâu năm của Phòng Công nghệ tế bào thực vật, nhóm nghiên cứu tiến hành tập trung đánh giá cụ thể hoạt động của gen Starch Synthase IV. Đây là một trong 5 gen quyết định lớn đến sinh tổng hợp và cấu trúc của tinh bột. Để có đƣợc Starch Synthase IV cũng nhƣ đánh giá gen này chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột”. 2. Mục đích nghiên cứu Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase, đồng thời bƣớc đầu đánh giá hoạt động của gen này đến khả năng tăng cƣờng sinh tổng hợp tinh bột ở các dòng rễ tơ khoai lang. Mục tiêu cụ thể: - Phân lập và thiết kế vector mang gen SSIV phục vụ cho mục đich chuyển gen vào cây khoai lang. - Tối ƣu hóa đƣợc quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogenes và tạo đƣợc các dòng rễ tơ. - Bƣớc đầu đánh giá khả năng hoạt động của gen trong các dòng rễ tơ khoai lang ở mức độ phiên mã 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu phân lập gen SSIV từ giống sắn KM140. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 12 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ - Nguyễn Mậu Hưng Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D mang gen SSIV bằng kỹ thuật Gateway. - Tạo chủng Agrobacterium rhizogenes mang cấu trúc vector pK7WG2D/SSIV. - Tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen và đánh giá hoạt động của gen SSIV trong các dòng rễ tơ khoai lang ở mức độ phiên mã. 4. Ý nghĩa khoa học Làm cơ sở cho việc đánh giá hoạt động của các gen chức năng liên quan đến sinh tổng hợp tinh bột ở các cây lƣơng thực tại Việt Nam. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 13 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về tinh bột và sinh tổng hợp tinh bột 1.1.1. Giới thiệu về tinh bột Tinh bột là một glucan không tan, đƣợc cấu thành từ hai chuỗi polymer (amylopectin và amylase) đƣợc cấu thành từ các tiểu phần là glucose. Ở thực vật bậc cao, tinh bột đƣợc tổng hợp trong plastid (thể lạp) của cả tế bào quang hợp và không quang hợp. Là carbohydrate dự trữ chủ yếu, tinh bột đóng vai trò quan trọng trong suốt chu kỳ sống của thực vật. Trong lá, một phần nhỏ carbon đồng hóa thông qua quang hợp đƣợc giữ lại trong các lục lạp ở dạng tinh bột chứ không đƣợc chuyển đổi thành sucrose để vận chuyển đến các bộ phận khác. Dạng tinh bột tạm thời này sẽ đƣợc phân hủy vào ban đêm để cung cấp cơ chất cho quá trình hô hấp ở lá và tiếp tục tổng hợp sucrose cho việc phát triển khác của cây(McMaugh et al. 2014) . Tinh bột, công thức hóa học: (C6H10O5)n) là một polysacarit carbohydrate chứa hỗn hợp amyloza và amylopectin, tỷ lệ phần trăm amilose và amilopectin thay đổi tùy thuộc vào từng loại tinh bột, tỷ lệ này thƣờng từ 20:80 đến 30:70. Tinh bột có nguồn gốc từ các loại cây khác nhau có tính chất vật lí và thành phần hóa học khác nhau. Chúng đều là các polymer carbohydrat phức tạp của glucose (công thức phân tử là C6H12O6). Tinh bột đƣợc thực vật tạo ra trong tự nhiên trong các quả, củ nhƣ: ngũ cốc. Tinh bột, cùng với protein và chất béo là một thành phần quan trọng bậc nhất trong chế độ dinh dƣỡng của loài ngƣời cũng nhƣ nhiều loài động vật khác. Ngoài sử dụng làm thực phẩm ra, tinh bột còn đƣợc dùng trong công nghiệp sản xuất giấy, rƣợu, băng bó xƣơng. Tinh bột đƣợc tách ra từ hạt nhƣ ngô và lúa mì, từ rễ và củ nhƣ sắn, khoai tây, dong là những loại tinh bột chính dùng trong công nghiệp (Evans et al. 2000). Tinh bột lƣu trữ đƣợc tái sử dụng để hỗ trợ giai đoạn phát triển khác của cây. Các bộ phận thu hoạch của cây trồng chủ lực của loài ngƣời phần lớn là cơ quan lƣu trữ tinh bột ở thực vật. Có thể kể đến nhóm hạt ngũ cốc (gạo, ngô, lúa mì, lúa mạch, lúa miến…) là nhóm quan trọng nhất, tiếp theo là các loại củ than Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 14 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng (khoai tây, khoai lang, khoai mỡ) và rễ củ (sắn, khoai môn), và hạt cây họ đậu. Hầu hết tinh bột của cây trồng đều dùng trực tiếp làm thực phẩm hoặc thức ăn cho chăn nuôi. Tuy nhiên nhu cầu dùng tinh bột cho công nghiệp đang ngày một tăng lên. Đặc biệt tinh bột đang là nguồn vật liệu chủ yếu cho thế hệ nguyên liệu sinh học đầu tiên do đặc tính dễ lên men. Cấu trúc phân tử amylopectin Cấu trúc phân tử amylose Hình 1. Cấu trúc phân tử của amylopectin và amylose 1.1.2. Cấu trúc của tinh bột Tinh bột đƣợc cấu tạo bởi 2 loại polysaccharid đƣợc gọi là amylose và amylopectin. Amylose: phân tử amylose là một chuỗi hiện nay đƣợc biết đến hàng nghìn đơn vị β-D-glucose nối với nhau theo dây nối (1→ 4). Quan niệm trƣớc đây cho rằng chỉ có từ 200-400 đơn vị vì do quá trình chiết xuất và phân tích, mạch bị đứt. Phân tử amylose đa số là các chuỗi thẳng rất ít phân nhánh. Amylopectin: amylopectin có phân tử lƣợng lớn hơn khoảng 106-107 gồm 5000-50.000 đơn vị glucose và phân nhánh nhiều. Các đơn vị α-D-glucose trong mạch cũng nối với nhau theo dây nối (1→ 4) còn chỗ phân nhánh thì theo dây nối (1→ 6). Để xét mức độ phân nhánh, ngƣời ta methyl hóa toàn bộ các nhóm OH của amylopectin rồi sau đó thủy phân và suy ra từ lƣợng 2, 3 dimethylglucose. Lƣợng 2, 3, 4, 6 tetramethylglucose ứng với những đơn vị tận cùng của mạch còn lƣợng 2, 3, 6 trimethylglucose ứng với những đơn vị glucose trong mạch (Evans et al. 2000). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 15 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng Ngoài ra còn có thể xác định lƣợng glucose cuối mạch dựa vào tính khử của amylopectin không methyl hóa. Chú ý rằng ở đây là glucose ở cuối mạch có OH bán acetal tự do. Mạch bên trong (mạch giữa 2 điểm phân nhánh) của amylopectin có khoảng 5-9 đơn vị glucose, những mạch bên ngoài có từ 10-18 đơn vị. Trong các loại tinh bột, trung bình tỉ lệ amylose là 25% còn amylopectin là 75%. Tuy nhiên ngƣời ta cũng tạo ra đƣợc những chủng có nhiều amylose, ví dụ ngô, có tinh bột chứa 75% amylose. Amylose cho với thuốc thử iod màu xanh đậm có cực đại phổ hấp thu khoảng 660nm, còn amylopectin thì có màu tím đỏ và cực đại hấp thụ khoảng 540nm. Màu tạo thành giữa tinh bột và iod đƣợc giải thích do sự hấp phụ. Ngƣời ta cho rằng iod bị hấp phụ vào phía trong hình xoắn ốc. Ứng với một vòng xoắn ốc thì có 1 phân tử iod. Những phân tử chƣa đủ 6 đơn vị glucose thì không phản ứng với iod(Mason-Gamer, Weil, and Kellogg 1998). 1.1.3. SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT Khi thủy phân tinh bột bằng acid thì sản phẩm cuối cùng là glucose C6H12O6 (C6H10O5)n + nH2O -> (1+n) (C6H12O6) Sự thủy phân qua các chặng: dextrin, erythrodextrin, achrodextrin, maltose, glucose. Amylose dễ bị thủy phân hơn amylopectin vì dây nối (1-> 4) dễ bị cắt hơn là dây nối (1-> 6). Thủy phân bằng enzym Enzym amylase. Có 2 loại chính: a-amylase và β-amylase. Enzym a phổ biến trong cây, nhiều nhất là các hạt ngũ cốc nẩy mầm, ngoài ra còn có trong nấm mốc, nƣớc bọt, dịch tụy. a-amylase chịu đƣợc nhiệt độ đến 70o, ở nhiệt độ này thì các enzym khác mất hoạt tính. Enzymβ-amylase có trong khoai lang, đậu nành và một số hạt ngũ cốc, chịu đƣợc nhiệt độ đến 50onhƣng chịu đƣợc môi trƣờng acid cao hơn so với enzym a (pH = 3,3). Trong thực tế ngƣời ta dựa vào ảnh hƣởng khác nhau đó về độ pH và nhiệt độ để tách 2 loại enzym trên. a) Enzym β cắt xen kẽ những dây nối α-(1->4)-glucosid của amylose để tạo thành các đƣờng maltose, kết quả thu đƣợc là 100% đƣờng maltose. Đối với Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 16 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng amylopectin thì b-amylase chỉ cắt đƣợc các dây nối (1->4), khi gặp mạch nhánh thì dừng lại, kết quả tạo thành maltose và dextrin, lƣợng maltose chỉ đạt từ 5060%. b) Enzym α cắt một cách ngẫu nhiên vào dây nối (1->4). Đối với amylose thì sản phẩm cuối cùng khoảng 90% là maltose ngoài ra có một ít là glucose. Đối với amylopectin thì α-amylase cũng chỉ tác động đến dây nối (1->4) mà không cắt đƣợc dây nối(1->6) vì thực tế ngƣời ta tìm thấy các phân tử isomaltose (= 6-O-α-D-gluco-pyranosyl-D-glucopyranose) trong dịch thủy phân. Enzym α-amylase tiếp tục cắt đƣợc những dextrin mà enzym b để lại để tạo thành các dextrin phân tử bé hơn. Nhƣ vậy α-amylase tác dụng lên tinh bột thì sản phẩm thu đƣợc chủ yếu là maltose rồi đến glucose và dextrin phân tử bé. Tinh bột nguồn gốc khác nhau, enzym nguồn gốc khác nhau thì khả năng thủy phân cũng khác nhau. 1.1.4. HÌNH DẠNG TINH BỘT Tinh bột tồn tại trong cây dƣới dạng hạt có hình dạng và kích thƣớc khác nhau, đây là một đặc điểm giúp ích cho việc kiểm nghiệm một dƣợc liệu chứa tinh bột. Tùy theo loài cây và tùy theo độ trƣởng thành của cây mà hình dáng và kích thƣớc thay đổi. Về hình dáng thì có thể hình cầu, hình trứng, hình nhiều góc ... kích thƣớc có thể từ 1-100mm đƣờng kính. Soi kính hiển vi thƣờng thấy hạt tinh bột cấu tạo bởi nhiều lớp đồng tâm sắp xếp chung quanh một điểm gọi là rốn hạt. Các lớp này tạo nên là do hạt tinh bột lớn dần bằng cách tăng thêm các lớp ở phía ngoài. Các lớp này khác nhau ở chỉ số chiết quang và hàm lƣợng nƣớc. Có tác giả cho rằng các lớp khác nhau đó là do những lớp đƣợc tăng thêm về ban đêm và những lớp tăng thêm về ban ngày nên không hoàn toàn giống nhau. 1.1.5. Các loại hạt tinh bột hay gặp Hạt hình trứng và hình thận: Tinh bột khoai tây chế từ củ cây khoai tây - Solanum tuberosumL. , thuộc họ Cà - Solanaceae. Hạt tinh bột hình trứng, rốn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 17 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng hạt ở đầu hẹp, các vân đồng tâm dễ nhận. Thỉnh thoảng có hạt kép 2 hoặc 3. Kích thƣớc trung bình 50mm nhƣng có hạt lớn đến 80-100mm. Tinh bột hoàng tinh chế từ củ cây dong - Maranta arundinacea L. , thuộc họ dong - Marantaceae, (đừng nhầm với cây hoàng tinh - Polygonatum sp.). Hạt hình trứng kích thƣớc 30-60mm. Tinh bột sen, chế từ hạt cây sen - Nelumbo nucifera Gaertn., họ Sen Nelumbonaceae. Hạt tinh bột hình trứng hay hình thận, rốn hạt hình vạch kích thƣớc hạt từ 3-25mm. Tinh bột sắn (= khoai mì) chế từ cây sắn (= khoai mì) - Manihot esculenta Crantz; họ Thầu Dầu- Euphorbiaceae. Hạt hình cầu phần lớn một đầu bị lẹm và hơi lõm trông nhƣ cái chuông. Rốn hạt hình sao, kích thƣớc 3-35mm. Tinh bột đậu, chế từ hạt của nhiều loại đậu - Phaseolus spp.; họ Đậu Fabaceae. Hạt hình trứng hay hình thận. Rốn hạt dài và phân nhánh, kích thƣớc trung bình 35mm. Tinh bột hoài sơn, chế từ củ của cây củ mài - Dioscorea persimilis Prain và Burkill, họ Củ nâu - Dioscoreaceae. Hạt hình trứng hay hình thận. Rốn hạt dài, kích thƣớc trung bình 40mm. Hạt hình đĩa hay hình thấu kính dẹt: Tinh bột mì chế từ hạt của cây lúa mì - Triticum vulgareL., họ Lúa - Poaceae, kích thƣớc hạt lớn đến 30mm, hạt bé 6-7mm. Tùy theo vị trí nhìn mà thấy hình tròn hoặc hình thấu kính lồi 2 mặt. Rốn hạt là 1 điểm ở giữa hạt, không rõ. Hạt hình nhiều góc: Tinh bột gạo chế từ hạt cây lúa - Oriza sativa L., họ Lúa - Poaceae. Hạt nhiều góc, nhỏ, kích thƣớc từ 4-6mm, thƣờng đƣợc kết thành đám. Rốn hạt không rõ. Tinh bột ngô (= bắp), chế từ hạt cây ngô - Zea mays L. ; họ Lúa Poaceae. Hạt nhiều góc, rốn hạt ở giữa rất rõ, kích thƣớc 15-30mm. 1.1.6. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan Quá trình tổng hợp tinh bột α-1,4 glucan bao gồm ba bƣớc quan trọng xảy ra trong lục lạp và thể vô sắc: i) cung cấp glucose-6-phosphate (Glc-6-P) vào Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 18 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng trong các thể lạp, ii) tổng hợp ADP-glucose (ADPG) từ Glc-1-P, và iii) tổng hợp tinh bột từ ADPG (Zeeman, Kossmann, and Smith 2010). Nói một cách ngắn gọn, bƣớc đầu tiên không thể thiếu đƣợc là sự tổng hợp ADPG từ Glc-1-P và ATP đƣợc xúc tác bởi ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase). Một khi đƣợc hoạt hóa, starch synthase (SS) chuyển ADPG tới đầu không khử của α-1,4 glucan để tạo thành các sợi α-1,4 glucan. Tiếp theo, các sợi α-1,4 glucan đƣợc dùng nhƣ là các cơ chất cho các enzyme phân nhánh của tinh bột (BE hoặc Qenzyme) tạo ra các liên kết sợi α-1,6 là amylopectin. Cuối cùng amylopectin đƣợc tinh thể hóa tạo thành tinh bột dƣới tác động của các enzyme phân rã (DPE), phosphorylase (P-enzyme) và glucanotransferase (D-enzyme). Ngoài ra, UDP-glucose: protein glucosyltransferase hoặc amylogenin (38 hoặc 45 kDa) cũng đƣợc dự đoán tham gia vào bƣớc đầu tiên trong quá trình tổng hợp tinh bột (Zeeman, Kossmann, and Smith 2010), (Egli et al. 2010). Hình 2. Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzyme liên quan Các starch synthase (SS) của thực vật bậc cao mã hóa bởi 5 nhóm gen ký hiệu là GBSS (granule-bound starch synthase), SSI, SSII, SSIII, và SSIV. GBSS gắn chặt với hạt tinh bột và chịu trách nhiệm tổng họp amylose. Các biến thể khác nhau của SS (thƣờng gọi là SS hòa tan) tạo ra các chuỗi amylopectin (1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 19 http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng dạng tinh bột đã polyme hóa) có thể tan hoặc trong các plastic hoặc một phần hòa tan một phần gắn với hạt tinh bột. Số liệu di truyền và sinh hóa chỉ ra rằng mỗi biến thể enzyme SS có các cấu thành khác nhau và vai trò nhất định trong tổng hợp amylopectin. Phân tích việc phân phối chiều dài chuỗi amylopectin trong các cây đột biến và cây chuyển gen mất các biến thể enzyme SS đặc trƣng đã dẫn tới kết luận rằng nhóm SSI, SSII, và SSIII đóng vai trò trong việc kéo dài các chuỗi ngắn, trung bình và dài tƣơng ứng. Việc phân nhánh của amylopectin xảy ra đồng thời với quá trình kéo dài chuỗi. Quá trình phân nhánh đƣợc xúc tác bởi enzyme phân nhánh (BE). Enzyme này cắt chuỗi α-l,4-glucan sẵn có và chuyển đoạn cắt mang 6 đơn vị glucose hoặc nhiều hơn tới vi trí C6 của gốc glucosyl ở chuỗi glucan khác. BE của thực vật bậc cao bao gồm hai nhóm I và II. Nhóm I vận chuyển các chuỗi dài hơn. Phân tích di truyền chỉ ra rằng hai nhóm BE có vai trò đặc biệt trong tổng hợp amylopectin. Bên cạnh SS và BE còn có các enzyme khác nhau tham gia vào quá trình sinh tổng hợp tinh bột. Các enzyme khừ phân nhánh - (debranching enzymes, DBE) làm mất các điểm phân nhánh và quan trọng trong việc quyết định cấu trúc của amylopectin. Thực vật có hai loại DBE— isoamylase (ISA) và limitdextrinase (LDA, hay còn gọi là pullulanase). Hai loại này khác nhau bởi trình tự amino acid và cơ chất. ISA có 3 nhóm - ISA1, ISA2, và ISA3. ISA1 và ISA2 liên quan chặt với tổng hợp amylopectin. Vai trò cơ bản của LDA và ISA3 là phân hủy tinh bột. ISA1 hoạt động mạnh nhất khi cơ chất là các chuỗi glucan tƣơng đối dài nhƣ là các amylopectin bị hòa tan, trong khi đấy LDA và ISA3 có hoạt tính cao với các chuỗi glucan ngắn nhƣ β-limit dextrins. ISA2 dƣờng nhƣ không có hoạt tính xúc tác mà tác dụng điều tiết hoặc ổn định ISA1 chứ không tham gia trực tiếp vào quá trình hủy phân nhánh. Trong các cây đột biến hoặc chuyển gen thiếu hụt ISA1, tinh bột dạng hạt bị giảm, thậm chí không có và thay thế một phần bởi các glucan tan trong nƣớc. Hiện tƣợng này quan sát đƣợc ở một số thực vật, ví dụ nhƣ ở nội nhũ non của ngũ cốc, lá Arabidopsis và củ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 20 http://www.lrc.tnu.edu.vn