Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
Mục Lục
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................... 6
MỞ ĐẦU.................................................................................................................................. 7
Mục Tiêu Đề Tài ........................................................................................................... 7
1.
2. Cách Tiếp Cận, Phƣơng Pháp Nghiên Cứu, Phạm Vi Nghiên Cứu ..................................... 7
2.1. Phạm Vi Nghiên Cứu: quy mô phòng thí nghiệm ......................................................... 7
2.2. Phương Pháp Nuôi Cấy .............................................................................................. 7
Phần 1: Tổng Quan ................................................................................................................... 8
1.1.
Tổng quan về tảo Chlorella vulgaris .......................................................................... 8
1.1.1.
Giới thiệu chung về chi tảo Chlorella ................................................................. 8
1.1.2.
Đặc điểm sinh học .............................................................................................. 8
1.1.3. Giá Trị Dinh Dƣỡng .............................................................................................. 10
1.2.
Tổng quan về kỹ thuật nuôi tảo .................................. Error! Bookmark not defined.
1.2.1.
Nuôi cấy batch ................................................... Error! Bookmark not defined.
1.2.2.
Nuôi bằng kỹ thuật fed-batch ............................. Error! Bookmark not defined.
1.2.3.
Nuôi bằng kỹ thuật cyclic fed-batch ................... Error! Bookmark not defined.
1.2.4.
Ƣu điểm của kỹ thuật fed-batch và kỹ thuật cyclic fed-batch. ..Error! Bookmark
not defined.
1.3 Hệ Thống Nuôi Tảo Quy Mô Phòng Thí Nghiệm............ Error! Bookmark not defined.
Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................. Error! Bookmark not defined.
2.1 Vật liệu v môi trƣờng thí ngiệm ..................................... Error! Bookmark not defined.
2.1.1 Giống tảo................................................................ Error! Bookmark not defined.
2.1.2 Địa điểm thí nghiệm ............................................... Error! Bookmark not defined.
2.1.3 Hóa chất sử dụng .................................................... Error! Bookmark not defined.
2.1.3.1.
Hóa chất pha môi trƣờng nuôi tảo ................... Error! Bookmark not defined.
2.1.3.2.
Hóa chất dùng trong phân tích thí nghiệm....... Error! Bookmark not defined.
2.1.4. Thiết bị ................................................................. Error! Bookmark not defined.
2.1.4.1.
Thiết bị nuôi tảo ............................................. Error! Bookmark not defined.
2.1.4.2.
Thiết bị dùng cho phân tích ............................ Error! Bookmark not defined.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu........................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.1
Trình tự tiến hành thí nghiệm ............................ Error! Bookmark not defined.
2.2.2
ố trí thí nghiệm ............................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.2.1.
Thí nghiệm - Xác định động học sinh trƣởng của tảo Chlorella vulgaris khi
nuôi cấy trong bình erlen thể tích
ml ........................... Error! Bookmark not defined.
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Page iv
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
2.2.2.2.
Thí nghiệm - Động học sinh trƣởng của tảo Chlorella vulgaris khi nuôi cấy
fed-batch và cyclic fed-batch trên hệ thống bể nuôi cấy quang học dạng tấm phẳng thể tích
với th nh phần môi trƣờng Walne .............................. Error! Bookmark not defined.
2.2.3.
Phƣơng pháp nghiên cứu động học sinh trƣởng của vi sinh vật (GS TS. Nguyễn
ân Dũng,
) ............................................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.3.1.
Đƣờng cong sinh trƣởng ................................. Error! Bookmark not defined.
2.2.3.2.
Tính toán về quá trình sinh trƣởng (PGS TSKH
Bookmark not defined.
2.2.4.
V N HOÀNG) ..... Error!
Phƣơng pháp phân tích các chỉ tiêu .................. Error! Bookmark not defined.
Phần : K T QUẢ VÀ ÀN UẬN ....................................................................................... 29
3.1 Động học sinh trƣởng tảo Chlorella vulgaris khi nuôi cấy trong các erlen thể tích 500ml
........................................................................................................................................... 29
Động học sinh trƣởng của tảo Chlorella vulgaris khi nuôi cấy fed-batch và cyclic fedbatch trên hệ thống bể nuôi cấy quang học dạng tấm phẳng thể tích
với th nh phần môi
trƣờng Walne ........................................................................ Error! Bookmark not defined.
3.3
Kết quả đo h m lƣợng protein trong sinh khối tảo. ..... Error! Bookmark not defined.
K T UẬN VÀ Đ XUẤT
KI N ........................................ Error! Bookmark not defined.
1.
Kết luận........................................................................ Error! Bookmark not defined.
2.
Đề xuất ý kiến ............................................................... Error! Bookmark not defined.
TÀI IỆU TH M KHẢO ......................................................... Error! Bookmark not defined.
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Page v
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên xin gửi lời cảm ơn quý thầy cô trong khoa Công Nghệ Hóa
Học & Thực Phẩm trƣờng Đại Học Sƣ Phạm Kỹ Thuật Tp HCM đã tạo những
điều kiện tốt nhất để em có thể ho n th nh đề tài nghiên cứu khoa học này.
Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn thầy Trịnh Khánh Sơn đã hƣớng dẫn
tận tình và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu để em có thể hoàn thành
nghiên cứu này.
Bên cạnh đó xin cảm ơn anh ê Th nh Đạt, chị Nguyễn Trần Kim Ngân,
Nguyễn Thị Phƣơng Thùy, Nguyễn Thị Ý và các bạn sinh viên lớp
đồng
h nh v giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu.
Xin chân thành cảm ơn!
Tp.HCM. Ngày 16 tháng 7 năm
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Văn Thôi
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Page 6
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
MỞ ĐẦU
1. Mục Tiêu Đề Tài
Khảo sát động học sinh trƣởng của tảo Chlorella vulgaris bằng kỹ thuật nuôi cấy
mẻ (batch) và nuôi cấy mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch)
Xây dựng đƣợc hệ thống các phép đo, công thức tính toán để khảo sát động học
về sự sinh trƣởng của tảo
Khảo sát sự tác động cụ thể của các yếu tố môi trƣờng , nhiệt độ, pH, nguồn cung
cấp carbon, nitơ…tác động đến sự sinh trƣởng của tảo, từ đó có thể tiến hành tính
toán tối ƣu hóa quá trình nuôi tảo thu sinh khối
2. Cách Tiếp Cận, Phƣơng Pháp Nghiên Cứu, Phạm Vi Nghiên Cứu
2.1. Phạm Vi Nghiên Cứu: quy mô phòng thí nghiệm
Nuôi trồng tảo đối với qui mô phòng thí nghiệm đƣợc tiến hành trong những
bình chứa nhỏ trong suốt có dung tích từ 0,5 – 1 lít và hệ thống quang học tấm
phẳng 60L Môi trƣờng nuôi cấy bao gồm những thành phần hóa chất tinh khiết
phù hợp với loại tảo cần nuôi trồng. Kết hợp sục khí đảo trộn môi trƣờng, có thể
có bơm điều chỉnh lƣợng khí CO đƣa v o bình Sử dụng nguồn ánh sáng nhân
tạo từ đèn huỳnh quang.
Ngo i ra cũng có thể sử dụng các hệ thống bình lên men (photobioreactor) có
dung tích nhỏ trong phòng thí nghiệm. Về nguyên tắc, hệ thống giống nhƣ các bể
lên men vi sinh vật nhƣng phải đƣợc trang bị thêm thiết bị chiếu sáng cho tảo
quang hợp. Nhiều nƣớc sử dụng hệ thống này kèm theo thiết bi điều chỉnh tự
động các thông số môi trƣờng thông qua một máy vi tính. Vi tảo nuôi trồng trong
hệ thống này là sạch thuần khiết
2.2. Phương Pháp Nuôi Cấy
+ Nuôi cấy mẻ (batch)
+ Nuôi cấy mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch)
+ Nuôi cấy bằng phƣơng pháp cyclic fed-batch
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Page 7
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
Phần 1: Tổng Quan
1.1. T ng u n về tả Chlorella vulgaris
1.1.1. Giới thiệu chung về chi tảo Chlorella
Vị trí phân loại:
− Nhóm: Eukaryota
− Giới: Flora ( thực vật)
− Ngành: Chlorophyta (tảo lục)
− Lớp: Trebouxiophyceae
− Bộ: Chlorellales
− Họ: Chlorellaceae
− Chi: Chlorella
− Loài : Chlorella vulgaris
(Bold and Wynne, 1978)
1.1.2. Đặc điểm sinh học
Chlorella là loại tảo đơn b o, không có tiêm mao, không có khả năng di động
chủ động, tế bào có dạng hình cầu hoặc hình oval. Kích cỡ tế bào từ 3-5µm,
hay 2-4 µm tùy lo i, tùy điều kiện môi trƣờng v giai đoạn phát triển. Màng
tế bào có vách cellulose bao bọc, chịu đƣợc những tác động cơ học nhẹ. Sự
thay đổi của các điều kiện môi trƣờng nhƣ ánh sáng, nhiệt độ, thành phần
các chất hóa học trong môi trƣờng sẽ ảnh hƣởng đến hình thái và chất lƣợng
của tế bào tảo (Trần Văn Vĩ, 99 )
Chlorella thƣờng sống ở vùng nƣớc ngọt v có h m lƣợng chlorophyll cao
nhất (đạt 28,9g/kg) so với bất kỳ thực vật quang hợp n o đƣợc biết đến trên
trái đất. Chlorella đã xuất hiện cách đây , tỷ năm v l dạng sống đầu tiên
có nhân thật. Các hóa thạch kỹ tiền Cambri đã chỉ ra sự tồn tại của Chlorella
ở thời kỳ này. Tảo Chlorella sinh sản bằng bào tử. khi gặp điều kiện sống
thuận lợi, tảo Chlorella sẽ lớn dần lên đến một kích thƣớc nhất định rồi tiến
hành quá trình phân bào. Chất nguyên sinh sẽ thu nhỏ lại ít nhiều trong lòng
vỏ tế bào, rồi sau đó sẽ tiến h nh chia đôi từ 1-3 lần liên tiếp hình thành nên
từ 2-8 khối bào chất riêng lẻ có cả nhân và lục lạp. Mỗi tế bào chất mới sẽ
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Page 8
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
hình thành lớp vỏ mới, khi đó lớp vỏ cũ sẽ vỡ ra và phóng thích các tế bào
con. Quá trình sinh sản nói chung đƣợc chia thành nhiều bƣớc theo nghiên
cứu của Tamiya (1963) (trích bởi Sharma, 1998) trong khi nghiên cứu vòng
đời của Chlorella ellipsoidea chia l m 4 giai đoạn:
Giai đoạn tăng trƣởng: ở giai đoạn này các tự bào tử sẽ tăng nhanh về
kích thƣớc nhờ các sản phẩm sinh tổng hợp
Giai đoạn bắt đầu chín: tế bào mẹ chuẩn bị quá trình phân chia
Giai đoạn chín mùi: tế b o nhân lên trong điều kiện có ánh sáng hoặc
trong bóng tối
Giai đoạn phân cắt: màng tế bào mẹ bị vỡ ra, các tự bào tử đƣợc phóng
thích ra ngo i : Sinh trƣởng - trƣởng thành - thành thục - phân chia
Hình 1.1.Sự sinh sản của tảo Chlorella
Dƣới những điều kiện sống tối ƣu: nhiều ánh sáng, nƣớc trong và không khí
sạch Chlorella sinh sản với tốc độ vô cùng lớn. Một tế bào Chlorella sẽ phân
chia thành 2-8 tế bào con trong thời gian chƣa đến 24 giờ. Tuổi thọ của một
vòng đời tế bào Chlorella phụ thuộc v o cƣờng độ ánh sáng mặt trời, nhiệt
độ và nguồn dinh dƣỡng trung bình là khoảng 7 giờ. Một số loài phổ biến
thuộc chi Chlorella là: Chlorella pyrenoidosa và Chlorella vulgaris.
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Page 9
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
1.1.3. Giá Trị Dinh Dƣỡng
Sinh khối tảo chlorella là một trong những thực phẩm giúp làm sạch ruột và
hệ bài tiết, thanh lọc gan và máu tốt nhất là chlorophyll – chất này có nhiều trong
rau (đặc biệt l rau có m u xanh đậm) và cỏ linh lăng; tuy nhiên lƣợng chlorophyll
tìm thấy trong những loại cây này chỉ khoảng 0,2 – 1%. Trong khi đó tỷ lệ này ở tảo
lục Chlorella là cao nhất: chiếm từ 3 – 5% chlorophyll. Bổ sung chlorophyll vào
khẩu phần ăn có thể tăng tốc độ thanh lọc ruột, máu và gan, bên cạnh đó còn giúp
làm lành những mô bị tổn thƣơng
+ Thực phẩm giàu chlorophyll nhất
+ Chứa nhiều vitamin, đặc biệt là B, C, E
+ Cũng cố sức khỏe hệ tiêu hóa v đƣờng ruột.
+ Tăng cƣờng hệ miễn dịch
+ Kích thích phục hồi mô thƣơng tổn.
+ H m lƣợng protein cao với đầy đủ 8 acid amine thiết yếu,Có hàm
lƣợng protein cao (chiếm khoảng 40-55% chất khô) đặc biệt là lysine
+ Cho đến nay chƣa tìm thấy độc tố nào nguy hiểm tồn tại trong sinh
khối tảo
+ Không bị virus tấn công, sống trong những điều kiện đơn giản
+ Tảo có khả năng l m sạch các nguồn nƣớc bẩn, giữ vệ sinh môi trƣờng.
1. Giải độc: Nhờ có lớp màng thớ( sporopolleine), chllorella hấp thu đƣợc các
kim laọi nặng, thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng v dƣ chất của các loại phân hoá
học nhờ vậy giúp cơ thể đ o thải độc tố này ra ngoài.
2. Chlorophylle: Làm sạch và cung cấp oxy: Chlorella rất giàu Chlorophylle,
thành phần giúp cung cấp oxy cho các mô và làm sạch đƣờng ruột.
3. C.G.F(Chlorella grow factor)- Nhân tố sinh trƣởng của Chlorella:
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Page 10
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
Nằm trong nhân của Chlorella, C.F.G là một hỗn hợp đƣợc tạo thành từ các
Vitamin, các nucleoit ( DN, RN) v các axit amin C F G l cơ sở di truyền của
Chlorella.
- Tăng sức đề kháng tự nhiên: Với C.F.G, Chlorella tham gia vào quá trình
l m tăng bạch huyết bào T( thuộc hệ miễn dịch của cơ thể)
-Tăng khả năng chịu đựng và sự dẻo dai: C.F.G có thể coi là nguồn tập trung
năng lƣợng: các thí nghiệm ở các vận động viên thể thao cho thấy chỉ với một liều
dùng duy nhất, tác dụng khả năng chịu đựng và dai sức có thể duy trì trong 10 tiếng
sau đó
- Hiệu quả probiotic và cân bằng hệ vi khuẩn ruột: Số lƣợng vi khuẩn
actobaccilius tăng lên nhờ sự có mặt của C.F.G. Do vậy hiệu quả probiotic( lợi ích
về sức khoẻ do vi khuẩn có ích đƣợc nuôi cấy mang lại) đƣợc phát huy.
4. Vitamin và khoáng chất:
- Tăng cƣờng sức sống: trong đó phải đặc biệt kể đến vai trò của vitamin B6,
B12 và phốt pho có tác dụng cũng cố hệ thần kinh và cải thiện giấc ngủ.
- H m lƣợng sắt cao trong Tảo lục giúp tăng cƣờng chức năng tạo máu.
- Do có nhiều sợi Xenlulô( chất xơ) nên giúp tiêu hoá tốt duy trì sự khoẻ mạnh
của đƣờng ruột
5. Tảo lục là bạn đồng hành của phụ nữ tuổi mãn kinh. Mọi nghiên cứu cho
thấy phụ nữ ở độ tuổi mãn kinh từ 4 đến 55 dùng tảo lục đúng liều lƣợng sẽ giảm
hẳn những rắc rối thƣờng gặp ở tuổi mãn kinh nhƣ táo bón, mệt mỏi, tùng cơn bốc
hoả...
6. Giảm lƣợng mỡ trong máu: Giảm sự ngƣng đọng Cholesterol, chống đƣợc
các bệnh về tim nhƣ nhồi máu cơ tim, xơ cứng động mạch vành.
7. Có tác dụng tốt đối với các chức năng của nam giới.
8. Là chất khử mùi hôi có hiệu quả:
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Page 11
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
- Chlorella có chứa một loại hormon kích thích sự tái sinh của các tế bào. Các
bác sỹ ở Nhật Bản đã chữa trị thành công nhiều ca viêm loét dạ dày chỉ với
Chlorella với một loại thuốc chống dƣ axit
- Chlorella có tác dụng làm giảm huyết áp Điều đặc biệt là nó không làm
giảm huyết áp bình thƣờng mà chỉ phát huy tác dụng này ở những trƣờng hợp huyết
áp cao, làm giảm cholesterol xấu v tăng cƣờng cholesterol tốt.
Hiện nay các sản phẩm từ tảo đều là ngoại nhập với giá th nh cao, ngƣời tiêu
dùng chƣa có điều kiện tiếp cận, từ những kết quả trên có thể thấy đƣợc việc nghiên
cứu phát triển đề t i n y để tìm ra một phƣơng pháp sản xuất quy mô lớn,tạo ra các
sản phẩm mang nhiều ý nghĩa về dinh dƣỡng cũng nhƣ y học. [theo wikipedia]
Bảng 1.1.Thành phần sinh hóa của tảo Chlorella vulgaris
Thành phần
% KLK
Protein
51÷58
Lipid
14÷12
Carbohydrat
12÷17
Kham khảo
Trubachev (1976)
1.2.T ng u n về ỹ thuật nuôi tả
1.2.1. Nu i cấ batch
Là một kỹ thuật nuôi truyền thống trong nuôi cấy vi sinh vật, sau mỗi đợt nuôi
cấy ngƣời ta thu toàn bộ sinh khối chỉ chừa lại một phần giống vi sinh vật để cho
nuôi cấy đợt kế tiếp Thông thƣờng thì trong công nghiệp tỷ lệ giống giữ lại là 10%
so với tổng sinh khối thu hoạch.
1.2.2. Nu i
ng ỹ thuật
-batch
Kỹ thuật fed-batch là một kỹ thuật hiện đại trong nuôi cấy vi sinh vật. Trong
quá trình nuôi ngƣời ta bổ sung thêm môi trƣờng v o, v nhƣ vậy thể tích môi
trƣờng nuôi tăng dần cho đến khi đạt đƣợc mức thể tích cần thu hoạch.
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Page 12
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
1.2.3. Nu i
ng ỹ thuật cyclic fed-batch
Kỹ thuật cyclic fed-batch là một kỹ thuật hiện đại trong nuôi cấy vi sinh vật,
khi sinh khối vi sinh vật đạt cực đại ngƣời ta tiến hành thu sinh khối tuy nhiên một
lƣợng lớn sinh khối đƣợc giữ lại để nuôi cấy cho mẻ tiếp, thƣờng thì tỷ lệ sinh khối
thu hoạch so với tổng thể tích sinh khối là 1:3, 1:2.
1.2.4. Ƣu điểm của kỹ thuật fed-batch và kỹ thuật cyclic fed-batch.
So với kỹ thuật nuôi cấy batch truyền thống thì kỹ thuật fed-batch và cyclic
fed-batch có nhiều ƣu điểm hơn v đƣợc minh chứng qua nhiều đề tài nghiên cứu
khác nhau và kết quả thu đƣợc là một minh chứng.
1.3 Hệ Thống Nuôi Tảo Quy Mô Phòng Thí Nghiệm
Hiện nay có nhiều hệ thống nuôi tảo ở quy mô phòng thí nghiệm khác nhau
nhƣng đa phần đều dựa trên nguyên tắc dùng bể hoặc bình chứa trong suốt có độ
truyền sáng tốt, có ống sục khí CO2 và chiếu sáng.
Dạng bể bản mỏng
Bình erlen ( 0,5-1L)
Dạng chai thủy tinh
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Dạng quang học tấm phẳng 60L
Page 13
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Vật iệu v
i t ƣờng thí ngiệm
2.1.1. Giống tả
Giống Chlorella Vulgaris có kích thƣớc tế bào từ 5-
µm, đƣợc cung cấp bởi
Viện Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản 2 TP.HCM
2.1.2. Đị điểm thí nghiệm
Phòng thí nghiệm Vi Sinh, khoa công nghệ Hóa Học và Thực Phẩm trƣờng
Đại Học Sƣ Phạm Kỹ Thuật Tp.HCM
2.1.3. Hóa chất sử dụng
2.1.3.1. Hóa chất ph
i t ƣờng nu i tả
Có nhiều môi trƣờng dinh dƣỡng dùng để nuôi tảo nhƣ: Môi trƣờng Walne,
Guillard, Ryther, Tamya, Ito v môi trƣờng phân vô cơ Tuy nhiên, trong phạm vi
nghiên cứu chỉ dụng môi trƣờng Walne.
Bảng 2.1.Thành phần và cách pha chế
Dung ịch A
i t ƣờng Walne (Walne PR, 1970)
Th nh phần
Thứ tự
Số ƣợng g
FeCl3
(4)
0.8
MnCl2.4H20
(5)
0.4
H3PO3
(3)
33.6
EDTA
(1)
45
NaH2PO4.2H20/
(6)
20
(2)
100
NaH2PO4.2H20
NaNO3/KNO3
Tất cả ph đến 1L nƣớc ngọt
Dung ịch
Tất cả ph đến 1
ZnCl2
2,1
CoCl2.6H20
2
(NH4)6Mo7O24.4H20
0,9
CuSO4.5H20
2
nƣớc ngọt
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Page 14
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
Dung ịch C
Vitamine B1
200mg
Vitamine B12
10mg
Tất cả ph đến 1
Cách ph
nƣớc ngọt
i t ƣờng
Dung dịch A: Cân toàn bộ hoá cho vào bình thuỷ tinh, sau đó đổ nƣớc ấm
khoảng 600C cho đến khi đƣợc 1 lít, khấy đều cho tan. Dung dịch B: pha dung dịch
th nh
ml nƣớc ấm, dùng 1ml dung dịch B cho vào 1 lít dung dich A. Trộn
tiếp dung dịch C vào dung dịch A với số lƣợng vitamin (B:1 ống/ 1 L dung dịch A,
B12: 5 ống/1 L dung dịch A). Cuối cùng ta có dung dịch A tổng hợp dùng để bón
cho tảo. Liều lƣợng dùng ở phòng thí nghiệm là 1 ml/1L tảo nuôi, nuôi ở ngoài trời
dùng 1 – 2 ml/10 L tảo nuôi.
2.1.3.2. Hóa chất dùng trong phân tích thí nghiệm
Etanol 98%; H2SO4 0,1N; NaOH 0,1N; H2SO4 đậm đặc; HClO4;
Phenolphtalein
2.1.4. Thiết bị
2.1.4.1. Thiết bị nuôi tảo
Bể nuôi cấy quang học đƣợc thiết kế với kích thƣớc: 20x10x35 cm. Bên trong
bể có trang bị dây và ống sục khí đƣợc nối với bơm không khí bên ngo i
Hình 2.1.Hệ thống bể nuôi cấy quang học dạng tấm phẳng
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Page 15
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
Hình 2.2.Bơm sục khí
2.1.4.2. Thiết bị dùng cho phân tích
Máy ly tâm E
đối lƣu hãng
; máy đo quang phổ UV Libra S32 hãng Biochrom; tủ sấy
INDER; máy đo pH METT ER TO EDO hãng SevenEasy; cân
phân tích 4 số lẻ TE62 hãng Sartorius; buồng hút khí độc Safehood 7 ; máy chƣng
cất đạm Kjeldahl; buồng đếm hồng cầu; kính hiển vi quang học.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Trình tự tiến hành thí nghiệm
2.2.1.1. Xử lý nguồn nƣớc
Nguồn nƣớc dùng cho nuôi cấy, phân lập và giữ giống đƣợc sử dụng l nƣớc
cất đƣợc cho vào các bình thủy tinh định mức
ml sau đó thêm
ml môi trƣờng
dinh dƣỡng Walne, khoáng rồi đƣợc đem đi hấp tiệt trùng ở 1210C, 1 atm trong 30
phút sau đó bổ sung thêm vitamin đem để nguội rồi tiến hành sử dụng để nuôi cấy
tảo.
2.2.1.2. Vệ sinh dụng cụ
Đối với các dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh: bình nuôi tảo, ống nghiệm,
bình đựng môi trƣờng, đều đƣợc rửa sạch bằng nƣớc máy sau đó đem đi hấp tiệt
trùng ở 121oC,
atm trong
phút Đối với các dụng cụ bằng nhựa: can đựng nƣớc
cất, can 5L nhân giống tảo, ống của bơm thổi khí cho tảo…đều đƣợc đem ngâm
trong dung dịch Chlorine có nồng độ
ppm để khử trùng rồi rửa lại bằng nƣớc
máy đã đun sôi
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Page 16
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
2.2.1.3. Vệ sinh thiết bị
Đối với hệ thống bể nuôi cấy quang học dạng tấm phẳng không thể cho vào
nồi hấp Autoclave vì quá lớn,vì vậy để vệ sinh thiết bị ta cho 1 thể tích cồn 760 nhất
định (tùy thuộc vào thể tích bể) vào thiết bể rồi chùi rửa, bịt kín trong 1 giờ sao đó
rửa lại bằng nƣớc máy đã đun sôi
2.2.1.4 Nhân giống và giữ giống
Sử dụng môi trƣờng walne để nhân giống sau đó có thể giữ giống trong tủ lạnh
(nhiệt độ 10-150C). Ngoài ra có thể nhân giống trên đĩa petri, giúp hạn chế sự
nhiễm tạp ngay từ khâu đầu tiên
2.2.2.
ố t th nghiệ
2.2.2.1. Th nghiệ
1- Xác định động học sinh t ƣởng của tảo Chlorella
vulgaris khi nuôi cấy trong
nh erlen thể t ch
Thí nghiệm nhằm khảo sát sự sinh trƣởng của tảo Chlorella vulgaris trong môi
trƣờng Wallne, đồng thời cung cấp giống cho các thí nghiệm tiếp theo Tiến hành nhân
giống trong các bình thủy tinh có thể tích 500ml, có sục khí và chiếu sáng Điều
kiện thí nghiệm: tốc độ sục khí 0.5L/phút, chiếu sáng 24 giờ, tỉ lệ giống cấy ban đầu
Trong quá trình nhân sinh khối tiến h nh theo d i các chỉ tiêu nhƣ: đo mật độ
tế b o, đo pH Từ những kết quả thu đƣợc, tiến h nh tính toán động sinh trƣởng cho
tảo Chlorella vulgaris v xác định thời điểm thu sinh khối
Hình 2.3.Các erlen 500ml
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Page 17
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
2.2.2.2. Th nghiệ
- Động học sinh t ƣởng của tảo Chlorella vulgaris khi
nuôi cấy fed-batch và cyclic fed-batch trên hệ thống bể nuôi cấy quang học
dạng tấm phẳng thể t ch 0L với th nh phần
i t ƣờng W n
Thí nghiệm nhằm khảo sát động học sự sinh trƣởng của tảo Chlorella vulgaris
trong hệ thống bể nuôi cấy quang học dạng tấm phẳng 60L với thành phần môi
trƣờng walne. Tiến hành khảo sát sự sinh trƣởng trong bể bể nuôi cấy quang học
dạng tấm phẳng thể tích 60L có sục khí và chiếu sáng Điều kiện thí nghiệm: tốc độ
sục khí 8L/phút, chiếu sáng 24h, tỉ lệ giống cấy ban đầu
Trong quá trình nuôi
cấy tiến h nh theo d i các chỉ tiêu: (a) đo mật độ tế. (b) đo pH. (c) đo h m lƣợng
sinh khối khô Từ những kết quả thu đƣợc, tiến h nh tính toán động sinh trƣởng cho
tảo chlorella vulgaris.
Hình 2.3 Bể nuôi cấy dạng tấm phẳng 60L
2.2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu động học sinh t ƣởng của vi sinh vật (GS TS.
Nguyễn ân Dũng,
)
2.2.3.1. Đƣờng c ng sinh t ƣởng
Sự sinh trƣởng quần thể vi sinh vật đƣợc nghiên cứu bằng cách phân tích
đƣờng cong sinh trƣởng trong một môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật theo phƣơng
pháp nuôi cấy theo mẻ (batch culture) hoặc trong một hệ thống kín Có nghĩa l vi
sinh vật đƣợc nuôi cấy trong một thiết bị kín, trong quá trình nuôi cấy không thay
đổi môi trƣờng và thời gian nuôi cấy càng kéo dài thì nồng độ chất dinh dƣỡng càng
giảm sút, các chất phế thải của trao đổi chất c ng tăng lên Nếu lấy thời gian nuôi
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Page 18
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
cấy là trục hoành và lấy số logarit của số lƣợng tế bào sống làm trục tung sẽ có thể
vẽ đƣợc đƣờng cong sinh trƣởng của các vi sinh vật sinh sản bằng cách phân đôi
Đƣờng cong n y có 4 giai đoạn (phases) khác nhau.
Hình2.4.Đường cong sinh trưởng trong hệ thống kín
(Theo sách của Prescott, Harley và Klein)
a) Giai đoạn Tiềm phát (Lag phase)
Khi cấy vi sinh vật vào một môi trƣờng mới số lƣợng thƣờng không tăng lên
ngay, đó l giai đoạn Tiềm phát hay pha ag Trong giai đoạn này tế b o chƣa phân
cắt nhƣng thể tích và khối lƣợng tăng lên rõ rệt do có sự tăng các th nh phần mới
của tế bào. Nguyên nhân là do tế bào ở trạng thái già, thiếu hụt ATP, các cofactor
cần thiết và ribosome. Thành phần môi trƣờng mới không giống môi trƣờng cũ cho
nên tế bào cần một thời gian nhất định để tổng hợp các enzyme mới nhằm sử dụng
đƣợc các chất dinh dƣỡng mới. Các tế b o cũng có thể bị thƣơng tổn và cần một
thời gian để hồi phục. Bất kỳ vì nguyên nhân gì thì kết quả vẫn là tế bào phải tự
trang bị lại các thành phần của mình, tái tạo ADN và bắt đầu tăng khối lƣợng. Giai
đoạn tiềm phát dài hay ngắn liên quan đến bản thân từng loại vi sinh vật và tính
chất của môi trƣờng. Nếu tính chất hóa học của môi trƣờng mới sai khác nhiều với
môi trƣờng cũ thì giai đoạn tiềm phát sẽ kéo d i Ngƣợc lại, nếu cấy từ giai đoạn
logarit vào một môi trƣờng có thành phần tƣơng tự thì giai đoạn tiềm phát sẽ rút
ngắn lại. Nếu cấy vi sinh vật từ giai đoạn tiềm phát hay từ giai đoạn tử vong thì giai
đoạn tiềm phát sẽ kéo dài
b) Giai đoạn logarit (log Phase) hay Pha Chỉ số (Exponential Phase)
Trong giai đoạn này vi sinh vật sinh trƣởng và phân cắt với nhịp độ tối đa so
với bản tính di truyền của chúng nếu gặp môi trƣờng v điều kiện nuôi cấy thích
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Page 19
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
hợp. Nhịp độ sinh trƣởng của chúng l không thay đổi trong suốt giai đoạn này, các
tế bào phân đôi một cách đều đặn. Do các tế bào sinh ra chỉ khác nhau rất ít cho nên
đƣờng cong sinh trƣởng là một đƣờng trơn nhẵn chứ không gấp khúc (hình 14.1).
Quần thể tế b o trong giai đoạn này có trạng thái hóa học và sinh lý học cơ bản là
nhƣ nhau cho nên việc nuôi cấy ở giai đoạn n y thƣờng đƣợc sử dụng để nghiên
cứu sinh hóa học và sinh lý học vi sinh vật.
Sinh trƣởng logarit l sinh trƣởng đồng đều, tức là các thành phần tế b o đƣợc
tổng họp với tốc độ tƣơng đối ổn định. Nếu cân bằng dinh dƣỡng hay các điều kiện
môi trƣờng thay đổi sẽ dẫn đến sự sinh trƣởng không đồng đều. Sự sinh trƣởng khi
nhịp độ tổng hợp các thành phần của tế b o tƣơng đối biến hóa sẽ biến đổi theo cho
đến khi đạt tới một sự cân bằng mới. Phản ứng này rất dễ quan sát thấy khi làm
thực nghiệm chuyển tế bào từ một môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng sang một môi
trƣờng gi u hơn Tế b o trƣớc hết phải tạo nên các ribosome mới có thể nâng cao
năng lực tổng hợp protein, sau đó l sự tăng cƣởng tổng hợp protein và ADN. Cuối
cùng tất yếu dẫn đến tốc độ phát triển nhanh chóng.
Lúc chuyển quần thể tế bào từ một môi trƣờng gi u dinh dƣỡng tới một môi
trƣờng nghèo thì cũng có kết quả về sự sinh trƣởng không đồng đều nhƣ vậy. Vi
sinh vật trƣớc đó có thể thu đƣợc từ môi trƣờng nhiều thành phần của tế b o nhƣng
khi chuyển sang môi trƣờng nghèo chúng cần có thời gian để tạo ra các enzyme cần
thiết để sinh tổng hợp các thành phần không có sẵn trong môi trƣờng Sau đó tế bào
mới có thể phân cắt, ADN mới có thể tái tạo, nhƣng việc tổng hợp protein và ARN
là chậm cho nên tế bào nhỏ lại và tổ chức lại sự trao đổi chất của chúng cho đến khi
chúng có thể sinh trƣởng tiếp Sau đó sự sinh trƣởng cân bằng sẽ đƣợc hồi phục và
trở về lại giai đoạn logarit.
Các thí nghiệm trên đây cho thấy sự sinh trƣởng của vi sinh vật đƣợc kiểm
soát một cách chính xác, phối hợp và phản ứng nhanh chóng với những sự biến đổi
của môi trƣờng.
Khi sự sinh trƣởng của vi sinh vật bị hạn chế bởi nồng độ thấp của các chất
dinh dƣỡng cần thiết thì sản lƣợng tế bào cuối cùng sẽ tăng lên cùng với sự tăng lên
của các chất dinh dƣỡng bị hạn chế (hình 4 a) Đây chính l cơ sở để sử dụng vi
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Page 20
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
sinh vật trong việc định lƣợng vitamin và các nhân tố sinh trƣởng khác. Tốc độ sinh
trƣởng cũng tăng lên cùng với sự tăng nồng độ các chất dinh dƣỡng (hình 14.2b).
Hình dáng của đƣờng cong hầu nhƣ phản ánh tốc độ hấp thu chất dinh dƣỡng nhờ
sự chuyển vận protein của vi sinh vật. Lúc nồng độ chất dinh dƣỡng đủ cao thì hệ
thống vận chuyển sẽ bão hòa và tốc độ sinh trƣởng không tăng lên cùng với sự tăng
lên của nồng độ chất dinh dƣỡng.
Hình 2.5.Nồng độ chất dinh dưỡng và sinh trưởng
(a) Ảnh hƣởng của sự hạn chế chất dinh dƣỡng đối với sản lƣợng chung của vi sinh
vật, lúc nồng độ đủ cao thì sản lƣợng chung sẽ đạt tới ổn định
(b) Ảnh hƣởng của sự hạn chế chất dinh dƣỡng tới tốc độ sinh trƣởng
c) Giai đoạn ổn định (Stationary Phase) hay Pha Cân bằng
Qua giai đoạn logarit sự sinh trƣởng của quần thể cuối cùng sẽ dừng lại,
đƣờng cong sinh trƣởng đi ngang (hình 4 ) Nồng độ vi khuẩn trong giai đoạn ổn
định thƣờng vào khoảng 109/ml. Với các vi sinh vật khác thƣờng không đạt đƣợc
đến nồng độ này. Với động vật nguyên sinh và vi tảo thƣờng chỉ đạt đến nồng độ
106/ml Đƣơng nhiên, số lƣợng tế bào cuối cùng quyết định bởi ảnh hƣởng chung
của điều kiện dinh đƣỡng, chủng loại vi sinh vật và các nhân tố khác. Trong giai
đoạn này số lƣợng tế bào sống l không thay đổi, có thể do số lƣợng tế bào mới
sinh ra cân bằng với số lƣợng tế bào chết đi, hoặc là tế bào ngừng phân cắt mà vẫn
giữ nguyên hoạt tính trao đổi chất.
Có nhiều nguyên nhân làm cho quần thể vi sinh vật chuyển sang giai đoạn ổn
định Trong đó nguyên nhân chủ yếu là sự hạn chế của chất dinh dƣỡng. Nếu một
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Page 21
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
chất dinh dƣỡng thiết yếu bị thiếu hụt nghiêm trọng thì sự sinh trƣởng sẽ chậm lại.
Vi sinh vật hiếu khí thƣờng bị hạn chế bởi nồng độ oxygen Oxygen thƣờng hòa tan
ít trong nƣớc, O2 trong nội bộ môi trƣờng rất nhanh chóng bị tiêu thụ hết, chỉ có các
vi sinh vật sinh trƣởng ở bề mặt môi trƣờng mới có đủ nồng độ O2 để sinh trƣởng.
Vì vậy, khi nuôi cấy vi sinh vật phải sử dụng tới máy lắc hay các biện pháp thông
khí khác. Quần thể vi sinh vật cũng có thể bị đình chỉ sinh trƣởng khi gặp sự tích
lũy của các sản phẩm trao đổi chất có hại. Một số vi sinh vật kỵ khí (nhƣ
Streptococcus) có thể lên men đƣờng làm sản sinh một lƣợng lớn acid lactic hay các
acid hữu cơ khác, l m acid hóa môi trƣờng và ức chế sự sinh trƣởng của vi sinh vật.
Đồng thời sự tiêu hao hết đƣờng cũng l m cho tế b o đi v o giai đoạn ổn định. Sau
nữa là, một số chứng cứ cho thấy khi số lƣợng vi sinh vật đạt đến một giới hạn nhất
định thì sự sinh trƣởng có thể bị đình chỉ. Sự sinh trƣởng của vi sinh vật chuyển
sang giai đoạn ổn định có thể do kết quả chung của rất nhiều nhân tố khác nhau .
Nhƣ chúng ta đã thấy, vi khuẩn khi nuôi cấy theo mẻ sẽ chuyển sang giai đoạn
ổn định khi thiếu thức ăn Trong tự nhiên, do nhiều môi trƣờng có nồng độ chấ dinh
dƣỡng rất thấp nên vi sinh vật thƣờng chuyển sang giai đoạn ổn định Đối với vi
khuẩn, việc chuyển sang giai đoạn ổn định có thể là một loại thích ứng tốt. Nhiều
loại vi khuẩn không có sự biến hóa rõ rệt về hình thái (nhƣ hình th nh b o tử nội
sinh-endospore) nhƣng chúng có thể thu nhỏ kích thƣớc lại, thƣờng do chất nguyên
sinh co lại và nhân giả (nucleoid) đậm đặc lại. Một biến đổi quan trọng hơn, khi
thiếu thức ăn vi khuẩn sẽ sinh ra một loại protein đói (starvation proteins) l m cho
tế b o đề kháng nhiều hơn với các thƣơng tổn bằng nhiều con đƣờng khác nhau.
Chúng l m tăng các liên kết peptidoglycan và sự bền vững của thành tế bào. Chẳng
hạn Dps (DNA-binding protein from starved cells), một loại protein kết hợp với
ADN lấy từ các tế b o đói, có thể bảo vệ cho ADN. Phân tử Chaperones cản trở sự
biến tính của protein và hồi phục lại đƣợc các protein bị tổn thƣơng Vì những việc
đó v nhiều cơ chế khác mà các tế b o đói có thể khó bị chết đi v đề kháng đƣợc
với tình trạng bị đói, với sự biến hóa của nhiệt độ, sự tổn thƣơng về ôxy hóa và sự
thẩm thấu, cũng nhƣ tăng sức đề kháng với các hóa chất có hại (nhƣ chlorine chẳng
hạn). Những cải biến này rất có hiệu quả và làm cho một số vi khuẩn có thể sống lại
sau v i năm bị đói R r ng việc hiểu rõ những vấn đề này sẽ có tầm quan trọng
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
Page 22
Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối
thực tiễn to lớn đối với y học và vi sinh vật học công nghiệp. Chúng còn có thể
chứng minh vi khuẩn thƣơng h n (Salmonella typhimurium) v nhiều vi khuẩn gây
bệnh khác có thể có khả năng gây bệnh mạnh hơn khi bị đói
d) Giai đoạn tử vong (Death Phase)
Việc tiêu hao chất dinh dƣỡng và việc tích lũy các chất thải độc hại sẽ làm tổn
thất đến môi trƣờng sống của vi sinh vật, làm cho số lƣợng tế bào sống giảm xuống.
Đó l đặc điểm của giai đoạn tử vong. Giống nhƣ giai đoạn logarit, sự tử vong của
quần thể vi sinh vật cũng có tính logarit (tỷ lệ tế bào chết trong mỗi giờ là không
đổi). Tổng số tế bào sống và tế bào chết không thay đổi vì các tế bào chết chƣa bị
phân hủy. Muốn xác định số lƣợng tế bào sống phải pha loãng ra rồi cấy lên thạch
đĩa v đƣa v o điều kiện thích hợp để xác định số khuẩn lạc xuất hiện. Mặc dầu
phần lớn vi sinh vật tử vong theo phƣơng thức logarit nhƣng sau khi số lƣợng tế bào
đột nhiên giảm xuống thì tốc độ chết của tế bào chậm lại Đó l do một số cá thể
sống lại nhờ có tính đề kháng đặc biệt mạnh Vì điều này và những nguyên nhân
khác l m cho đƣờng cong của giai đoạn tử vong có thể khá phức tạp
2.2.3.2. Tính toán về uá t nh sinh t ƣởng (PGS TSKH
V N HOÀNG)
a. Số thế hệ (generation time hay doubling time)
Là thời gian giữa hai lần phân chia liên tiếp hay thời gian cần cho sự tăng đôi
số tế bào. Có thể biểu thị mối quan hệ bằng công thức sau đây:
n=
(số thế hệ)
Trong đó: N0 là số lƣợng tế b o ban đầu; Nt là số lƣợng tế bào ở thời gian t;
n là số thế hệ.
b. H ng số tốc độ phân chia k (mean growth rate constant k)
Hằng số tốc độ phân chia biểu thị tốc độ sinh trƣởng trong giai đoạn logarit
khi nuôi cấy batch (batch culture) theo tốc độ phân chia của tế bào nên còn gọi là
hằng số tốc phân chia hay số thế hệ sinh ra trong một đơn vị thời gian, thƣờng biểu
thị bằng số thế hệ trong 1 giờ:
K= =
GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn
(thế hệ/giờ)
Page 23
- Xem thêm -