Tài liệu Nghiên cứu nhân sinh khối vi tảo haematococcus pluvialis và cảm ứng tổng hợp astaxanthin

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG NGUYỄN PHƯỚC KHA NGHIÊN CỨU NHÂN SINH KHỐI VI TẢO HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS VÀ CẢM ỨNG TỔNG HỢP ASTAXANTHIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đà Nẵng - Năm 2018 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG NGUYỄN PHƯỚC KHA NGHIÊN CỨU NHÂN SINH KHỐI VI TẢO HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS VÀ CẢM ỨNG TỔNG HỢP ASTAXANTHIN Ngành: Quản lý Tài nguyên và Môi trường Cán bộ hướng dẫn: TS. TRỊNH ĐĂNG MẬU Đà Nẵng – Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đề tài “Nghiên cứu nhân sinh khối vi tảo Haematococcus pluvialis và cảm ứng tổng hợp astaxanthin” là kết quả công trình nghiên cứu riêng của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Các số liệu liên quan được trích dẫn có ghi chú nguồn gốc. Tác giả khóa luận Nguyễn Phước Kha LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu khoa học tự lực đầu tiên mà tôi đã hoàn thành trong sự nghiệp học và làm khoa học của tôi. Tuy nhiên, sự quan tâm, tin tưởng, giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và bạn bè chính là những yếu tố quan trọng tạo nên sự hoàn thiện của khóa luận. Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, tôi xin được chân thành cảm ơn đến những người luôn đồng hành cùng tôi vừa qua: Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Trịnh Đăng Mậu – người đã định hướng, động viên, đưa tôi đến gần với nghiên cứu khoa học và đã tận tình chỉ dạy cho tôi những kiến thức bổ ích trong cả học tập và cuộc sống trong suốt thời gian chuẩn bị và thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến em Nguyễn Thị Trang – đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong quá trình làm đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến những người bạn trong tập thể lớp 14CTM đã nhiệt tình hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến những người bạn trong tập thể nhóm nghiên cứu khoa học Plankton’s Lab đã hỗ trợ và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô Khoa Sinh – Môi trường đã trang bị cho tôi kiến thức và tạo điều kiện về trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm cho tôi thực hiện tốt đề tài nghiên cứu của tôi. Tôi xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, Ngày 23 tháng 4 năm 2018 Sinh viên: Nguyễn Phước Kha MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU ...............................................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài ...........................................................................................1 2. Mục tiêu đề tài ..........................................................................................................1 2.1 Mục tiêu tổng quát .............................................................................................. 2 2.2 Mục tiêu cụ thể ...................................................................................................2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................................2 3.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................... 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn................................................................................................ 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................3 1.1 Giới thiệu chung về vi tảo Haematococcus pluvialis ............................................3 1.1.1 Vị trí phân loại và phân bố của Haematococcus pluvialis .............................. 3 1.1.2 Đặc điểm sinh học và đặc điểm hình thái ........................................................3 1.1.3 Thành phần sinh hóa học của tảo H.pluvialis ..................................................5 1.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sinh trưởng của H.pluvialis ...............6 1.3 Giới thiệu chung về astaxanthin .............................................................................6 1.3.1 Đặc điểm chung ............................................................................................... 6 1.3.2 Cấu trúc astaxanthin ........................................................................................7 1.3.3 Các nguồn cung cấp astaxanthin......................................................................8 1.3.3.1 Nguồn astaxanthin tổng hợp hóa học ...........................................................8 1.3.3.2 Các nguồn astaxanthin trong tự nhiên ..........................................................8 1.3.4 Đặc tính chống oxy hóa của astaxanthin .......................................................10 1.4 Các yếu tố môi trường khác nhau ảnh hưởng đến tích lũy astaxanthin ở vi tảo H.pluvialis ..................................................................................................................10 1.5 Tình hình nghiên cứu về vi tảo H.pluvialis tổng hợp astaxanthin trên thế giới và Việt Nam ....................................................................................................................11 1.5.1 Trên thế giới ...................................................................................................11 1.5.2 Ở Việt Nam ....................................................................................................13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU ..................................................................................................................................14 2.1 Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................14 2.2. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................14 2.3 Phạm vi và thời gian nghiên cứu ..........................................................................14 2.3.1 Phạm vi nghiên cứu .......................................................................................14 2.3.2 Thời gian nghiên cứu .....................................................................................14 2.4 Phương pháp nghiên cứu......................................................................................14 2.4.1 Phương pháp làm sạch và lưu giữ giống .......................................................14 2.4.2 Phương pháp xác định sinh trưởng qua MĐTB.............................................14 2.4.3 Phương pháp phân tích số liệu .......................................................................15 2.5 Bố trí thí nghiệm ..................................................................................................15 2.5.1 Khảo sát môi trường tối ưu ............................................................................15 2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển của vi tảo H.pluvialis .............................................................................................. 16 2.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng cao và sốc muối trong môi trường nuôi cấy đến sự tích lũy astaxanthin của vi tảo H.pluvialis ........................17 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................18 3.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi đến sinh trưởng của vi tảo Haematococcus pluvialis ......................................................................................................................18 3.2 Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển của vi tảo Haematococcus pluvialis ...........................................................................................19 3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ ssodium nitrate lên sự sinh trưởng của H.pluvialis 19 3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ dikali phosphate lên sự sinh trưởng của H.pluvialis ................................................................................................................................ 23 3.3 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng cao và sốc muối trong môi trường nuôi cấy đến sự tích lũy astaxanthin của vi tảo Haematococcus pluvialis ............................... 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................................28 1. KẾT LUẬN ............................................................................................................28 2. KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................28 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..............................................................................................................30 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Số hiệu bảng Tên Trang 1.1 Thành phần dinh dưỡng của tảo H.pluvialis ở 2 giai đoạn sinh trưởng khác nhau 6 1.2 Nguồn cung cấp astaxanthin khác nhau 11 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ sodium nitrate lên sự sinh trưởng của H. pluvialis 16 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ dipotassium phosphate lên sự sinh trưởng của H. pluvialis 17 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khả năng tích lũy astaxanthin 27 3.1 Tốc độ sinh trưởng đạt đỉnh của hai môi trường RM và BBM ở các nồng độ sodium nitrate khác nhau 22 3.2 Tốc độ sinh trưởng đạt đỉnh của hai môi trường RM và BBM ở các nồng độ dipotassium phosphate khác nhau 26 DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu hình vẽ 1.1 1.2 Tên Hình dạng tế bào vi tảo Haematococcus pluvialis Sự thay đổi hình thái tế bào (A) và sự phân bào (B) trong vòng đời của vi tảo H.pluvialis Trang 4 5 1.3 Cấu trúc của astaxanthin 8 1.4 Phản ứng tổng hợp astaxanthin 8 3.1 Mật độ tế bào trên hai môi trường BBM và RM 18 3.2 Tốc độ sinh trưởng của tảo trên hai môi trường BBM và RM 18 3.3 Mật độ tế bào cao nhất trong môi trường RM ở các nồng độ NaNO3 20 3.4 Mật độ tế bào vi tảo H.pluvialis được nuôi cấy trong môi trường RM có nồng độ sodium nitrate khác nhau 20 3.5 Mật độ tế bào cao nhất trong môi trường BBM ở các nồng độ NaNO3 21 3.6 Mật độ tế bào vi tảo H.pluvialis được nuôi cấy trong môi trường BBM có nồng độ sodium nitrate khác nhau 21 3.7 Mật độ tế bào cao nhất trong môi trường RM ở các nồng độ K2HPO4 23 3.8 Mật độ tế bào vi tảo H.pluvialis được nuôi cấy trong môi trường RM có nồng độ dipotassium phosphate khác nhau 24 3.9 Mật độ tế bào cao nhất trong môi trường BBM ở các nồng độ K2HPO4 25 3.10 Mật độ tế bào vi tảo H.pluvialis được nuôi cấy trong môi trường BBM có nồng độ dipotassium phosphate khác nhau 25 3.11 Phần trăm tế bào tích lũy astaxanthin 26 3.12 Tế bào H.pluvialis tích lũy astaxanthin 26 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Astaxanthin (3, 3’- dihydroxy ß, ß’ carotene - 4,4 - dione) là một sắc tố carotenoid, được tìm thấy trong nhiều loại hải sản như các hồi, cá vền, tôm, cua, trứng cá, đôi khi nó cũng được phát hiện ở một số loài chim [16]. Hoạt tính chống oxy hóa của chúng cao hơn gấp 10 lần so với các loại carotenoit khác như ß-carotene, zeaxanthin, lutein, canthaxanthin và cao hơn gấp 500 lần so với α-tocopherol [38]. Bên cạnh đó, do khả năng ngăn chặn một số loại ung thư, kích thích hệ thống miễn dịch cao hơn so với ß-carotene và α-tocopherol nên hiện nay, ứng dụng của astaxanthin còn được mở rộng trong lĩnh vực y dược học [28, 32, 38]. Astaxanthin có giá trị kinh tế cao được sử dụng phổ biến trong công nghiệp thực phẩm, thực phẩm chức năng và nuôi trồng thủy sản. Astaxanthin được ứng dụng phổ biến làm thức ăn cho các loài thủy sản như trong nuôi cá hồi, màu sắc của thịt cá là một tham số chất lượng quan trọng đối với sự lựa chọn của người tiêu dùng [13, 14]. Màu sắc của cá được tạo bởi sự lắng đọng của các carotenoid (như astaxanthin và canthaxanthin) trong thịt cá. Nhưng cá hồi không tự tổng hợp được astaxanthin mà phải được cung cấp từ nguồn thức ăn. Vì vậy, sự hấp thụ astaxanthin của cá hoàn toàn phụ thuộc vào hàm lượng của chất này có trong nguồn thức ăn cũng như thời gian cho cá ăn thức ăn có bổ sung thêm astaxanthin [41]. Astaxanthin được bổ sung vào khẩu phần ăn để nhằm tạo màu sắc cho thịt nhằm tăng chất lượng sản phẩm, nâng cao giá trị kinh tế. Ngoài ra, astaxanthin không những có vai trò tạo màu hồng đỏ cho thịt cá mà còn có hoạt tính chống oxy hóa và là tiền vitamin A. Trong bối cảnh hiện nay, nhu cầu sử dụng astaxanthin trên thế giới ngày càng cao nhưng nguồn cung cấp astaxanthin chủ yếu là từ tổng hợp hóa học (chiếm 95%), nguồn astaxanthin này có giá thành rất cao, nhưng chỉ có 25% astaxanthin được tổng hợp có hoạt tính và hữu dụng. Do đó, viêc sản xuất astaxanthin từ nguồn tự nhiên vi tảo Haematococcus pluvialis (H.pluvialis) đã thu hút nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà nghiên cứu và sản xuất ứng dụng vì vi tảo H.pluvialis có khả năng tích lũy astaxanthin lên tới trên 5-6% trọng lượng khô [4, 6]. Bên cạnh đó, 100% astaxanthin được chiết xuất từ H.pluvialis có dạng đồng phân 3S-3’S đây là dạng đồng phân có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất [32]. 2 Tuy nhiên, việc sản xuất astaxanthin hiệu quả từ loài vi tảo này còn gặp nhiều khó khăn bởi vì chúng có tốc độ sinh truởng thấp và nhạy cảm với sự thay đổi của điều kiện nuôi cấy. Hầu hết tế bào vi tảo đều duy trì ở trạng thái sinh duỡng, tích lũy rất ít hoặc không tích lũy astaxanthin khi nuôi ở điều kiện thích hợp. Nhưng dưới điều kiện stress, tế bào chuyển sang dạng bào nang không chuyển động và khi được kích thích phù hợp tế bào tảo có thể tích lũy một luợng lớn astaxanthin. Vì vậy, điều kiện cho tế bào sinh truởng và tổng hợp astaxanthin là rất khác nhau. Việc xác định rõ ràng yếu tố dinh dưỡng, môi trường nhân sinh khối vi tảo H. pluvialis và các điều kiện cảm ứng astaxanthin ở H. pluvialis là cần thiết để đạt được mật độ tế bào cao và giàu hàm lượng astaxanthin. Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu nhân sinh khối vi tảo Haematococcus pluvialis và cảm ứng tổng hợp astaxanthin” 2. Mục tiêu đề tài 2.1 Mục tiêu tổng quát Tìm ra được điều kiện nuôi cho hiệu quả sinh trưởng của vi tảo tốt nhất và điều kiện kích thích phù hợp để tảo tích lũy một hàm lượng lớn astaxanthin. 2.2 Mục tiêu cụ thể - Xác định các yếu tố dinh dưỡng và môi trường nuôi tối ưu cho nhân sinh khối vi tảo Haematococcus pluvialis; - Xác định được điều kiện cảm ứng tổng hợp astaxanthin ở vi tảo Haematococcus pluvialis. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về sự ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng và môi trường tối ưu cho sinh trưởng và phát triển vi tảo Haematococcus pluvialis và các điều kiện cảm ứng tổng hợp astaxanthin. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài làm cơ sở nghiên cứu tạo ra các sản phẩm thủy hải sản chất lượng cao với việc bổ sung astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về vi tảo Haematococcus pluvialis Haematococcus pluvialis (H. pluvialis) là một loài vi tảo lục, nước ngọt, đơn bào, sinh sản vô tính bằng cách nhân đôi có thể di chuyển được [8]. Đây là một loài tảo có tiềm năng rất lớn vì khả năng tổng hợp astaxanthin của nó. Lượng astaxanthin tối đa mà loài tảo này có thể đạt được lên tới 4-6% TLK [4, 6]. 1.1.1 Vị trí phân loại và phân bố của Haematococcus pluvialis Vị trí của Haematococcus pluvialis trong hệ thống phân loại như sau [37]: - Giới: Eukaryota - Ngành: Chlorophyta - Lớp: Chlorophyceae - Bộ: Volvocales - Họ: Chlamydomonadales - Chi: Haematococcus - Loài: Haematococcus pluvialis Tảo H. pluvialis được phân bố rộng rãi trong nhiều môi trường sống trên toàn thế giới. Tảo này được tìm thấy ở các vùng ôn đới trên thế giới và đã được phân lập từ châu Âu, châu Phi, Bắc Mỹ và Himachal Pradeslv Ấn Độ [36]. Nhiều công trình công bố đã cho thấy tảo này có thể sinh sống trong những điều kiện môi trường và khí hậu đa dạng như vùng nước lợ trên những tảng đá trên bờ biển [5]; lưu vực nước ngọt trong đá dày, tuyết tan chảy trên đảo Blomstrandhalvoya; Na Uy [23]; đài phun nước khô gần Rozhen, Blagoevgrad ở Blugaria [12]. Với khả năng chống chịu tốt ở các điều kiện bất lợi, thích nghi được với điều kiện môi trường thay đổi đột ngột bằng cách hình thành màng dày bao bọc xung quanh tế bào (tế bào dạng cyst) và có khả năng nảy mầm trở lại khi gặp điều kiện môi trường thuận lợi [33]. 1.1.2 Đặc điểm sinh học và đặc điểm hình thái Tảo đơn bào nước ngọt H. pluvialis thuộc nhóm tảo lục hai roi và có khả năng chuyển động ở giai đoạn sinh dưỡng [11]. Sinh sản vô tính bằng cách nhân đôi. Hình thái tế bào của H.pluvialis có sự biến đổi khác nhau trong chu trình sống của chúng. Tế bào có 2 dạng, tương ứng với đặc điểm sinh trưởng: Tế bào sinh dưỡng và nang bào tử (cyst). Trong đó: 4 Hình 1.1 Hình dạng tế bào vi tảo Haematococcus pluvialis [26] A. Tế bào H.pluvialis ở dạng dinh dưỡng, B. Tế bào H.pluvialis ở dạng nang bào tử (cyst) - TB sinh dưỡng: màu xanh, dạng hình cầu hoặc elip với đường kính khoảng 10 20µm, có thể chuyển động nhờ 2 roi. Trong điều kiện thuận lợi, phần lớn tế bào ở dạng sinh dưỡng, có hàm lượng chlorophyll a,b và tiền carotenoid, đặc biệt là β-carotene và lutein cao [42]. Sinh trường quang tự dưỡng khi có ánh sáng [4] và dị dưỡng trong tối [11]. - Nang bào tử (cyst): Khi gặp điều kiện bất lợi (cạn kiệt dinh dưỡng, cường độ ánh sáng cao, nhiệt độ cao, stress muối,…) TB sẽ cảm ứng hình thành nang bào tử và hình thái thay đổi sang dạng cyst. Tế bào dạng này hình cầu, mất roi, không còn khả năng di động. Đường kính tăng lên đột ngột tới 40-50 µm [28]. Ngoài ra, những tế bào nang này có hàm lượng carotenoid thứ cấp như echinenone, canthanxanthin và astaxanthin tăng trong khi có hàm lượng chlorophyll và tiền carotenoid lại giảm [9]. Tốc độ sinh trưởng của tảo H. pluvialis ở giai đoạn này giảm, tế bào tích lũy một lượng lớn astaxanthin. Ban đầu, astaxanthin chủ yếu được hình thành tập trung quanh nhân và quá trình được tiếp diễn đến khi toàn bộ tế bào chuyển sang màu đỏ [25]. Các tế bào ở dạng cyst có hàm lượng astaxanthin đạt khoảng 4% TLK [2]. Thời gian chuyển pha mất khoảng vài tuần dưới điều kiện quang tự dưỡng [8]. Cùng lúc với sự thay đổi hình thái và kích thước tế bào là sự thay đổi hàm lượng sắc tố và protein nội bào, trong đó diễn ra sự tích lũy astaxanthin cao. Theo một số công bố cho thấy hàm lượng chlorophyll không thay đổi trong suốt quá trình tích lũy astaxanthin [17], nhưng trong nghiên cứu của Spery, 1970 [38] lại cho rằng có xu hướng giảm đi. 5 Theo Kobayashi và cs., [21] vòng đời của H. pluvialis trải qua các giai đoạn như sau (hình 1.2 ): Hình 1.2 Sự thay đổi hình thái tế bào (A) [26] và sự phân bào (B) trong vòng đời của vi tảo H.pluvialis [31] (I) Giai đoạn TB sinh dưỡng: TB hình elip, chuyển động bằng hai roi, phân chia TB để gia tăng số lượng. Các tế bào chứa hàm lượng chlorophyll và protein cao nhưng hàm lượng carotenoid trong TB thấp. (II) Giai đoạn tạo bào nang: Các TB sinh dưỡng chuyển sang dạng màu nâu, hình khối cầu, mất roi. Trong suốt giai đoạn nang bào, mức độ sinh tổng hợp carotenoid và protein tăng lên [27]. (III) Giai đoạn tế bào nang hoàn chỉnh: TB nang đã hoàn chỉnh, bất động, tích lũy hàm lượng carotenoid cao nhất. (IV) Giai đoạn nảy mầm: Xảy ra sự tổng hợp chlorophyll và protein, xuất hiện sự phân giải carotenoid. Có hai cách thức nảy mầm ở vi tảo H. pluvialis đã được quan sát: (1) nảy mầm trực tiếp từ một nang bào tử hình cầu, không di động thành 1 tế bào sinh dưỡng hình elip, có 2 roi; (2) nảy mầm gián tiếp thông qua pamella (cụm tế bào được bao bọc bởi một màng). Khi đó màng bao bọc pamella bị vỡ, từ một tế bào nang tạo ra 8 tế bào sinh dưỡng. 1.1.3 Thành phần sinh hóa học của tảo H.pluvialis Do tảo H. pluvialis có chu kỳ sống phức tạp, vòng đời của tảo có sự xen kẽ giữa tế bào sinh dưỡng màu xanh với tế bào cyst màu đỏ nên thành phần dinh dưỡng của tế 6 bào tảo này thay đổi rất khác nhau giữa 2 giai đoạn sinh trưởng trong quá trình nuôi cấy (Bảng 1.1). Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của tảo H.pluvialis ở 2 giai đoạn sinh trưởng khác nhau [27, 31] 1.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sinh trưởng của H.pluvialis Ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng của H. pluvialis gồm nhiều yếu tố như cường độ ánh sáng tối ưu cho sinh trưởng của H. pluvialis dao động từ 2-24klux [10,12,20]. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của H. pluvialis dao động từ 15-17oC [25,37]. pH tối ưu cho sự phát triển của H. pluvialis nằm trong khoảng từ 6,5-8 [28]. Cuối cùng là nguồn dinh dưỡng: Bao gồm đa lượng và vi lượng. Dinh dưỡng đa lượng được cung cấp với lượng (carbon, nito, phospho, canxi,…). Các nguyên tố vi lượng chỉ cần cung cấp với hàm lượng thấp, dao động từ mức µg/l đến mg/l. Một số dinh dưỡng vi lượng cần thiết cho sinh trưởng của tảo đã được biết gồm sắt, mangan, đồng và các vitamin… [20]. 1.3 Giới thiệu chung về astaxanthin 1.3.1 Đặc điểm chung Astaxanthin (3,3’- dihydroxy – β, β’-crotenen-4,4’-dione) là một oxycarotenoit, có công thức phân tử C40H52O4, khối lượng phân tử M = 595, điểm nóng chảy xấp xỉ 224oC, một chất thuộc carotenoid. Astaxanthin được tìm thấy trong nhiều loại hải sản như cá hồi, cá vền (seabream), tôm, cua, trứng cá, đôi khi nó cũng được phát hiện ở 7 một số loài chim [16]. Ngoài tự nhiên, astaxanthin tồn tại ở dạng liên kết với protein tạo phức chất màu xanh đen. Khi gia nhiệt hay bị oxy hóa, liên kết bị cắt đứt, giải phóng astaxanthin tự do có màu đỏ cam. Động vật có vú không có khả năng tổng hợp astaxanthin mà phải được cung cấp từ khẩu phần ăn. Ở H. pluvialis, astaxanthin được tổng hợp ở giai đoạn bào nang và là loại sắc tố rất đặc trưng, có giá trị cao. Astaxanthin có liên quan chặt chẽ với các carotenoid khác như β-carotene, zeaxanthin và lutein, do đó chúng có nhiều chức năng chuyển hóa (trao đổi chất) và sinh lý học của carotenoid. Sự hiện diện của hydroxyl và keto ở mỗi vòng ionone, giải thích một số tính năng độc đáo, như khả năng este hóa, hoạt động chống oxy hóa cao hơn và cấu hình đối cực hơn các carotenoid khác. Trong tự nhiên, nó được tìm thấy kết hợp với các protein, chẳng hạn như trong cơ thể cá hồi hoặc lớp vỏ tôm hùm, hoặc thành hợp chất muối với một hoặc hai axit béo, để ổn định phân tử. Ở H. pluvialis, hình thái este hóa chủ yếu, hầu hết là astaxanthin monoester [16]. Astaxanthin có vai trò là một chất chống oxi hóa với hoạt tính cao hơn các carotenoid khác nhiều lần nên được gọi là một “siêu Vitamin E”. Màu sắc của các loại giáp xác bắt nguồn từ loại carotenoid chúng thu nhận trong thức ăn, chính là astaxanthin. Nó còn có vai trò thức đẩy sự thành thục, tăng tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ sống sót của trứng và cải thiện sự phát triển của phôi [16]. 1.3.2 Cấu trúc astaxanthin Astaxanthin bao gồm hai vòng đầu cuối được nối bởi một chuỗi polyene. Phân tử này có hai carbon bất đối xứng nằm ở vị trí 3, 3' của vòng β-ionon với nhóm hydroxyl (-OH) ở cả hai đầu của phân tử. Trong trường hợp, một nhóm hydroxyl phản ứng với một axit béo sau đó tạo thành monoester, trong khi cả hai nhóm hydroxyl được phản ứng với các axit béo thì kết quả được gọi là diester. Astaxanthin tồn tại trong các đồng phân lập thể, các đồng phân hình học, các dạng tự do và este hóa [40]. Tất cả các hình thức này được tìm thấy trong các nguồn tự nhiên. Các bộ giải mã (3S - 3'S) và (3R 3'R) là chất dồi dào nhất trong tự nhiên. Astaxanthin tổng hợp bao gồm các đồng phân của (3S - 3'S) (3R - 3'S) và (3R - 3'R) (Hình 1.3). Trong đó, 3S - 3'S là dạng astaxanthin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, dạng 3R - 3'S không có hoạt tính sinh học, dạng 3R - 3'R có hoạt tính yếu [1]. 8 Hình 1.3 Cấu trúc của astaxanthin [29] (Dạng tự do(A), dạng monoester (B), dạng diester (C) và các đồng phân hình học (D). R là các chuỗi axit béo bão hòa hoặc không bão hòa) 1.3.3 Các nguồn cung cấp astaxanthin 1.3.3.1 Nguồn astaxanthin tổng hợp hóa học Hiện nay, nguồn astaxanthin tổng hợp là nguồn cung cấp chủ yếu cho nuôi trồng thủy sản. Hơn 95% astaxanthin tổng hợp trên thị trường được sử dụng làm thức ăn, tạo ra các màu sắc khác nhau. Dù vậy, nguồn astaxanthin này có giá thành rất cao, không tinh khiết và tiềm ẩn nhiều sản phẩm phụ có nguy cơ gây hại. Quá trình tổng hợp hóa học astaxanthin được sử dụng lâu đời và rộng rãi nhất liên quan đến phản ứng Wittig của muối phosphate ở vị trí C15 với dialdehyde ở vị trí carbon C10 (Hình 1.4A). Các phương pháp khác bao gồm hydroxyl hóa canthaxanthin (Hình 1.4B) [3], một quá trình trùng hợp 3 mạch carbon có chiều dài 10, 20 và 30 nguyên tử carbon thông qua ngưng tụ dienolether [2] và các đồng phân của lutein được chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ để tạo thành zeaxanthin và sau đó chất này bị ôxy hóa để hình thành astaxanthin (Hình 1.4C) [35]. Hình 1.4 Phản ứng tổng hợp astaxanthin (Phản ứng Witting (A); Hydroxyl hóa canthaxanthin (B); Oxy hóa zeaxanthin (C) [29] 1.3.3.2 Các nguồn astaxanthin trong tự nhiên a. Từ các loại giáp xác 9 Trong các loài giáp xác thủy sản, astaxanthin chủ yếu được tập trung ở phần vỏ ngoài, chiếm từ 58 đến 87% carotenoid tổng số. Hàm lượng astaxanthin có trong vỏ tôm, cua thay đổi đáng kể tùy thuộc vào loài, từ 10 đến 140mg/kg khối lượng tươi và tồn tại ở dạng 3S-3S’. Chính vì vậy, vỏ tôm, cua chính là một nguồn astaxanthin đáng kể trong tự nhiên. Tuy vậy, hàm lượng astaxanthin trong các nguyên liệu này tương đối thấp. Trong khi đó, độ ẩm, hàm lượng tro và các chất dinh dưỡng khác trong vỏ tôm, cua lại rất cao đã gây ra một số khó khăn nhất định trong việc sản xuất [18]. b. Nấm men Phaffia rhodozyma là một loại nấm men duy nhất được biết đến hiện nay có khả năng tổng hợp astaxanthin lên tới 0,5% SKK (nhưng 100% astaxanthin tích lũy ở dạng đồng phân 3R,3R’) [5] Một lợi thế của chủng này là có khả năng sinh trưởng nhanh và đạt mật độ tế bào cao trong quá trình lên men. Tích lũy astaxanthin ở nấm men thông qua con đường menvalonate [35]. Tuy nhiên, hàm lượng astaxanthin tổng hợp được phụ thuộc rất nhiều vào đặc điểm sinh học của chủng, phương pháp và điều kiện nuôi cấy [19]. Ngoài ra, do Ph.rhdozyma có cấu tạo vách tế bào cứng, khó tiêu hóa đối với các động vật nên trong quá trình sản xuất các chế phẩm sinh học chứa astaxanthin từ loài nấm men này cần phải phá hủy thành tế bào bằng các phương pháp cơ học hay xử lý bằng enzyme khác nhau, nhằm tăng hiệu quả hấp thụ của chất này đối với động vật. c. Tảo Astaxanthin có thể được sản xuất từ nhiều loại vi tảo khác nhau như Ankitrodesmus branuii, Dunaliella salina, Chlamydomonas (<50 µg/g TB)… nhưng hàm lượng astaxanthin ở những đối tượng này lại khá thấp và không thích hợp để sản xuất thương mại. Trong khi đó loại tảo lục Haematococcus pluvialis có khả năng tích lũy một lượng lớn astaxanthin, thu hút các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu [39]. Astaxanthin từ tảo Haematococcus pluvialis chứa 5% dạng tự do và 95% dạng từ ester hóa (75% monoester và 20% diester). Trong đấy, 100% astaxanthin được chiết xuất từ H.pluvialis có dạng 3S-3S’ đây là dạng đồng phân có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất [32]. d. Các vi sinh vật khác 10 Một số loại vi khuẩn như Mycobacterium lacticola, Brevibacterium sp. Và một số chủng nấm thuộc chi Peniophora cũng có khả năng tích lũy astaxanthin. Hàm lượng carotenoid của những sinh vật này thấp đồng thời cũng sinh trưởng rất chậm. Cá hồi cũng là một nguồn cung cấp astxanthin tự nhiên. Hàm lượng Astaxanthin trong cá hồi tự nhiên Oncorhynchus được báo cáo trong khoảng 26-38 mg / kg thịt cá hồi. Hàm lượng Astaxanthin trong cá hồi Đại Tây Dương được nuôi là 6-8 mg / kg thịt. Tôm, cua và cá hồi có thể là nguồn cung cấp astaxanthin trong chế độ ăn kiêng. Cá hồi đánh bắt tự nhiên là một nguồn cung cấp astaxanthin tốt. Để có được 3,6 mg astaxanthin một người có thể ăn 165 gram cá hồi mỗi ngày. Astaxanthin bổ sung 3,6 mg mỗi ngày có thể có lợi cho sức khoẻ như báo cáo của Iwamoto et al [43]. 1.3.4 Đặc tính chống oxy hóa của astaxanthin Astaxanthin có vai trò là chất chống oxy hóa mạnh. Sự trao đổi chất bình thường ở sinh vật hiếu khí tạo ra các gốc tự do như hydroxyl, peroxide và phân tử oxy có hoạt tính (reactive oxygeb species – ROS) cần thiết để duy trì sự sống. Tuy nhiên, khi hàm lượng các chất này quá cao sẽ gây nguy hiểm bởi chũng có thể oxy hóa với các thành phần của tế bào như protein, lipit, carbonhydrate và ADN. Để kiểm soát và giảm quá trình này, cơ thể con người sản sinh ra các chất chống oxy hóa như superoxide dismutase (SOD), catalase, peroxidase… tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, những hợp chất này không đủ để bảo vệ cơ thể chống lại stress oxy hóa [31] Hoạt tính chống oxy hóa của astaxanthin đã được chứng minh trong một số nghiên cứu, astaxanthin có hoạt tính chống oxy hóa cao gấp 10 lần so với các carotenoid khác như zeaxanthin, lutein, canthxanthin, β-carotene và cao hơn gấp 100 lần so với α – tocopherol. Vì vậy, astaxanthin được gọi là một “super vitamin E”. Astaxanthin thực hiện các hoạt động chống oxy hóa bằng cách loại bỏ các gốc tự do hoặc dập tắt các các phản ứng oxy hóa. Đặc tính này của astaxanthin có thể do sự tương tác vật lý và hóa học của astaxanthin với các màng tế bào [2]. 1.4 Các yếu tố môi trường khác nhau ảnh hưởng đến tích lũy astaxanthin ở vi tảo H.pluvialis Khả năng tích lũy astaxanthin ở H.pluvialis phụ thuộc rất nhiều vào những thông số môi trường sau [19]: Ánh sáng là yếu tố kích thích quá trình sinh tổng hợp carotenoid, đặc biệt astaxanthin ở H.pluvialis. Cường độ ánh sáng tối ưu cho tổng hợp – tích lũy astaxanthin ở H.pluvialis dao động từ 75-100 klux. Tuy nhiên khả năng sinh tổng hợp carotenoid còn phụ thuộc vào chất lượng ánh sáng. 11 Nhiệt độ: việc tổng hợp và tích lũy astaxanthin tăng lên dần dần khi tảo được nuôi trồng ở điều kiện nhiệt độ cao. Nhiệt độ tối ưu cho sự tích lũy astaxanthin là trên 30oC. Các yếu tố dinh dưỡng như nguồn carbon và nito: Đối với H.pluvialis, giới hạn nguồn nito là yếu tố chìa khóa cho tổng hợp và tích lũy astaxanthin [21]; Phospho: Trong điều kiện thiếu hụt phosphate, H.pluvialis có thể tích lũy một lượng lớn astaxanthin [15]; Stress độ mặn: dưới điều kiện stress độ mặn, tích lũy astaxanthin trong bào nang xảy ra cả trong tối và ngoài sáng [15] 1.5 Tình hình nghiên cứu về vi tảo H.pluvialis tổng hợp astaxanthin trên thế giới và Việt Nam 1.5.1 Trên thế giới Haematococcus được Girod – Chantrans nghiên cứu đầu tiên vào năm 1797 và tiếp tục được các nhà khoa học như Agardh, Cohn, Braun, Rostafinski, Butschli và các nhà khoa học khác tiếp tục nghiên cứu cho đến nay. Từ những thập kỷ cuối của thế kỷ XIX, người ta đã phát hiện ra các đặc điểm sinh học về vòng đời của loài vi tảo này. Các tế bào ở trạng thái bất hoạt sau khi được ngâm trong nước trong thời gian dài đã mất đi khả năng sinh trưởng. Nếu những tế bào này được phơi khô, thậm chí trong một khoảng thời gian ngắn sau đó ngâm lại trong nước thì có khả năng tăng trưởng rất nhanh. Như vậy, Haematococcus có khả năng thích nghi với điều kiện luân phiên của tình trạng ẩm ướt và khô hạn. Trong thời gian đó, người ta đã nghĩ đến việc sử dụng thiết bị hút ẩm để điều chỉnh quá trình này. Đây là cơ sở khoa học đầu tiên của việc ứng dụng các đặc tính tự nhiên của loài vi tảo này và manh nha các ý tưởng khởi đầu cho các tác động của con người nhằm can thiệp vào vòng đời tự nhiên của H.pluvialis [7]. Từ những năm cuối của thập kỷ 20 của thế kỷ XX, người ta đã phát hiện thấy khả năng tồn tại trong điều kiện bất lời đối với tế bào bào tử của loài tảo này đáng ngạc nhiên. Năm 1950, Haematococcus pluvialis đã được xác định trong hệ thống phân loại [37]. Vòng đời của Haematococcus cũng đã được Kobayashi và cs (1992;1993) công bố. Trong những năm gần đây, với sự bùng nổ dân số thế giới, kéo theo hàng loạt những vẫn đề về sức khỏe . Hiện nay, với mục đích bổ sung các vi chất cần thiết nhằm tăng cường sức khỏe, ngăn chặn quá trình lão hóa cũng như giảm nguy cơ của một số bệnh tật, nhu cầu về các hạt chất, đặc biệt là các chất có nguồn gốc tự nhiên là rất lớn, do đó việc nghiên cứu về các hợp chất có giá trị từ sinh vật có tiềm năng to lớn và ngày càng được đẩy mạnh. Astaxanthin, một loại sắc tố được tìm thấy nhiều ở vi tảo