Tài liệu Nghiên cứu nhân giống cây gừng núi đá ( zingiber purpureum roscoe) bằng phương pháp in vitro

  • Số trang: 65 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 1652 |
  • Lượt tải: 0
tailieuonline

Tham gia: 31/07/2015

Mô tả:

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ---------------------- HOÀNG TRUNG SƠN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY GỪNG NÚI ĐÁ (Zingiber purpureum Roscoe) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo :Chính quy Chuyên ngành:Công nghệ sinh học Khoa :CNSH - CNTP Khóa học :2012 - 2016 Thái Nguyên - 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ---------------------- HOÀNG TRUNG SƠN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY GỪNG NÚI ĐÁ (Zingiber purpureum Roscoe) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp : K44 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 - 2016 Giảng viên hƣớng dẫn :1. PGS.TS. Ngô Xuân Bình 2. ThS. Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên - 2016 i LỜI CẢM ƠN Được sự nhất trí của ban giám hiệu nhà trường, ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu nhân giống cây Gừng núi đá ( Zingiber purpureum Roscoe) bằng phương pháp in vitro”. Qua 5 tháng thực tập tại Viện Nghiên cứu và Phát triển lâm nghiệp phía bắc đến nay em đã hoàn thành đề tài. Để đạt kết quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu nhà trường, ban chủ nhiệm khoa cùng các thầy cô giáo bộ môn công nghệ sinh học, cùng các anh chị phòng công nghệ sinh học trong Viện Nghiên cứu và Phát triển lâm nghiệp đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS.Ngô Xuân Bình, cô giáo Ths. Nguyễn Thị Tình và chị Phạm Thị Thảo đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện tốt nhất có thể và luôn là chỗ dựa tinh thần cho tôi trong quá trình học tập ,cảm ơn bạn bè đã giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua. Do thời gian thực tập đề tài có giới hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót. Tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến chân thành từ các thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn ! Thái nguyên, ngày 23 tháng 05 năm 2016 Sinh viên thực hiện Hoàng Trung Sơn ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu....................................................25 Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trường nuôi cấy (MS, B5, WPM) đến khả năng tái sinh chồi Gừng núi đá sau 3 tuần ..................27 Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Gừng núi đá sau 4 tuần ........................................................................30 Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Gừng núi đá sau 4 tuần .............................................................32 Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Gừng núi đá sau 4 tuần.....................................34 Bảng 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng cảm ứng hình thành rễ của Gừng núi đá sau 4 tuần ...................................................36 Bảng 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng một số loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ở vườn ươm sau 2 tuần ....................................38 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu....................................................26 Hình 4.2. Ảnh củ Gừng núi đá trong giai đoạn tái sinh chồi ....................................26 Hình 4.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của môi trường MS , B5 và WPM đến khả năng tái sinh chồi gừng núi đá ....................................................................28 Hình 4.4. Ảnh tái sinh chồi Gừng núi đá sau 3 tuần nuôi cấy trong môi trường MS .....................................................................................................................28 Hình 4.5. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Gừng núi đá .........................................................................................30 Hình 4.6. Ảnh mô Gừng núi trong môi trường nhân nhanh MS có bổ sung nồng độ BA 1,5mg/l sau 4 tuần .................................................................................31 Hình 4.7. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Gừng núi đá ..............................................................................32 HÌnh 4.8. Ảnh chồi gừng núi đá trong môi trường nhân nhanh bổ sung Kinetin 1mg/l trong 4 ...............................................................................................33 Hình 4.9. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Gừng núi đá .....................................................................35 Hình 4.10. Ảnh chồi Gừng núi đá trong môi trường nhân nhanh MS bổ sung BA kết hợp với NAA sau 4 tuần với nồng độ BA 1,5mg/l và nồng độ NAA 0,5 mg/l ..............................................................................................................35 Hình 4.11. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng cảm ứng rễ của gừng núi đá ...........................................................................................37 Hình 4.12. Ảnh Gừng núi đá ra rễ trong môi trường MS khi bổ sung nồng độ NAA 0,5 mg/l sau 4 tuần ......................................................................................37 Hình 4.13. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của một số loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ở vườn ươm ................................39 Hình 4.14. ảnh cây Gừng núi đá được trồng trên giá thể đất + trấu hun +mùn (1:2:1) sau 2 tuần .....................................................................................................40 iv DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ADN : Acid deoxyribonucleic B1 : Thiamin B3 : Nicotinic ac B5 : Gamborg's B6 : Pyridoxine BA : 6- Benzylaminopurine CT : Công thức Đ/C : Đối chứng IAA : Indol axetic acid Kinetin : 6-Furfurylaminopurine MT : Môi trường TN : Thí nghiệm CV : Coefficient of Variation LSD : Least Significant Difference Test MS : Murashige and Skoog‟s NAA : α - Naphlene axetic acid 2,4-D :2,4-Dichlorophenoxy acetic acid v MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1 1.2.Mục đích nghiên cứu ................................................................................... 2 1.3.Yêu cầu ........................................................................................................ 2 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài ................................................... 2 1.4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2 1.4.2. Ý nghĩa thực tiến ..................................................................................... 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 3 2.1. Giới thiệu về Gừng núi đá .......................................................................... 3 2.1.1. Phân loại .................................................................................................. 3 2.1.2.Đặc điểm hình thái ................................................................................... 3 2.1.3. Đặc điểm phân bố.................................................................................... 4 2.1.4. Sinh thái, trồng trọt ................................................................................. 4 2.1.5. Thành phần hóa học và tác dụng dược lý ............................................... 5 2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) ....................... 6 2.2.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................................. 6 2.2.2. Tính toàn năng của tế bào ....................................................................... 6 2.2.3. Phản phân hóa và phân hóa tế bào .......................................................... 7 2.2.4. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................ 7 2.3. Tình hình nghiên cứu Gừng núi đá trong nước và thế giới ..................... 13 2.3.1. Tình hình nghiên cứu thế giới ............................................................... 13 2.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 14 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU16 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................ 16 3.1.1. Đối tượng .............................................................................................. 16 vi 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 16 3.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu ................................................................ 16 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 16 3.2.2. Thời gian nghiên cứu ............................................................................ 16 3.3. Điều kiện nuôi cấy ................................................................................... 16 3.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 17 3.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 17 3.5.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro .................................................. 17 3.5.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm.............................................................. 17 PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 25 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu ..................................... 25 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trường nuôi cấy (MS, B5, WPM) đến khả năng tái sinh chồi Gừng núi đá. ...................................... 27 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Gừng núi đá ............................................................................................. 29 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Gừng núi đá .................................................................................. 31 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA Kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi Gừng núi đá........................................ 33 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng cảm ứng rễ của Gừng núi đá .......................................................................................... 36 4.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng một số loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ở vườn ươm ................................... 38 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ………………….…………………... 41 5.1 Kết luận ..................................................................................................... 41 5.2 Kiến nghị ................................................................................................... 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 43 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Họ Gừng bao gồm khoảng 47 chi và hơn 1.000 loài , phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chủ yếu ở nam và đông nam châu Á. Ở Việt Nam hiện nay biết gần 20 chi và gần 100 loài, trong đó Gừng núi đá là một trong những loài có giá trị lớn [13]. Tên khoa học Zingiber purpureum Roscoe , họ Gừng zingiberaceae, thuộc chi Gừng zingiber, bộ Gừng Zingiberales. Cây Gừng núi đá cao khoảng từ 0,3-1m, thân rễ dạng củ phân nhiều nhánh [12]. Từ đời nhà Minh Trung Quốc nhà y học nổi tiếng Lý Thời Châu đã viết trong cuốn “ Bản Thảo Cương Mục” như sau: “Gừng đắng mà không hôi, đắng có thể xua tà, đuổi ác, có thể ăn sống, ăn chín, ngâm giấm, làm tương, ngâm muối, xào với mật, đường. Cũng có thể làm rau, làm kẹo, làm thuốc rất có lợi”. Nước Gừng tính ôn có công dụng long đờm chữa ho. Vỏ Gừng tính mát có công dụng tỳ vị, tiêu viêm ,sưng, Gừng khô tính nhiệt, dùng ấm, có công dụng giải hàn, trừ tỳ vị hư hàn. Lá Gừng có tính ôn có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, hoạt huyết. Ngày nay với khoa học và kỹ thuật phát triển cây Gừng có tác dụng đặc biệt đã được phát hiện như hoạt tính kháng virus, chống oxy hóa và kháng khuẩn. Tuy nhiên nguồn gen cây họ Gừng đang có nguy cơ mất mát nhanh do sự khai thác quá mức. Theo quyết định số 80/2005QĐ- BNN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn từ năm 2005 cây Gừng núi đá đã được xếp vào nhóm cây thực phẩm quý hiếm cần được bảo tồn. Vì vậy Gừng núi đá rất cần có định hướng để bảo tồn đúng đắn để phục vụ trong tương lai [20]. 2 Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu giống cây Gừng núi đá (Zingiber purpureum Roscoe ) bằng phương pháp in vitro”. 1.2.Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu thành công quy trình nhân giống cây Gừng núi đá bằng phương pháp in vitro. 1.3.Yêu cầu - Xác định được thời gian khử trùng thích hợp - Xác định được môi trường nuôi cấy thích hợp đến khả năng tái sinh Gừng núi đá. - Xác định được ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (BA, Kinetin, NAA) đến qua trình nhân nhanh chồi, ra rễ chồi Gừng núi đá. - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng cảm ứng rễ của chồi Gừng núi đá. - Xác định được loại giá thể phù hợp đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro trong vườn ươm. 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài 1.4.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu sẽ xây dựng được biện pháp kỹ thuật nhân giống Gừng núi đá bằng phương pháp in vitro. Đánh giá được chất kích thích sinh trưởng, thành phân môi trường nuôi cấy và thời gian khử trùng trong quy trình nhân giống Gừng núi đá bằng phương pháp in vitro. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiến - Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống Gừng núi đá bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, để đảm bảo cung cấp số lượng lớn cây giống có chất lượng cao phục vụ cho sản xuất. - Bảo tồn được loại dược liệu quý. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về Gừng núi đá 2.1.1. Phân loại Theo hệ thống thực vật học mới nhất cây Gừng núi đá được phân loại như sau: Giới : Plantae Nghành : Magnoliophyta Lớp : Liliopsida Bộ : Zingiberales Họ : Zingiberaceae Chi : Zingiber Loài : Zingiber purpureum Roscoe Tên Việt Nam: Gừng núi đá Tên khoa học: Zingiber purpureum Roscoe Tên khác: Cây Ngải, Zơ Rơng, Gừng Gié, Gừng Tía. Tên nước ngoài: Zingiber cassumunar Roxb., Bengle (Java) 2.1.2.Đặc điểm hình thái Cây thân thảo cao 1-1,4m, thân rễ dạng củ, phân nhánh, màu trắng, lúc củ còn non có màu vàng nhạt, thơm. Củ càng già càng to và chắc trong ruột củ có màu vàng, mùi thơm ngọt, dễ chịu. Thân khí sinh khỏe, mọc thẳng đứng [10]. Lá mọc xếp lớp, không cuống mọc thành hai dãy, thuôn dài đầu nhọn, dài khoảng 20cm, rộng 5cm, mặt trên nhẵn , mặt dưới có lông rải rác, bẹ lá to nhẵn, lưỡi bẹ tròn dễ gãy [10]. 4 Cụm hoa dạng trứng, đôi khi hình trụ, mọc từ thân rễ trên một cán mập, dài 20- 30cm, phủ bởi những lá bắc xếp lợp, mép màu lục nhạt, đôi khi pha hồng. Đài hoa nhỏ, tràng hoa có ống loe thành thùy màu trắng, một nhị, bao phấn dài hơn trung đới, cánh môi rộng màu vàng nhạt, chia ba thùy ngắn, nhị lép tạo thành thùy bên của cánh môi,bầu hình elip [10]. Quả nang hình bầu dục, chứa ít hạt màu đen, có áo mềm mầu trắng. Mùa hoa : tháng 7-9 2.1.3. Đặc điểm phân bố Gừng núi đá có nguồn gốc từ Ấn Độ, hiện nay có mặt ở các vùng nhiệt đới như Polynesia, Hawaii, Đông Nam Á bao gồm một số nước như Malaysia, Thái Lan, Lào, Việt Nam và Nam Trung Quốc. Ở nước ta cây xuất hiện tự nhiên khá nhiều ở vùng núi cao Trà Bồng( Quảng Ngãi), một số vùng rừng núi ở Tây Nguyên, Tây Bắc và vùng đồng bằng có địa hình núi ở miền Tây. Hiện nay Gừng núi đá được trồng ở nhiều nơi để làm thuốc [3][10]. 2.1.4. Sinh thái, trồng trọt 2.1.4.1. Sinh thái Gừng núi đá ưa khí hậu nóng ẩm, ưa ánh sáng, có thể bị che bóng một phần trong ngày, thường mọc ở ven rừng và dưới tán rừng kín thường xanh. ở vùng trung du và đồng bằng cây mọc lẫn trong các lùm bụi dưới chân đồi hoặc quanh làng bản. Cây sinh trưởng mạnh vào mùa hè, nhiệt độ thích hợp 21-27°C, lượng mưa hang năm 1500- 2500mm. Gừng gió có hệ thống rễ phát triển, mỗi năm từ một nhánh mẹ có thể mọc thêm 2-3 nhánh con. Do đó, trong tự nhiên cây thường tạo thành những bụi lớn, có khi chiếm 1-2m [10]. 2.1.4.2. Trồng trọt Cây thích hợp ở vùng có một mùa khô ngắn, có nhiệt độ không khí tương đối cao trong thời kỳ của Gừng thành thục. Vì vậy, khí hậu ở nhiều địa phương ở miền Nam nước ta thích hợp cho trồng Gừng núi đá. Cây cần đất 5 tương đối tốt, tầng đất dày, tơi xốp, ít đá lẫn, Khả năng dữ nước lớn nhưng thoát nước tốt, có độ ẩm đầy đủ trong suốt thời gian cây sinh trưởng, tốt nhất là đất thịt không ưa đất cát và đất sét. Đất có hàm lượng mùn cao rất thích hợp cho trồng Gừng núi đá [12]. Cắt các đoạn thân ngầm ( củ) dài 2,5-5 cm, trên mỗi đoạn thân ngầm có ít nhất một mắt mầm ( chồi ngủ) để làm giống trồng. Giống Gừng có thể lấy ngay sau khi thu hoạch để trồng hoặc bảo quản trong thời gian ngắn ở nơi khô, thoáng mát sau đó mới đem trồng. Cây được đem trồng vào tháng 2-3 âm lịch, sau 10- 20 ngày, mắt mầm bắt đầu nảy chồi non và lá non, sau một năm sẽ cho thu hoạch củ [12]. 2.1.5. Thành phần hóa học và tác dụng dược lý Gùng núi đá chứa nhiều tinh dầu, dầu béo và nhựa,. Thành phần chủ yếu của tinh dầu là các monoterpen chiếm 13% và nhiều sesquiterpen. Các monoterpen gồm α-pinen, camphen, limonene, cineol và camphor. Các sesquiterpen chủ yếu là các humulen chiếm 27%, sesquiterpen monoterpen monocyelic ceton và 37,5% zerumbon. Nhiều loại hợp chất thứ cấp cũng được phân lập từ Gừng núi đá như terpenoid, flavonoid [10]. Trong số đó, zerumbon là thành phần chính của thành phần Gừng núi đá và được xem là hoạt chất chính có tác dụng sinh học đáng chú ý. Zerumbom có tác dụng ức chế sự phát triển của tụ cầu vàng và trực cầu lao. Zerumbon là một serquiterpen dạng tinh thể được phân lập từ tinh dầu Gừng núi đá. Thành phần có hoạt tính sinh học này có cấu trúc rất đặc biệt và duy nhất, với một nối ceton lieen hợp ở vị trí C số 11, nhờ đó nó có tác dụng sinh học rất đặc biệt. Các nghiên cứu trong và ngoài nước cũng đã góp phần làm rõ hơn về zerumbon. Gừng núi đá đang trở nên dần quen thuộc ở các nước Đông Nam Á và được sử dụng trong các bài thuốc truyền thống, đem lại hiệu quả trong điều trị 6 một vài bệnh. Ở Malysia, rễ Gừng núi đá được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh như đau bụng, buồn nôn, đau họng, ho, trị vết thâm, sẹo, chữa đau mắt, chữa bệnh gan, chữa thấp khớp, chữa khối u ác tính,chữa hen suyễn [6][10]. 2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) 2.2.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Nhân giống vô tính là hình thức nhân giống qua các cơ quan dinh dưỡng ( thân, lá,củ, vỏ…) bao gồm các phương pháp giâm cành, chiết cành, mắt ghép và nuôi cấy mô in vitro. Trong đó nuôi cấy mô được gọi là phương pháp hữu hiệu nhất[2]. Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ dùng chung để chỉ quá trình nuôi cấy in vitro và các nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh thực vật, duy trì và bảo vệ các nguồn gen quý…[2]. 2.2.2. Tính toàn năng của tế bào Nguyên lý cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế bào thực vật. Haberlandt (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm rằng mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tằng để phất triển thành một cá thể hoàn chỉnh [1]. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của hệ gen và môi trường. Do đó, khi gặp điều kiện thuận lợi cơ quan, mô, tế bào đều có thể phất triển thành một cá thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ [1]. 7 2.2.3. Phản phân hóa và phân hóa tế bào 2.2.3.1. Sự phân hóa tế bào Sự sinh trưởng của tế bào gồm hai giai đoạn: Giai đoạn phân chia tế bào và giai đoạn dãn của tế bào. Trong hai giai đoạn này tế bào chưa có những đặc trưng riêng về cấu trúc và chức năng [14]. Sau đó, các tế bào bắt đầu phân hóa thành các mô chuyên hóa để đảm nhận các chức năng khác nhau; các tế bào trong giai đoạn này có các đặc trưng riêng về cấu trúc và chức năng [14]. Có thể nói rằng sự phân hóa tế bào là sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa [14]. 2.2.3.2. Sự phản phân hóa tế bào Sự phản phân hóa tế bào là quá trình ngược lại với sự phân hóa tế bào. Các tế bào đã phân hóa trong các mô chức năng không mất đi khả năng phân chia của mình, trong những điều kiện thích hợp, chúng có thể quay lại đóng vai trò như các mô phân sinh và có khả năng phân chia để tạo ra các tế bào mới [14]. 2.2.4. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, yếu tố quyết định cho sự phân hóa tế bào và cơ quan nuôi cấy. 2.2.4.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật - Điều kiện vô trùng Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao nuôi cấy bị nhiễm. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro. Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học, đèn tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn. 8 Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định. Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao. Thông thường hay sử dụng một số hóa chất như: HgCl2 0,1% , nước Clolox, cồn 70°, Ca(ClO)2… để khử trùng [1]. - Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ + Ánh sáng Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: Thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12- 18h/ ngày. Cường độ chiếu sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Theo Ammirato (1986) : Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo. Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho nuôi cấy là 1000 – 7000 lux, ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế, vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. Hiện nay trong các phòng nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000 – 2500 lux người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35 – 40cm [2]. + Nhiệt độ Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt đọ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc vào nguồn gốc của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loại cây là 25±2ºC..[2]. 9 2.2.4.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Môi trường nuôi cấy phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hóa tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây. Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy mô tế bào và thực vật. Mỗi loại vật liệu khác nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải lựa chon cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp. Từ năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS, B5, WPM. Tuy có nhiều loại nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau [2]: + Các muối khoáng đa lượng và vi lượng. + Nguồn cacbon. +Các vitamin và amino acid. + Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường. + Các chất điều hòa sinh trưởng. - Các muối khoáng đa lƣợng và vi lƣợng Đối với các cây trồng, các chất khoáng đa lượng và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng. Ví dụ Mg là một phần của phân tử diệp lục, Ca cấu tạo màng tế bào, nitơ là thành phần quan trọng của vitamin, amino acid và protein. Ngoài ra, các nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một số enzyme cần thiết cho hoạt động sống của tế bào. Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, làm vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ, enzyme. 10 Các ion của các muối hòa tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường trong tế bào, duy trì điện thế hoạt hóa của thực vật. Các yếu tố như: K, Ca rất quan trọng trong điều hòa tính thấm lọc của tế bào [15]. - Nguồn cacbon Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năng quang hợp, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của tế bào. Nguồn cacbon được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường saccarose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho saccarose nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thực vật. Ngoài ra, khi khử trùng môi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời gian để tránh xảy ra hiện tượng caramen hóa, làm cho môi trường chuyển sang màu vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào [15]. - Các vitamin và axit amin Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các loài khác nhau là khác nhau Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các lạo vitamin cơ bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu. để mô có thể sinh trưởng, tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và amoni acid. Trong các loại vitamin, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật. Acid nicotinic (B3) và pyridoxine (B6) cũng có thể bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sức sống cho mô [2]. - Các chất bổ sung +Agarose Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn hóa môi trường. Hàm lượng agar sử dụng thường là 0,6 – 1% đây là loại 11 tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì thiếu oxy nếu nuôi trong môi trường lỏng và tĩnh [7]. + pH môi trường Với mỗi loại cây trồng yêu cầu một loại môi trường khác nhau nhưng pH của môi trường thường là 5,6 – 6,0 [15] . Nếu pH của môi trường thấp hơn 5 hay cao hơn 6 đều có ảnh hưởng đến trạng thái của môi nuôi cấy và sự hòa tan các chất dinh dưỡng. - Các chất điều tiết sinh trƣởng Các chất điều tiết sinh trưởng gồm chất kích thích và ức chế. Trong nhân giống cây trồng, người ta thường sử dụng chất kích thích sinh trưởng để kích thích sự phát sinh của cơ quan. + Auxin Chất auxin tự nhiên được tìm thấy ở nhiều loại thực vật là indol axetic acid (IAA). IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự hình thành rễ. Ngoài ra IAA, còn có các dẫn xuất của nó là napthyl axetic acid (NAA) và 2,4- dichlorophenoxy axetic acid (2,4D). Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ. NAA có tác dụng tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzyme và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường . NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA, NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ. NAA tác động ở mức độ phân tử trong tế bào theo ba cơ chế đó là : cơ chế thứ nhất: NAA gắn với phân tử enzyme và kích thích enzyme hoạt động. Tác dụng của auxin là kích thích hoạt tính của ATPase; cơ chế thứ hai: auxin tác động vào gen và các enzyme phân giải acid nucleic; cơ chế thứ ba: auxin tác động thông qua sự thay đổi tính thẩm thấu của màng. 12 Dùng phương pháp đánh dấu phân tử có thể thấy NAA dính kết vào màng tế bào làm cho màng hoạt động như một bơm proton và bơm ra ngoài ion H+ làm màng tế bào mềm và kéo dài ra, do đó tế bào lớn lên và sinh trưởng. Trong tế bào, NAA có tác dụng lên sự tổng hợp acid nucleic [15]. Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển và vùng đỉnh chồi. Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần phía dưới của cây. + Gibberellin Gibberellin được tách chiết lần đầu tiên từ dịch tiết của nấm bởi các nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Gibberellin được tổng hợp trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển. Gibberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hóa phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây. Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kích thước của chồi nuôi cấy. GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất [11]. + Cytokinin Cytokinin là chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào do chúng hoạt hóa mạnh mẽ sự tổng hợp acid nucleic và protein. Các cytokinin thường gặp là kinetine, BAP. Kinetin được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất acid nucleic. Kinetin thực chất là một chất dẫn xuất của bazơ nitơ adenine. BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn nhiều kinetine. Kinetine và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự già hóa của tế bào. Ngoài ra các chất này còn có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp DNA, tổng hợp protein làm tăng hoạt tính của một số enzyme. Cơ chế tác dụng của auxin ở mức độ phân tử trong tế bào thể hiện ở múc độ tương hỗ của cytokinin với nucleoprotein làm yếu mối lien kết của histon với DNA, tạo điều kiện cho sự tổng hợp DNA [15].
- Xem thêm -