Tài liệu Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease sống bám trên cá chim vây vàng

  • Số trang: 66 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 98 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 27125 tài liệu

Mô tả:

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG I. ............................................................................................................... 3 TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU .................................................................................... 3 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁ CHIM VÂY VÀNG ................................................................... 3 1.2. GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTICS ........................................................................ 4 CHƢƠNG II ............................................................................................................. 10 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 10 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ................................................................................................. 10 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................... 12 2.2.1. Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu ................................................................... 12 2.2.2. Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật .................................................................. 13 2.2.3. Phƣơng pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh protease mạnh nhất: đƣợc đánh giá qua hoạt tính sinh protease ....................................................................................... 15 2.2.4. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh trƣởng ................................................. 16 2.2.5. Phƣơng pháp định danh chủng vi khuẩn (theo phƣơng pháp truyền thống) .. 17 2.2.6. Phƣơng pháp xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp ..................................... 19 2.2.7. Phƣơng pháp nuôi cấy và thu canh trƣờng chứa enzyme của chủng đã phân lập trên môi trƣờng nhân giống cấp 2 ............................................................................ 22 2.3. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ............................................................................ 25 CHƢƠNG III ........................................................................................................... 26 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................. 26 3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG SINH PROTEASE CAO SỐNG BÁM TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG ..................................................................... 26 3.2. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP ................. 28 3.3. ĐẶC ĐIỀM SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP ................... 29 3.3.1. Khả năng lên men các loại đƣờng .................................................................. 29 3.3.2. Khả năng sinh hơi .......................................................................................... 31 3.3.3. Khả năng chịu muối ....................................................................................... 32 3.3.4. Khả năng di động ........................................................................................... 32 3.4. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH PROTEASE CỦA CHỦNG R2.1.5 PHÂN LẬP ĐƢỢC ................................................................................ 33 3.4.1. Thời gian nuôi cấy thích hợp .................................................................................... 33 3.4.2. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp ........................................................................... 35 3.4.3. pH thích hợp ................................................................................................... 36 3.5. THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY CHỦNG R2.1.5 TRÊN MÔI TRƢỜNG NHÂN GIỐNG CẤP 2 ......................................................................................................... 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ...................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................ 41 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1. Hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc ..................... 26 Bảng 3.2. Hoạt tính protease của 5 chủng vi khuẩn cao nhất phân lập đƣợc .......... 27 Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn tuyển chọn .......... 28 Bảng 3.4. Khả năng lên men các loại đƣờng của các chủng vi khuẩn phân lập ...... 30 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) .................................................... 4 Hình 2.1. Cách thức tiếp cận vấn đề nghiên cứu ..................................................... 13 Hình 2.2. Quá trình phân lập vi sinh vật .................................................................. 15 Hình 2.3. Quá trình tuyển chọn vi khuẩn sinh protease ........................................... 16 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm định danh vi khuẩn theo phƣơng pháp truyền thống .................................................................................................................................. 17 Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy tối ƣu ..................... 19 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy tối ƣu ..................... 20 Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ƣu ....................... 21 Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH nuôi cấy tối ƣu ............................... 22 Hình 2.9. Sơ đồ quy trình sản xuất protease từ chủng đã phân lập trên môi trƣờng nhân giống cấp 2 ............................................................................................................... 24 Hình 3.1. Hoạt tính protease của các chủng tuyển chọn đƣợc ................................. 28 Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng R2.1.5 dƣới độ phóng đại X-100... 29 Hình 3.3 Một số hình ảnh về khả năng lên men đƣờng của các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn ................................................................................................................ 31 Hình 3.4. Khả năng sinh hơi của các chủng vi khuẩn tuyển chọn ........................... 31 Hình 3.5. Khả năng chịu muối của các chủng vi khuẩn .......................................... 32 Hình 3.6. Khả năng di động của các chủng vi khuẩn .............................................. 33 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trƣởng và hoạt tính enzyme của chủng R2.1.5 ........................................................................................ 34 Hình 3.8. Sự thay đổi họat tính sinh enzyme của chủng vi khuẩn R2.1.5 khi nuôi ở của nhiệt độ môi trƣờng khác nhau ................................................................................ 36 Hình 3.9. Sự thay đổi họat tính sinh enzyme của chủng vi khuẩn R2.1.5 khi nuôi ở các pH môi trƣờng khác nhau ........................................................................................ 37 Hình 3.10. Canh trƣờng nuôi chứa enzyme protease của chủng R2.1.5 sau 18h nuôi cấy .................................................................................................................................. 38 Hình 3.11 Chế phẩm chứa chủng R2.1.5 sau khi đóng gói ..................................... 38 Hình 3.12. Xác định hoạt độ protease theo phƣơng pháp Gross & Fuld ................. 39 1 MỞ ĐẦU Việt Nam có bờ biển dài trên 3000km và vùng thềm lục địa hàng triệu km2 là điều kiện thuận lới để phát triển ngành thủy sản. Với truyền thống lao động cần cù sáng tạo của con ngƣời Việt Nam đồng thời với sự định hƣớng đúng đắn của Đảng và Nhà nƣớc, ngành Thủy sản đã phá triển mạnh mẽ vƣơn lên trở thành ngành có kim ngạch xuất khẩu đứng hàng thứ 3 chỉ sau dệt may và dầu khí. Năm 2010, sản lƣợng khai thác thủy sản là 2.450,8 ngàn tấn, kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 4,94 tỷ USD; sản lƣợng nuôi trồng thủy sản năm 2010 lên 2.706,8 ngàn tấn đã đƣa Việt Nam đứng thứ 6 trong số 10 nhà xuất khẩu thủy sản hàng đầu của thế giới và đứng thứ 5 trong khu vực châu Á sau Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia và Philippines. Để đẩy mạnh phát triển ngành thủy sản và khẳng định chủ quyền biển đảo, Chính phủ đã định hƣớng phải tăng cƣờng khai thác đánh bắt xa bờ và đẩy mạnh phát triển nuôi các loài cá biển có giá trị kinh tế, trong đó có cá chim vây vàng - đối tƣợng nuôi mới, có giá trị kinh tế cao. Tuy vậy muốn phát triển nuôi bền vững các đối tƣợng này cần phải sản xuất thức ăn có chứa các chế phẩm vi sinh vật hữu ích (probiotics) giúp tăng sức đề kháng, tăng khả năng tiêu hóa của cá trong điều kiện nuôi công nghiệp và hạn chế ô nhiễm môi trƣờng. Song hiện tại Việt Nam việc nghiên cứu chƣa nghiên cứu về chế phẩm probiotics dùng cho nuôi thủy sản còn rất hạn chế. Đặc biệt đối với cá chim vây vàng, hiện chƣa có chế phẩm dạng này. Xuất phát từ thực tế trên, em đƣợc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học giao thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease sống bám trên cá chim vây vàng”, với mục đích phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme protease ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotics dùng trong sản xuất thức ăn cho cá chim vây vàng. Nội dung của đề tài: 1) Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn sinh protease cao sống bám trên cá chim vây vàng, GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân 2 2) Xác định một số đặc tính của chủng có hoạt tính sinh protease cao, 3) Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của chủng phân lập được Do thời gian và kinh phí có hạn nên báo cáo này chắc hẳn sẽ còn c ó các hạn chế, em kính mong nhận đƣợc các ý kiến góp ý của quý thầy cô và bạn bè đồng nghiệp để cho các nghiên cứu thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn! GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân 3 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁ CHIM VÂY VÀNG Cá chim trắng vây vàng là loài cá biển có giá trị kinh tế cao, đƣợc nuôi nhiều ở Đài Loan, Trung Quốc, Singapore... và tiêu thụ mạnh trên thị trƣờng thế giới. Tuy nhiên ở nƣớc ta, cá chim trắng vây vàng là đối tƣợng khá mới mẻ. Với đƣờng bờ biển dài, diện tích mặt nƣớc biển lớn, ngành nuôi cá biển đang trên đà phát triển mạnh. Đặc biệt, điều kiện biển tự nhiên ở nƣớc ta rất thích hợp với loài cá chim trắng vây vàng. Vì môi trƣờng sống của loại cá này là vùng biển ấm, vị trí rất thích hợp, những vùng vịnh, đầm phá, eo biển, biển nội địa ít sóng gió. Bên cạnh đó, là chất lƣợng nƣớc tốt, độ mặn nƣớc biển tƣơng đối ổn định. Nguồn thức ăn cho cá có tự nhiên, thức ăn tổng hợp đơn giản và giá thành không quá đắt. Cá chim vây vàng còn có một tên gọi khác là cá sòng mũi hếch hay cá chim trứng. Là loài cá ăn tạp, thiên về động vật, cá có thể kiếm thức ăn ở trong cát, cá trƣởng thành có thể bắt những động vật vỏ cứng nhƣ: ngao, cua, ốc. Giai đoạn cá giống thức ăn là động vật phù du và động vật đáy, chủ yếu là luân trùng, nauplius của Artemia. Cá con ăn tôm cá nhỏ, hai mảnh vỏ nhỏ. Thức ăn chính của cá trƣởng thành là các loại tôm cá nhỏ.Trong điều kiện ƣơng nuôi cá dài 2 cm thức ăn là cá tạp xay nhỏ, tôm tép băm nhỏ, thức ăn tổng hợp. Cá trƣởng thành ăn tôm nhỏ và thức ăn công nghiệp hoặc hoàn toàn thức ăn công nghiệp trong nuôi thƣơng phẩm. Sau đây là hệ thống phân loại của cá chim vây vàng: Nghành: Vertebrata Lớp: Osteichthyes Bộ: Perciformes Họ: Giống: Loài: GVHD: TS Vũ Ngọc Bội Carangidae Trachinotus Trachinotus blochii Lacepede, 1801 SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân 4 Theo Borut Forlan (2004) cá chim vây vàng sống ở vùng biển hở và đƣợc tìm thấy ở Thái Bình Dƣơng, Đại Tây Dƣơng, Ấn Độ Dƣơng. Ở châu Á, cá chim vây vàng phân bố ở miền Nam Nhật Bản, Indonesia, Trung Quốc (Hoàng Hải, Đông Hải, Quảng Đông, Phúc Kiến, Hải Nam), Đài Loan. Ở Việt Nam, cá chim vây vàng đƣợc tìm thấy trên vịnh Bắc Bộ, miền Trung và Nam Bộ. Hình 1.1 Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) 1.2. GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTICS Thuật ngữ “probiotic” đƣợc Lilly và Stiwell đề xuất năm 1965 để mô tả những chất sản sinh bởi vi sinh vật làm tăng trƣởng một vi sinh vật (hoặc sinh vật) khác. Năm 1989, Parker lại định nghĩa thêm cho rõ:”Probiotic là những vi sinh vật (chủ yếu là vi khuẩn) có khả năng cộng sinh (hoặc hợp sinh) trong đường ruột có tác dụng cân bằng hệ vi sinh vật trong đó có một số tác dụng hữu ích cho vật chủ” (Parker, 1989). Nghiên cứu ứng dụng probiotic mới đƣợc chú ý trong 20 năm trở lại đây, nhƣng tác dụng của nó đã đƣợc nhận thấy từ lâu. Elie Metnhicoff là ngƣời đầu tiên đặt nền móng cho việc sử dụng probiotic (Metnhicoff, 1908). Năm 1908, ông đề nghị sử dụng vi khuẩn lactic (Lactobacterium delbruekii spp bulgaricus) để kéo dài tuổi thọ con ngƣời. Ngày nay chế phẩm probiotic đƣợc sử dụng khá hiệu quả trong chăn nuôi đặc biệt là trong nuôi tôm, trồng trọt, trong bảo vệ sức khỏe con ngƣời và bảo vệ môi trƣờng. Tuy nhiên việc dùng chế phẩm này vào nuôi trồng thủy sản (tôm, cua, cá, nhuyễn thể…) mới bắt đầu trong hơn thập kỷ gần đây. GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân 5 Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản giúp phân hủy các chất hữu cơ trong nƣớc (chất hữu cơ là một trong nhiều nguyên nhân làm môi trƣờng nƣớc bị ô nhiễm), hấp thu xác tảo chết và làm giảm sự gia tăng của lớp bùn đáy, giảm các độc tố trong môi trƣờng nƣớc (do các chất khí: NH3, H2S… phát sinh), do đó sẽ làm giảm mùi hôi trong nƣớc, giúp tôm cá phát triển tốt, nâng cao khả năng miễn dịch của tôm cá (do kích thích tôm, cá sản sinh ra kháng thể). Hơn nữa chế phẩm probiotic sẽ ức chế sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật có hại (do các loài vi sinh vật có lợi sẽ cạnh tranh thức ăn và tranh giành vị trí bám với vi sinh vật có hại). Trong môi trƣờng nƣớc, nếu vi sinh vật có lợi phát triển nhiều sẽ kìm hãm, ức chế, lấn át sự phát triển của vi sinh vật có hại, do đó sẽ hạn chế đƣợc mầm bệnh phát triển để gây bệnh cho tôm cá. Đồng thời chế phẩm probiotic giúp ổn định độ pH của nƣớc, ổn định màu nƣớc do probiotic hấp thu chất dinh dƣỡng hòa tan trong nƣớc nên hạn chế tảo phát triển nhiều. Thành phần chế phẩm probiotic thƣờng có những nhóm vi sinh vật sau: - Các nhóm vi sinh vật cơ bản: Vi khuẩn lactic, Vi khuẩn Bacillus, Vi khuẩn quang dƣỡng khử H2S – vi khuẩn tía lƣu huỳnh, Nấm men (men rƣợu Saccharomyses). - Các nhóm vi sinh vật phụ: Nhóm vi khuẩn nitrat (Nitrosomonas và Nitrobacter), Nhóm xạ khuẩn, Nhóm nấm mốc. 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Tại Nhật Bản, chế phẩm probiotic có tên gọi là E.M (các vi sinh vật hữu hiệu) do giáo sƣ, tiến sỹ Teruo Higa, Trƣờng đại học Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản đề xuất năm 1980 đã đƣợc sử dụng nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cũng nhƣ bảo vệ môi trƣờng đều cho kết quả khả quan (Higa, 1980). Đến nay chế phẩm này đƣợc hơn 80 nƣớc và vùng lãnh thổ sử dụng, đặc biệt là khu vực Châu Á và Thái Bình Dƣơng trong đó có Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam. Griffith (1995) thông báo nhờ việc đƣa probiotic vào nuôi tôm giống ở Ecuador trong năm 1992, mà các trại nuôi tôm giống giảm thời gian nghỉ để làm vệ sinh ở các GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân 6 bể nuôi từ 7 ngày trong một tháng đến 21 ngày trong một năm, sản lƣợng tôm giống tăng 35%, và giảm sử dụng các chất diệt khuẩn đến 94% . Ở Châu Á đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các chế phẩm vi sinh trong nuôi tôm, đặc biệt ở Thái Lan. Jiravanichpaisal & cộng sự (1997) đã sử dụng Lactobacillus sp. trong nuôi tôm sú (P. monodon Fabrius) . Ở Trung Quốc, nghiên cứu probiotic trong nuôi thủy sản đƣợc tập trung vào vi khuẩn quang hợp. Qiao Zhenguo & cộng sự (1992) nghiên cứu 3 chủng vi khuẩn quang hợp sử dụng cho tôm (P. chinensis) bằng cách cho vào thức ăn hoặc cho và nƣớc nuôi tôm cho thấy có sự gia tăng khả năng phát triển của tôm, loại trừ nhanh chóng NH3-N, H2S, acid hữu cơ và những chất có hại, cải thiện chất lƣợng nƣớc, cân bằng độ pH. Ngày nay probiotics đƣợc sử dụng rộng rãi và rất hiệu quả trong việc phòng bệnh cho động vật thủy sản và con ngƣời. Hiện có khoảng 500 loại chế phẩm sinh học đang lƣu thông trên thị trƣờng, trong đó có khoảng 430 loại dùng để xử lý môi trƣờng và trên 60 loại dùng để trộn vào thức ăn nhằm mục đích kích thích tăng trƣởng, tăng sức đề kháng…nhƣng chủ yếu vẫn tập trung vào xử lý môi trƣờng. Các loại chế phẩm này có nguồn gốc từ nhiều nƣớc: Trung Quốc, Indonesia, Đài Loan, Anh, Mỹ, Ấn Độ, Hàn Quốc, Úc, Đức, và Thái Lan (Aditya et al., 2008; Wang et al., 2008). Để tạo thành các chế phẩm hoàn chỉnh, các probiotics có thể đƣợc sử dụng kết hợp với các chất có hoạt tính sinh học khác. Chẳng hạn, chế phẩm De-Odorase của hãng Bayer sử dụng hoạt chất chính đƣợc chiết xuất từ thực vật (từ cây Yucca) kết hợp với nấm men và vi khuẩn. Chế phẩm này giúp loại bỏ các khí độc trong ao ƣơng nuôi tôm cá nhƣ khí: NH3, H2S, NO2… do đó giảm ô nhiễm môi trƣờng nuôi. Tuy nhiên, chế phẩm này có nhƣợc điểm là không khống chế đƣợc vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật trong ao. Chế phẩm BZT (BZT Aquaculture và BZT Waster digester) là sự kết hợp giữa các vi khuẩn và enzyme, giúp xử lý lớp bùn đáy ao ô nhiễm và làm sạch môi trƣờng. Các vi khuẩn có lợi trong chế phẩm này bao gồm Lactobaccilus spp., Nitromonas spp., Nitrobacter spp., Bacillus spp., và Clostridium spp. GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân 7 Những nghiên cứu về việc sử dụng chế phẩm probiotics trong lĩnh vực thủy sản chỉ ra rằng các probiotics có một số lợi ích sau: làm ổn định chất lƣợng nƣớc và nền đáy trong ao nuôi tôm cá, nâng cao sức khoẻ và sức đề kháng cho tôm, cá nuôi, giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng ao nuôi và xung quanh do nuôi trồng thuỷ sản gây nên và nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn (Verschuere et al., 2000). Các đánh giá về hiệu quả môi trƣờng của chế phẩm sinh học chỉ ra rằng các chủng vi sinh vật trong các chế phẩm probiotics có khả năng phân giải nhanh xác tảo tàn, thức ăn thừa, hoặc có tác dụng xử lý các chất hữu cơ lơ lửng, cạnh tranh và làm giảm vi khuẩn gây bệnh trong nƣớc, xử lý ô nhiễm bùn đáy ao nuôi (Zhou et al., 2009). Một số công trình nghiên cứu trên thế giới đã công bố cho thấy sử dụng các chế phẩm probiotics trong thức ăn nuôi trồng thuỷ sản còn có các lợi ích nhƣ sau: - Giúp làm giảm stress cho tôm cá qua đó cải thiện sức khỏe của động vật nuôi đồng thời làm giảm tác động có hại của thức ăn thừa đến môi trƣờng. - Do quy luật cạnh tranh và loại trừ vi khuẩn gây bệnh, các vi sinh vật có lợi trong chế phẩm probiotics sẽ cạnh tranh và làm giảm sự phát triển cũng nhƣ độc tính của vi khuẩn gây bệnh. Vì thế chế phẩm probiotics sẽ giúp cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột và giảm thiểu vi sinh vật gây bệnh trong đƣờng ruột của vật nuôi. - Mặt khác, một số lọai vi khuẩn có lợi trong chế phẩm probiotics nhƣ Bacillus subtilis, nấm men...còn là nguồn cung cấp dinh dƣỡng protein, vitamin, nhất là sản xuất ra các enzyme tiêu hóa nhƣ protease, amylase,.. Vì thế khi bổ sung chế phẩm probiotics có khả năng sinh enzyme vào thức ăn nuôi động vật thủy sản nhất là nuôi tôm nói chung và thức ăn nuôi tôm hùm nói riêng sẽ làm tăng cƣờng quá trình tiêu hóa thức ăn trong đƣờng ruột của tôm và giảm chi phí thức ăn. - Quan trọng hơn, các vi sinh vật có lợi trong chế phẩm probiotics nhƣ các lọai vi khuẩn lactic còn kích thích tăng cƣờng hệ miễn dịch của động vật thủy sản chống lại vi sinh vật gây bệnh nên nguy cơ dịch bệnh ở vật nuôi sẽ đƣợc giảm thiểu. Do vậy khi sử dụng chế phẩm probiotics trong thức ăn nuôi động vật thủy sản nói chung và cá chim GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân 8 vây vàng nói riêng sẽ giúp hạn chế dịch bệnh và ngăn chặn việc lạm dụng kháng sinh trong nuôi trồng. 1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc Hiện đã có một số chế phẩm probiotics đƣợc đƣa vào sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản ở Việt Nam từ đầu những năm 1995, chủ yếu là các chế phẩm nhập ngoại từ Mỹ và Nhật Bản. Một số chế phẩm đƣợc sản xuất trong nƣớc. Các chế phẩm đƣợc biết đến nhiều nhất thuộc nhóm EM (“Effective Microorganisms™”) có nguồn gốc từ Nhật Bản. Một số chế phẩm khác nhƣ: ACTIVE CARE, ACTIVE CLEANER, GEM-P … đƣợc sử dụng để bổ sung vào ao nuôi nhằm cải thiện chất lƣợng nƣớc và làm giảm stress cho động vật thuỷ sản, đã mang lại những hiệu quả đáng khích lệ và góp phần đáng kể vào việc phát triển của ngành nuôi trồng thuỷ sản. Một số nghiên cứu trong nƣớc ở lĩnh vực sản xuất các chế phẩm probiotics ứng dụng trong nuôi trồng thuỷ sản đã đƣợc tiến hành và cho một số kết quả bƣớc đầu đáng chú ý. Khuất Hữu Thanh (2009) đã công bố nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học để hoàn thiện chế phẩm BIO-TS3 có khả năng tăng sức đề kháng của tôm trong nuôi tôm sú thâm canh và thu đƣợc nhiều kết quả đáng khích lệ là chế phẩm này có khả năng cải thiện chất lƣợng ao nuôi (Khuất Hữu Thanh (2009), Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học hoàn thiện chế phẩm BIO-TS3 có khả năng tăng sức đề kháng của tôm trong nuôi tôm sú thâm canh, Hội thảo đánh giá kết quả thực hiện đề tài dự án CNSH Nông nghiệp, Thủy sản giai đoạn 2007-2008). Trong năm 2009, Chi cục Quản lý chất lƣợng nông lâm sản và thủy sản tỉnh Đồng Tháp đã triển khai mô hình “Qui trình ƣơng cá tra giống trên ao có sử dụng chế phẩm sinh học”. Mô hình tiến hành trên 2 ao diện tích 4.000 m2 và 2 ao diện tích 6.000 m2. Kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng chế phẩm sinh học làm giảm nồng độ N-NH4, NO2, H2S, số lƣợng vi khuẩn Aeromonas và Pseudomonas trong ao nuôi cá tra. Hơn nữa, ở ao dùng chế phẩm sinh học, tình trạng cá khỏe và không có biểu hiện nhiễm bệnh. Trong ao không sử dụng chế phẩm sinh học, cá bị nhiễm ký sinh trùng (15 – 20 GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân 9 con/10x10) và có biểu hiện bệnh nhiễm khuẩn từ ngày thứ 20-25, sau khi điều trị thì cá bị hao hụt, tỷ lệ sống giảm và tăng trƣởng không đều. Cuối cùng, sử dụng chế phẩm sinh học còn làm tăng tỉ lệ sống đạt 33,26% so với ao đối chứng không sử dụng chế phẩm là 26% và làm giảm hệ số chuyển hóa thức ăn là 0,6 so với đối chứng là 0,8. Sử dụng probiotics có tác dụng trên nhiều mặt và có nhiều triển vọng. Tuy nhiên, tại Việt Nam chƣa có những nghiên cứu đầy đủ về vai trò của vi sinh vật, đặc biệt là chƣa có các nghiên cứu bổ sung chúng vào thành phần thức ăn viên cho nuôi cá chim vây vàng. Do vậy việc “Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease sống bám trên cá chim vây vàng” với mục đích sử dụng cho sản xuất probiotics làm thức ăn cho cá chim vây vàng là một hƣớng nghiên cứu cần thiết. GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân 10 CHƢƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Mẫu phân lập vi sinh Mẫu cá chim vây vàng đƣợc thu tại Trại thực nghiệm nuôi cá chim vây vàng của Khoa Nuôi trồng Thủy sản - Ba Làng - Nha Trang. 2.1.2. Môi trƣờng nuôi vi sinh vật, hóa chất và thuốc thử Môi trƣờng phân lập vi khuẩn Môi trƣờng TSB Casein peptone 17g Soya peptone 3g NaCl 5g K2HPO4 4g Glucose 2.5g Bile Salts 1.5g pH 7.4 ± 0.2 Môi trƣờng tăng sinh: Ankaline Peptone Water (APW) Pepton : 10 g; Natri clorua (NaCl) : 30 g Nƣớc cất : 1 lít ; pH = 8,5 ± 0,2 Hoà tan các thành phần, điều chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình tam giác. Hấp ở nhiệt độ 121oC trong 10 phút. Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình, để tránh bay hơi nƣớc và pH bị thay đổi. Môi trƣờng lên men đƣờng (Môi trƣờng cơ bản) Pepton : 10 g NaCl : 30 g; Cao thịt bò : 3 g; GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân 11 Phenol đỏ : 0,04 g; Nƣớc cất : 1 lít; pH = 7,0 ± 0,2 Hoà tan các thành phần trên, chỉnh pH rồi rót 2,5 ml vào các ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 10 phút. Pha các loại dung dịch cacbonhydrat 50% (nhƣ: sucrose, lactose,D-mannitol, mantose..) trong nƣớc cất rồi lọc vô trùng. Thêm 0,278 ± 0,002 ml dung dịch này vào ống nghiệm chứa 2,5 ml môi trƣờng cơ bản. Môi trƣờng cuối cùng có nồng độ carbohydrat là 5%. Môi trƣờng thạch thƣờng Pepton 10g Nƣớc mắm 20ml Nƣớc cất 1000ml Môi trƣờng nhân giống cấp 2 Bột đậu nành 30% Cám gạo 20% Bột sữa 10% Bột bắp 40% Khoáng DAP 32% Nƣớc 80% Thuốc nhuộm Tím Violet Tím violet :1g Rƣợu ethylic : 1 g Phenol tinh thể: 2g Nƣớc cất : 100 ml Pha chế Hòa tan 1 g tím violet vào trong 10 ml cồn (dung dịch 1) Hòa tan 2 g phenol tinh thể vào 10 ml nƣớc cất (dung dịch 2) Trộn chung dung dịch 1 và dung dịch 2 lại với nhau ta có dung dịch thuốc nhuộm tím violet Thuốc nhuộm Liugol GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân 12 Iod tinh thể : 1 g KI :2g Nƣớc cất : 200 ml Pha chế: Hòa tan iod vào nƣớc cất, sau đó cho KI vào, bảo quản trong lọ tối màu. Thuốc nhuộm Fuschin Fuschin kiềm : 1g Rƣợu ethylic 95% : 10 ml Phenol tinh thể : 5g Nƣớc cất : 100 ml Pha chế: Hòa tan Fuschin vào trong 10 ml cồn 95% (dung dịch 1). Hòa tan phenol tinh thể vào 100 ml nƣớc cất (dung dịch 2). Trộn đều dung dịch 1 và dung dịch 2 đem lọc, ta có thuốc nhuộm Fuschin. Dung dịch xanh methylen Rƣợu ethylic: 300 ml Xanh methylen: 25 g Hòa tan xanh methylen vào rƣợu rồi lọc (dung dịch 1). Dịch lọc 1 thêm 1 ml KOH 1% và 1000 ml nƣớc cất. Dung dịch nƣớc muối sinh lý Hoà tan 8,5 g NaCl trong 1 lít nƣớc cất. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút rồi để nguội. 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu Đề tài sử dụng cách tiếp cận kế thừa và chọn lọc các phƣơng pháp phân lập tuyển chọn các chủng probiotics có khả năng sinh enzyme protease theo sơ đồ: GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân 13 Phân lập • Phân lập vi khuẩn tổng số trên môi trƣờng TSB • Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính protease • Xác định các đặc điểm hình thái • Xác định một số đặc tính sinh lý, sinh hóa Xác định hình thái • Tiến hành định danh chủng có hoạt tính cao nhất Định danh Thử nghiệm nuôi cấy và thu sinh khối trên môi trường nhân giống cấp 1 và 2 • Tiến hành khảo sát một số điều kiện nuôi cấy thích hợp • Thu sinh khối Hình2.1. Cách thức tiếp cận vấn đề nghiên cứu 2.2.2. Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật Mục tiêu của thí nghiệm là tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn sinh protease mạnh nhất. Thí nghiệm đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau: Xử lý mẫu GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân
- Xem thêm -