Tài liệu Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn streptococcus suis gây bệnh ở lợn tại tỉnh thái nguyên và chế tạo autocvaccine phòng bệnh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM –––––––––––––––––––––––– NGUYỄN MẠNH CƯỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS GÂY BỆNH Ở LỢN TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN VÀ CHẾ TẠO AUTOVACCINE PHÒNG BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y THÁI NGUYÊN - 2019 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM –––––––––––––––––––––––– NGUYỄN MẠNH CƯỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS GÂY BỆNH Ở LỢN TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN VÀ CHẾ TẠO AUTOVACCINE PHÒNG BỆNH Ngành: Ký sinh trùng và Vi sinh vật học thú y Mã số : 9.64.01.04 LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Tô Long Thành 2. TS. Nguyễn Văn Quang THÁI NGUYÊN - 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi; các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác và chưa từng sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận án này đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, tháng 7 năm 2019 Tác giả luận án Nguyễn Mạnh Cường ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình triển khai thực hiện đề tài và hoàn thành luận án, tôi luôn nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của các thày, cô, các bạn đồng nghiệp, cơ quan công tác và gia đình. Tôi xin trân trọng cảm ơn Khoa Chăn nuôi - Thú y, Phòng Đào tạo, Trường đại học Nông Lâm, Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên; Trung tâm chẩn đoán Thú y trung ương - Cục Thú y, Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y, Chi cục Chăn nuôi - Thú y tỉnh Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài luận án. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thày hướng dẫn khoa học là: PGS.TS. Tô Long Thành - Giám đốc Trung tâm chẩn đoán Thú y trung ương, Cục Thú y và TS. Nguyễn Văn Quang - Nguyên Trưởng Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và tập thể cán bộ Bộ môn Vi trùng Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương - Cục Thú y, Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y và Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Công nghệ Phân tử - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện, giúp đỡ và hướng dẫn thực hiện các thí nghiệm của đề tài luận án. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thày, cô, các bạn đồng nghiệp, học viên cao học, các em sinh viên và đặc biệt là gia đình đã luôn giúp đỡ, động viên, hỗ trợ tôi trong thời gian qua để hoàn thành luận án này. Thái Nguyên, tháng 7 năm 2019 Tác giả iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................................ ii MỤC LỤC ................................................................................................................................iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU................................................................vii DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................................... ix DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................................ xi MỞ ĐẦU ................................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài.................................................................................................................. 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài................................................................................ 2 3.1. Ý nghĩa khoa học................................................................................................................. 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................................. 3 4. Những đóng góp mới của đề tài: ............................................................................................ 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 4 1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh liên cầu khuẩn và chế tạo vaccine phòng bệnh trên lợn gây ra do S. suis ở trong và ngoài nước................................................................................................. 4 1.1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước .................................................................................... 4 1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ..................................................................................... 5 1.2. Vi khuẩn S. suis ................................................................................................................... 7 1.2.1. Phân loại vì khuẩn S. suis ................................................................................................. 7 1.2.2. Hình thái và tính chất nuôi cấy của vi khuẩn S. suis ........................................................ 8 1.2.3. Đặc tính sinh hoá của vi khuẩn S. suis ............................................................................. 9 1.2.4. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn S. suis .................................................................. 10 1.2.5. Các yếu tố độc lực của vi khuẩn S. suis.......................................................................... 11 1.3. Bệnh liên cầu khuẩn ở lợn do vi khuẩn S. suis gây ra ....................................................... 13 1.3.1. Đặc điểm dịch tễ học ...................................................................................................... 13 1.3.2. Cơ chế sinh bệnh ............................................................................................................ 15 iv 1.3.3. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích................................................................................. 17 1.3.4. Miễn dịch ở lợn chống vi khuẩn S. suis.......................................................................... 20 1.3.5. Chẩn đoán....................................................................................................................... 24 1.3.6. Phòng bệnh ..................................................................................................................... 28 1.3.7. Điều trị bằng kháng sinh................................................................................................. 32 Chương 2: NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................................................... 36 2.1. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................................... 36 2.1.1. Nghiên cứu tình hình bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn nuôi tại Thái Nguyên do vi khuẩn S. suis gây ra .................................................................................................................. 36 2.1.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng S. suis gây viêm phổi và viêm khớp ở lợn tại Thái Nguyên..................................................................................................... 36 2.1.3. Nghiên cứu chế tạo thử nghiệm Autovaccine vô hoạt keo phèn từ các chủng S. suis phân lập............................................................................................................................ 36 2.1.4. Nghiên cứu thử nghiệm biện pháp phòng, trị bệnh do S. suis gây ra ở lợn.................... 36 2.2. Đối tượng, nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................... 37 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu..................................................................................................... 37 2.2.2. Nguyên vật liệu............................................................................................................... 37 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................................................... 38 2.3.1. Địa điểm nghiên cứu ...................................................................................................... 38 2.3.2. Thời gian nghiên cứu...................................................................................................... 38 2.4. Phương pháp nghiên cứu................................................................................................... 38 2.4.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ ....................................................................................... 38 2.4.2. Phương pháp thu thập mẫu .................................................................................. 39 2.4.3. Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn S. suis ........................................................ 40 2.4.4. Phương pháp kiểm tra hình thái vi khuẩn bằng nhuộm Gram ........................................ 40 2.4.5. Phương pháp thực hiện các phản ứng sinh hóa (Nhận biết cấp I).................................. 41 2.4.6. Phương pháp thực hiện bộ Kit sinh hóa API 20 Strep (Nhận biết cấp II)...................... 41 2.4.7. Phương pháp PCR để xác định các serotype gây bệnh thông thường và các gen mã hoá một số yếu tố độc lực của vi khuẩn S. suis ............................................................................... 42 v 2.4.8. Phương pháp tính liều gây chết 50% (LD50) của vi khuẩn S. suis ................................. 43 2.4.9. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn ...................................................................... 43 2.4.10. Phương pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được trên động vật thí nghiệm ........................................................................................................................... 43 2.4.11. Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được .................................................................................................................... 44 2.4.12. Xây dựng phác đồ điều trị lợn mắc viêm phổi, viêm khớp .......................................... 44 2.4.13. Phương pháp chế tạo thử nghiệm Autovaccine vô hoạt keo phèn từ các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được ..................................................................................................... 45 2.4.14. Kiểm tra vô trùng, an toàn và hiệu lực của Autovaccine thử nghiệm phòng bệnh liên cầu khuẩn (chi tiết được trình bày ở phụ lục 10). ..................................................................... 46 2.4.15. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của lợn sau tiêm Autovaccine ........................................ 46 2.4.16. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể ở lợn đã được tiêm Autovaccine bằng phản ứng IHA................................................................................................................................... 46 2.5. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................................. 48 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................... 49 3.1. Tình hình lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp từ năm 2015 – 2017 tại tỉnh Thái Nguyên ........................................................................................................................... 49 3.1.1. Tỷ lệ lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp từ năm 2015 - 2017 ........................... 49 3.1.2. Tỷ lệ lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp trên các huyện, thành thuộc tỉnh Thái Nguyên ........................................................................................................................... 51 3.1.3. Tỷ lệ lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp theo mùa vụ ....................................... 54 3.1.4. Tỷ lệ lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp theo lứa tuổi ....................................... 55 3.2. Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng S. suis phân lập được........ 58 3.2.1. Kết quả phân lập vi khuẩn S. suis từ lợn mắc viêm phổi và viêm khớp tại Thái Nguyên .......................................................................................................................... 58 3.2.2. Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được ........................................................................................................................... 60 3.2.3. Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được bằng bộ Kit sinh hóa API 20 Strep............................................................................ 62 vi 3.2.4. Kết quả xác định tính mẫn cảm kháng sinh của các chủng S. suis phân lập .................. 64 3.2.5. Kết quả xác định serotype của các chủng S. suis phân lập được bằng kỹ thuật PCR .......................................................................................................................................... 65 3.2.6. Kết quả xác định gen mã hóa yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được ........................................................................................................................ 69 3.2.7. Kết quả nghiên cứu sự ổn định một số đặc tính sinh học của các chủng S. suis phân lập được ở lợn tại Thái Nguyên ...................................................................................................... 73 3.3. Kết quả nghiên cứu chế tạo thử nghiệm Autovaccine từ các chủng S. suis phân lập được ........................................................................................................................ 79 3.3.1. Chọn chủng vi khuẩn S. suis để chế tạo thử nghiệm Autovaccine................................. 79 3.3.2. Chế tạo thử nghiệm Autovaccine phòng bệnh S. suis ở lợn........................................... 80 3.3.3. Kết quả kiểm nghiệm Autovaccine phòng bệnh S. suis ở lợn........................................ 83 3.3.4. Kết quả xác định đáp ứng miễn dịch ở lợn sau tiêm Autovaccine thử nghiệm phòng bệnh S. suis ở lợn ...................................................................................................................... 88 3.4. Kết quả thử nghiệm biện pháp phòng và trị viêm phổi, viêm khớp cho lợn do S. suis gây ra ................................................................................................................................ 98 3.4.1. Kết quả xác định hiệu lực của Autovaccine phòng viêm phổi và viêm khớp cho lợn...... 98 3.4.2. Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị lợn mắc viêm phổi và viêm khớp .............100 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................................106 1. KẾT LUẬN........................................................................................................................106 2. ĐỀ NGHỊ ...........................................................................................................................107 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ...........................................................108 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................109 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ADH : Arginine Dihydrolase AMD : amidon ARA : arabinose BHI : Brain Heart Infusion CFU : Colony Forming Unit CPS : Capsule polysaccharide cs : cộng sự EF : Extracellular factor ELISA : Enzyme - linked Immunosorbert Assay ESL : Esculin GAL : Galactosidase GLYG: : glycogen GUR : Glucuronidase HIP : acid Hippuric ICAM : Intercellular adhension molecule IHA : Indirect Haemaglunation test INU : đường inulin LAP : Leucine AminoPeptidase LAC : đường lactose LD : Lethal dose MAN : đường mannitol MRP : Muramidase - released protein NAG : N-acetylgluco acid NAM : N-acetylmuramic acid NIN : Ninhydrin PAL : Alkaline Phosphatase PBS : Phosphate-buffered solution PCR : Polymerase Chain Reaction viii PYRA : Pyrrolidonyl Arylamidase QCVN : quy chuẩn Quốc Gia RAF : đường raffinose RIB : đường ribose RR : Relative Risk S. suis : Streptococcus suis SLY : Suilysin SOR : đường sorbitol STSS : Streptococcus toxic shock syndrome TCCS : tiêu chuẩn cơ sở TCVN : tiêu chuẩn Quốc Gia TRE : trehalose TSA : Tryptone soya agar TSB : Tryptone soya broth TYE : Tryptone Yeast Extract Broth VP : Voges Proskauer VCAM : Vascular cell adhension molecule YE : Yeast Extract ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Tỷ lệ lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp từ năm 2015 – 2017 .........50 Bảng 3.2: Tỷ lệ lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp trên huyện, thành thuộc tỉnh Thái Nguyên ........................................................................................52 Bảng 3.3: Tỷ lệ lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp theo mùa vụ ......................54 Bảng 3.4: Tỷ lệ lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp theo lứa tuổi .....................56 Bảng 3.5: Kết quả phân lập vi khuẩn S. suis từ lợn mắc viêm phổi và viêm khớp ở các lứa tuổi khác nhau .............................................................................59 Bảng 3.6: Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng S. suis phân lập được ......................................................................................61 Bảng 3.7: Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được bằng bộ Kit sinh hóa API 20 Strep ...............63 Bảng 3.8: Kết quả xác định tính mẫn cảm kháng sinh của các chủng S. suis phân lập được ......................................................................................................64 Bảng 3.9: Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được ...67 Bảng 3.10: Kết quả xác định gen mã hóa yếu tố độc lực của các chủng S. suis phân lập được .............................................................................................70 Bảng 3.12: Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học cơ bản của các chủng S. suis lựa chọn sau 5 đời cấy truyền ...............................................76 Bảng 3.13: Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng S. suis trên chuột bạch sau 5 đời cấy truyền ..........................................................................................77 Bảng 3.14: Đặc tính của các chủng S. suis được lựa chọn để chế tạo thử nghiệm Autovaccine ................................................................................................79 Bảng 3.15: Kết quả đếm số lượng vi khuẩn có trong canh trùng S. suis dùng chế tạo Autovaccine thử nghiệm ............................................................................81 Bảng 3.16: Kết quả kiểm tra thuần khiết của canh trùng dùng chế tạo autovaccine thử nghiệm.........................................................................................................82 Bảng 3.17: Kết quả kiểm tra vô trùng của Autovaccine chế tạo thử nghiệm ......................84 Bảng 3.18: Kết quả kiểm tra an toàn của Autovaccine trên lợn thí nghiệm ........................85 x Bảng 3.19: Kết quả xác định hiệu lực của Autovaccine thử nghiệm trên chuột bạch khi công cường độc vi khuẩn S. suis serotype 2 ........................................86 Bảng 3.20. Kết quả xác định hiệu lực của Autovaccine thử nghiệm trên chuột bạch khi công cường độc vi khuẩn S. suis serotype 7 ........................................86 Bảng 3.21: Kết quả xác định hiệu lực của Autovaccine thử nghiệm trên chuột bạch khi công cường độc vi khuẩn S. suis serotype 9 ........................................87 Bảng 3.22: Kết quả kiểm tra kháng thể trong huyết thanh của lợn sau tiêm Autovaccine 30 ngày ..................................................................................89 Bảng 3.23: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của lợn thí nghiệm sau tiêm Autovaccine 30 ngày ..................................................................................90 Bảng 3.24: Kết quả kiểm tra kháng thể trong huyết thanh của lợn sau tiêm Autovaccine 60 ngày ..................................................................................91 Bảng 3.25: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của lợn thí nghiệm sau tiêm Autovaccine 60 ngày ..................................................................................92 Bảng 3.26: Kết quả kiểm tra kháng thể trong huyết thanh của lợn sau tiêm Autovaccine 90 ngày ..................................................................................93 Bảng 3.27: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của lợn thí nghiệm sau tiêm Autovaccine 90 ngày ..................................................................................94 Bảng 3.28: Kết quả kiểm tra kháng thể trong huyết thanh của lợn sau tiêm Autovaccine 120 ngày ................................................................................96 Bảng 3.29: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của lợn thí nghiệm sau tiêm Autovaccine 120 ngày ................................................................................96 Bảng 3.30: Kết quả thử nghiệm Autovaccine phòng viêm phổi và viêm khớp do S. suis cho lợn nuôi tại Thái Nguyên..............................................................98 Bảng 3.31: Kết quả điều trị thử nghiệm lợn mắc viêm phổi .......................................100 Bảng 3.32: Kết quả điều trị thử nghiệm lợn mắc viêm khớp ......................................102 xi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1. Biểu đồ so sánh tỷ lệ lợn mắc bệnh và chết do viêm phổi, viêm khớp từ năm 2015 - 2017 tại tỉnh Thái Nguyên .............................................................. 51 Hình 3.2. Biểu đồ so sánh tỷ lệ lợn mắc bệnh và chết do viêm phổi, viêm khớp giữa các huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên từ năm 2015 – 2017 ........................... 53 Hình 3.3. Biểu đồ so sánh tỷ lệ lợn mắc bệnh và chết do viêm phổi, viêm khớp theo mùa vụ ........................................................................................................ 55 Hình 3.4. Biểu đồ so sánh tỷ lệ lợn mắc bệnh và chết do viêm phổi, viêm khớp theo lứa tuổi của lợn ........................................................................................... 58 Hình 3.5: Kết quả phản ứng PCR xác định serotype của vi khuẩn S. suis .................... 69 Hình 3.6: Kết quả phản ứng PCR xác định gen mã hóa độc lực của các chủng S. suis phân lập được ............................................................................................. 72 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Chăn nuôi lợn ở tỉnh Thái Nguyên trong những năm qua phát triển nhanh về số lượng và được cải tiến nhiều về chất lượng nên đã đáp ứng với nhu cầu tiêu dùng nội tỉnh và hướng tới xuất khẩu, góp phần giải quyết việc làm và tăng thu nhập cho người chăn nuôi trên địa bàn. Theo thống kê của Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Thái Nguyên (1/10/2018) [2] năm 2018 tổng đàn lợn có trên 680.000 con, tổng sản lượng thịt hơi đạt trên 80.170 tấn, đây là nguồn cung cấp thực phẩm chủ yếu trong ngành chăn nuôi. Vì vậy, chăn nuôi lợn đã chiếm vị thế quan trọng trong phát triển kinh tế của tỉnh và trở thành ngành mũi nhọn được quan tâm phát triển. Chăn nuôi lợn ở Thái Nguyên hiện tại vẫn chủ yếu là các trại quy mô nhỏ nên gặp rất nhiều khó khăn đặc biệt là khâu kiểm soát dịch bệnh nên đã ảnh hưởng lớn đến hiệu quả chăn nuôi. Ngoài các bệnh truyền nhiễm gây ra cho đàn lợn như lở mồm long móng, dịch tả, tai xanh… thì viêm phổi, viêm khớp ở lợn do vi khuẩn S. suis cũng xảy ra khá phổ biến và gây tổn thất về kinh tế cho người chăn nuôi. Bệnh do S. suis ở lợn với các biểu hiện bệnh lý như bại huyết, viêm phổi, viêm khớp, viêm não…dẫn đến chết, đặc biệt là ở giai đoạn lợn con sau cai sữa, làm ảnh hưởng tới tăng trọng, chất lượng con giống và tăng tỷ lệ loại thải. Vi khuẩn S. suis đóng vai trò quan trọng trong gây bệnh hô hấp và viêm khớp ở lợn. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Nội và Nguyễn Ngọc Nhiên (1993) [15] về hệ vi khuẩn đường hô hấp của 162 lợn mắc ho thở truyền nhiễm cho thấy vi khuẩn Streptococcus chiếm tỷ lệ 74,0%. Kết quả điều tra của Đỗ Ngọc Thúy và cs. (2009b) [32] từ những lợn khỏe nuôi tại trại, lợn được đưa tới lò mổ, lợn có triệu chứng bệnh đường hô hấp, tai xanh hoặc viêm khớp, viêm não đều đã phân lập được vi khuẩn S. suis với các tỷ lệ khác nhau. Trong số các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được đã phát hiện thấy các serotype gây bệnh quan trọng và phổ biến là serotype 2, 7 và 9. Không chỉ gây thiệt hại trên đàn lợn, vi khuẩn S. suis còn gây bệnh nguy hiểm cho người. Ở Việt Nam cũng đã ghi nhận nhiều ca mắc và chết do S. suis 2 serotype 2. Trong 6 tháng đầu năm 2017 cả nước có 69 người mắc bệnh liên cầu khuẩn lợn, trong đó có 4 ca chết do nhiễm khuẩn nặng (Phương Trang, 2017) [142]. Theo thống kê của Cục Y tế dự phòng (Bộ Y tế) [140] trong năm 2017 cả nước ghi nhận 171 ca mắc bệnh liên cầu lợn, trong đó 14 người chết. Đặc biệt, trong tháng 6/2018 trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên có 3 ca mắc bệnh do S. suis (Phương Nam, 2018) [141]. Những người bị mắc bệnh đều được xác nhận là có tiếp xúc với lợn mắc trong chăn nuôi, giết mổ, ăn thịt hoặc tiết canh lợn nhiễm liên cầu khuẩn. Xuất phát từ tình hình thực tế sản xuất và an toàn thực phẩm hiện nay, nhằm có hiểu biết đầy đủ hơn về vi khuẩn S. suis gây viêm phổi và viêm khớp ở lợn, làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu các biện pháp phòng, trị bệnh hiệu quả là một yêu cầu cấp thiết, góp phần nâng cao hiệu quả, tăng thu nhập cho người chăn nuôi lợn và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng, vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Streptococcus suis gây bệnh ở lợn tại tỉnh Thái Nguyên và chế tạo Autovaccine phòng bệnh”. 2. Mục tiêu của đề tài - Xác định một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn S. suis gây bệnh viêm phổi và viêm khớp ở lợn nuôi tại tỉnh Thái Nguyên. - Nghiên cứu chế tạo Autovaccine thử nghiệm phòng viêm phổi và viêm khớp cho lợn từ các chủng S. suis phân lập được và thử nghiệm các phác đồ điều trị bệnh viêm phổi và viêm khớp cho lợn do S. suis gây ra có hiệu quả cao, góp phần thúc đẩy chăn nuôi lợn trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên phát triển. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học - Là một công trình nghiên cứu có hệ thống về đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn S. suis ở lợn nuôi tại Thái Nguyên. - Nghiên cứu chế tạo Autovaccine từ các chủng S. suis phân lập được để phòng viêm phổi, viêm khớp cho lợn nuôi tại Thái Nguyên có hiệu quả và đề xuất được phác đồ điều trị viêm phổi, viêm khớp cho lợn do S. suis cho hiệu quả cao. - Bổ sung và làm phong phú thêm dữ liệu khoa học, sử dụng làm tài liệu tham khảo trong giảng dạy và nghiên cứu về vi khuẩn S. suis gây bệnh ở lợn. 3 3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Sử dụng Autovaccine thử nghiệm tiêm phòng cho lợn nuôi tại tỉnh Thái Nguyên đã góp phần giảm tỷ lệ lợn mắc viêm phổi, viêm khớp do vi khuẩn S. suis gây ra. - Áp dụng phác đồ điều trị bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn cho hiệu quả cao, góp phần tăng thu nhập cho người chăn nuôi và phát triển bền vững ngành chăn nuôi lợn tại tỉnh Thái Nguyên. - Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học để xây dựng các biện pháp phòng, trị bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra ở lợn đạt hiệu quả. 4. Những đóng góp mới của đề tài: - Là công trình nghiên cứu có hệ thống và đầy đủ về vi khuẩn S. suis gây bệnh ở lợn tại tỉnh Thái Nguyên. - Chế tạo thành công Autovaccine từ các chủng S. suis phân lập có hiệu quả trong phòng viêm phổi, viêm khớp cho lợn và xác định phác đồ điều trị lợn mắc viêm phổi, viêm khớp đạt hiệu quả cao được ứng dụng vào thực tiễn sản xuất chăn nuôi lợn tại Thái Nguyên. 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh liên cầu khuẩn và chế tạo vaccine phòng bệnh trên lợn gây ra do S. suis ở trong và ngoài nước 1.1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Vi khuẩn S. suis là một trong các nguyên nhân gây ra bệnh quan trọng và gây ra những thiệt hại cho ngành chăn nuôi lợn. Bệnh do S. suis gây ra ở lợn được xác nhận lần đầu tiên ở Hà Lan vào năm 1951 và ở Anh năm 1954. Từ đó, bệnh đã xảy ở hầu khắp các nước trên thế giới nơi có ngành chăn nuôi lợn phát triển (Higgins R. và Gottschalk M., 2006) [77]. Theo Gottschalk M. (2012) [68] vi khuẩn S. suis serotype 1 và serotype ½ thường gây bệnh cho lợn con theo mẹ từ 1 - 3 tuần tuổi, có khi tới 6 tuần tuổi và thường ở thể bại huyết hoặc nhiễm trùng như viêm phổi, viêm khớp, màng não, viêm nội tâm mạc, đặc biệt là ở lợn con từ 1 - 7 ngày tuổi. Vi khuẩn S. suis thuộc serotype 2 cũng gây bệnh cho lứa tuổi này nhưng thường gây cho lợn trong giai đoạn sau cai sữa và lợn thịt (4-16 tuần tuổi) với các thể bệnh như trên. Theo Segura M. và cs. (2014a) [109] đã xác định từ 30 - 70% vi khuẩn S. suis cư trú ở đường hô hấp trên của lợn khỏe xâm nhập vào đường hô hấp dưới gây nhiễm trùng huyết, viêm phổi, viêm khớp, viêm ngoại tâm mạc, màng não... khi hệ miễn dịch của lợn bị suy giảm. Bệnh thường xảy ra vào mùa xuân khi điều kiện chăn nuôi bất lợi và thuận lợi cho sự phát triển của các loại cầu khuẩn. Ở Anh, các nghiên cứu cũng cho thấy vi khuẩn S. suis serotype 2 là nguyên nhân chính gây bại huyết, viêm não và viêm đa khớp, ít khi gây viêm phổi; trong khi đó ở Bắc Mỹ khi lợn mắc bệnh liên cầu khuẩn thì bệnh tích ở phổi vẫn là chủ yếu. Vi khuẩn S. suis serotype 2 có thể lây nhiễm từ đàn này sang đàn khác hoặc trong cùng một đàn do sự tiếp xúc giữa các cá thể lợn với nhau hoặc từ chất thải nhiễm vi khuẩn (Segura M. và cs., 2014b) [110]. Bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra ở lợn là đa dạng gồm viêm phổi, viêm khớp, viêm não, viêm nội tâm mạc... và thường dẫn đến chết. Ở Hàn Quốc, Han D.U. và 5 cs. (2001) [73] đã khảo sát xác định S. suis ở hạch amidan của lợn thịt khỏe là 13,8%; trong khi đó ở Trung Quốc, nghiên cứu của Rui P. và cs. (2012) [106] trong mẫu dịch mũi của lợn khỏe có 24,67% nhiễm S. suis. Theo Goyette - Desijardins G. và cs. (2014) [70] các nghiên cứu ở nhiều nước cho thấy S. suis serotype 2 được tìm thấy trên lợn khỏe, có thể lây nhiễm cho người qua tiếp xúc hoặc sử dụng các loại thực phẩm từ lợn không qua nấu chín. Ở Trung Quốc, năm 2005 đã chế tạo vaccine vô hoạt từ các chủng S. suis serotype 2 để kiểm soát dịch bệnh liên cầu khuẩn ở lợn theo Lun Z.R. và cs. (2007) [94]. Nghiên cứu của Jiang X. và cs. (2016) [81] đã xác định chủng S. suis serotype 5 (XS045) độc lực thấp có thể sử dụng để sản xuất vaccine nhược độc cho an toàn và hiệu quả trong việc bảo vệ cơ thể chống lại S. suis serotype 2 và 9 độc lực cao. Theo Jiao J. và cs. (2017) [82] peptide NZ.2114 là một dẫn xuất từ kháng sinh defensin và plectasin của nấm rừng, có hoạt tính kháng S. suis serotype 2 trong điều kiện invitro và invivo mạnh hơn so với ampicillin. Theo Dutkewicz J. và cs. (2017) [54] dựa vào kháng nguyên vỏ polysaccharide, vi khuẩn S. suis được phân thành 35 serotype từ 1 đến 34 và serotype ½. Đến nay, nhiều nghiên cứu đều cho thấy 6 serotype của S. suis bao gồm serotype 20, 22, 26, 32, 33 và 34 đã có những biến đổi về đặc tính sinh học của chúng so với ban đầu. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, nghiên cứu của Trịnh Phú Ngọc và Lê Văn Tạo (2001) [11] cho thấy trong 37 chủng vi khuẩn Streptococcus spp. phân lập được từ lợn ở các lứa tuổi khác nhau, trong đó có 19 chủng từ hạch phổi. Kết quả của Cù Hữu Phú và cs. (2005) [22] khi nghiên cứu nguyên nhân gây viêm phổi của lợn nuôi tại một số tỉnh phía Bắc đã xác định vi khuẩn S. suis là một trong những căn nguyên phổ biến có vai trò gây bệnh quan trọng. Đỗ Ngọc Thúy và Lê Thị Minh Hằng (2009a) [31] đã nghiên cứu đặc tính sinh học và các phản ứng PCR để xác định các gen mã hóa một số yếu tố độc lực, các serotype thông thường của S. suis cho thấy các phản ứng đã thiết lập và chuẩn hóa đều đảm bảo các yêu cầu và tính chính xác cao, được ứng dụng trong khảo sát 6 các yếu tố gây bệnh và serotype thông thường của các chủng S. suis. Năm 2010, Đỗ Ngọc Thúy và cs. (2010) [33] nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm đặc tính gây miễn dịch của vaccine vô hoạt keo phèn phòng bệnh cho lợn do vi khuẩn S. suis gây ra có đậm độ vi khuẩn trong vaccine đạt từ 3,2 - 3,5 x 108 vi khuẩn/ml bước đầu có sinh đáp ứng miễn dịch trên lợn thí nghiệm. Nghiên cứu của Hoa N.T. và cs. (2011) [78] tỷ lệ lợn khỏe ở lò mổ tại các tỉnh miền Nam nhiễm S. suis là 41,0%, trong đó từ bệnh phẩm là hạch amidan, là nơi cư trú thường xuyên của vi khuẩn S. suis nên có tỷ lệ cao hơn. Trương Quang Hải và cs. (2012) [6] nghiên cứu lợn mắc bệnh viêm phổi tại tỉnh Bắc Giang cho thấy tỷ lệ phân lập được S. suis là 51,67%. Trong đó, tỷ lệ cao nhất ở lợn sau cai sữa từ 1,5 đến 3 tháng tuổi chiếm 59,46% và thấp nhất là ở lợn con dưới 1,5 tháng tuổi (39,29%). Theo Lê Văn Dương và cs. (2013) [3] lợn dương tính với PRRS tại tỉnh Bắc Giang phân lập được S. suis là 55,10%. Các chủng S. suis phân lập được thuộc serotype 2 với tỷ lệ là 56,29%, serotype 9 là 17,03% và serotype 7 là 5,18%, các chủng thuộc serotype 21 và 29 đều chiếm tỷ lệ thấp (2,22%). Cù Hữu Phú và cs. (2013) [24] nghiên cứu chọn chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis để chế tạo vaccine phòng bệnh viêm phổi cho lợn cho thấy các chủng S. suis thuộc serotype 2 có gen mã hóa độc tố được phân bố rải rác trong các kiểu tổ hợp gen là arcA, arcA/sly; arcA/mrp; arcA/mrp/sly; arcA/mrp/sly/epf. Theo Cù Hữu Phú và cs. (2014) [25] các lô vaccine vô hoạt có chất bổ trợ keo phèn được chế tạo từ các chủng vi khuẩn trên đều sinh miễn dịch và có hiệu lực bảo hộ cao (90 - 100%) khi thử trên động vật thí nghiệm. Hoàng Văn Minh và cs. (2017) [21] khi thử nghiệm vaccine vô hoạt phòng viêm phổi cho lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra tại Bắc Giang cho thấy lợn được tiêm chủng vaccine này đã sinh miễn dịch, đạt tỷ lệ bảo hộ là 71,04%. Nghiên cứu của Bùi Thị Hiền và cs. (2016) [8] về sự lưu hành của S. suis trên một số địa bàn thuộc tỉnh Thừa Thiên - Huế trong vụ xuân hè năm 2015 cho thấy tỷ lệ nhiễm S. suis trên lợn khỏe là 11,4%. Huỳnh Ngân Hà và cs. (2016) [4] 7 khảo sát mức độ nhiễm S. suis trên các sản phẩm từ lợn ở cơ sở giết mổ tại thành phố Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ mẫu tìm thấy S. suis là 72,2%, trong đó S. suis serotype 2 là 14,8% trên tổng số mẫu khảo sát. Lê Quốc Việt và cs. (2017) [41] đã xác định tỷ lệ nhiễm S. suis ở lợn giết mổ trên địa bàn thành phố Huế cũng cho thấy trong 100 mẫu dịch mũi của lợn đã phát hiện có 9,0% nhiễm S. suis serotype 2 và đã tạo dòng, biểu hiện gen mã hóa 6 - phosphogluconate - dehydrogenase protein trong E. coli BL21. Lê Hồng Thủy Tiên và cs. (2018) [34] khảo sát tỷ lệ mang S. suis trên lợn khỏe ở các độ tuổi khác nhau tại miền Đông Nam Bộ cho thấy S. suis là tác nhân gây bệnh viêm phổi, viêm khớp, viêm màng não, nhiễm trùng máu ở lợn, đặc biệt là S. suis serotype 2 và đã phân lập, xác định được tỷ lệ lợn khỏe mang S. suis là 12,05%. Từ những nghiên cứu trên có thể thấy S. suis là vi khuẩn được quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây, tuy tỷ lệ phát hiện được chưa cao nhưng sự có mặt của S. suis đã chứng tỏ vai trò quan trọng trong bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn tại Việt Nam hiện nay nên việc chăm sóc, phòng và trị bệnh cho lợn con cần được lưu tâm nhằm hạn chế nhiễm bệnh do S. suis cho đàn lợn cũng như cho người chăn nuôi. 1.2. Vi khuẩn S. suis 1.2.1. Phân loại vì khuẩn S. suis Phân loại vi khuẩn S. suis nếu dựa vào phản ứng sinh hoá thì gặp khó khăn bởi các serotype đều có các đặc tính sinh hóa tương tự nhau. Ban đầu, S. suis được phân loại huyết thanh học thành các nhóm theo ký hiệu S, R, RS và T. Sau đó, các nhóm S, R và RS này lần lượt được thay thế bằng các serotype ký hiệu lần lượt là 1; 2 và 1/2, còn nhóm T được thay thế bằng serotype 15 (Higgins R. và Gottschalk M., 2006) [77]. Trong thời gian từ năm 1983 đến 1995, có 32 serotype mới của S. suis được phát hiện và phân loại dựa trên cấu trúc kháng nguyên polysaccharide của giáp mô, nâng tổng số serotype của vi khuẩn này lên thành 35 loại (ký hiệu từ 1 đến 34, và 1/2). Trong đó, đáng chú ý nhất là các chủng thuộc serotype 2 phân lập được