Tài liệu Nghiên cứu nhân giống cây dâu tây (fragaria vesca l.) bằng phương pháp nuôi cấy mô

  • Số trang: 54 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 539 |
  • Lượt tải: 0
dangvantuan

Tham gia: 02/08/2015

Mô tả:

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------------- NGUYỄN DUY GIANG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY DÂU TÂY (Fragaria vesca L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2010 - 2014 Thái Nguyên, 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------------- NGUYỄN DUY GIANG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY DÂU TÂY (Fragaria vesca L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Thực phẩm Khoa : CNSH & CNTP Lớp : 42 - CNSH Khóa học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn: 1. ThS. Nguyễn Thị Tình Khoa CNSH & CNTP - Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên 2. ThS. Đào Duy Hưng Viện Khoa học Sự sống - Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, 2014 LỜI CẢM ƠN Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhịêm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm em đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nhân giống cây Dâu Tây (Fragaria vesca L.) bằng phương pháp nuôi cấy mô”. Qua thời gian làm việc tại Phòng thí nghiệm Khu Công nghệ Tế bào, Viện Khoa học Sự sống, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đến nay em đã hoàn thành đề tài. Để đạt được kết quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm Khoa cùng các thầy cô giáo và các anh chị trong Bộ môn đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: ThS. Nguyễn Thị Tình, ThS. Đào Duy Hưng đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2014 Sinh viên thực hiện Nguyễn Duy Giang DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu Tây (theo dõi sau 45 ngày) .............................................................................................. 21 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu Tây ( theo dõi sau 45 ngày) ................................................................................................ 23 Bảng 4.3. Ảnh hưởng kết hợp của nồng độ BAP và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu Tây ( theo dõi sau 45 ngày) ........................................................................ 25 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của sự kết hợp nồng độ BAP và IAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu Tây ( theo dõi sau 45 ngày) ................................................................ 27 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của chồi cây Dâu Tây ( theo dõi sau 30 ngày) ................................................................................................ 29 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây Dâu Tây ...... 31 (theo dõi sau 30 ngày) .............................................................................................. 31 Bảng 4.7. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Dâu Tây ngoài vườn ươm (theo dõi sau 30 ngày) ............................................................................. 32 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1. Sơ đồ quá trình phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật ............... 6 Biểu đồ 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu Tây ............................................................................................................................ 21 Hình 4.1.1. Chồi cấy trong công thức 1 (ĐC) ......................................................... 22 Hình 4.1.2. Chồi cấy trong công thức 4 .................................................................. 22 Biểu đồ 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu Tây ............................................................................................................................ 23 Hình 4.2.1. Chồi cấy trong công thức 1 (ĐC) ......................................................... 24 Hình 4.2.2. Chồi cấy trong công thức 2 .................................................................. 24 Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng củasự kết hợp nồng độ BAP và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu Tây ...................................................................................................... 25 Hình 4.3.1. Chồi cấy trong công thức 1 (ĐC) ......................................................... 26 Hình 4.3.2. Chồi cấy trong công thức 3 .................................................................. 26 Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của sự kết hợp nồng độ BAP và IAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu Tây ........................................................................................... 27 Hình 4.4.1. Chồi cấy trong công thức 1 (ĐC) ......................................................... 28 Hình 4.4.2. Chồi cấy trong công thức 5 .................................................................. 28 Biểu đồ 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của chồi cây Dâu Tây29 Hình 4.5.1. Chồi cấy trong công thức 1 (ĐC) ......................................................... 30 Hình 4.5.2. Chồi cấy trong công thức 2 .................................................................. 30 Biểu đồ 4.6. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của cây Dâu Tây .. 31 Hình 4.6.1. Chồi cấy trong CT 1 (ĐC) .................................................................... 31 Hình 4.6.2. Chồi cấy trong CT 2 ............................................................................. 31 Biểu đồ 4.7. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Dâu Tây ngoài vườn ươm.................................................................................................................. 33 Hình 4.7.1. Cây trồng trên giá thể đất màu .............................................................. 33 Hình 4.7.2. Cây trồng trên giá thể 1 Đất màu +1 Trấu hun ...................................... 33 DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ADN : Acid deoxyribonucleic B1 : Thiamin B3 : Nicotinic acid B5 : Gamborg’s B6 : Pyridoxine BA : 6-Benzylaminopurine CV : Coefficient of Variation ĐC : Đối chứng IAA : Indol axetic acid Kinetin LSD : 6-Furfurylaminopurine : Least Significant Difference Test MS : Murashige and Skoog’s NAA : α - Naphlene axetic acid TN : Thí nghiệm WPM : Woody Plant Medium (A/C) : Auxin/Cytokinin MS : (Murashinge &Skoog , 1962) IBA : Indole - 3 - butiric acid BAP : 6 - benzylaminopurine ETDA : Ethylen Diamin Tetraacetic Acid MỤC LỤC Trang PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1 1.2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 1 1.3. Yêu cầu của đề tài ...................................................................................... 2 1.4. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 2.1. Giới thiệu và phân loại ............................................................................... 3 2.1.1 . Nguồn gốc .............................................................................................. 3 2.1.2. Phân loại .................................................................................................. 3 2.1.3. Đặc điểm thực vật học của cây ............................................................... 3 2.1.4. Tác dụng của cây ..................................................................................... 4 2.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ................ 5 2.2.1. Tính toàn năng của tế bào ....................................................................... 5 2.2.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào .............................................. 5 2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào .......................................... 6 2.3.1. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................. 6 2.3.2. Yếu tố vô trùng ..................................................................................... 10 2.4. Các công đoạn của nuôi cấy mô tế bào .................................................... 12 2.5. Tình hình nghiên cứu cây Dâu Tây trên Thế Giới và ở Việt Nam .......... 14 2.5.1. Tình hình nghiên cứu trên Thế Giới...................................................... 14 2.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .......................................................... 14 PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU15 3.1. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu ............................................................... 15 3.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 15 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 15 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 15 3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 15 3.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 15 3.4.1. Phương pháp nghiên cứu nội dung 1 ................................................... 15 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2 ................................................... 17 3.4.3. Phương pháp nghiên cứu nội dung 3 ................................................... 18 3.5. Xử lý số liệu ............................................................................................. 19 PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 21 4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng đơn lẻ hoặc kết hợp của một số chất kích thích sinh trưởng (BAP, Kinetin, IAA, IBA) đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu Tây21 4.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi ......... 21 4.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu Tây ......................................................................................................................... 23 4.1.3. Ảnh hưởng kết hợp của nồng độ BAP và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu Tây............................................................................................. 25 4.1.4. Ảnh hưởng của sự kết hợp nồng độ BAP và IAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Dâu Tây .................................................................................. 27 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA đến khả năng ra rễ của chồi cây Dâu Tây ................................................................................................................... 29 4.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của chồi cây Dâu Tây29 4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi cây Dâu Tây31 4.3. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Dâu Tây ngoài vườn ươm ........................................................................................................ 32 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................... 35 5.1. Kết luận .................................................................................................... 35 5.2. Đề nghị ..................................................................................................... 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 36 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cây Dâu tây (Fragaria vesca L.) thuộc họ hoa hồng (Rosaceae) [4], được trồng đầu tiên ở châu Âu cuối thế kỷ XV, là kết quả của sự lai ghép giống F. chiloensis duch và F. virgiana duch [17]. Là loài cây thân thảo, quả giả do nhiều quả đóng tập hợp trên đế hoa lồi nạc, mọng nước [9]. Quả có vị ngọt, chua se, tính mát, cung cấp nhiều loại vitamin cần thiết cho cơ thể con người như vitamin A, B1, B2 và đặc biệt là lượng vitamin C khá cao, hơn cả cam, dưa hấu. Ngoài ra còn có tác dụng lợi tiểu, chữa sỏi tiết niệu, dùng làm rượu bổ [6]. Cây Dâu tây được trồng trên đất ở nhiều nước trên khắp thế giới, đồng thời cây Dâu tây cũng được sản xuất trong nhà kính bằng công nghệ nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là một trong những phương pháp nhân giống vô tính với những ưu điểm nổi trội là: Cho hệ số nhân giống rất cao, sản xuất quanh năm không phụ thuộc vào mùa vụ, cần ít diện tích sản xuất và vật liệu nhân giống ban đầu, cây giống sản xuất hoàn toàn sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền, việc vận chuyển cây giống đi xa thuận tiện, tổn thất ít, chất lượng cây được đảm bảo do đó đáp ứng được các yêu cầu về sản xuất cây giống với số lượng mang tính công nghiệp. Ở nước ta, Dâu tây còn mới mẻ so với những cây trồng khác và là một loại cây trồng có giá trị kinh tế đang được chú ý phát triển hiện nay. Đây cũng là một loại cây trồng tiềm năng và được trồng chủ yếu ở Đà Lạt (Lâm Đồng) và một số tỉnh phía Bắc. Cây có thể nhân giống bằng nhiều cách như gieo hạt, tách chồi, tách thân bò, giâm hom. Các phương pháp này cho hệ số nhân giống thấp, cây không đồng đều và hiệu quả thấp. Trong những năm gần đây, nhằm tạo ra các giống cây trồng chất lượng tốt, không phụ thuộc vào mùa vụ, nhiều địa phương trong cả nước đã ứng dụng phương pháp giâm hom vào công tác nhân giống. Tuy nhiên phương pháp này cho kết quả không cao ở nhiều đối tuợng cây trồng và không đáp ứng số lượng lớn cây giống [11]. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nhân giống cây Dâu tây (Fragaria vesca L.) bằng phương pháp nuôi cấy mô ”. 1.2. Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu khả năng nhân giống cây Dâu tây (Fragaria vesca L.) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. 2 1.3. Yêu cầu của đề tài - Nghiên cứu được ảnh hưởng riêng rẽ và kết hợp của một số chất điều tiết sinh trưởng (Kinetin, BAP, IAA, IBA) đến khả năng nhân nhanh chồi . - Nghiên cứu được ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA đến khả năng ra rễ của cây . - Nghiên cứu ảnh hưởng một số loại giá thể đến sinh trưởng phát triển của cây ngoài vườn ươm. 1.4. Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu + Giúp sinh viên củng cố lại kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học + Thông qua đề tài, tìm hiểu được vai trò của một số chất điều tiết sinh trưởng đối với quá trình tái sinh, nhân nhanh và tạo rễ cho chồi của cây . + Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lí và phân tích số liệu, biết cách trình bày một báo cáo khoa học. - Ý nghĩa thực tiễn + Cung cấp cho công tác nuôi cấy mô các môi trường nuôi cấy tối ưu cho quá trình nhân chồi, tạo cây hoàn chỉnh trong phòng thí nghiệm và phát triển của cây ngoài vườn ươm. + Tạo tiền đề cho việc sản xuất số lượng lớn cây giống có chất lượng cao, đồng đều cho sản xuất. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu và phân loại 2.1.1 . Nguồn gốc Cây Dâu Tây có tên khoa học là Fragaria vesca L., là kết quả của sự lai ghép giống F. chiloensis duch và F. virgiana duch. Xuất sứ từ châu Mỹ và được các nhà làm vườn châu Âu lai tạo thế kỷ 18 và tạo ra giống dâu ngày nay. Cuối thế kỷ XVI, ba loài của Châu Âu được ghi nhận là Fragaria vesca, Fragaria moschata và Fragaria viridis [17]. Người Anh gọi là "Strawberry", người Pháp gọi là "Fraisier", khi du nhập qua Việt Nam vì có nguồn gốc từ Pháp nên được gọi là Dâu Tây. 2.1.2. Phân loại Theo hệ thống thực vật học mới nhất, cây được phân loại như sau: Giới: Plantea (thực vật) Ngành: Angiospermae (hạt kín) Lớp: Rosids (hoa hồng) Bộ: Rosales (hoa hồng) Họ: Rosaceae (hoa hồng) Chi: Fragaria Loài: Fragaria L. (có hơn 20 loài trên thế giới) 2.1.3. Đặc điểm thực vật học của cây 2.1.3.1. Rễ Rễ cây thuộc loại rễ chùm, chỉ khi cây thực sinh còn nhỏ mới có rễ chính rõ ràng. Đầu chóp rễ có sức phân nhánh mạnh. Rễ cây phát triển tốt nhất trong điều kiện khi nhiệt độ đất là 25oC. Rễ có vai trò cố định cây và giúp cây hấp thu nước và dinh dưỡng. Rễ có chu kỳ sống từ vài ngày đến vài tuần [3]. 2.1.3.2. Thân Cây thuộc loài cây thân thảo, có 2 kiểu thân là thân chính và thân bò [9]. Thân bò bắt đầu từ cổ rễ vươn dài trên mặt đất và tận cùng là một chồi. Chồi này phát triển thành một vòng lá mới, mọc rễ mới, từ đó sinh ra một thân bò lan khác và cứ tiếp tục như thế. Gióng của thân bò đó có thể chết đi hoặc bị cắt đứt nhưng chồi mới được hình thành vẫn sống độc lập. Thường thì từ thân chính sẽ phát sinh thêm 1 đến 2 thân con nữa và các nhánh này góp phần vào năng suất của cây sau này. 4 2.1.3.3. Lá Lá phát sinh xung quanh thân, cây có nhiều lá bao quanh thân, lá có cuống dài, lá kép lông chim có 3 lá chét. Lá có dạng ô van. Số lá cũng như diện tích lá giảm xuống vào đầu đông, có lẽ điều này có mối quan hệ với việc ra hoa vào mùa xuân. Mỗi lá tồn tại 1 đến 3 tháng tùy vào thời tiết. 2.1.3.4. Hoa Lá đài của hoa nhỏ và có mùa xanh, lá được bố trí bên dưới những cánh hoa màu trắng, những cánh hoa xếp khít với nhau khi hoa ở trạng thái nụ. Hoa có 5 cánh, có 25 đến 30 nhị màu vàng, 50 đến 500 nhụy, đế hoa hình nón. Hoa là hoa lưỡng tính vì vậy là cây tự thụ. 2.1.3.5. Quả Thực chất quả vẫn thường gọi là quả giả, chứa các mô ngoài noãn, nó được phình ra từ đế hoa. Quả thật là những quả bế gọi là hạt. Số lượng quả bế nhiều, nhỏ, hình elip bao phủ bề mặt quả [9]. Quả thường phát triển sau khi hoa nở và chín sau đó khoảng 20 đến 30 ngày, số lượng quả bé cũng ít hơn. Thường thì ra quả theo chùm, xếp hình xim gồm quả đầu tiên, thứ cấp và sau thứ cấp vì vậy kích thước cũng như thời gian chín cũng khác nhau. Quả đầu có kích thước lớn nhất, quả thứ cấp có kích thước nhỏ hơn, số lượng quả bế cũng ít hơn, nhưng là quả thu hoạch chính làm nên năng suất. Mùa vụ thu hoạch quả bắt đầu từ tháng 11, 12 đến tháng 3, 4 năm sau. 2.1.4. Tác dụng của cây Quả có vị ngọt, chua se, tính mát, cung cấp nhiều loại vitamin cần thiết cho cơ thể con người như vitamin A, B1, B2, đặc biệt lượng vitamin C khá cao, hơn cả cam, dưa hấu. Quả có tác dụng lợi tiểu, chữa sỏi tiết niệu, dùng làm rươu bổ [6]. dùng chữa các chứng như ho do phổi nóng, cổ họng sưng đau, chán ăn, tiểu ngắn, tiểu gắt, thiếu máu suy nhược, ung nhọt, say rượu [4]. Dâu tươi mới hái hàm lượng vitamin C và đường fructose đều rất cao, trong đó hàm lượng chất khoáng như K, Na, Fe... cũng rất phong phú, cho nên ăn nhiều giúp thúc đẩy chuyển hóa các chất trong cơ thể, làm máu huyết lưu thông, đồng thời có tác dụng trấn tĩnh an thần và phòng chống lão hóa [18]. Ngoài ra còn có tác dụng với tim mạch [16]. 5 2.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.1. Tính toàn năng của tế bào Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20 nhà sinh lý thực vật người Đức Haberlandt (1902) đã phát biểu tính toàn năng của tế bào như sau: Mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh [1], [14], [19], [20]. Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Cho đến nay con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [5]. Trong nuôi cấy in vitro, tế bào thực vật thể hiện tính toàn năng thông qua sự phản phân hoá và phân hoá của tế bào. 2.2.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hoá). Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hoá đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau [7]. Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau của cơ thể. TB phôi sinh Tế bào dãn TB phân hoá có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình.Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá trình đó gọi là phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào. Sự giãn tế bào: Tế bào giãn ra cả về chiều ngang và chiều dọc làm tăng kích thước của từng cơ quan nói riêng và toàn bộ cơ thể nói chung. Sau hai giai đoạn này cùng với quá trình biệt hoá tế bào phân hoá thành các mô chức năng chuyên hoá chuyên biệt, đảm nhận các vai trò khác nhau trong cùng một cơ thể sống. 6 Phân hoá Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyển hoá Phản phân hoá Hình 2.1. Sơ đồ quá trình phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hoà. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hoá các gen của tế bào [5], [14]. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào . 2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào 2.3.1. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Một trong nghững yếu tố quan trọng nhất đối với sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường. Thành phần này thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm mà thành phần môi trường cũng thay đổi. Thành phần các môi trường nuôi cấy bao gồm 5 phần chính: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường (nguồn carbon) và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. 2.3.1.1. Khoáng đa lượng Bao gồm các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30mg/l. Những nguyên tố đó là: N, S, P, K, Mg và Ca. Riêng Na và Cl cũng được sử dụng trong một vài môi trường, nhưng chưa rõ vai trò của chúng. 7 + Nitơ (N): Được sử dụng ở hai dạng NO3- và NH4+ riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau. Tùy thuộc vào từng loại cây, từng bộ phận nuôi cấy, mục đích nuôi cấy mà ta sử dụng dạng nào cho phù hợp với sự phát triển của cây. Các dạng muối cung cấp nitơ là: Ca(NO3)2, KNO3, NaNO3, NH4NO3 [26]. + Lưu huỳnh (S): Chủ yếu và tốt nhất là muối SO4-2. Các dạng ion khác như SO32- hoặc SO22- thường kém tác dụng, thậm chí còn độc. + Phospho (P): Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu về phospho rất cao. Phospho là một trong những thành phần cấu trúc của phân tử acid nucleic, photpholipit và các co-enzyme. Phospho được hấp thụ ở 2 dạng: H2PO4- và HPO4-2 quá trình hấp thụ mất năng lượng, trong môi trường nuôi cấy photpho được cung cấp dưới dạng KHPO4 hoặc KH2PO4 [26]. 2.3.1.2. Khoáng vi lượng Là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 ppm. Đó là Fe, B, Mn, I, Mo, Cu, Zn, Ni, Co. + Sắt (Fe): Thiếu sắt, tế bào mất khả năng phân chia. Fe thường tạo phức hợp với các thành phần khác và khi pH môi trường thay đổi, phức hợp này thường mất khả năng giải phóng Fe cho các nhu cầu trao đổi chất trong tế bào. Từ các phức chất này Fe được giải phóng ra trong một phạm vi pH khá rộng. Cung cấp Fe ở các dạng: FeSO4.7H2O, Fe(SO4)3, FeCL2...Nên sử dụng Fe ở dạng phức chelat với citrat hoặc với ETDA cây hấp thụ dễ dàng nhất [26]. + Mangan (Mn): Thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các amino acid tự do và ADN tăng lên, nhưng lượng ARN và sinh tổng hợp protein giảm dẫn đến kém phân bào. Mn được cung cấp cho môi trường ở dạng: MnSO4.4H2O [26]. + Bo (B): Thiếu B trong môi trường gây lên biểu hiện như thừa auxin vì thực chất B làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm. Mô nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hóa mạnh, nhưng thường là mô sẹo xốp, mọng nước, kém tái sinh [1]. 2.3.1.3. Carbon và nguồn năng lượng Đường là thành phần dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu trong bất kỳ môi trường dinh dưỡng nào. Nó được sử dụng làm nguồn cacbon cung cấp năng lượng trong nuôi cấy, đồng thời đóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu của môi trường [13]. Loại đường được sử dụng phổ biến là saccarose với hàm lượng từ 2-6%. Những loại đường khác như: fructose, glucose, maltose, . . . chỉ dùng trong những 8 trường hợp cá biệt. Trong nuôi cấy chồi cây Dâu tằm, môi trường có fructose cho kết quả tốt hơn những loại đường khác [14]. 2.3.1.4. Vitamin Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng. Chúng cần vitamin để xúc tác nhiều quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng. Trong các loại vitamin, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật. Axit nicotinic (B3) và pyridoxin (B6) cũng có thể được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sức sống cho mô [2]. 2.3.1.5. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Trong nuôi cấy mô thực vật có 5 nhóm chất điều hòa quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid và ethylen. Miller là người đầu tiên nhận thấy tỉ lệ auxin và cytokinin bổ sung vào môi trường để kích thích sự phát sinh hình thái và tỷ lệ phytohormone sử dụng để kích thích sự tạo chồi hay sự tạo rễ không giống nhau. Auxin: Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic axit (IAA). IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào, điều khiển sự hình thành rễ. Ngoài IAA, còn có những dẫn xuất khác là naphtyl axetic axit (NAA) và 2,4 – diclophenoxyl axetic axit (2,4-D). Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia mô và trong quá trình tạo rễ [10], [13], [21], [22]. NAA, IBA, 2,4-D là những auxin tổng hợp, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA. Chúng có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ. Tuy nhiên, ở nồng độ cao auxin cản trở sự phát triển của các phát thể chồi vừa được thành lập hay các chồi nách (các chồi ở trạng thái tiềm sinh), auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khỏi rễ (phát thể non của rễ) nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng của các sơ khởi này. Trong sự tạo rễ auxin cần phối hợp với các vitamin (như thiamine mà rễ không tạo được), amino acid (như arginin), và nhất là các hợp chất othordiphenollic (như cafeic acid, chlorogenic acid). IAA kích thích sự ra rễ và kìm hãm sự phát triển callus. Ngược lại, 2,4-D kích thích sự hình thành callus và kìm hãm sự hình thành rễ trong môi trường nuôi cấy. Mặc dù cùng nhóm chất auxin nhưng hai chất IAA và 2,4-D lại có tính chất đối kháng. NAA được Went và Thimann tìm ra 1937. Chất này có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzyme và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường nuôi cấy [10], [13], [21], [22]. 9 Cytokinin: là chất điều tiết sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào. Các cytokinin thường gặp là BAP, Kinetin, BA, Zeotine, TDZ. Kinetin được Shoog phát hiện ngẫu nhiên trong khi chiết xuất axit nucleic. Kinetin là dẫn xuất của base nitơ adenin. BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn kinetin. Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự hóa già của tế bào. Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và tăng cường hoạt động của một số enzyme [10], [21], [22]. Benjamin và cs., (1987) đã cho rằng nồng độ BA cao (1-5ppm) kích thích sự phát triển của chồi đỉnh và đầu rễ của cây Atropa belladona. Lat và cs., (1988) cho rằng khi sử dụng kinetin để nhân nhanh cây Picrohiza kurroa phải dùng nồng độ từ 15mg/l. Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các chất điều tiết sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với các chất điều tiết sinh trưởng nội sinh. Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô. Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzyme. Cơ chế tác dụng của auxin ở mức độ phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histon với ADN, tạo điều kiện cho sự tổng hợp ADN [14], [15]. Trong các nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật, tỷ lệ (A/C) là một yếu tố rất quan trọng: A/C cao kích thích sự tạo rễ, A/C thấp kích thích sự tạo chồi, vậy cytokinin hỗ trợ auxin trong tăng trưởng nhưng đồng thời nhưng đồng thời cũng có sự đối kháng giữa auxin (giúp tạo rễ) và cytokinin giúp tạo chồi. Sự cân bằng giữa 2 phytohormone này là một trong những yếu tố kiểm soát phát triển. Ngoài 5 thành phần cơ bản trên người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, ETDA...) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men... vào môi trường nuôi cấy. 2.3.1.6. Các chất bổ sung Bổ sung nhiều chất hữu cơ khác nhau vào môi trường nuôi cấy mang lại kết quả thuận lợi cho sự tăng trưởng mô. Chất bổ sung là: protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nước cam, cà chua. Nước dừa: Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hoá và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây. Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993) [18]. Nước dừa thường sử dụng 10 với nồng độ 5-20% thể tích môi trường, kích thích phân hoá và nhân nhanh chồi [12]. Dịch chiết nấm men: Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào. Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật với nồng độ thích hợp. Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thủy phân casein hydrolyase (0,1 - 1%) hoặc bột chuối với hàm lượng 40g nhằm tăng cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy. Agarose: Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agarose để làm rắn hoá môi trường. Nồng độ agarose sử dụng thường là 0,6-1%, đây là loại agarose được đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì thiếu O2 nếu nuôi trong môi trường lỏng và tĩnh [1]. 2.3.2. Yếu tố vô trùng 2.3.2.1. Ý nghĩa của việc nuôi cấy vô trùng tế bào nuôi cấy mô tế bào thực vật - Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật chứa đường, các chất khoáng, vitamin… là điều kiện thuận lợi để các vi sinh vật phát triển mạnh mẽ. - Do tế bào nấm và vi khuẩn nhiều hơn so với tế bào thực vật nên chỉ cần nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn, thì chúng nhanh chóng phủ đầy bề mặt môi trường, bề mặt mô tế bào thực vật. Các vi sinh vật lấn át tế bào nuôi cấy mô tế bào thực vật sẽ làm mô tế bào thực vật phát triển chậm lại và chết dần. Nếu không đảm bảo điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trường bị nhiễm mẫu sẽ bị chết. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro [12]. 2.3.2.2. Nguồn tạp nhiễm - Có 3 nguồn tạp nhiễm chính: + Dụng cụ, nút đậy, môi trường nuôi cấy không được vô trùng tuyệt đối. + Trên bề mặt mô có chứa các sợi nấm, bào tử nấm và bào tử vi khuẩn. + Trong quá trình thao tác làm nhiễm các bào tử nấm hoặc vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy. 2.3.2.3. Kỹ thuật vô trùng - Vô trùng thuỷ tinh, nút đậy, môi trường Dụng cụ thuỷ tinh: thông thường dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các phòng thí nghiệm bằng dung dịch sulfocromate một lần trước khi đưa vào sử dụng, về sau chỉ cần rửa sạch để ráo trước khi sử dụng . 11 Trong trường hợp các dụng cụ thủy tinh dùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi phải vô trùng, có thể khử trùng bằng cách đưa vào tủ sấy sấy trong nhiều giờ dụng cụ phải được gói trong giấy nhôm hoặc cất trong hộp kim loại để tránh bị nhiễm trở lại sau khi khử trùng. Nút đậy: thường là nút đậy không thấm nước. Nút đậy phải chặt để bụi đi qua được đồng thời nước ở môi trường cũng không bốc hơi dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Bông thấm nước là một loại chất đơn giản nhất nhưng có những nhược điểm sau: - Nếu khi nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì sẽ bị nấm nhất là đối với những thí nghiệm lâu dài. - Thao tác nút bông chậm không thể sản xuất trên quy mô lớn. - Chỉ dùng vài lần rồi bỏ. Môi trường: Môi trường nuôi vấy thường được hấp khử trùng, khử trùng bằng áp suất hơi bão hòa. Thời gian thường 15 -30 phút ở áp suất 1atm nhiệt độ 121oC. Việc khử trùng này không hợp với các chất nhạy cảm với nhiều như: acid amin, các vitamin, hormone tăng trưởng, các chất kháng sinh. Các chất này thường được khử bằng cách lọc qua màng lọc polyethylen hoặc sợi cellulose, các lỗ màng này có thể giữ lại các vi sinh vật. - Khử trùng nơi thao tác và dụng cụ cấy Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ thuỷ tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông trong khi thao tác cấy. Người ta áp dụng nhiều biện pháp khác nhau để chống lại nguồn nhiễm tạp này. Phòng cấy thường là buồng có diện tích hẹp, rộng từ 10-15m2, có hai lớp cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào. Sàn và tường lát gạch men để có thể lau chùi thường xuyên. Vô trùng phòng cấy: Trước khi đưa vào sử dụng hoặc cứ sau 2-3 tháng, phòng cấy phải được xử lý hơi formol bằng cách rót formol 40% ra một số đĩa petri để rải rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do, đóng kín cửa phòng cấy trong 24h, sau đó bỏ formalin đi và khử hơi formalin thừa bằng dung dịch amoniac 25% cũng để rải rác trong phòng 24h. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao, trong phòng cấy ngoài đèn tử ngoại trong box cần có 4 đèn tử ngoại 40W trên trần. Chỉ cho các đèn tử ngoại làm việc khi không có người làm việc trong box cấy. Nên bật đèn tử ngoại 30 phút và tắt trước 30 phút trước khi làm việc hoặc bật sau khi đã ngưng làm việc. Cần hạn chế chuyển 12 động không khí trong phòng cấy đến mức tối thiểu. Các dụng cụ làm việc phải chuẩn bị đầy đủ, bố trí hợp lý, thuận tiện để làm việc và hạn chế đi lại khi cấy, ra vào buồng cấy, đóng cửa cẩn thận. Phòng nuôi cũng phải được khử trùng trước bằng xà bông bột, sau đó lau bằng dung dịch calcium hypochlorite loãng hoặc cồn 70%. Trần, sàn đều phải được lau như vậy mỗi tuần, không được khuấy động những nơi bị nhiễm để tránh phát tán bào tử. Khử trùng các dụng cụ kim loại và môi trường khoáng: Các dụng cụ kim loại được khử trùng bằng không khí nóng (130oC – 170oC). Các dụng cụ này phải được gói kín trước khi khử trùng, nên gói trong giấy nhôm là tốt nhất. Không nên hấp khử trùng dụng cụ kim loại vì điều kiện nóng ẩm sẽ làm kim loại bị rỉ sét và bị ăn mòn. Autoclave là phương pháp khử trùng bằng hơi nước dưới một áp suất nhất định nút gòn, khăn vải, các vật dụng phòng thí nghiệm bằng thủy tinh, các bình nuôi cấy bằng plastic, nút cao su, các bộ lọc, nước, môi trường khoáng đều có thể khử trùng bằng nồi hấp. Các vi sinh vật đều bị tiêu diệt bởi hơi nước trong nồi hấp thời gian từ 10 - 30 phút ở nhiệt độ 121oC, 1atm. Môi trường sau khi pha chế có thể chuyển vào bình cấy với lượng cần thiết trước khi hấp tiệt trùng, cũng có thể hấp trước với khối lượng lớn và rót chuyển vào bình cấy trong box cấy. Thời gian hấp tiệt trùng phụ thuộc dung tích môi trường trong dụng cụ đựng khi hấp ở nhiệt độ 121oC, 1atm. Thời gian tối thiểu này gồm cả thời gian cần thiết để nhiệt độ nồi hấp đạt đến o 121 C và 15 phút tiệt trùng. Đối với môi trường khoáng, áp suất không nên cao quá 1atm vì áp suất cao sẽ làm phân hủy carbohydrate và các phức hợp nhạy cảm với nhiệt độ. Sau khi tiệt trùng, môi trường được chuyển ngay sang phòng cấy để làm nguội và sử dụng theo yêu cầu. Nếu là môi trường thạch hấp với khối lượng lớn trước khi chia vào bình cấy, thì chuyển ngay vào box cấy đã được vô trùng để tránh nhiễm. Trên bàn thường xuyên có một đèn cồn để sử dụng khi cấy và cốc đựng cồn 90% để nhúng các dụng cụ làm việc. Các dụng cụ khác để cấy như bình môi trường, ống nghiệm, bình đựng mẫu cấy chuyền… Đều được xử lý khử trùng bề mặt bằng cách lau bằng cồn 70% trước khi đưa vào trong box cấy. 2.4. Các công đoạn của nuôi cấy mô tế bào Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm 5 giai đoạn sau: - Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị
- Xem thêm -