Tài liệu Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (curcuma longa l.) và các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh​

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT --------------- HVCH: NGHIÊM VĂN ĐỨC TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN: NGHIÊN CỨU NẤM NỘI SINH TRONG CÂY NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA L.) VÀ CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN TỪ NẤM NỘI SINH LUẬN VĂN: THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT --------------- HVCH: NGHIÊM VĂN ĐỨC NGHIÊN CỨU NẤM NỘI SINH TRONG CÂY NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA L.) VÀ CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN TỪ NẤM NỘI SINH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm – Hóa sinh Mã ngành: 60420114 LUẬN VĂN: THẠC SĨ SINH HỌC HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. DƢƠNG NGỌC TÚ Hà Nội - 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới TS.Dƣơng Ngọc Tú, Trƣởng phòng Sinh dƣợc - Viện Hóa học, Phó giám đốc kiêm điều phối viên Trung tâm Xuất sắc liên ngành về lĩnh vực các hợp chất thiên nhiên Việt Nam – Vƣơng quốc Anh. Thầy đã luôn hƣớng dẫn, định hƣớng và giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trƣờng Đại học Thái Nguyên cũng nhƣ các thầy cô thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giảng dạy và truyền thụ cho tôi kiến thức chuyên môn để thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các nhà khoa học, các bạn đồng nghiệp tại phòng Sinh dƣợc, phòng Nghiên cứu các Hợp chất tự nhiên, Viện Hóa học và đã đồng hành và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Đặc biệt là PGS.TS.Nguyễn Thị Hoàng Anh ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo tôi từng bƣớc từ khi mới bắt đầu nghiên cứu về lĩnh vực các hợp chất thiên nhiên, cũng nhƣ giúp đỡ, và cho tôi những lời khuyên quý báu để tôi hoàn thành luận văn này. Xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bố mẹ những ngƣời sinh thành, nuôi dƣỡng tôi là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi suốt thời gian qua. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới anh chị, bạn bè tôi đã cổ vũ động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Một lần nữa tôi vô cùng cảm ơn. Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 Học viên Nghiêm Văn Đức i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i MỤC LỤC ......................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT……………………………iii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU ...................................................... iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ........................................................ v MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 4 1.1. Nấm nội sinh. ........................................................................................ 4 1.1.1. Khái niệm và quan hệ giữa nấm nội sinh và thực vật. .................... 4 1.1.2. Phân lập nấm nội sinh:.................................................................... 5 1.2. Tình hình nghiên cứu về nấm nội sinh: .............................................. 6 1.2.1. Tình hình nghiên cứu về nấm nội sinh trên thế giới: ...................... 6 1.2.2. Tình hình nghiên cứu về nấm nội sinh trong nước: ...................... 12 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 16 2.1. Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ, hóa chất và thiết bị máy móc. ........ 16 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu. ....................................................................... 16 2.1.2. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị máy móc. ........................................ 16 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu. .................................................................. 16 2.2.1. Phương pháp thu hái mẫu thực vật. .............................................. 16 2.2.2. Phương pháp phân lập nấm nội sinh trong thực vật. .................... 16 2.2.3. Phương pháp bảo quản nấm.......................................................... 17 2.2.4. Phương pháp phân loại dựa vào quan sát hình thái. .................... 18 2.2.5. Phương pháp sinh khối nấm nội sinh. ........................................... 19 2.2.6. Phương pháp chiết tách các hợp chất tự nhiên. ............................ 20 2.2.7. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất. ......... 21 2.2.8. Phương pháp thử hoạt tính kháng nấm của các hợp chất sinh học. .................................................................................................................. 23 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 24 3.1. Kết quả phân lập và sinh khối nấm nội sinh. .................................. 24 3.1.1. Kết quả thu hái và xử lý mẫu thí nghiệm. ...................................... 24 3.1.2. Kết quả phân lập nấm nội sinh. ..................................................... 25 3.1.3. Kết quả định danh một số chủng nấm nội sinh. ............................ 33 3.1.4. Kết quả sinh khối nấm nội sinh: .................................................... 35 3.2. Kết quả ngâm chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu nấm nội sinh. ..................................................................................................................... 36 3.2.1. Kết quả ngâm chiết mẫu nấm B1 và C, sinh khối.......................... 36 3.2.2. Kết quả thử hoạt tính kháng nấm B.cinera của các dịch chiết ..... 38 3.2.3. Kết quả phân lập chất từ nấm Fusarium sp. (B1). ........................ 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 52 ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt AChE Enzyme thủy phân Acetylcholinesterase acetylcholinesterase ARNr ARN ribosome ARN ribosome TLC Thin layer chromatography Sắc ký bản mỏng CC Column chromatography Sắc ký cột HPLC High-performance liquid sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography GC/MS Gas Chromatography Mass Sắc ký khí ghép khối phổ Spectometry MS Mass spectrometry Khối phổ NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại iii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU Sơ đồ 3.1: Qui trình ngâm chiết mẫu nấm đã sinh khối .......................... 37 Sơ đồ 3.2: Qui trình phân lập các hợp chất từ nấm Fusarium sp. (B1)... 40 Bảng 3.1: Hoạt tính ức chế nấm Botrytis cinera của các dịch chiết nấm 38 Bảng 3.2: Thông tin các hợp chất 1-12 ................................................... 41 Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR và HSQC của chất 14 (DMSO, 500 và 125 MHz) ...................................................................... 47 iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 3.1: Hình ảnh mẫu nghệ vàng (Curcuma longa) ............................ 24 Hình 3.2: Thu hái mẫu nghệ vàng ........................................................... 24 Hình 3.3: Khử trùng các mẫu nghệ trong phân lập nấm nội sinh............ 25 Hình 3.4: Mẫu đối trứng (kiểm tra công thức khử trùng)........................ 25 Hình 3.5: Mẫu thí nghiệm (mẫu lá, củ nuôi cấy phân lập nấm nội sinh) 26 Hình 3.6: Chủng nấm A ........................................................................... 27 Hình 3.7: Chủng nấm B1 ......................................................................... 27 Hình 3.8: Chủng nấm B2 ......................................................................... 28 Hình 3.9: Chủng nấm C ........................................................................... 28 Hình 3.10: Chủng nấm D ......................................................................... 28 Hình 3.11: Chủng nấm E ......................................................................... 29 Hình 3.12: Chủng nấm F ......................................................................... 29 Hình 3.13: Chủng nấm G ......................................................................... 29 Hình 3.14: Chủng nấm H ......................................................................... 30 Hình 3.15: Chủng nấm I .......................................................................... 30 Hình 3.16: Chủng nấm J .......................................................................... 30 Hình 3.17: Chủng nấm K ......................................................................... 31 Hình 3.18: Chủng nấm L ......................................................................... 31 Hình 3.19: Chủng nấm M ........................................................................ 31 Hình 3.20: Chủng nấm Ng1 ..................................................................... 32 Hình 3.21: Chủng nấm Ng2 ..................................................................... 32 Hình 3.22: Chủng nấm Ng3 ..................................................................... 32 Hình 3.23: Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng C, bar 20 µm ...... 33 Hình 3.24: Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng B1, bar 10 µm .... 34 Hình 3.25: Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng NG01, bar 20 µm 35 Hình 3.26: Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng NG03, bar 20 µm .................................................................................................................. 35 Hình 3.27: Kết quả sinh khối chủng nấm Fusarium sp. (B1) ................. 36 Hình 3.28: Ngâm chiết mẫu sinh khối chủng nấm .................................. 37 Hình 3.29: Hình ảnh thử hoạt tính ức chế sự phát triển chủng nấm Botrytis cinera của các cặn chiết. ............................................................ 39 Hình 3.30: Phổ sắc ký đồ của mẫu NB1M4 ........................................... 44 Hình 3.31: Phổ 1H chất 14 .................................................................... 48 Hình 3.32: Phổ C13CPD chất 14 ............................................................ 49 Hình 3.33: Phổ HSQC chất 14............................................................... 50 v MỞ ĐẦU Nấm nội sinh là những vi sinh vật sống trong tế bào cây mà không gây ra bất kì tác động tiêu cực nào. Trong nhiều trƣờng hợp, nấm nội sinh có chức năng bảo vệ cây chống lại các loài gây bệnh bên ngoài. Có hai cơ chế liên quan đến khả năng bảo vệ cây này, hoặc các loài nấm nội sinh trực tiếp sản xuất ra các sản phẩm trao đổi chất để tấn công các loài ngoại lai xâm nhập, hoặc chúng sẽ kích thích cơ chế phòng vệ của cây chủ. Nấm nội sinh còn có thể kích thích tăng trƣởng cây bằng cách sản xuất ra hormone thực vật, tổng hợp siderophore, cố định nito, hòa tan các chất khoáng, ức chế ethylene, hoặc trợ giúp quá trình phytoremediation. Nấm nội sinh có thể đƣợc truyền đi từ thế hệ này sang thế hệ khác thông qua mô cây, hạt, hoặc các phƣơng thức truyền giống thực vật khác. Trong số hơn 300 ngàn loài cây thực vật bậc cao, mỗi cây là vật chủ của một hoặc nhiều loài nấm nội sinh. Tƣơng tác giữa nấm nội sinh và cây chủ tƣơng ứng liên quan đến quá trình đồng sản xuất các phân tử có hoạt tính sinh học, tuy nhiên ngƣời ta vẫn chƣa hiểu hết đƣợc bản chất sự tƣơng tác này. Điều quan trọng là bản chất mối quan hệ cộng sinh xác định rằng các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm nội sinh đều không hại đến tế bào cây và không gây độc, do đó việc ứng dụng chúng trong y tế, chữa trị bệnh cho con ngƣời có tiềm năng rất cao. Hợp chất tự nhiên là các chất hóa học có nguồn gốc từ thiên nhiên có hoạt tính sinh học hoặc có tác dụng dƣợc học dùng để làm thuốc. Các hợp chất thiên nhiên đóng vai trò quan trọng trong việc đáp ứng nhu cầu trên thế giới đối với các chất có hoạt tính sinh dƣợc. Những loài nấm nội sinh sống cộng sinh bên trong tế bào thực vật, chúng hiện nay đang đƣợc nghiên cứu sâu và rộng trên thế giới và đƣợc coi nhƣ là nguồn tài nguyên vô tận chƣa khám phá hết với ngành công nghệ sinh học - dƣợc phẩm. Những nghiên cứu về nấm nội sinh có nguồn gốc từ biển đã tìm thấy hơn 270 các hợp chất mới từ những năm 1990 tới giữa năm 2002 (2/3 trong số đó là từ tảo biển và cây 1 ngập mặn). Chỉ trong khoảng 5 năm từ 2002 tới 2006, đã tìm ra hơn 330 các hợp chất mới (là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của nấm nội sinh). Các hợp chất trao đổi chất bậc hai do vi sinh vật sống sản sinh ra là con đƣờng quan trọng để giải quyết nhu cầu thuốc mới trong y tế ngày càng tăng vì giá thành sản xuất rẻ, sự phong phú về cấu trúc, và tính mới. Các loài nấm sống nội sinh trong tế bào cây có thể sản sinh các hợp chất tƣơng tự, hoặc cùng một loại hợp chất sản xuất bởi cây chủ. Cũng có trƣờng hợp nấm có thể sản sinh ra các chất mà ngƣời ta không chiết ra đƣợc từ cây. Thông qua quá trình lên men vi sinh ở quy mô lớn, các loài nấm nội sinh có thể sản xuất một số lƣợng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học với giá thành rẻ để cung cấp cho ngành công nghiệp sản xuất dƣợc phẩm. Điều quan trọng nữa là khi sử dụng vi sinh vật nội sinh sẽ tránh đƣợc việc khai thác cạn kiệt nguồn tài nguyên thực vật, làm mất sự đa dạng sinh học và đe dọa tuyệt chủng các loài cây, gây hậu quả xấu tới môi trƣờng tự nhiên. Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), thân rễ nghệ vàng chứa tinh dầu, ngoài ra còn có chất curcumin... Theo y học cổ truyền, nghệ vàng đƣợc phân làm hai vị thuốc. Thân rễ to đƣợc gọi là khƣơng hoàng, các củ nhỏ mọc ra từ thân rễ đƣợc gọi là uất kim. Uất kim thƣờng có màu đỏ hơn. Nghệ không chỉ làm gia vị để tạo màu cho món ăn mà đặc biệt nghệ còn dùng để làm thuốc, có nhiều loại nghệ nhƣng công dụng nhất là loại nghệ vàng. Nghệ vàng có vị đắng cay, có mùi thơm hắc, tính ấm, có tác dụng hành khí phá ứ, thông kinh chỉ thống. Nghệ vàng dùng để chữa các bệnh: kinh nguyệt không đều, viêm loét dạ dày, ung nhọt, phong thấp, tay chân đau nhức, đặc biệt Nghệ vàng còn dùng để điều trị ung thƣ, HIV, tiểu đƣờng, Alzheimer, viêm gan B, C, kháng nấm, chống oxy hóa, sử dụng trong Mỹ phẩm và Thực phẩm [1]. Hoạt chất Curcumin trong c Nghệ (Curcuma longa L.): Curcumin là thành phần chính của Curcuminoit – một chất trong củ Nghệ, có tên khoa 2 học là (1E,6E)-1,7-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5dione. Curcumin có dạng bột màu vàng đƣợc mệnh danh nhƣ một loại thần dƣợc có khả năng phòng chống và chữa đƣợc rất nhiều loại bệnh: tác dụng chuyển hóa lipid, hoạt tính chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thƣ - cảm ứng apoptosis, chống tăng sinh mạch máu ở khối u, giúp tăng cƣờng miễn dịch, chống đông máu, hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus. Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu về cây nghệ, nhƣng đối tƣợng nấm nội ký sinh trong cây nghệ thì vẫn chƣa đƣợc quan tâm nghiên cứu. Vì vậy phân lập nấm nội ký sinh từ cây nghệ là một hƣớng mới trong nghiên cứu khoa học nói chung và trong lĩnh vực các hợp chất thiên nhiên nói riêng. Để tìm hiểu về những vấn đề trên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu nấm nội sinh trong cây nghệ vàng (Curcuma longa L.) và các hợp chất thiên nhiên từ nấm nội sinh”. Mục tiêu chính của đề tài là tìm ra các chủng nấm nội sinh trong cây nghệ và nghiên cứu thành phần hóa học của chúng. Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên từ nấm nội sinh. 3 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nấm nội sinh. 1.1.1. Khái niệm và quan hệ giữa nấm nội sinh và thực vật. Nấm nội sinh (Endophytes fungal, Endophytic fungi) là những vi sinh vật sống ở mô sâu thực vật nhƣng không gián tiếp hoặc trực tiếp gây bất lợi cho cây [32]. Endophytes cũng có thể thúc đẩy tăng trƣởng thực vật thông qua các cơ chế khác nhau nhƣ sản xuất phytohormones [10], tổng hợp siderophores [21], cố định đạm [23], hay qua hỗ trợ phytoremediation [24]. Endophytes có thể đƣợc truyền từ một thế hệ kế tiếp thông qua các mô của vật chủ, hạt giống hoặc mầm thực vật [9]. Nghiên cứu đã cho thấy rằng các sản phẩm tự nhiên thu đƣợc từ vi khuẩn endophytic có chống vi khuẩn, chống ung thƣ, chống oxy hóa, chống tiểu đƣờng, ức chế miễn dịch, chống huyết khối, chống viêm và chống bệnh Alzheimer và một số bệnh khác [26]. Giữa nấm nội sinh và thực vật có mối quan hệ cộng sinh hoặc tƣơng sinh, nấm nội sinh xuất phát từ một số bệnh lý thực vật trong quá trình tiến hóa của cây. Sự tƣơng tác giữa cây chủ và vi sinh vật gây bệnh trong suốt quá trình phát triển lâu dài dẫn đến việc xuất hiện những đột biến gen từ những vi sinh vật gây bệnh để cho ra những chủng nấm nội sinh hữu ích. Chúng đƣợc xem nhƣ là một tác nhân giúp cân bằng hệ vi sinh trên cây chủ nhằm ngăn chặn những tác nhân vi sinh gây bệnh [7,32]. Nấm nội sinh thúc đẩy khả năng thích nghi sinh thái của thực vật chủ. Ở một số loài cây cỏ có nấm nội sinh sống, ngƣời ta nhận thấy chúng có khả năng gia tăng sức chịu đựng khô hạn hoặc chịu đƣợc độc tính của nhôm trong nguồn nƣớc, trong môi trƣờng sống… Ngoài việc bảo vệ cây chống lại một số yếu tố bất lợi cho kí chủ nhƣ động vật ăn cỏ hoặc côn trùng, nhiều sản phẩm tự nhiên đƣợc sinh ra từ nấm nội sinh cũng đã đƣợc quan sát, theo dõi và đƣợc kết luận về khả năng ngăn chặn, kìm hãm hay diệt nhiều mầm bệnh khác nhau xâm nhập mô thực vật. Trƣớc thực tế này, một câu hỏi đƣợc đặt ra 4 rằng: các hoạt chất quí giá này do chính cây sản xuất hay là kết quả của mối quan hệ tƣơng sinh của các nấm nội sinh có ích trong mô thực vật và cây chủ sinh ra [7]. 1.1.2. Phân lập nấm nội sinh: Trên thế giới có khoảng 300 nghìn loài thực vật. Đó là một số lƣợng quá lớn mà ta không thể thử nghiệm hết cũng nhƣ không thể chọn lựa một cách ngẫu hứng khi đƣa vào nghiên cứu. Do đó, việc chọn thực vật để phân lập nấm nội sinh cũng cần phải dựa trên những đối tƣợng cây có đặc điểm sinh học. Một số nguyên tắc cơ bản sau đây thƣờng đƣợc áp dụng: Với thực vật sống trong môi trƣờng sinh học bất thƣờng, môi trƣờng bất thƣờng và các điều kiện tự nhiên khắc nghiệt bắt buộc cây muốn tồn tại thì cần có yếu tố đặc biệt nào đó giúp cây có khả năng chống chịu cao. Và ngƣời ta mong đợi nhân tố đó chính là các nấm nội sinh có ích. Ví dụ: Rhyncholacis penicillata là một loài cây sống dƣới nƣớc ở Tây Nam Venezuela, nơi mà môi trƣờng nƣớc rất khắc nghiệt, cây luôn bị va đập bởi tác dụng nƣớc cuốn, mảnh vụn, đá sỏi…làm cho cây bị tổn thƣơng. Từ đó các nấm gây bệnh thực vật có thể xâm nhập, nhƣng cây vẫn khỏe mạnh, vì cây đƣợc sự bảo vệ bởi các nấm nội sinh có trong cây. Dựa vào đặc điểm sinh học này, chủng Serratia marcescens đƣợc phân lập từ cây R. penicillata có khả năng sản xuất ra oocydin A, một hợp chất kháng nấm mới [30]. Một số loài thực vật dƣợc liệu dân gian đã đƣợc sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, từ đời này sang đời khác để chữa lành vết thƣơng, kháng nấm, kháng khuẩn…ví dụ nhƣ, Kennedia nigriscans, một loài cây leo ở Úc đã đƣợc dân gian sử dụng sáp nhựa để trị vết thƣơng, sát trùng. Từ cây này đã phân lập đƣợc chủng Streptomyces sp. NRRL 30562 sản xuất kháng sinh phổ rộng munumbicin, kháng đƣợc nấm gây bệnh thực vật, vi khuẩn và Plasmodium [11]. 5 Các thực vật có tính đặc thù về sinh thái: tuổi thọ cao bất thƣờng, phát triển trong các vùng có biến đổi sinh học lớn, hay sống trong khu vực đất đai cổ xƣa…cũng là những đối tƣợng nghiên cứu rất lý tƣởng để cung cấp các nấm nội sinh mới lạ. Nấm nội sinh có mặt ở khắp nơi trong thế giới thực vật, số lƣợng của chúng tìm thấy thay đổi tùy thuộc vào bộ phận cây, chủng loại cây và môi trƣờng sống của nó. Đã có nhiều kĩ thuật phân lập nấm nội sinh đƣợc đề nghị bởi nhiều tác giả khác nhau. Nhƣng tất cả các quy trình phân lập đều dựa trên cơ sở chung nhất đó là: giải quyết tốt giai đoạn xử lý bề mặt, diệt các sinh vật ngoại nhiễm bằng chất sát trùng hoặc các phƣơng pháp sát trùng. Sau đó tạo điều kiện không nhiễm để chỉ thu nhận các nấm nội sinh phát triển từ nội mô thực vật. Tiếp theo chọn nuôi cấy trên môi trƣờng thích hợp và thử hoạt tính sinh học [30,32]. 1.2. Tình hình nghiên cứu về nấm nội sinh: 1.2.1. Tình hình nghiên cứu về nấm nội sinh trên thế giới: Năm 1955, trên thế giới chỉ tìm ra đƣợc 500 chất kháng sinh thì 20 năm sau, năm 1975 đã tìm ra đƣợc 5.000 chất kháng sinh. Trên thế giới đã biết đƣợc hơn 13.000 chất kháng sinh đƣợc sản xuất từ thiên nhiên (Berdy, 1984). Theo đó, từ những năm 1990, Taxomyces andreanae lần đầu tiên đƣợc phân lập từ cây Taxus brevifolia, nấm này sản xuất paclitaxel - chất ức chế các thoi phân bào trong quá trình phân chia tế bào, có phổ khối tƣơng tự nhƣ paclitaxel chiết xuất từ cây thông đỏ (Taxus wallichiana). Một số nhà khoa học đã nghiên cứu khu hệ nấm nội sinh của các cây thuộc chi Thông đỏ và tìm thấy các hoạt chất taxol (một hoạt chất đƣợc sử dụng hiệu quả nhất trong điều trị bệnh ung thƣ buồng trứng, ung thƣ vú) do nấm nội sinh tổng hợp. Chi thông đỏ (Taxus) luôn là 1 nguồn giàu nấm nội sinh [28,29]. Năm 1995 – 1996, các nhà nghiên cứu đã phân lập đƣợc hàng trăm loài nấm nội sinh từ các cây thông đỏ ở Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ. Có thể nói 6 các cây thông đỏ là một kho báu chứa nhiều vi sinh vật chƣa từng đƣợc phát hiện và rất đáng chú ý, chúng tƣơng tác với nhau và với cây chủ. Những nấm đã đƣợc biết là có tổng hợp taxol gồm: Taxomyces andreanae, Pestolotiopsis microspora. Ngoài ra, thông qua những bằng chứng miễn dịch học, ngƣời ta cũng đã phát hiện đƣợc sự tổng hợp taxol ở nhiều nấm nội sinh khác phân lập từ cây thông đỏ Taxus brevifolia, bao gồm nhiều chủng của Penicillium sp., Pestalotiopsis sp. và Truncatella sp. [28,29]. Năm 2000, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về vai trò của vi khuẩn nội sinh Streptomyces sp. chủng NRRL 30562 đƣợc phân lập từ cây Kennedia nigriscans, sản xuất kháng sinh phổ rộng munumbicin, kháng vi khuẩn Gram (+) nhƣ Bacillus anthracis, M. tuberculosis đa kháng và một số vi khuẩn kháng thuốc khác. Streptomyces sp. chủng NRRL 30562 phát triển trong lá cây Grevilea pteridifolia phát triển ở Úc, sản xuất kháng sinh kakadumicin và echinomycin đều cho tác động kháng P. falciparum với LD50=7-10ng/ml [11]. Năm 2001, Tan và Zou chứng minh rằng nấm nội sinh cũng đƣợc công nhận là nguồn phong phú của chất chuyển hóa cho hoạt tính sinh học. Một vật chủ có thể phân lập đƣợc rất nhiều các chủng nấm nội sinh khác nhau [33]. Năm 2003, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về chủng nấm nội sinh Cryptospriopsis quercina đƣợc phân lập từ cây Tripterigeum wilfordii, nấm này có thể sản xuất cryptocandin và cryptocin. Trong đó, cryptocandin kháng một số nấm gây bệnh cho ngƣời nhƣ Candida albicans, Trichophyton sp. và chống một số nấm gây bệnh thực vật nhƣ Sclerotinia sclerotiorum và Botrytis cinerea. Cryptocin có tác dụng kháng Pryriaria oryzae và một số nấm gây bệnh thực vật [30]. Cùng năm 2003, Taechowisan và cộng sự đã nghiên cứu về endophyte có hoạt tính kháng nấm từ rễ cây Zingiber officinale và Alpinia galanga [32]. 7 Năm 2005, Raviraja đã phân lập đƣợc mƣời tám loài nấm nội sinh đƣợc phân lập từ vỏ cây, thân và lá phân đoạn của năm loài cây thuốc ở Tây Ghats của Ấn Độ: Curvularia clavata, C. lunata, C. Pallescens, Fusarium oxysporum... Nấm nội sinh đã đƣợc tìm thấy nhiều nhất trong các đoạn lá, chứ không phải là phân khúc thân cây và vỏ cây. Phần lớn các loài nấm nội sinh đã đƣợc tìm thấy trong cây Callicarpa tomentosa thuộc chi Tử châu, họ Hoa môi (11 loài), trong khi cây Lobelia nicotinifolia thuộc phân họ Lỗ bình, họ Hoa chuông (5 loài) [22]. Năm 2007, Li và cộng sự đã tìm ra nấm Acremonium (2F09P03B) từ Huperzia serrate có khả năng sản xuất huperzine A có tác dụng là chất ức chế enzyme acetylcholinesterase, và đƣợc dùng trong điều trị bệnh Alzheimer [20]. Năm 2009, Kusari và cộng sự đã phân lập đƣợc Fusarium solani từ Camptotheca acuminate có khả năng sản xuất camptothecin và 2 dẫn xuất (9methoxycamptothecin và 10-hydroxycamptothecin) có khả năng chống ung thƣ [19]. Năm 2012, Agnes Joseph Aswathy và cộng sự đã nghiên cứu về endophyte trong cây Nghệ (Curcuma longa). Các chất dinh dƣỡng trong thân rễ của cây nghệ là môi trƣờng sống đa dạng cho các nhóm vi khuẩn khác nhau. Một số vi khuẩn nội sinh liên quan có thể thúc đẩy tăng trƣởng. Trong nghiên cứu này, hai chủng endophyte Paenibacillus sp. đƣợc phân lập từ thân rễ củ nghệ và cả hai chủng đã đƣợc tìm thấy có khả năng để sản xuất Indole 3 acetic acid qua phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - highperformance liquid chromatography) [8]. Năm 2012, Cui và cộng sự đã phát hiện nấm nội sinh Fusarium oxysporum phân lập từ cây Ginkgo biloba có khả năng sản xuất ginkgolid B dùng để điều trị bệnh tim mạch [12]. 8 Năm 2014, Lena Hammerschmidt và cộng sự của Viện Sinh dƣợc và Công nghệ Sinh học, Đại học Heinrich-Heine, Duesseldorf, Cộng hòa Liên bang Đức phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ các dịch chiết của nấm nội ký sinh Acremonium strictum Gams, phân lập từ cây Đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) thu hái tại Việt Nam. Trong đó có 5 dẫn xuất polyketide mới 60-hydroxypestalotiopsone C (1), acropyrone (2), bicytosporone D (3), waol acid (4), và pestalotiopene C (5) và 7 hợp chất đã biết (6-12). Các hợp chất 6, 7 và 9 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức độ trung bình đối với hai dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời là ung thƣ biểu mô buồng trứng nhạy cảm với cisplatin (A2780) và dòng kháng cisplatin (A2780 CisR), trong khi chỉ có chất 9 biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus với giá trị MIC 14,3 µM [13]. Các hợp chất có hoạt tính sinh dược từ sản phẩm thứ cấp khi lên men nấm nội sinh 1 - Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thƣ: Nhiều nghiên cứu đã chứng minh nấm nội sinh phân lập từ cây ngập mặn ở một số vùng địa lý khác nhau có thể tổng hợp đƣợc các chất gây độc và tiêu diệt tế bào ung thƣ. Cyclic depsipeptides bionectriamides A-C đƣợc tách chiết từ chủng Bionectria ochroleuca đƣợc phân lập từ cây Bần chua (Sonneratia caseolaris) ở Hải Nam, Trung Quốc [11]. 2 - Tiêu diệt vi sinh vật: Các hợp chất mới có tính diệt khuẩn do nấm nội sinh sản xuất có thể sử dụng thay thế thuốc kháng sinh, giúp khắc phục hiện tƣợng nhờn thuốc của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh. Các nhà khoa học đã tìm thấy nhiều hợp chất có nguồn gốc từ nấm nội sinh có khả năng tiêu diệt một dải rộng các loài vi khuẩn gây bệnh. Fusarium incarnatum đƣợc phân lập từ cây Cúc tần (Pluchea indica) ở đảo Hải Nam, Trung Quốc có khả năng sinh ra equisetin [7]. 9 3 - Chất chống oxi hóa: Chất chống oxi hóa thƣờng đƣợc tìm thấy ở các cây dƣợc liệu, rau và hoa quả. Chất chống oxi hóa thƣờng đƣợc xem nhƣ các tác nhân giúp phòng tránh và chữa trị bệnh nhƣ ung thƣ, bệnh tim, tăng huyết áp, tiểu đƣờng, run chân tay và mất trí nhớ, lão hóa… Thành phần phenol từ nấm nội sinh có tác dụng chống oxi hóa cao. Loài nấm Phomopsis amygdale phân lập từ cây ngập mặn ở Karankadu (Ấn Độ), và Trichoderma đƣợc tìm thấy trong lá cây ngập mặn Aegiceras corniculatum có thể sinh ra các chất có hoạt tính chống oxy hóa cao. Nấm nội sinh Alternaria sp. R6 phân lập từ rễ cây ngập mặn loài Myoporum bontioides A có khả năng tiết ra các chất chuyển hóa resverratrodehydes A&C chống các gốc tự do ABTS&DPPH [7,34]. 4 - Ức chế α-glucosidase: Các chất ức chế α-glucosidase có thể làm giảm sự hấp thụ carbohydrate từ bữa ăn và ngăn chặn tăng đƣờng huyết sau khi ăn. Các chất này có thể đƣợc sử dụng để điều trị tiểu đƣờng, béo phì. Hai chất mới đƣợc tìm thấy từ nấm nội sinh Penicillium chermesinum phân lập từ loài cây ngập mặn Kandelia candel ở vùng Quảng Đông, Trung Quốc (6’-Odesmethylterphenyllin, 3-hydroxy-6’-O-desmethylterphenyllin) có hoạt tính ức chế α-glycosidase rất mạnh, và có hiệu quả cao hơn cả chất đối chứng dƣơng genistein. Hợp chất 07H239 từ nấm Xylaria sp. BL321 có hoạt tính ức chế α-glucosidase khi thử ở nồng độ cao. Ngoài ra, các chất chuyển hóa của vermistatin, 6-demethylpenisimplicissin và 2-epihydroxyldihydrovermistatin từ nấm nội sinh Penicillium sp. HN29-3B1 (phân lập từ cây Cerbera manghas) cũng biểu hiện hoạt tính kháng cao [27]. 5 - Ức chế acetylcholinesterase: Chất ức chế acetylcholinesterase (AChE) hiện sử dụng trong điều trị bệnh mất trí nhớ Alzheimer. Tuy nhiên, hiện vẫn chƣa tìm đƣợc loại chất AChE có tác dụng mạnh, lâu dài mà ít tác dụng phụ nhất. Sporothrin A từ nấm nội sinh Sporothrix sp. có biểu hiện ức chế AChE rất mạnh. Hai terphenyls từ nấm nội sinh Penicillium chermesinum 10 (ZH4-E2) cũng có hoạt tính ức chế AchE. Ngoài ra, họ đang nghiên cứu các hợp chất do nấm nội sinh của cây ngập mặn sản sinh ra, chủng Penicillium sp. sk5GW1L và Penicillium sp. sk14JW2P, có tác dụng ức chế AChE nhƣ arigsugacin I, arigsugacin F và territrem B [14]. 6 - Hoạt tính chống viêm: Hợp chất chống viêm không chứa steroid rất cần thiết trong điều trị các bệnh viêm. Nấm nội sinh Irpex hydnoides, Aspergillus flavus, Schizophyllum commune, Neurospora crassa, Hypocrea lixii, Pestalotiopsis microspora, Aspergillus oryzae và Meyerozyma guilliermondi phân lập từ cây ngặp mặn có thể sản sinh ra các chất chống viêm có hoạt tính tƣơng đƣơng thuốc Indomethacin [15]. 7 - Tiêu diệt vi khuẩn lao mycobacteria, vi khuẩn Lao phổi đang trở nên rất nguy hiểm khi xuất hiện các dạng vi khuẩn kháng thuốc, do đó việc tìm ra các chất mới thay thế trở thành vấn đề cấp bách. Nấm nội sinh Fusarium sp. DZ-27 phân lập từ thân cây Kandelia candel (Hải Nam, TQ) có thể sinh ra axit fusaric. Các thử nghiệm chống vi khuẩn lao cho thấy rằng hỗn hợp axit fusaric với muối cadmium và muối đồng của nó thể hiện hoạt tính tiêu diệt rất cao hai chủng vi khuẩn lao Mycobacterium bovis BCG và M.tuberculosis H37Rv [7]. Nấm nội sinh Nigrospora sp. phân lập từ cây Bruguiera sexangula có thể sản sinh anthraquinones có tác dụng phòng bệnh cao chống lại rhino virus [17]. Nhiều nấm nội sinh trong cây đã đƣợc phân lập, chúng có khả năng sản sinh những chất biến dƣỡng có hoạt tính sinh học nhƣ kháng khuẩn, kháng nấm, kiềm hãm khối u, chống oxy hóa và các hoạt tính sinh học khác. Fusarium sp. là nấm phân lập từ cây Selaginella pallescens, đƣợc thu nhập từ vùng Bảo vệ thực vật của Guanacaste của Costa Rica, sản xuất đƣợc một pentaketide mới là CR 377 cho tác dụng mạnh trên C. albicans [25]. Pestralotiopisis microspora thƣờng gặp ở rừng mƣa nhiệt đới, sản xuất nhiều chất có tác dụng sinh học, một trong những chất này là axit ambuic có 11 tác dụng kháng nấm. Ngoài ra, nhiều chủng nấm trong chi Pestalotiopsis đã đƣợc phân lập từ các nguồn thực vật khác, các chủng nấm này có thể sản xuất các kháng sinh kháng nấm. Muscodor albus là nấm đƣợc phân lập từ cành của cây Quế (Cinnamomum zeylanicum), nấm này sản xuất một số chất bay hơi có thể ức chế vi khuẩn và nấm. Thành phần chính của những hợp chất này đã đƣợc xác định cấu trúc hóa học bằng sắc ký khí ghép với khối phổ (GC-MS), từ đó đƣợc tổng hợp hóa học. Các chất tổng hợp đƣợc có hiệu quả kháng khuẩn, kháng nấm, không độc với ngƣời [31]. Nodulisporium sp. đƣợc phân lập từ cây Bontia daphnoides sản xuất hợp chất nodulisporic có hiệu lực trừ sâu, chống lại ấu trùng của ruồi xanh, nhặng [16]. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu về nấm nội sinh trong nước: Từ năm 1994, các nhà nghiên cứu trong nƣớc đã phân lập đƣợc 6 chủng nấm nội sinh từ vỏ cây thông đỏ, đã định đƣợc tên của 6 chủng nấm này. Đây là loài thực vật đặc hữu có ở Việt Nam, từ lâu đã đƣợc nhân dân ta sử dụng nhƣ một vị thuốc. Chúng thƣờng đƣợc phân bố ở Pà Cò, Mai Châu, Hòa Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh, Phú Yên, Khánh Hòa, và chủ yếu là ở Lâm Đồng. Trong đó đáng chú ý là chủng nấm Pestalotiopsis maculans (corda) NagRai. có mặt ở tất cả các mẫu vỏ của cây thông đỏ đƣợc lấy mẫu. Chúng phù hợp nhất với hình thái chủng nấm Pestalotiopsis sp. đƣợc tìm thấy trong vỏ cây thông đỏ ở Mỹ và đƣợc các nhà khoa học tiến hành lên men, nuôi cấy, chiết rút, chạy sắc kí bản mỏng cùng với chất taxol chuẩn [35]. Trong 2 năm 2003-2004, phòng sinh học thực nghiệm cũng đã phân lập đƣợc trên 115 chủng nấm kí sinh trên các cây thuốc khác nhau trong đề tài đƣợc giao: “Phân lập một số chủng nấm ký sinh thực vật và tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học” [35]. 12 Năm 2005, Lê Mai Hƣơng cùng các cộng sự thuộc phòng sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên đã tiến hành nhiệm vụ “Nghiên cứu khu hệ nấm nội ký sinh trong các cây Thông”. Nghiên cứu này tập trung chủ yếu vào 3 loài Thông là Thủy tùng (Glyptostrobus pensilis), Thông đỏ Bắc (Taxus chinensis) và Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana). Mục tiêu của việc nghiên cứu là cung cấp cơ sở khoa học cho chính quyền địa phƣơng và ngành Lâm nghiệp về giá trị bảo tồn và sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên quý hiếm, cũng nhƣ cho ngành Y học ứng dụng kết quả nghiên cứu để giảm thiểu và điều trị bệnh ung thƣ. Địa điểm triển khai khảo sát thực địa, thu thập mẫu của nhiệm vụ này ở tại một số tỉnh phía Bắc nhƣ Hà Giang, Cao Bằng, Lào Cai, Hòa Bình, Sơn La và một số tỉnh miền Trung nhƣ Lâm Đồng, Đắc Lắc. Sau chuyến thực địa, các nhà nghiên cứu đã thu thập đƣợc 118 mẫu tại các tỉnh khảo sát. Các mẫu này đƣợc kiểm định rồi đem nuôi cấy, lên men và tách chiết sơ bộ các chủng nấm phân lập để sàng lọc hoạt tính sinh học, tách chiết hóa học theo định hƣớng hoạt tính một số chủng nấm tiêu biểu [35]. Lê Mai Hƣơng và cộng sự đã phân lập, sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của 45 mẫu cây lấy ở vùng Yên Tử, Hà Nội và vƣờn thuốc Mê Linh thu đƣợc 89 chủng nấm nội sinh trong đó có 32 chủng có hoạt tính kháng sinh (chiếm 36%); 20 chủng có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn (chiếm 22,5% tổng số), 26 chủng có hoạt tính kháng khuẩn (chiếm 29,2 % tổng số), 27 chủng có hoạt tính kháng nấm (chiếm 30,33% tổng số chủng phân lập). Từ 32 chủng có hoạt tính, bằng phƣơng pháp lên men tách chiết sơ bộ đã chọn đƣợc 9 chủng có hoạt tính mạnh, hoạt phổ rộng, đặc biệt chủng có kí hiệu N2 có hoạt tính cao nhất, kháng Bacillus subtilis (ATCC25922) và Fusarium oxyporum [3]. Năm 2009, Trần Thị Nhƣ Hằng và cộng sự nghiên cứu về nấm nội sinh trên cây khổ sâm (Croton tonkinensis Gapnep.) và bùm bụp (Mallotus paella Lour.) thu đƣợc chủng nấm Trichoderma konilangbra KS14 sản sinh chất 13