Tài liệu Nghiên cứu nuôi cấy tảo chlorella thu nhận sinh khối

  • Số trang: 36 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 57 |
  • Lượt tải: 0
trangtranthi64149

Tham gia: 04/06/2016

Mô tả:

Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối Mục Lục LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................... 6 MỞ ĐẦU.................................................................................................................................. 7 Mục Tiêu Đề Tài ........................................................................................................... 7 1. 2. Cách Tiếp Cận, Phƣơng Pháp Nghiên Cứu, Phạm Vi Nghiên Cứu ..................................... 7 2.1. Phạm Vi Nghiên Cứu: quy mô phòng thí nghiệm ......................................................... 7 2.2. Phương Pháp Nuôi Cấy .............................................................................................. 7 Phần 1: Tổng Quan ................................................................................................................... 8 1.1. Tổng quan về tảo Chlorella vulgaris .......................................................................... 8 1.1.1. Giới thiệu chung về chi tảo Chlorella ................................................................. 8 1.1.2. Đặc điểm sinh học .............................................................................................. 8 1.1.3. Giá Trị Dinh Dƣỡng .............................................................................................. 10 1.2. Tổng quan về kỹ thuật nuôi tảo .................................. Error! Bookmark not defined. 1.2.1. Nuôi cấy batch ................................................... Error! Bookmark not defined. 1.2.2. Nuôi bằng kỹ thuật fed-batch ............................. Error! Bookmark not defined. 1.2.3. Nuôi bằng kỹ thuật cyclic fed-batch ................... Error! Bookmark not defined. 1.2.4. Ƣu điểm của kỹ thuật fed-batch và kỹ thuật cyclic fed-batch. ..Error! Bookmark not defined. 1.3 Hệ Thống Nuôi Tảo Quy Mô Phòng Thí Nghiệm............ Error! Bookmark not defined. Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................. Error! Bookmark not defined. 2.1 Vật liệu v môi trƣờng thí ngiệm ..................................... Error! Bookmark not defined. 2.1.1 Giống tảo................................................................ Error! Bookmark not defined. 2.1.2 Địa điểm thí nghiệm ............................................... Error! Bookmark not defined. 2.1.3 Hóa chất sử dụng .................................................... Error! Bookmark not defined. 2.1.3.1. Hóa chất pha môi trƣờng nuôi tảo ................... Error! Bookmark not defined. 2.1.3.2. Hóa chất dùng trong phân tích thí nghiệm....... Error! Bookmark not defined. 2.1.4. Thiết bị ................................................................. Error! Bookmark not defined. 2.1.4.1. Thiết bị nuôi tảo ............................................. Error! Bookmark not defined. 2.1.4.2. Thiết bị dùng cho phân tích ............................ Error! Bookmark not defined. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu........................................... Error! Bookmark not defined. 2.2.1 Trình tự tiến hành thí nghiệm ............................ Error! Bookmark not defined. 2.2.2 ố trí thí nghiệm ............................................... Error! Bookmark not defined. 2.2.2.1. Thí nghiệm - Xác định động học sinh trƣởng của tảo Chlorella vulgaris khi nuôi cấy trong bình erlen thể tích ml ........................... Error! Bookmark not defined. GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Page iv Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối 2.2.2.2. Thí nghiệm - Động học sinh trƣởng của tảo Chlorella vulgaris khi nuôi cấy fed-batch và cyclic fed-batch trên hệ thống bể nuôi cấy quang học dạng tấm phẳng thể tích với th nh phần môi trƣờng Walne .............................. Error! Bookmark not defined. 2.2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu động học sinh trƣởng của vi sinh vật (GS TS. Nguyễn ân Dũng, ) ............................................................... Error! Bookmark not defined. 2.2.3.1. Đƣờng cong sinh trƣởng ................................. Error! Bookmark not defined. 2.2.3.2. Tính toán về quá trình sinh trƣởng (PGS TSKH Bookmark not defined. 2.2.4. V N HOÀNG) ..... Error! Phƣơng pháp phân tích các chỉ tiêu .................. Error! Bookmark not defined. Phần : K T QUẢ VÀ ÀN UẬN ....................................................................................... 29 3.1 Động học sinh trƣởng tảo Chlorella vulgaris khi nuôi cấy trong các erlen thể tích 500ml ........................................................................................................................................... 29 Động học sinh trƣởng của tảo Chlorella vulgaris khi nuôi cấy fed-batch và cyclic fedbatch trên hệ thống bể nuôi cấy quang học dạng tấm phẳng thể tích với th nh phần môi trƣờng Walne ........................................................................ Error! Bookmark not defined. 3.3 Kết quả đo h m lƣợng protein trong sinh khối tảo. ..... Error! Bookmark not defined. K T UẬN VÀ Đ XUẤT KI N ........................................ Error! Bookmark not defined. 1. Kết luận........................................................................ Error! Bookmark not defined. 2. Đề xuất ý kiến ............................................................... Error! Bookmark not defined. TÀI IỆU TH M KHẢO ......................................................... Error! Bookmark not defined. GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Page v Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên xin gửi lời cảm ơn quý thầy cô trong khoa Công Nghệ Hóa Học & Thực Phẩm trƣờng Đại Học Sƣ Phạm Kỹ Thuật Tp HCM đã tạo những điều kiện tốt nhất để em có thể ho n th nh đề tài nghiên cứu khoa học này. Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn thầy Trịnh Khánh Sơn đã hƣớng dẫn tận tình và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu để em có thể hoàn thành nghiên cứu này. Bên cạnh đó xin cảm ơn anh ê Th nh Đạt, chị Nguyễn Trần Kim Ngân, Nguyễn Thị Phƣơng Thùy, Nguyễn Thị Ý và các bạn sinh viên lớp đồng h nh v giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn! Tp.HCM. Ngày 16 tháng 7 năm Sinh viên thực hiện Nguyễn Văn Thôi GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Page 6 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối MỞ ĐẦU 1. Mục Tiêu Đề Tài Khảo sát động học sinh trƣởng của tảo Chlorella vulgaris bằng kỹ thuật nuôi cấy mẻ (batch) và nuôi cấy mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch) Xây dựng đƣợc hệ thống các phép đo, công thức tính toán để khảo sát động học về sự sinh trƣởng của tảo Khảo sát sự tác động cụ thể của các yếu tố môi trƣờng , nhiệt độ, pH, nguồn cung cấp carbon, nitơ…tác động đến sự sinh trƣởng của tảo, từ đó có thể tiến hành tính toán tối ƣu hóa quá trình nuôi tảo thu sinh khối 2. Cách Tiếp Cận, Phƣơng Pháp Nghiên Cứu, Phạm Vi Nghiên Cứu 2.1. Phạm Vi Nghiên Cứu: quy mô phòng thí nghiệm Nuôi trồng tảo đối với qui mô phòng thí nghiệm đƣợc tiến hành trong những bình chứa nhỏ trong suốt có dung tích từ 0,5 – 1 lít và hệ thống quang học tấm phẳng 60L Môi trƣờng nuôi cấy bao gồm những thành phần hóa chất tinh khiết phù hợp với loại tảo cần nuôi trồng. Kết hợp sục khí đảo trộn môi trƣờng, có thể có bơm điều chỉnh lƣợng khí CO đƣa v o bình Sử dụng nguồn ánh sáng nhân tạo từ đèn huỳnh quang. Ngo i ra cũng có thể sử dụng các hệ thống bình lên men (photobioreactor) có dung tích nhỏ trong phòng thí nghiệm. Về nguyên tắc, hệ thống giống nhƣ các bể lên men vi sinh vật nhƣng phải đƣợc trang bị thêm thiết bị chiếu sáng cho tảo quang hợp. Nhiều nƣớc sử dụng hệ thống này kèm theo thiết bi điều chỉnh tự động các thông số môi trƣờng thông qua một máy vi tính. Vi tảo nuôi trồng trong hệ thống này là sạch thuần khiết 2.2. Phương Pháp Nuôi Cấy + Nuôi cấy mẻ (batch) + Nuôi cấy mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch) + Nuôi cấy bằng phƣơng pháp cyclic fed-batch GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Page 7 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối Phần 1: Tổng Quan 1.1. T ng u n về tả Chlorella vulgaris 1.1.1. Giới thiệu chung về chi tảo Chlorella Vị trí phân loại: − Nhóm: Eukaryota − Giới: Flora ( thực vật) − Ngành: Chlorophyta (tảo lục) − Lớp: Trebouxiophyceae − Bộ: Chlorellales − Họ: Chlorellaceae − Chi: Chlorella − Loài : Chlorella vulgaris (Bold and Wynne, 1978) 1.1.2. Đặc điểm sinh học Chlorella là loại tảo đơn b o, không có tiêm mao, không có khả năng di động chủ động, tế bào có dạng hình cầu hoặc hình oval. Kích cỡ tế bào từ 3-5µm, hay 2-4 µm tùy lo i, tùy điều kiện môi trƣờng v giai đoạn phát triển. Màng tế bào có vách cellulose bao bọc, chịu đƣợc những tác động cơ học nhẹ. Sự thay đổi của các điều kiện môi trƣờng nhƣ ánh sáng, nhiệt độ, thành phần các chất hóa học trong môi trƣờng sẽ ảnh hƣởng đến hình thái và chất lƣợng của tế bào tảo (Trần Văn Vĩ, 99 ) Chlorella thƣờng sống ở vùng nƣớc ngọt v có h m lƣợng chlorophyll cao nhất (đạt 28,9g/kg) so với bất kỳ thực vật quang hợp n o đƣợc biết đến trên trái đất. Chlorella đã xuất hiện cách đây , tỷ năm v l dạng sống đầu tiên có nhân thật. Các hóa thạch kỹ tiền Cambri đã chỉ ra sự tồn tại của Chlorella ở thời kỳ này. Tảo Chlorella sinh sản bằng bào tử. khi gặp điều kiện sống thuận lợi, tảo Chlorella sẽ lớn dần lên đến một kích thƣớc nhất định rồi tiến hành quá trình phân bào. Chất nguyên sinh sẽ thu nhỏ lại ít nhiều trong lòng vỏ tế bào, rồi sau đó sẽ tiến h nh chia đôi từ 1-3 lần liên tiếp hình thành nên từ 2-8 khối bào chất riêng lẻ có cả nhân và lục lạp. Mỗi tế bào chất mới sẽ GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Page 8 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối hình thành lớp vỏ mới, khi đó lớp vỏ cũ sẽ vỡ ra và phóng thích các tế bào con. Quá trình sinh sản nói chung đƣợc chia thành nhiều bƣớc theo nghiên cứu của Tamiya (1963) (trích bởi Sharma, 1998) trong khi nghiên cứu vòng đời của Chlorella ellipsoidea chia l m 4 giai đoạn:  Giai đoạn tăng trƣởng: ở giai đoạn này các tự bào tử sẽ tăng nhanh về kích thƣớc nhờ các sản phẩm sinh tổng hợp  Giai đoạn bắt đầu chín: tế bào mẹ chuẩn bị quá trình phân chia  Giai đoạn chín mùi: tế b o nhân lên trong điều kiện có ánh sáng hoặc trong bóng tối  Giai đoạn phân cắt: màng tế bào mẹ bị vỡ ra, các tự bào tử đƣợc phóng thích ra ngo i : Sinh trƣởng - trƣởng thành - thành thục - phân chia Hình 1.1.Sự sinh sản của tảo Chlorella Dƣới những điều kiện sống tối ƣu: nhiều ánh sáng, nƣớc trong và không khí sạch Chlorella sinh sản với tốc độ vô cùng lớn. Một tế bào Chlorella sẽ phân chia thành 2-8 tế bào con trong thời gian chƣa đến 24 giờ. Tuổi thọ của một vòng đời tế bào Chlorella phụ thuộc v o cƣờng độ ánh sáng mặt trời, nhiệt độ và nguồn dinh dƣỡng trung bình là khoảng 7 giờ. Một số loài phổ biến thuộc chi Chlorella là: Chlorella pyrenoidosa và Chlorella vulgaris. GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Page 9 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối 1.1.3. Giá Trị Dinh Dƣỡng Sinh khối tảo chlorella là một trong những thực phẩm giúp làm sạch ruột và hệ bài tiết, thanh lọc gan và máu tốt nhất là chlorophyll – chất này có nhiều trong rau (đặc biệt l rau có m u xanh đậm) và cỏ linh lăng; tuy nhiên lƣợng chlorophyll tìm thấy trong những loại cây này chỉ khoảng 0,2 – 1%. Trong khi đó tỷ lệ này ở tảo lục Chlorella là cao nhất: chiếm từ 3 – 5% chlorophyll. Bổ sung chlorophyll vào khẩu phần ăn có thể tăng tốc độ thanh lọc ruột, máu và gan, bên cạnh đó còn giúp làm lành những mô bị tổn thƣơng + Thực phẩm giàu chlorophyll nhất + Chứa nhiều vitamin, đặc biệt là B, C, E + Cũng cố sức khỏe hệ tiêu hóa v đƣờng ruột. + Tăng cƣờng hệ miễn dịch + Kích thích phục hồi mô thƣơng tổn. + H m lƣợng protein cao với đầy đủ 8 acid amine thiết yếu,Có hàm lƣợng protein cao (chiếm khoảng 40-55% chất khô) đặc biệt là lysine + Cho đến nay chƣa tìm thấy độc tố nào nguy hiểm tồn tại trong sinh khối tảo + Không bị virus tấn công, sống trong những điều kiện đơn giản + Tảo có khả năng l m sạch các nguồn nƣớc bẩn, giữ vệ sinh môi trƣờng. 1. Giải độc: Nhờ có lớp màng thớ( sporopolleine), chllorella hấp thu đƣợc các kim laọi nặng, thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng v dƣ chất của các loại phân hoá học nhờ vậy giúp cơ thể đ o thải độc tố này ra ngoài. 2. Chlorophylle: Làm sạch và cung cấp oxy: Chlorella rất giàu Chlorophylle, thành phần giúp cung cấp oxy cho các mô và làm sạch đƣờng ruột. 3. C.G.F(Chlorella grow factor)- Nhân tố sinh trƣởng của Chlorella: GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Page 10 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối Nằm trong nhân của Chlorella, C.F.G là một hỗn hợp đƣợc tạo thành từ các Vitamin, các nucleoit ( DN, RN) v các axit amin C F G l cơ sở di truyền của Chlorella. - Tăng sức đề kháng tự nhiên: Với C.F.G, Chlorella tham gia vào quá trình l m tăng bạch huyết bào T( thuộc hệ miễn dịch của cơ thể) -Tăng khả năng chịu đựng và sự dẻo dai: C.F.G có thể coi là nguồn tập trung năng lƣợng: các thí nghiệm ở các vận động viên thể thao cho thấy chỉ với một liều dùng duy nhất, tác dụng khả năng chịu đựng và dai sức có thể duy trì trong 10 tiếng sau đó - Hiệu quả probiotic và cân bằng hệ vi khuẩn ruột: Số lƣợng vi khuẩn actobaccilius tăng lên nhờ sự có mặt của C.F.G. Do vậy hiệu quả probiotic( lợi ích về sức khoẻ do vi khuẩn có ích đƣợc nuôi cấy mang lại) đƣợc phát huy. 4. Vitamin và khoáng chất: - Tăng cƣờng sức sống: trong đó phải đặc biệt kể đến vai trò của vitamin B6, B12 và phốt pho có tác dụng cũng cố hệ thần kinh và cải thiện giấc ngủ. - H m lƣợng sắt cao trong Tảo lục giúp tăng cƣờng chức năng tạo máu. - Do có nhiều sợi Xenlulô( chất xơ) nên giúp tiêu hoá tốt duy trì sự khoẻ mạnh của đƣờng ruột 5. Tảo lục là bạn đồng hành của phụ nữ tuổi mãn kinh. Mọi nghiên cứu cho thấy phụ nữ ở độ tuổi mãn kinh từ 4 đến 55 dùng tảo lục đúng liều lƣợng sẽ giảm hẳn những rắc rối thƣờng gặp ở tuổi mãn kinh nhƣ táo bón, mệt mỏi, tùng cơn bốc hoả... 6. Giảm lƣợng mỡ trong máu: Giảm sự ngƣng đọng Cholesterol, chống đƣợc các bệnh về tim nhƣ nhồi máu cơ tim, xơ cứng động mạch vành. 7. Có tác dụng tốt đối với các chức năng của nam giới. 8. Là chất khử mùi hôi có hiệu quả: GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Page 11 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối - Chlorella có chứa một loại hormon kích thích sự tái sinh của các tế bào. Các bác sỹ ở Nhật Bản đã chữa trị thành công nhiều ca viêm loét dạ dày chỉ với Chlorella với một loại thuốc chống dƣ axit - Chlorella có tác dụng làm giảm huyết áp Điều đặc biệt là nó không làm giảm huyết áp bình thƣờng mà chỉ phát huy tác dụng này ở những trƣờng hợp huyết áp cao, làm giảm cholesterol xấu v tăng cƣờng cholesterol tốt. Hiện nay các sản phẩm từ tảo đều là ngoại nhập với giá th nh cao, ngƣời tiêu dùng chƣa có điều kiện tiếp cận, từ những kết quả trên có thể thấy đƣợc việc nghiên cứu phát triển đề t i n y để tìm ra một phƣơng pháp sản xuất quy mô lớn,tạo ra các sản phẩm mang nhiều ý nghĩa về dinh dƣỡng cũng nhƣ y học. [theo wikipedia] Bảng 1.1.Thành phần sinh hóa của tảo Chlorella vulgaris Thành phần % KLK Protein 51÷58 Lipid 14÷12 Carbohydrat 12÷17 Kham khảo Trubachev (1976) 1.2.T ng u n về ỹ thuật nuôi tả 1.2.1. Nu i cấ batch Là một kỹ thuật nuôi truyền thống trong nuôi cấy vi sinh vật, sau mỗi đợt nuôi cấy ngƣời ta thu toàn bộ sinh khối chỉ chừa lại một phần giống vi sinh vật để cho nuôi cấy đợt kế tiếp Thông thƣờng thì trong công nghiệp tỷ lệ giống giữ lại là 10% so với tổng sinh khối thu hoạch. 1.2.2. Nu i ng ỹ thuật -batch Kỹ thuật fed-batch là một kỹ thuật hiện đại trong nuôi cấy vi sinh vật. Trong quá trình nuôi ngƣời ta bổ sung thêm môi trƣờng v o, v nhƣ vậy thể tích môi trƣờng nuôi tăng dần cho đến khi đạt đƣợc mức thể tích cần thu hoạch. GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Page 12 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối 1.2.3. Nu i ng ỹ thuật cyclic fed-batch Kỹ thuật cyclic fed-batch là một kỹ thuật hiện đại trong nuôi cấy vi sinh vật, khi sinh khối vi sinh vật đạt cực đại ngƣời ta tiến hành thu sinh khối tuy nhiên một lƣợng lớn sinh khối đƣợc giữ lại để nuôi cấy cho mẻ tiếp, thƣờng thì tỷ lệ sinh khối thu hoạch so với tổng thể tích sinh khối là 1:3, 1:2. 1.2.4. Ƣu điểm của kỹ thuật fed-batch và kỹ thuật cyclic fed-batch. So với kỹ thuật nuôi cấy batch truyền thống thì kỹ thuật fed-batch và cyclic fed-batch có nhiều ƣu điểm hơn v đƣợc minh chứng qua nhiều đề tài nghiên cứu khác nhau và kết quả thu đƣợc là một minh chứng. 1.3 Hệ Thống Nuôi Tảo Quy Mô Phòng Thí Nghiệm Hiện nay có nhiều hệ thống nuôi tảo ở quy mô phòng thí nghiệm khác nhau nhƣng đa phần đều dựa trên nguyên tắc dùng bể hoặc bình chứa trong suốt có độ truyền sáng tốt, có ống sục khí CO2 và chiếu sáng. Dạng bể bản mỏng Bình erlen ( 0,5-1L) Dạng chai thủy tinh GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Dạng quang học tấm phẳng 60L Page 13 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật iệu v i t ƣờng thí ngiệm 2.1.1. Giống tả Giống Chlorella Vulgaris có kích thƣớc tế bào từ 5- µm, đƣợc cung cấp bởi Viện Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản 2 TP.HCM 2.1.2. Đị điểm thí nghiệm Phòng thí nghiệm Vi Sinh, khoa công nghệ Hóa Học và Thực Phẩm trƣờng Đại Học Sƣ Phạm Kỹ Thuật Tp.HCM 2.1.3. Hóa chất sử dụng 2.1.3.1. Hóa chất ph i t ƣờng nu i tả Có nhiều môi trƣờng dinh dƣỡng dùng để nuôi tảo nhƣ: Môi trƣờng Walne, Guillard, Ryther, Tamya, Ito v môi trƣờng phân vô cơ Tuy nhiên, trong phạm vi nghiên cứu chỉ dụng môi trƣờng Walne. Bảng 2.1.Thành phần và cách pha chế Dung ịch A i t ƣờng Walne (Walne PR, 1970) Th nh phần Thứ tự Số ƣợng g FeCl3 (4) 0.8 MnCl2.4H20 (5) 0.4 H3PO3 (3) 33.6 EDTA (1) 45 NaH2PO4.2H20/ (6) 20 (2) 100 NaH2PO4.2H20 NaNO3/KNO3 Tất cả ph đến 1L nƣớc ngọt Dung ịch Tất cả ph đến 1 ZnCl2 2,1 CoCl2.6H20 2 (NH4)6Mo7O24.4H20 0,9 CuSO4.5H20 2 nƣớc ngọt GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Page 14 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối Dung ịch C Vitamine B1 200mg Vitamine B12 10mg Tất cả ph đến 1 Cách ph nƣớc ngọt i t ƣờng Dung dịch A: Cân toàn bộ hoá cho vào bình thuỷ tinh, sau đó đổ nƣớc ấm khoảng 600C cho đến khi đƣợc 1 lít, khấy đều cho tan. Dung dịch B: pha dung dịch th nh ml nƣớc ấm, dùng 1ml dung dịch B cho vào 1 lít dung dich A. Trộn tiếp dung dịch C vào dung dịch A với số lƣợng vitamin (B:1 ống/ 1 L dung dịch A, B12: 5 ống/1 L dung dịch A). Cuối cùng ta có dung dịch A tổng hợp dùng để bón cho tảo. Liều lƣợng dùng ở phòng thí nghiệm là 1 ml/1L tảo nuôi, nuôi ở ngoài trời dùng 1 – 2 ml/10 L tảo nuôi. 2.1.3.2. Hóa chất dùng trong phân tích thí nghiệm Etanol 98%; H2SO4 0,1N; NaOH 0,1N; H2SO4 đậm đặc; HClO4; Phenolphtalein 2.1.4. Thiết bị 2.1.4.1. Thiết bị nuôi tảo Bể nuôi cấy quang học đƣợc thiết kế với kích thƣớc: 20x10x35 cm. Bên trong bể có trang bị dây và ống sục khí đƣợc nối với bơm không khí bên ngo i Hình 2.1.Hệ thống bể nuôi cấy quang học dạng tấm phẳng GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Page 15 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối Hình 2.2.Bơm sục khí 2.1.4.2. Thiết bị dùng cho phân tích Máy ly tâm E đối lƣu hãng ; máy đo quang phổ UV Libra S32 hãng Biochrom; tủ sấy INDER; máy đo pH METT ER TO EDO hãng SevenEasy; cân phân tích 4 số lẻ TE62 hãng Sartorius; buồng hút khí độc Safehood 7 ; máy chƣng cất đạm Kjeldahl; buồng đếm hồng cầu; kính hiển vi quang học. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Trình tự tiến hành thí nghiệm 2.2.1.1. Xử lý nguồn nƣớc Nguồn nƣớc dùng cho nuôi cấy, phân lập và giữ giống đƣợc sử dụng l nƣớc cất đƣợc cho vào các bình thủy tinh định mức ml sau đó thêm ml môi trƣờng dinh dƣỡng Walne, khoáng rồi đƣợc đem đi hấp tiệt trùng ở 1210C, 1 atm trong 30 phút sau đó bổ sung thêm vitamin đem để nguội rồi tiến hành sử dụng để nuôi cấy tảo. 2.2.1.2. Vệ sinh dụng cụ Đối với các dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh: bình nuôi tảo, ống nghiệm, bình đựng môi trƣờng, đều đƣợc rửa sạch bằng nƣớc máy sau đó đem đi hấp tiệt trùng ở 121oC, atm trong phút Đối với các dụng cụ bằng nhựa: can đựng nƣớc cất, can 5L nhân giống tảo, ống của bơm thổi khí cho tảo…đều đƣợc đem ngâm trong dung dịch Chlorine có nồng độ ppm để khử trùng rồi rửa lại bằng nƣớc máy đã đun sôi GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Page 16 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối 2.2.1.3. Vệ sinh thiết bị Đối với hệ thống bể nuôi cấy quang học dạng tấm phẳng không thể cho vào nồi hấp Autoclave vì quá lớn,vì vậy để vệ sinh thiết bị ta cho 1 thể tích cồn 760 nhất định (tùy thuộc vào thể tích bể) vào thiết bể rồi chùi rửa, bịt kín trong 1 giờ sao đó rửa lại bằng nƣớc máy đã đun sôi 2.2.1.4 Nhân giống và giữ giống Sử dụng môi trƣờng walne để nhân giống sau đó có thể giữ giống trong tủ lạnh (nhiệt độ 10-150C). Ngoài ra có thể nhân giống trên đĩa petri, giúp hạn chế sự nhiễm tạp ngay từ khâu đầu tiên 2.2.2. ố t th nghiệ 2.2.2.1. Th nghiệ 1- Xác định động học sinh t ƣởng của tảo Chlorella vulgaris khi nuôi cấy trong nh erlen thể t ch Thí nghiệm nhằm khảo sát sự sinh trƣởng của tảo Chlorella vulgaris trong môi trƣờng Wallne, đồng thời cung cấp giống cho các thí nghiệm tiếp theo Tiến hành nhân giống trong các bình thủy tinh có thể tích 500ml, có sục khí và chiếu sáng Điều kiện thí nghiệm: tốc độ sục khí 0.5L/phút, chiếu sáng 24 giờ, tỉ lệ giống cấy ban đầu Trong quá trình nhân sinh khối tiến h nh theo d i các chỉ tiêu nhƣ: đo mật độ tế b o, đo pH Từ những kết quả thu đƣợc, tiến h nh tính toán động sinh trƣởng cho tảo Chlorella vulgaris v xác định thời điểm thu sinh khối Hình 2.3.Các erlen 500ml GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Page 17 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối 2.2.2.2. Th nghiệ - Động học sinh t ƣởng của tảo Chlorella vulgaris khi nuôi cấy fed-batch và cyclic fed-batch trên hệ thống bể nuôi cấy quang học dạng tấm phẳng thể t ch 0L với th nh phần i t ƣờng W n Thí nghiệm nhằm khảo sát động học sự sinh trƣởng của tảo Chlorella vulgaris trong hệ thống bể nuôi cấy quang học dạng tấm phẳng 60L với thành phần môi trƣờng walne. Tiến hành khảo sát sự sinh trƣởng trong bể bể nuôi cấy quang học dạng tấm phẳng thể tích 60L có sục khí và chiếu sáng Điều kiện thí nghiệm: tốc độ sục khí 8L/phút, chiếu sáng 24h, tỉ lệ giống cấy ban đầu Trong quá trình nuôi cấy tiến h nh theo d i các chỉ tiêu: (a) đo mật độ tế. (b) đo pH. (c) đo h m lƣợng sinh khối khô Từ những kết quả thu đƣợc, tiến h nh tính toán động sinh trƣởng cho tảo chlorella vulgaris. Hình 2.3 Bể nuôi cấy dạng tấm phẳng 60L 2.2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu động học sinh t ƣởng của vi sinh vật (GS TS. Nguyễn ân Dũng, ) 2.2.3.1. Đƣờng c ng sinh t ƣởng Sự sinh trƣởng quần thể vi sinh vật đƣợc nghiên cứu bằng cách phân tích đƣờng cong sinh trƣởng trong một môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật theo phƣơng pháp nuôi cấy theo mẻ (batch culture) hoặc trong một hệ thống kín Có nghĩa l vi sinh vật đƣợc nuôi cấy trong một thiết bị kín, trong quá trình nuôi cấy không thay đổi môi trƣờng và thời gian nuôi cấy càng kéo dài thì nồng độ chất dinh dƣỡng càng giảm sút, các chất phế thải của trao đổi chất c ng tăng lên Nếu lấy thời gian nuôi GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Page 18 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối cấy là trục hoành và lấy số logarit của số lƣợng tế bào sống làm trục tung sẽ có thể vẽ đƣợc đƣờng cong sinh trƣởng của các vi sinh vật sinh sản bằng cách phân đôi Đƣờng cong n y có 4 giai đoạn (phases) khác nhau. Hình2.4.Đường cong sinh trưởng trong hệ thống kín (Theo sách của Prescott, Harley và Klein) a) Giai đoạn Tiềm phát (Lag phase) Khi cấy vi sinh vật vào một môi trƣờng mới số lƣợng thƣờng không tăng lên ngay, đó l giai đoạn Tiềm phát hay pha ag Trong giai đoạn này tế b o chƣa phân cắt nhƣng thể tích và khối lƣợng tăng lên rõ rệt do có sự tăng các th nh phần mới của tế bào. Nguyên nhân là do tế bào ở trạng thái già, thiếu hụt ATP, các cofactor cần thiết và ribosome. Thành phần môi trƣờng mới không giống môi trƣờng cũ cho nên tế bào cần một thời gian nhất định để tổng hợp các enzyme mới nhằm sử dụng đƣợc các chất dinh dƣỡng mới. Các tế b o cũng có thể bị thƣơng tổn và cần một thời gian để hồi phục. Bất kỳ vì nguyên nhân gì thì kết quả vẫn là tế bào phải tự trang bị lại các thành phần của mình, tái tạo ADN và bắt đầu tăng khối lƣợng. Giai đoạn tiềm phát dài hay ngắn liên quan đến bản thân từng loại vi sinh vật và tính chất của môi trƣờng. Nếu tính chất hóa học của môi trƣờng mới sai khác nhiều với môi trƣờng cũ thì giai đoạn tiềm phát sẽ kéo d i Ngƣợc lại, nếu cấy từ giai đoạn logarit vào một môi trƣờng có thành phần tƣơng tự thì giai đoạn tiềm phát sẽ rút ngắn lại. Nếu cấy vi sinh vật từ giai đoạn tiềm phát hay từ giai đoạn tử vong thì giai đoạn tiềm phát sẽ kéo dài b) Giai đoạn logarit (log Phase) hay Pha Chỉ số (Exponential Phase) Trong giai đoạn này vi sinh vật sinh trƣởng và phân cắt với nhịp độ tối đa so với bản tính di truyền của chúng nếu gặp môi trƣờng v điều kiện nuôi cấy thích GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Page 19 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối hợp. Nhịp độ sinh trƣởng của chúng l không thay đổi trong suốt giai đoạn này, các tế bào phân đôi một cách đều đặn. Do các tế bào sinh ra chỉ khác nhau rất ít cho nên đƣờng cong sinh trƣởng là một đƣờng trơn nhẵn chứ không gấp khúc (hình 14.1). Quần thể tế b o trong giai đoạn này có trạng thái hóa học và sinh lý học cơ bản là nhƣ nhau cho nên việc nuôi cấy ở giai đoạn n y thƣờng đƣợc sử dụng để nghiên cứu sinh hóa học và sinh lý học vi sinh vật. Sinh trƣởng logarit l sinh trƣởng đồng đều, tức là các thành phần tế b o đƣợc tổng họp với tốc độ tƣơng đối ổn định. Nếu cân bằng dinh dƣỡng hay các điều kiện môi trƣờng thay đổi sẽ dẫn đến sự sinh trƣởng không đồng đều. Sự sinh trƣởng khi nhịp độ tổng hợp các thành phần của tế b o tƣơng đối biến hóa sẽ biến đổi theo cho đến khi đạt tới một sự cân bằng mới. Phản ứng này rất dễ quan sát thấy khi làm thực nghiệm chuyển tế bào từ một môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng sang một môi trƣờng gi u hơn Tế b o trƣớc hết phải tạo nên các ribosome mới có thể nâng cao năng lực tổng hợp protein, sau đó l sự tăng cƣởng tổng hợp protein và ADN. Cuối cùng tất yếu dẫn đến tốc độ phát triển nhanh chóng. Lúc chuyển quần thể tế bào từ một môi trƣờng gi u dinh dƣỡng tới một môi trƣờng nghèo thì cũng có kết quả về sự sinh trƣởng không đồng đều nhƣ vậy. Vi sinh vật trƣớc đó có thể thu đƣợc từ môi trƣờng nhiều thành phần của tế b o nhƣng khi chuyển sang môi trƣờng nghèo chúng cần có thời gian để tạo ra các enzyme cần thiết để sinh tổng hợp các thành phần không có sẵn trong môi trƣờng Sau đó tế bào mới có thể phân cắt, ADN mới có thể tái tạo, nhƣng việc tổng hợp protein và ARN là chậm cho nên tế bào nhỏ lại và tổ chức lại sự trao đổi chất của chúng cho đến khi chúng có thể sinh trƣởng tiếp Sau đó sự sinh trƣởng cân bằng sẽ đƣợc hồi phục và trở về lại giai đoạn logarit. Các thí nghiệm trên đây cho thấy sự sinh trƣởng của vi sinh vật đƣợc kiểm soát một cách chính xác, phối hợp và phản ứng nhanh chóng với những sự biến đổi của môi trƣờng. Khi sự sinh trƣởng của vi sinh vật bị hạn chế bởi nồng độ thấp của các chất dinh dƣỡng cần thiết thì sản lƣợng tế bào cuối cùng sẽ tăng lên cùng với sự tăng lên của các chất dinh dƣỡng bị hạn chế (hình 4 a) Đây chính l cơ sở để sử dụng vi GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Page 20 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối sinh vật trong việc định lƣợng vitamin và các nhân tố sinh trƣởng khác. Tốc độ sinh trƣởng cũng tăng lên cùng với sự tăng nồng độ các chất dinh dƣỡng (hình 14.2b). Hình dáng của đƣờng cong hầu nhƣ phản ánh tốc độ hấp thu chất dinh dƣỡng nhờ sự chuyển vận protein của vi sinh vật. Lúc nồng độ chất dinh dƣỡng đủ cao thì hệ thống vận chuyển sẽ bão hòa và tốc độ sinh trƣởng không tăng lên cùng với sự tăng lên của nồng độ chất dinh dƣỡng. Hình 2.5.Nồng độ chất dinh dưỡng và sinh trưởng (a) Ảnh hƣởng của sự hạn chế chất dinh dƣỡng đối với sản lƣợng chung của vi sinh vật, lúc nồng độ đủ cao thì sản lƣợng chung sẽ đạt tới ổn định (b) Ảnh hƣởng của sự hạn chế chất dinh dƣỡng tới tốc độ sinh trƣởng c) Giai đoạn ổn định (Stationary Phase) hay Pha Cân bằng Qua giai đoạn logarit sự sinh trƣởng của quần thể cuối cùng sẽ dừng lại, đƣờng cong sinh trƣởng đi ngang (hình 4 ) Nồng độ vi khuẩn trong giai đoạn ổn định thƣờng vào khoảng 109/ml. Với các vi sinh vật khác thƣờng không đạt đƣợc đến nồng độ này. Với động vật nguyên sinh và vi tảo thƣờng chỉ đạt đến nồng độ 106/ml Đƣơng nhiên, số lƣợng tế bào cuối cùng quyết định bởi ảnh hƣởng chung của điều kiện dinh đƣỡng, chủng loại vi sinh vật và các nhân tố khác. Trong giai đoạn này số lƣợng tế bào sống l không thay đổi, có thể do số lƣợng tế bào mới sinh ra cân bằng với số lƣợng tế bào chết đi, hoặc là tế bào ngừng phân cắt mà vẫn giữ nguyên hoạt tính trao đổi chất. Có nhiều nguyên nhân làm cho quần thể vi sinh vật chuyển sang giai đoạn ổn định Trong đó nguyên nhân chủ yếu là sự hạn chế của chất dinh dƣỡng. Nếu một GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Page 21 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối chất dinh dƣỡng thiết yếu bị thiếu hụt nghiêm trọng thì sự sinh trƣởng sẽ chậm lại. Vi sinh vật hiếu khí thƣờng bị hạn chế bởi nồng độ oxygen Oxygen thƣờng hòa tan ít trong nƣớc, O2 trong nội bộ môi trƣờng rất nhanh chóng bị tiêu thụ hết, chỉ có các vi sinh vật sinh trƣởng ở bề mặt môi trƣờng mới có đủ nồng độ O2 để sinh trƣởng. Vì vậy, khi nuôi cấy vi sinh vật phải sử dụng tới máy lắc hay các biện pháp thông khí khác. Quần thể vi sinh vật cũng có thể bị đình chỉ sinh trƣởng khi gặp sự tích lũy của các sản phẩm trao đổi chất có hại. Một số vi sinh vật kỵ khí (nhƣ Streptococcus) có thể lên men đƣờng làm sản sinh một lƣợng lớn acid lactic hay các acid hữu cơ khác, l m acid hóa môi trƣờng và ức chế sự sinh trƣởng của vi sinh vật. Đồng thời sự tiêu hao hết đƣờng cũng l m cho tế b o đi v o giai đoạn ổn định. Sau nữa là, một số chứng cứ cho thấy khi số lƣợng vi sinh vật đạt đến một giới hạn nhất định thì sự sinh trƣởng có thể bị đình chỉ. Sự sinh trƣởng của vi sinh vật chuyển sang giai đoạn ổn định có thể do kết quả chung của rất nhiều nhân tố khác nhau . Nhƣ chúng ta đã thấy, vi khuẩn khi nuôi cấy theo mẻ sẽ chuyển sang giai đoạn ổn định khi thiếu thức ăn Trong tự nhiên, do nhiều môi trƣờng có nồng độ chấ dinh dƣỡng rất thấp nên vi sinh vật thƣờng chuyển sang giai đoạn ổn định Đối với vi khuẩn, việc chuyển sang giai đoạn ổn định có thể là một loại thích ứng tốt. Nhiều loại vi khuẩn không có sự biến hóa rõ rệt về hình thái (nhƣ hình th nh b o tử nội sinh-endospore) nhƣng chúng có thể thu nhỏ kích thƣớc lại, thƣờng do chất nguyên sinh co lại và nhân giả (nucleoid) đậm đặc lại. Một biến đổi quan trọng hơn, khi thiếu thức ăn vi khuẩn sẽ sinh ra một loại protein đói (starvation proteins) l m cho tế b o đề kháng nhiều hơn với các thƣơng tổn bằng nhiều con đƣờng khác nhau. Chúng l m tăng các liên kết peptidoglycan và sự bền vững của thành tế bào. Chẳng hạn Dps (DNA-binding protein from starved cells), một loại protein kết hợp với ADN lấy từ các tế b o đói, có thể bảo vệ cho ADN. Phân tử Chaperones cản trở sự biến tính của protein và hồi phục lại đƣợc các protein bị tổn thƣơng Vì những việc đó v nhiều cơ chế khác mà các tế b o đói có thể khó bị chết đi v đề kháng đƣợc với tình trạng bị đói, với sự biến hóa của nhiệt độ, sự tổn thƣơng về ôxy hóa và sự thẩm thấu, cũng nhƣ tăng sức đề kháng với các hóa chất có hại (nhƣ chlorine chẳng hạn). Những cải biến này rất có hiệu quả và làm cho một số vi khuẩn có thể sống lại sau v i năm bị đói R r ng việc hiểu rõ những vấn đề này sẽ có tầm quan trọng GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Page 22 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối thực tiễn to lớn đối với y học và vi sinh vật học công nghiệp. Chúng còn có thể chứng minh vi khuẩn thƣơng h n (Salmonella typhimurium) v nhiều vi khuẩn gây bệnh khác có thể có khả năng gây bệnh mạnh hơn khi bị đói d) Giai đoạn tử vong (Death Phase) Việc tiêu hao chất dinh dƣỡng và việc tích lũy các chất thải độc hại sẽ làm tổn thất đến môi trƣờng sống của vi sinh vật, làm cho số lƣợng tế bào sống giảm xuống. Đó l đặc điểm của giai đoạn tử vong. Giống nhƣ giai đoạn logarit, sự tử vong của quần thể vi sinh vật cũng có tính logarit (tỷ lệ tế bào chết trong mỗi giờ là không đổi). Tổng số tế bào sống và tế bào chết không thay đổi vì các tế bào chết chƣa bị phân hủy. Muốn xác định số lƣợng tế bào sống phải pha loãng ra rồi cấy lên thạch đĩa v đƣa v o điều kiện thích hợp để xác định số khuẩn lạc xuất hiện. Mặc dầu phần lớn vi sinh vật tử vong theo phƣơng thức logarit nhƣng sau khi số lƣợng tế bào đột nhiên giảm xuống thì tốc độ chết của tế bào chậm lại Đó l do một số cá thể sống lại nhờ có tính đề kháng đặc biệt mạnh Vì điều này và những nguyên nhân khác l m cho đƣờng cong của giai đoạn tử vong có thể khá phức tạp 2.2.3.2. Tính toán về uá t nh sinh t ƣởng (PGS TSKH V N HOÀNG) a. Số thế hệ (generation time hay doubling time) Là thời gian giữa hai lần phân chia liên tiếp hay thời gian cần cho sự tăng đôi số tế bào. Có thể biểu thị mối quan hệ bằng công thức sau đây: n= (số thế hệ) Trong đó: N0 là số lƣợng tế b o ban đầu; Nt là số lƣợng tế bào ở thời gian t; n là số thế hệ. b. H ng số tốc độ phân chia k (mean growth rate constant k) Hằng số tốc độ phân chia biểu thị tốc độ sinh trƣởng trong giai đoạn logarit khi nuôi cấy batch (batch culture) theo tốc độ phân chia của tế bào nên còn gọi là hằng số tốc phân chia hay số thế hệ sinh ra trong một đơn vị thời gian, thƣờng biểu thị bằng số thế hệ trong 1 giờ: K= = GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn (thế hệ/giờ) Page 23
- Xem thêm -