Tài liệu Nghiên cứu phân lập một số hợp chất saponin có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ hải sâm cercodemas anceps

Luận văn cao học ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN KHẮC SINH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ TỪ HẢI SÂM CERCODEMAS ANCEPS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI, 2016 i Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN KHẮC SINH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ TỪ HẢI SÂM CERCODEMAS ANCEPS Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60.42.0114 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN XUÂN CƢỜNG PGS. TS. HOÀNG THỊ MỸ NHUNG HÀ NỘI, 2016 ii Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi tình cảm chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến với: TS. Nguyễn Xuân Cƣờng, người thầy hướng dẫn chính của tôi trong luận văn tốt nghiệp của mình. Đối với tôi, lĩnh vực hóa sinh còn rất mới mẻ nhưng thầy đã giúp tôi tiếp cận được một cách dễ dàng nhất; hỗ trợ tôi rất đúng lúc, kịp thời để tôi có cái nhìn sâu sắc về lĩnh vực mới.Tuy vẫn còn rất nhiều kiến thức cần phải học hỏi nhưng chắc chắn những gì thầy chỉ bảo sẽ là tiền đề vững chắc cho tôi có khả năng tìm hiểu sâu hơn về các kỹ thuật hóa sinh. PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, người thầy tôi vô cùng kính trọng và có ảnh hưởng sâu sắc nhất đến tôi. Cô không chỉ là người lãnh đạo nhóm Ung thư học thực nghiệm mà còn là phó chủ nhiệm bộ môn Sinh học tế bào.Với bao bộn bề công việc, cô vẫn dành cho tôi những khoảng thời gian để giúp tôi giải quyết những khó khăn trong công việc. Mỗi lần được cô chỉ dạy tận tình tôi lại thấy mình thật may mắn khi được cô nhận vào nhóm nghiên cứu. Cô dạy tôi kiến thức và kỹ năng thực hành, truyền lại cho tôi kinh nghiệm và tinh thần làm việc, cho tôi nơi làm thí nghiệm và hỗ trợ tôi cả về vật chất.Cùng với những lời động viên nho nhỏ, đó là động lực để tôi bước qua những rào cản lớn nhất trong công việc. ThS. Bùi Thị Vân Khánh, người chị cả luôn gắn bó với các thế hệ sinh viên, trong đó có cả thời sinh viên của tôi. Tôi đã luôn được nghe nói về sự nhiệt tình của chị đối với sinh viên, nhưng khi được làm việc cùng chị tôi mới thấy hết được sự năng nổ và nhiệt tình ấy của chị.Tôi muốn dành một lời cảm ơn đặc biệt nhất đến với chị vì có thể nói không có sự giúp đỡ của chị tôi khó mà hoàn thành được công việc của mình.Chị đã luôn động viên tôi mỗi khi nói chuyện và quan tâm đến tôi cho đến những ngày cuối cùng trước khi hoàn thành công việc. ThS. Nguyễn Đắc Tú, CN.Lê Thị Kim Anh, ThS. Nguyễn Thị Ngọc Ánh như những người anh, người chị lớn trong một gia đình, gần gũi chăm lo cho nhóm nghiên cứu.Các anh chị không chỉ quan tâm đến công việc và còn lo cả đời sống tinh thần cho các em, luôn tạo không khí vui vẻ, môi trường làm việc thân thiện, tốt nhất cho các em. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PhòngDƣợc liệu biển, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp tôi phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất saponin với sự tài trợ kinh phí từ Đề tài nghiên cứu khoa học trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam: “Nghiên cứu khai thác dược iii Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học liệu Da gai ở vùng biển Đông bắc Việt Nam theo định hướng hoạt tính diệt tế bào ung thư và kháng sinh", mã số VAST.TĐ.ĐAB.03/13-15. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô trong Khoa Sinh học nói chung và các thầy cô trong Bộ môn Sinh học tế bào nói riêng. Thầy cô đã giúp tôi có được kiến thức vững vàng và kỹ năng để tìm hiểu các vấn đề quan tâm.Điều đó giúp tôi rất nhiều trong việc hoàn thành khoá luận tốt nghiệp của mình. Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn gia đình, cảm ơn từ những gì bé nhỏ nhất mà gia đình đã dành cho tôi. Tất cả đã luôn vui vẻ với những sự lựa chọn của tôi, ủng con đường tôi đang đi, những gì tôi đang làm. Cảm ơn các anh chị đồng nghiệp, bạn bè đã hỗ trợ tôi để tôi có thời gian hoàn thành luận văn của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên Nguyễn Khắc Sinh iv Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 Chƣơng 1 – TỔNG QUAN .......................................................................................3 1.1. Saponin .....................................................................................................3 1.1.1. Saponin và khả năng kháng u ...................................................3 1.1.2. Cơ chế kháng u của một số saponin ..........................................4 1.1.3. Mối liên quan giữa cấu trúc và chức năng kháng u của saponin .........................................................................................7 1.2. Saponin từ hải sâm ..................................................................................7 1.2.1. Hải sâm ........................................................................................7 1.2.2. Nguồn saponin từ hải sâm..........................................................8 1.3. Một số phƣơng pháp phân lập và xác định cấu trúc hợp chất hóa học ...................................................................................................................9 1.3.1. Sắc ký cột .....................................................................................9 1.3.2. Sắc kí lớp mỏng .........................................................................10 1.3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR) ..................................................................10 1.3.3.1. 1.3.3.2. Phổ 13C-NMR ............................................................................................... 10 1.3.3.3. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) ........... 11 1.3.3.4. 1.4. Phổ 1H-NMR ................................................................................................ 10 Phổ 2D-NMR................................................................................................ 11 Ung thƣ ...................................................................................................12 .................................................................................................................13 1.5. Các mô hình sàng lọc thuốc chống ung thƣ.........................................16 1.5.1. Mô hình nuôi cấy đơn lớp tế bào .............................................16 1.5.2. Mô hình nuôi cấy khối cầu đa bào ..........................................18 1.5.3. Mô hình động vật thí nghiệm...................................................18 Chƣơng 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................20 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................20 i Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học 2.1.1. Loài hải sâm Cercodemas anceps .............................................20 2.1.2. Mẫu chế phẩm sinh học............................................................21 2.1.3. Dòng tế bào ung thƣ mô liên kết Sarcoma-180 ......................21 2.1.4. Dòng tế bào ung thƣ vú MCF7 ................................................21 2.1.5. Dòng tế bào ung thƣ biểu mô ruột kết HCT116 ....................22 2.1.6. Chuột nhắt trắng Swiss ............................................................22 2.2. Hoá chất, thiết bị ....................................................................................23 2.2.1. Hoá chất .....................................................................................23 2.2.2. Thiết bị .......................................................................................24 2.2.3. Dụng cụ và vật tƣ tiêu hao .......................................................25 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................26 2.3.1. Phân lập hợp chất saponin từ hải sâm ....................................26 2.3.2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ hải sâm .. ....................................................................................................26 2.3.3. Phƣơng pháp thử độc tính tế bào trên mô hình đơn lớp ......27 2.3.4. Phƣơng pháp xác định tế bào apoptosis dƣới tác dụng của CPSH ..........................................................................................30 2.3.5. Phƣơng pháp gây u thực nghiệm cho động vật thí nghiệm ..33 2.3.6. Phƣơng pháp thử tác dụng của chế phẩm trên chuột thí nghiệm........................................................................................34 2.3.7. Các phƣơng pháp đánh giá tác dụng kháng u của chế phẩm sinh học ......................................................................................35 Chƣơng 3 – KẾT QUẢ ...........................................................................................38 3.1. Kết quả phân lập các hợp chất từ hải sâm Cercodemas anceps ........38 3.2. Kết quả xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập đƣợc ......39 ............................................................................................................................39 3.3. Kết quả thử độc tính với tế bào của hai chất phân lập ......................49 3.4. Kết quả đánh giá tác động của CPSH trên mô hình in vitro và in vivo .................................................................................................................52 ii Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học KẾT LUẬN ..............................................................................................................64 KIẾN NGHỊ .............................................................................................................64 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................65 iii Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học DANH MỤC HÌNH MINH HỌA Hình 1.1: Các đặc trƣng cơ bản của tế bào ung thƣ ...........................................13 Hình 1.2: Quá trình chết theo chƣơng trình (apoptosis) ....................................15 Hình 1.3: Sự biểu hiện sớm PS trên màng tế bào chết theo chƣơng trình .......16 Hình 1.4: Một số dòng tế bào ung thƣ và dạng sống của chúng .........................17 Hình 1.5: Cách phân loại 11 lớp hợp chất saponin .. Error! Bookmark not defined. Hình 2.1: Loài hải sâm Cercodemas anceps trong nghiên cứu ............................20 Hình 2.2: Tế bào ung thƣ mô liên kết Sarcoma-180 trong nghiên cứu ..............21 Hình 2.3: Tế bào ung thƣ vú MCF7 trong nghiên cứu ........................................22 Hình 2.4: Tế bào ung thƣ biểu mô ruột kết HCT116 trong nghiên cứu ............22 Hình 2.5: Chuột nhắt trắng Swiss (Mus musculus) trong nghiên cứu ...............23 Hình 2.6: Cấu trúc hoá học muối MTS và sản phẩm màu Formazan ..............27 Hình 2.7: Tỷ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng 490 nm với số lƣợng tế bào .............27 Hình 2.8: Bố trí thí nghiệm MTS ...........................................................................28 Hình 2.9: Xác định chỉ số IC50 .............................................................................30 Hình 2.10: Annexin V gắn trên màng tế bào đang chết theo chƣơng trình.......30 Hình 2.11: Hình ảnh cắt dọc cấu trúc da ..............................................................33 Hình 2.12: Thuốc 6MP (Purinethol hay Mercaptopurine) .................................35 Hình 2.13: Thƣớc kẹp caliper ................................................................................36 Hình 3.1: Phổ 13C-NMR của chất 1 .......................................................................39 Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của chất 1 ........................................................................41 Hình 3.3: Phổ HSQC của chất 1 ............................................................................41 Hình 3.4: Phổ HMBC của chất 1 ...........................................................................42 Hình 3.5: Phổ COSY của chất 1 .............................................................................43 Hình 3.6: Phổ ROESY của chất 1 ..........................................................................44 Hình 3.7: Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 – hợp chất colochiroside A ............44 iv Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học Hình 3.8: Phổ 13C-NMR của chất 2 .......................................................................45 Hình 3.9: Phổ 1H-NMR của chất 2 ........................................................................45 Hình 3.10: Phổ HMBC của chất 2 .........................................................................47 Hình 3.11: Phổ HSQC của chất 2 ..........................................................................47 Hình 3.12: Phổ COSY của chất 2...........................................................................48 Hình 3.13: Phổ ROESY của chất 2 ........................................................................48 Hình 3.14: Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 – hợp chất philinopside A ...........49 Hình 3.15: Đƣờng cong đáp ứng liều của tế bào HCT116 với hai chất .............50 Hình 3.16: Đƣờng cong đáp ứng liều của tế bào Sar-180 với hai chất ...............51 Hình 3.17: Đƣờng cong đáp ứng liều của tế bào MCF7 với hai chất .................51 Hình 3.18: Đƣờng cong đáp ứng liều của Sar.180 (A) và MCF7 (B) đối với CPSH ....................................................................................................................53 Hình 3.19: Mẫu ĐC TB Sar.180 với Annecxin V .................................................54 Hình 3.20: Mẫu ĐC TB Sar.180 với PI .................................................................54 Hình 3.21: Mẫu ĐC TB MCF7 với Annecxin V ...................................................54 Hình 3.22: Mẫu ĐC TB MCF7 với PI ...................................................................55 Hình 3.23: Tế bào Sar.180 nhuộm Annexin V sau khi ủ với CPSH ..................56 Hình 3.24: Tế bào Sar.180 nhuộm nhân PI sau khi ủ với CPSH ........................56 Hình 3.25: Tế bào MCF7 nhuộm Annexin V sau khi ủ với CPSH .....................57 Hình 3.26: Tế bào MCF7 nhuộm nhân PI sau khi ủ với CPSH..........................57 Hình 3.27: U thực nghiệm dƣới da của một số chuột thí nghiệm .......................58 Hình 3.34: Đồ thị biểu diễn sự tăng trọng lƣợng các lô ung thƣ trong quá trình thí nghiệm ................................................................................................................59 Hình 3.29: Hình ảnh khối u ở chuột tại các lô thí nghiệm vào ngày thứ 32 sau cấy u ....................................................................................................................60 Hình 3.30: Đồ thị tăng trƣởng kích thƣớc trung bình của u rắn ở các lô thí nghiệm ....................................................................................................................61 v Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm ......................................................23 Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ........................................................24 Bảng 2.3: Dụng cụ và vật tƣ dùng trong thí nghiệm ............................................25 Bảng 2.4: Dải nồng độ thuốc sử dụng trong thí nghiệm MTS ............................28 Bảng 2.5: Quy trình tiến hành thí nghiệm MTS ..................................................29 Bảng 2.6: Sơ đồ thí nghiệm xác định tế bào chết theo chƣơng trình .................31 Bảng 2.7: Quy trình tiến hành thí nghiệm miễn dịch huỳnh quang...................31 Bảng 2.8: Lô và các thông số trong quá trình thí nghiệm ...................................35 Bảng 2.9: Thang đánh giá hiệu lực kháng u của H. Itokawa ..............................37 Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, Pyridine-d5) và 13C-NMR 125 MHz, Pyridine-d5) phần aglycon của các hợp chất 1, 2 và các chất tham khảo ... ....................................................................................................................40 Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, Pyridine-d5) và 13C-NMR (125 MHz, Pyridine-d5) phần chuỗi đƣờng của các hợp chất 1, 2 và các chất tham khảo ....................................................................................................................46 Bảng 3.3: Tổng hợp trọng lƣợng trung bình của chuột ở các lô thí nghiệm .....59 Bảng 3.4: Theo dõi kích thƣớc khối u trong quá trình thử nghiệm ...................61 Bảng 3.5: Tổng hợp kết quả khảo sát tác dụng kháng u của CPSH trên chuột mang u rắn Sar.180 .................................................................................................62 Bảng 3.6: Các chỉ số huyết học của chuột ở các lô thí nghiệm và đối chứng .....63 vi Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học BẢNG DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ đầy đủ ADN (DNA) Deoxyribonucleic acid TBUT Tế bào ung thư PS Phosphatidylserine SKLM Sắc ký lớp mỏng HPLC High Performance Liquid Chromatography CPSH Chế phẩm sinh học UT Ung thư ĐCDM Đối chứng dung môi ĐCSH Đối chứng sinh học EGF Epidermal growth factor HeLa Henrietta Lacks' 'Immortal' cell line IC50 Inhibited Concentration at 50% LD50 Lethal Dose at 50% TLCT Trọng lượng cơ thể MMP-9 Matrix metallopeptidase 9 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4sulfophenyl)-2H-tetrazolium) NMR Nuclear Magnetic Resonance (Cổng hưởng từ hạt nhân) OD Optical Density vii Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học MỞ ĐẦU Ba tỷ USD là số tiền khổng lồ mà nhà sáng lập mạng xã hội Facebook Mark Zuckerberg cam kết hiến tặng cho khoa học, nhằm mục đích giải quyết 4 loại bệnh nguy hiểm nhất trong thế kỷ tới. Một trong bốn loại bệnh đó chính là bệnh ung thư. Bệnh ung thư không phải bệnh mới xuất hiện trong những thế kỷ gần đây, nó đã được ghi nhận từ năm 3000 đến 1500 trước Công nguyên. Như vậy, bệnh ung thư đã tồn tại cùng con người trong suốt chiều dài lịch sử.Tuy đã hiểu được bản chất của bệnh ung thư nhưng việc phòng tránh và chữa trị ung thư vẫn luôn là thách thức to lớn cho tất cả chúng ta. Nhiều năm qua, trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu khoa học về ung thư, kèm theo những số liệu thống kê đáng lưu ý. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) số 297, tháng 2 năm 2011, ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Số lượng người tử vong do ung thư năm 2008 là 7,6 triệu người trong tổng số 57 triệu ca tử vong do bệnh tật trên toàn cầu (chiếm 13%). Riêng ở Hoa Kỳ năm 2008 có tới 1,5 triệu ca mắc mới ung thư. Tổ chức Y tế thế giới dự đoán đến năm 2030, loài người sẽ phải đối mặt với số người tử vong do các bệnh ung thư tăng lên hơn 11 triệu người trên toàn thế giới. Tại Việt Nam, theo thông tin được đưa ra tại hội thảo khoa học Ung bướu quốc gia lần thứ VII vào năm 2013, mỗi năm Việt Nam có khoảng 150.000 người mới mắc ung thư và 75.000 người tử vong vì căn bệnh này, tức 205 người/ ngày và con số này dự báo sẽ ngày càng tăng cao. Nếu chúng ta có dịp đặt chân đến Bệnh viện K sẽ thấy rõ ung thư đã trở thành vấn nạn của xã hội ra sao. Căn cứ vào những hiểu biết của con người về ung thư, các nhà khoa học trên thế giới định hướng nghiên cứu theo nhiều hướng khác nhau. Trong đó, xu hướng sàng lọc các chất tách chiết từ động vật, thực vật diễn ra mạnh mẽ và luôn nổi bật nhất. Hiện nay, hàng trăm chất đã được tìm ra với tác dụng có khả năng chống lại tế bào ung thư.Ở Việt Nam, khoảng hơn 90 chất đã được sử dụng.Một chất có thể có khả năng chữa trị nhất định cho một số người và một số loại ung thư nên việc phối hợp nhiều loại thuốc sẽ mang đến hiệu quả cao hơn, tránh được việc quen thuốc của các tế bào ung thư. Hơn nữa, ung thư lại là nhóm bệnh vô cùng phức tạp, có thể tác động đến hầu khắp các cơ quan trong cơ thể, nên việc tiếp tục tìm ra các chất mới và bổ sung hoàn thiện cho các chất đang được nghiên cứu vẫn là việc vô cùng quan trọng và được ưu tiên hàng đầu. 1 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học Trong đó, nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng hợp chất saponin có tiềm năng gây độc với nhiều dòng tế bào ung thư người.Nhưng saponin là nhóm hợp chất có cấu trúc rất phức tạp và tác dụng cũng rất khác nhau giữa các nhóm hợp chất saponin. Để góp phần làm rõ hơn về tác dụng của hợp chất saponin, Tiến sĩ Nguyễn Xuân Cường của Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam định hướng nghiên cứu về loài hải sâm với tiềm năng mang nhiều hợp chất saponin. Cùng với nhóm Nghiên cứu Ung thư học thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập một số hợp chất saponin có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ hải sâm Cercodemas anceps” với mục đích: 1. Phân lập và xác định cấu trúc từ 1 đến 3 hợp chất saponin từ loài hải sâm Cercodemas anceps 2. Đánh giá được hoạt tính diệt tế bào ung thư của các chất phân lập được trên một số dòng tế bào ung thư và trên mô hình động vật in vivo. 2 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 1.1. Saponin 1.1.1. Saponin và khả năng kháng u Saponin là một nhóm hợp chất được phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, có đặc tính hoạt động bề mặt và không bay hơi. Cái tên saponin có nguồn gốc tiếng Latin là từ “sapo”, có nghĩa là “xà phòng” vì chất này tạo bọt dạng như xà phòng khi rung lắc mạnh với nước. Hiện tượng trên được giải thích về mặt cấu trúc là do saponin gồm các aglycone không phân cực kết hợp với một hoặc nhiều gốc monosaccharide. Sự kết hợp giữa thành phần cấu trúc phân cực và không phân cực trong các phân tửcủa chúng giải thích vì sao chúng tạo bọt trong nước. Saponin thông thường có trong thực vật và thường có nhiều trong rễ, thân, lá, hoa và hạt. Cụ thể hơn, hợp chất này được ghi nhận là có trong hơn 100 họ thực vật và có ít nhất 150 saponin tự nhiên được cho là có khả năng kháng ung thư (anticancer) [11]. Bộ khung của saponin đều có nguồn gốc từ tiền chất oxidosqualene (Hình 1.1) đặc trưng bởi 30 carbon gắn thêm glycosyl.Dựa trên bộ khung carbon, saponin được chia thành triterpenes và steroid.Sự khác nhau giữa 2 lớp này là do steroid bị mất đi 3 nhóm methyl nên bộ khung chỉ có 27 carbon, trong khi triterpenes có đủ 30 carbon. Các thành phần glycone của chúng thường là oligosaccharide, chúng được sắp xếp dạng thẳng hoặc phân nhánh, và thường liên kết với nhóm hydroxyl thông qua liên kết acetal [16]. Dựa trên bộ khung carbon, kết hợp với con đường sinh tổng hợp ra triterpenes và steroid, Jean-Paul Vincken và cộng sự đã chia thành 11 lớp saponin khác nhau bao gồm: dammaranes, tirucallanes, lupanes, hopanes, oleananes, taraxasteranes, ursanes, cycloartanes, lanostanes, cucurbitanes và steroids [11](Hình 1.1).Các nhóm này luôn cho thấy hiệu quả kháng u thông qua nhiều con đường khác nhau. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế của saponin cũng như sự tương quan giữa cấu trúc và chức năng dưới cấp độ phân tử và tế bào để hiểu về cơ chế tác động hóa sinh học của saponin. Một số saponin đặc biệt với khả năng kháng u mạnh như ginsenoside thuộc loại dammarane đã cho thấy khả năng ức chế hình thành khối u bằng cách kìm giữ một số thành phần như các tế bào nội mô mạch máu và ngăn cản sự neo bám, xâm lấn và di căn của các tế bào khối u. Dioscin là 1 thành phần loại steroid cũng được nghiên cứu sâu với khả năng kháng khối u thông qua ngăn cản chu trình tế bào và apoptosis. Nhiều phân tử quan trọng khác thuộc về 3 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học oleanane saponin như avicin, platycodon, sailosaponin, soysaponin cùng với tubeimosides cũng cho thấy vai trò quan trọng của mình [11]. Các nghiên cứu hiện đại cho thấy saponin có khả năng kháng khối u trên nhiều dòng tế bào ung thư như LA795 [13], MCF7 và MDA-MB-231 [10]. Vài loại saponin ức chế sự phát triển của tế bào khối u thông qua việc làm dừng chu trình và kích thích apoptosis với giá trị IC50 khoảng 2,5 µM đến 5 µM [10]. Đối với động vật, một số saponin được nghiên cứu có giá trị LD50 khác nhau như polyphyllin D thuộc loại steroid có giá trị LD50 là 2,73 mg/kg [10], hay saponin tách chiết từ Citrullus colocynthis có giá trị LD50 là 200 mg/kg [24]. Trong khi đó, saponin kết hợp điều trị trong các liệu pháp kháng u cho kết quả cải thiện hơn rất nhiều. Hơn nữa, sự hiểu biết một cách rõ ràng về mối liên quan giữa cấu trúc của saponin với các yếu tố khác sẽ giúp việc sử dụng saponin hiệu quả hơn. 1.1.2. Cơ chế kháng u của một số saponin Saponin rất đa dạng về cấu trúc nên tác động kháng ung thư của từng lớp cũng rất đa dạng. Nhiều lớp thể hiện tính kháng u rất rõ rệt với nhiều con đường khác nhau. Cycloartanes: Loại saponin này cho thấy khả năng kháng ung thư kém nhưng chúng có thể được sử dụng kết hợp trong điều trị hóa trị khối u. Chúng làm giảm biểu hiện của dấu chuẩn ung thư ruột HCC (human colon cancer) là αfetoprotein và ngăn cản sự phát triển của tế bào HepG2 bằng cách cảm ứng quá trình chết theo chương trình và điều khiển con đường tín hiệu của NF-kB phụ thuộc ERK (ERK-independent NF-kB) [11]. Dammeranes: hầu hết loại saponin này cho thấy khả năng kháng ung thư.Những saponin loại này thường có tác dụng mạnh với tế bào ung thư di căn hơn tế bào không ác tính.IC50 đối với tế bào không ác tính gấp tới 40 đến 150 lần IC50 đối với tế bào ác tính. Bằng các ảnh chụp hiển vi điện tử và các biện pháp hóa sinh, saponin này được chứng minh là phá hủy màng trong và màng ngoài của ty thể của cả tế bào ung thư tụy và bạch cầu ở người, dẫn đến làm mất khả năng vận chuyển qua màng, làm tăng canxi nội bào, qua đó kích hoạt con đường chết theo chương trình thông qua canxi [11]. Oleananes: là loại được tìm thấy nhiều nhất trong tự nhiên và có khả năng kháng ung thư qua nhiều con đường như kháng u, chống lại khả năng di căn, kích thích miễn dịch. Một số chất như Avincin có nguồn gốc từ cây Acacia victoriae ở 4 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học samạc Australia có khả năng dephosphoryl hóa Stat3 trong nhiều dòng tế bào ung thư và dẫn đến làm giảm hoạt động của Stat3, qua đó làm giảm hoạt động của nhiều protein như c-myc, cyclin D1, Bcl2, survivin và VEGF. Avincin D và G gây ức chế sự phát triển của tế bào lympho T, cảm ứng khởi động con đường chết theo chương trình và đẩy tế bào vào con đường chết kiểu tự thực bào [11].Chất Tubeimoside có hiệu quả gây độc với tế bào ung thử cổ tử cung HeLa thông qua cơ chế làm rối loạn hoạt động của ty thể hoặc gây chết tế bào bằng các ức chế lên lưới nội chất và ức chế trùng hợp tubulin. Ngoài ra, chất Saikosaponin A làm giảm khả năng sống và khả năng phân chia của tế bào MCF7, khởi phát chết theo chương trình và dừng chu trình tế bào ở pha G1. Hay chất saponin được tách chiết từ cây Platycodon grandiflorumtác động đến hoạt động của thoi vô sắc nên làm dừng phân chia tế bào, ức chế hoạt động của telomerase thông qua can thiệp vào quá trình phiên mã hTERT của telomere. Spirostanes cho thấy khả năng kháng u mạnh và kích thích hệ miễn dịch. Trong đó, chất Polyphyllin D trong nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy tiềm năng gây chết theo chương trình thông qua con đường ty thể và lưới nội chất như một số chất khác. Bên cạnh đó, chất Dioscin trong nghiên cứu tiền lâm sàng lại cho thấy khả năng ức chế hoạt động phân chia của hầu hết dòng tế bào ung thư máu và khối u rắn. Phân tích proteomic cho thấy chất này thúc đẩy apoptosis thông qua con đường ty thể và một số con đường khác. Trong thực tế, chất Formosanin C trong nhóm này có tác động lên đáp ứng miễn dịch và được sử dụng hỗ trợ cho chất 5fluorouracil (chất đã được sử dụng trong điều trị ung thư). Con đường ảnh hưởng của Formosanin C là do chất này hoạt hóa caspase-2, biến đổi hoạt động của ty thể (trong tế bào ung thư ruột kết HT29) [11]. 5 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học Hình 1.1: Cách phân loại 11 lớp hợp chất saponin 6 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học 1.1.3. Mối liên quan giữa cấu trúc và chức năng kháng u của saponin Sự khác nhau trong cấu trúc của saponin chính là khác nhau về loại, vị trí, và số lượng gốc đường gắn trong liên kết glycoside tại các vị trí khác nhau trong vòng, qua đó có thể quyết định đặc tính tác dụng đáp ứng sinh học của saponin đó, đặc biệt là khả năng kháng u. Chúng ta có thể thấy một số mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt động như sau: - Tác dụng của aglycone trong khả năng kháng u của saponin: so sánh sự khác nhau về vị trí và số lượng nhóm hydroxyl trong aglycone cho thấy khả năng khác nhau của các saponin. TubeimosideII có C-16 nhóm hydroxyl đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh hoạt động sinh học của tubeimosideII và giảm khả năng gây độc của nó. Nhưng C-17 nhóm hydroxyl có khả năng gây độc kém hơn và C-27 hydroxyl có khả năng kháng u kém nhất [11]. Tác dụng của chuỗi đường trong cấu trúc của saponin: các liên kết đường, số lượng và thứ tự sắp xếp đường ảnh hưởng đến khả năng của saponin. Ví dụ: với cùng loại aglycone và độ dài chuỗi đường nhưng các cầu nối liên kết sẽ cho tiềm năng kháng u khác nhau. 4 disaccharide với 1-3 cầu nối cho tác dụng kém hơn 1-2 hoặc 1-4 cầu nối. Số lượng gốc đường ảnh hưởng đến khả năng kháng u của saponin. Hoạt động của các ginsenoside có tác động theo thứ tự: monosaccharide glycoside > disaccharide glycoside > trisaccharide glycoside > tetrasaccharide glycoside [11]. Tóm lại, sự phát hiện và phát triển của saponin đóng góp rất lớn vào các liệu pháp ung thư và nhiều thành phần, trong số đó cho đến nay đã được ứng dụng trong các thử nghiệm lâm sàng. Hầu hết tất cả saponin đều gây cảm ứng chết theo chương trình cho tế bào khối u, chúng là thuốc được ưa dùng trong các liệu pháp chữa ung thư vì loại trừ các tế bào khối u bằng apoptosis là biện pháp hữu ích để tăng hiệu quả cho bệnh nhân, tránh việc bị hoại tử. Mảng kiến thức quan trọng của cơ chế kháng u của saponin là cần thiết cho việc cải thiện trực tiếp các liệu pháp chống khối u dựa trên saponin trong tương lai.Mặt khác, các nghiên cứu và thử nghiệm nên được tập trung vào việc kết hợp giữa saponin và các thuốc kháng u khác. 1.2. Saponin từ hải sâm 1.2.1. Hải sâm Hải sâm hay còn được gọi là dưa biển, sâm biển, đỉa biển, là loài động vật không xương sống. Thân có dạng ống dài như quả dưa, phình ra ở giữa và thon nhỏ 7 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học ở hai đầu với những gai thịt nhỏ. Phía trước có miệng với vành tua rõ rệt, phía sau là hậu môn. Dọc thân là các dãy chân ống. Da mềm có các phiến xương nằm rải rác dưới da. Hải sâm là động vật phân tính, trừ một số loài thuộc bộ Không chân (Apoda). Trứng thụ tinh và phát triển ngoài cơ thể mẹ. Chúng sống bò trên nền đáy, ở độ sâu khác nhau, chỉ có một số loài thuộc họ Pelagothuridae là bơi lội. Hải sâm có khả năng tái sinh rất cao và sức chịu đựng bền bỉ (có thể sống dưới nước tới độ sâu 6.000m). Có nhiều loại hải sâm thuộc các chi Holothuria, Actinopyga, Stichopus. Trong đó, hai loài hải sâm đen và trắng được sử dụng rộng rãi hơn:  Hải sâm đen (Holothuria vagabunda) có thân màu đen, bụng nhạt màu hơn, dài 30-40cm.  Hải sâm trắng (H. scabra) có lưng màu xám, nhạt dần ở hai bên, bụng trắng, dài 40-50cm, có khi đến 60-70cm. Trên thế giới, hải sâm có hàng nghìn loài, phân bố ở nhiều nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Úc, Ấn Độ, Malaysia, vùng Đông Phi.... Ở Việt Nam, có bốn loài đã được phát hiện phổ biến là hải sâm đen, hải sâm trắng, hải sâm vú (Microthele nobilis Selenka) và hải sâm mít (Actinopyga echinites Jaeger). Chúng có ở khắp tuyến biển từ bắc vào nam, nhiều nhất ở Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu, Côn Đảo, Phú Quốc, Kiên Giang. Chúng thường sống ở các dải nông ven bờ đến độ sâu khoảng 5-7m, chủ yếu ở vịnh và những nơi nhiều đá ngầm. Chúng di chuyển bằng cách phụt nước hoặc co duỗi các cơ; ăn động vật, thực vật nhỏ ở đáy và chất bã hữu cơ. Các nghiên cứu về thành phần hóa học đã cho thấy hải sâm chứa rất nhiều chất có các hoạt tính quý báu như hoạt tính gây độc tế bào, chống oxy hóa, kháng MAO. Đặc biệt là sự có mặt của các hợp chất triterpenes saponin (holothurin) có hoạt tính gây độc tế bào rất mạnh đối với nhiều dòng tế bào ung thư người, hứa hẹn cho việc phát triển các dược phẩm có tác dụng phòng và trị bệnh ung thư. 1.2.2. Nguồn saponin từ hải sâm Trước đây, Saponin đã được phân tách từ nhiều loài sinh vật biển như hải sâm (Nigrelli 1952; Yamanouchi 1955), sao biển (Mackie và Turner 1970), hải miên (Thompson 1985).Trong hải sâm, saponin là chất chuyển hóa thứ cấp. Về mặt cấu trúc , chúng là các glycoside triterpene được tạo thành từ các chuỗi oligosaccharide và aglycone là các holostane-3b-ol, đóng vai trò quan trọng trong 8 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm Luận văn cao học tác dụng dược lý của hải sâm. Trên thế giới, các nhóm nghiên cứu đã tìm ra ít nhất 59 gylcoside tritecpen.Nhiều saponin xuất hiện trong nhiều loài hải sâm khác nhau nhưng cũng có nhiều saponin rất đặc hiệu cho loài. Trong cơ thể hải sâm, saponin phân bố khác nhau và nồng độ saponin cũng khác nhau trong các khoang cơ thể. Saponin được tìm thấy trong các cơ quan tiêu hóa, cơ, lớp biểu bì, buồng trứng và tinh hoàn (thay đổi theo chu kỳ sinh sản) và ống Cuvierian. Saponin tách từ hải sâm thể hiện dược tính cao với khả năng kháng u, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virut, kháng nấm,.. Ở Việt Nam, một vài nhóm nghiên cứu đã phân lập saponin từ hải sâm.Trong đó có nhóm nghiên cứu của Nguyễn Hải Đăng thuộc viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã phân tách được hai hợp chất mới từ loài hải sâm Holothuria scabravào năm 2007. Trong đó, nhóm nghiên cứu đã sử dụng khối phổ và cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc hóa học của hai hợp chất Holothurin A3 và Holothurin A4 với hoạt tính gây độc lên dòng tế bào ung thư KB và Hep-G2 với IC50 lần lượt là 0,87 và 0,32 µg/ml (đối với chất Holothurin A3); 1,12 và 0,57 µg/ml (đối với chất Holothurin A4). 1.3. Một số phƣơng pháp phân lập và xác định cấu trúc hợp chất hóa học 1.3.1. Sắc ký cột Đây là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, đơn giản nhất, chất hấp phụ làpha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và phađảo YMC, ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷtinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ rấtquan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ.Kích thước của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năngtách càng cao, và ngược lại.Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càngnhỏ thì tốc độ chảy càng giảm, có thể gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi khôngchảy được).Khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC)hoặc áp suất cao (HPLC). Trong sắc kí cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) rất quantrọng, nó thể hiện khả năng tách của cột.Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách,tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể.Trong sắc kí, tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờvào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp.Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng. Tuỳ theo yêu cầutách 9 Nguyễn Khắc Sinh K22-Sinh học thực nghiệm