Tài liệu Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của đơn bào histomonas meleagridis ký sinh trên gà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA ĐƠN BÀO Histomonas meleagridis KÝ SINH TRÊN GÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA ĐƠN BÀO HISTOMONAS MELEAGRIDIS KÝ SINH TRÊN GÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành Công nghệ sinh học Mã số 60420201 Quyết định giao đề tài 526/QĐ-ĐHNT ngày 17/06/2014 Quyết định thành lập HĐ Ngày bảo vệ 30/11/2015 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN ĐỨC TÂN Chủ tịch Hội đồng: Khoa sau đại học: KHÁNH HÒA - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của đơn bào Histomonas meleagridis ký sinh trên gà” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chƣa từng đƣợc công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này. Nha Trang, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thu Hằng iii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ của quý phòng ban trƣờng Đại học Nha Trang, Viện Công nghệ sinh học và Môi trƣờng đã tại điều kiện tốt nhất cho tôi đƣợc hoàn thành đề tài. Đặc biệt là sự hƣớng dẫn tận tình của TS. Nguyễn Đức Tân đã giúp tôi hoàn thành tốt đề tài. Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến sự giúp đỡ này. Tôi cũng xin cảm ơn ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung cùng các cán bộ Bộ môn nghiên cứu Ký sinh trùng, các thầy cô Viện Công nghệ sinh học và Môi trƣờng đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn tốt nghiệp này. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và tất cả bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày....tháng....năm 2015 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thu Hằng iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................... iii LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................... iv MỤC LỤC ............................................................................................................................ v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................... ix DANH MỤC BẢNG ............................................................................................................ x DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ....................................................................................... xi TRÍCH YẾU LUẬN VĂN................................................................................................xiii PHẦN MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ................................................. 3 1.1. Lịch sử bệnh do đơn bào Histomonas meleagridis trên thế giới và tại Việt Nam .... 3 1.2. Đặc điểm chung của Histomonas meleagridis .......................................................... 4 1.2.1. Hệ thống phân loại ............................................................................................. 4 1.2.2. Đặc điểm hình thái và cấu tạo ............................................................................ 4 1.2.3. Chu trình sinh học .............................................................................................. 6 1.3. Đặc điểm dịch tễ ........................................................................................................ 7 1.3.1. Vật chủ cảm nhiễm ............................................................................................ 7 1.3.2. Một số nghiên cứu về bệnh do đơn bào Histomonas meleagridis trên thế giới và tại Việt Nam ..................................................................................................... 8 1.3.3. Mùa nhiễm bệnh ................................................................................................ 9 1.3.4. Vật chủ trung gian Heterakis gallinarum ........................................................ 10 1.3.4.1. Đặc điểm sinh học của giun kim Heterakis gallinarum ........................... 10 1.3.4.2. Cơ chế sinh bệnh ...................................................................................... 12 1.3.5. Đƣờng truyền bệnh .......................................................................................... 12 1.4. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của bệnh do đơn bào Histomonas meleagridis .................................................................................................................... 13 1.4.1. Triệu chứng lâm sàng ....................................................................................... 13 1.4.2. Bệnh tích .......................................................................................................... 14 1.5. Đặc điểm mô bệnh học ............................................................................................ 16 1.6. Đặc điểm miễn dịch học .......................................................................................... 17 1.6.1. Miễn dịch chủ động ......................................................................................... 17 1.6.2. Miễn dịch thụ động .......................................................................................... 17 v 1.7. Một số phƣơng pháp chẩn đoán bệnh ..................................................................... 18 1.7.1. Chẩn đoán lâm sàng ......................................................................................... 18 1.7.2. Chẩn đoán phân biệt......................................................................................... 18 1.7.3. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm.................................................................. 20 1.7.3.1. Xét nghiệm tiêu bản .................................................................................. 20 1.7.3.2. Nuôi cấy .................................................................................................... 20 1.7.3.3. Kỹ thuật PCR ............................................................................................ 22 1.8. Một số biện pháp phòng và trị bệnh ........................................................................ 22 1.8.1. Phòng bệnh....................................................................................................... 22 1.8.2. Trị bệnh ............................................................................................................ 23 1.9. Giới thiệu phản ứng PCR ........................................................................................ 24 1.9.1. Định nghĩa ........................................................................................................ 24 1.9.2. Nguyên lý ......................................................................................................... 24 1.9.3. Một số yếu tố ảnh hƣởng và giải pháp tối ƣu hoá phản ứng PCR ................... 27 1.9.3.1. DNA khuôn mẫu ....................................................................................... 28 1.9.3.2. Enzyme DNA polymerase ........................................................................ 28 1.9.3.3. Primer và nhiệt độ lai ............................................................................... 29 1.9.3.4. Nồng độ dNTP .......................................................................................... 30 1.9.3.5. Dung dịch đệm.......................................................................................... 30 1.9.3.6. Nƣớc ......................................................................................................... 31 1.9.3.7. Nhiệt độ của quá trình ủ ........................................................................... 31 1.9.3.8. Số lƣợng chu kỳ phản ứng ........................................................................ 31 1.9.3.9. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR .................................................... 32 1.9.4. Ƣu và nhƣợc điểm kỹ thuật PCR ..................................................................... 32 1.9.4.1. Ƣu điểm .................................................................................................... 32 1.9.4.2. Nhƣợc điểm .............................................................................................. 32 Chƣơng 2. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 34 2.1. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 34 2.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 34 2.2.1. Mẫu bệnh phẩm, động vật thí nghiệm ............................................................. 34 2.2.2. Hóa chất- sinh phẩm ........................................................................................ 34 2.2.3. Máy móc, thiết bị ............................................................................................. 35 vi 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................................... 35 2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu ...................................................................................... 35 2.3.2. Nghiên cứu xác định các đặc điểm hình thái cấu tạo, đặc điểm sinh học của Histomonas meleagridis............................................................................................. 36 2.3.2.1. Phƣơng pháp xét nghiệm tiêu bản ............................................................ 36 2.3.2.2. Phƣơng pháp nuôi cấy trên môi trƣờng Dwyer ........................................ 36 2.3.3. Phƣơng pháp xác định vòng đời của Histomonas meleagridis........................ 37 2.3.3.1. Xác định quá trình phát triển của Histomonas meleagridis trong trứng giun kim ở môi trƣờng bên ngoài .......................................................................... 37 2.3.3.2. Xác định quá trình phát triển của Histomonas meleagridis trong cơ thể gà...................................................................................................................... 37 2.3.4. Nghiên cứu xác định triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của bệnh do Histomonas meleagridis gây ra .................................................................................. 38 2.3.5. Phƣơng pháp chẩn đoán Histomonas meleagridis bằng kỹ thuật PCR ........... 39 2.3.5.1. Chiết tách DNA.................................................................................. 40 2.3.5.2. Quy trình PCR để phát hiện Histomonas meleagridis ............................. 41 2.3.5.3. Chạy điện di và đọc kết quả ..................................................................... 43 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 45 3.1. Kết quả xác định một số đặc điểm hình thái cấu tạo, đặc điểm sinh học của Histomonas meleagridis ................................................................................................. 45 3.1.1. Đặc điểm hình thái cấu tạo của Histomonas meleagridis ................................ 45 3.1.2. Đặc điểm sinh học của Histomonas meleagridis ............................................. 47 3.1.2.1. Đặc điểm nuôi cấy .................................................................................... 47 3.1.2.2. Kết quả xác định vòng đời của Histomonas meleagridis ......................... 49 3.2. Kết quả xác định triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của bệnh do Histomonas meleagridis ..................................................................................................................... 53 3.2.1. Kết quả xác định triệu chứng lâm sàng ............................................................ 53 3.2.2. Kết quả xác định bệnh tích .............................................................................. 55 3.2.2.1. Kết quả xác định bệnh tích đại thể ........................................................... 55 3.2.2.2. Kết quả xác định bệnh tích vi thể ............................................................. 58 3.2.3. Chẩn đoán phân biệt bệnh do Histomonas meleagridis với một số bệnh truyền nhiễm (Newcastle và Salmonella) .................................................................. 59 vii 3.3. Kết quả chẩn đoán Histomonas meleagridis bằng kỹ thuật PCR ........................... 60 3.3.1. Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis ở gà tại huyện Cam Ranh và Ninh Hòa ............................................................................................................................. 60 3.3.2. Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis ở gà theo phƣơng thức chăn nuôi ........ 62 3.3.3. Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis theo nhóm tuổi của gà ......................... 63 3.3.4. Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagiridis theo mùa vụ ........................................ 64 Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ................................................................... 66 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 67 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BAC : Bacterial artificial chromosome (Nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn) DNA : Deoxyribonucleic Acid DNase : Deoxyribonuclease ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) ETS : External Transcribed Spacer (Vùng phiên mã bên ngoài) GOT : Glutamic-Oxaloacetic Transaminase GPT : Glutamic Pyruvic Transaminase HE : Haematoxilin – Eosin ITS : Internal Transcribed Spacer (Vùng phiên mã bên trong) LDH : Lactic MDH : Malic Dehydrogenase NFX : Nifurtimox PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA (Tính đa hình của DNA nhân Dehydrogenase bản ngẫu nhiên) rDNA : ribosomal Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid RNase : Ribonuclease rRNA : ribosomal Ribonucleic Acid STS : Sequence Tagged Site TBE : Tris Acetate-EDTA ix DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR .......................................................................... 42 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái cấu tạo của Histomonas meleagridis ............................ 43 Bảng 3.2. Số lƣợng Histomonas meleagridis ở môi trƣờng nuôi cấy theo thời gian ... 46 Bảng 3.3. Thí nghiệm xác định vòng đời của Histomonas meleagridis ...................... 50 Bảng 3.4. Triệu chứng lâm sàng ở gà nhiễm Histomonas meleagridis ....................... 52 Bảng 3.5. Bệnh tích đại thể ở các cơ quan gà bị bệnh Histomonas meleagridis ........ 54 Bảng 3.6. Đặc điểm khác biệt giữa bệnh do Histomonas meleagridis với bệnh Newcastle và Salmonella ở gà ...................................................................................... 58 Bảng 3.7. Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis ở gà tại huyện Cam Ranh và Ninh Hòa ...................................................................................................................................... 59 Bảng 3.8. Tỷ lệ nhiễm Histomonas meleagridis theo phƣơng thức chăn nuôi ............ 61 Bảng 3.9. Tình hình nhiễm Histomonas meleagridis theo nhóm tuổi của gà ............. 62 Bảng 3.10. Kết quả chẩn đoán Histomonas meleagridis theo mùa vụ ......................... 63 x DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của Histomonas meleagridis ....................................... .5 Hình 1.2. Trứng giun kim Heterakis gallinarum (10X) ............................................ 10 Hình 1.3. Phần đuôi giun kim Heterakis gallinarum (10X) ....................................... 10 Hình 1.4. Manh tràng gà bị sƣng ................................................................................ 15 Hình 1.5. Lá gan bị viêm hoại tử hình hoa cúc .......................................................... 15 Hình 1.6. Nguyên tắc phản ứng PCR ......................................................................... 24 Hình 2.1. Quy trình tách chiết DNA tổng số Histomonas meleagridis từ mẫu nội tạng ............................................................................................................................ 40 Hình 3.1. Histomonas meleagridis ở tiêu bản niêm mạc manh tràng (40X) ............ 45 Hình 3.2. Histomonas meleagridis ở tiêu bản gan (40X) ........................................... 45 Hình 3.3. Histomonas meleagridis ở tiêu bản phân (40X) ......................................... 45 Hình 3.4. Histomonas meleagridis ở tiêu bản phân (40X) ......................................... 45 Hình 3.5. Môi trƣờng nuôi cấy Dwyer ........................ .............................................. 46 Hình 3.6. Histomonas meleagridis sau 1 ngày nuôi cấy (40X) .................................. 46 Hình 3.7. Histomonas meleagridis sau 2 ngày nuôi cấy (40X) ................................. 46 Hình 3.8. Gà thí nghiệm gây nhiễm Histomonas meleagridis .................................. 48 Hình 3.9. Gà thí nghiệm gây nhiễm Histomonas meleagridis .................................. 48 Hình 3.10. Trứng giun kim chƣa phân chia (40X) ..................................................... 48 Hình 3.11. Trứng giun kim phân chia thành 2 phôi bào (40X) .................................. 48 Hình 3.12. Trứng giun kim phân chia thành 4 phôi bào (40X) .................................. 48 Hình 3.13. Trứng giun kim phân chia thành 16 phôi bào (40X) ................................ 48 Hình 3.14. Ấu trùng giun kim (40X) .......................................................................... 49 Hình 3.15. Trứng giun kim bị chết (40X) .................................................................. 49 Hình 3.16. Vòng đời của Histomonas meleagridis .................................................... 51 Hình 3.17. Gà kém vận động ủ rũ, xù lông và xệ cánh .............................................. 53 Hình 3.18. Gà kém vận động ủ rũ, xù lông và xệ cánh .............................................. 53 Hình 3.19. Gà chết mào tái, thâm tím......................................................................... 53 Hình 3.20. Gà chết mào tái, thâm tím......................................................................... 53 Hình 3.21. Gan sƣng to và mềm nhũn ........................................................................ 55 Hình 3.22. Gan xuất hiện các u cục và các mảng hoại tử ở bề mặt ............................ 55 xi Hình 3.23. Manh tràng sƣng to, chất chứa đóng kén dạng bã đậu ............................. 55 Hình 3.24. Manh tràng sƣng to, chất chứa đóng kén dạng bã đậu ............................. 55 Hình 3.25 Bệnh tích vi thể gan hoại tử có nhiều tế bào viêm và Histomonas meleagridis (100X) ..................................................................................................... 57 Hình 3.26. Bệnh tích vi thể gan hoại tử có nhiều tế bào viêm và Histomonas meleagridis (100X) ..................................................................................................... 57 Hình 3.27. Bệnh tích vi thể manh tràng gà bị hoại tử với vô số noãn nang (100X) . 57 Hình 3.28. Bệnh tích vi thể manh tràng gà bị hoại tử với vô số noãn nang (100X) . 57 Hình 3.29. Ảnh đại diện kết quả điện di sản phẩm PCR ............................................ 60 xii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Bệnh đầu đen ở gà do đơn bào Histomonas meleagridis gây ra, là bệnh ký sinh trùng có khả năng lây lan nhanh, mạnh và tỷ lệ chết là khá cao. Gà nhiễm bệnh này do ăn thức ăn hoặc uống nƣớc có lẫn trứng giun kim chứa mầm bệnh Histomonas meleagridis. Những năm gần đây, theo báo cáo của Chi cục Thú y tỉnh Khánh Hòa, bệnh đầu đen khá phổ biến trên đàn gà, ảnh hƣởng khá lớn đến hiệu quả chăn nuôi. Từ những vấn đề cấp thiết đó chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của đơn bào Histomonas meleagridis ký sinh trên gà” Mục tiêu của đề tài là xác định đƣợc đặc điểm hình thái cấu tạo, vòng đời của Histomonas meleagridis; triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của bệnh; chẩn đoán Histomonas meleagridis bằng kỹ thuật PCR nhằm làm cơ sở cho việc phòng chống bệnh do Histomonas meleagridis gây ra trên gà, góp phần phát triển chăn nuôi theo hƣớng bền vững. Để đáp ứng mục tiêu trên, đề tài tiến hành xác định các đặc điểm hình thái cấu tạo, đặc điểm sinh học của đơn bào bằng phƣơng pháp xét nghiệm tiêu bản và nuôi cấy trên môi trƣờng Dwyer; bố trí thí nghiệm sự phát triển của mầm bệnh ở môi trƣờng tự nhiên và gây nhiễm mầm bệnh trên gà để nghiên cứu vòng đời (chu kỳ sinh học). Ngoài các phƣơng pháp thƣờng quy trong nghiên cứu đơn bào ký sinh, đề tài còn sử dụng các phƣơng pháp hiện đại: kỹ thuật PCR; làm tiêu bản bệnh tích vi thể. Kết quả đề tài cho thấy, về hình thái học đơn bào Histomonas meleagridis có kích thƣớc từ 8 – 25 µm dạng hình tròn hoặc oval. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh học cho thấy, số lƣợng đơn bào nuôi cấy trong môi trƣờng Dwyer đạt cực đại sau 24 giờ nuôi cấy và vòng đời của đơn bào Histomonas meleagridis là 36 – 42 giờ. Triệu chứng lâm sàng chính của bệnh là gà ủ rũ, mào tái, thâm tím. Bệnh tích đặc trƣng là tổn thƣơng ở gan và manh tràng: gan xuất huyết, hoại tử hình hoa cúc; manh tràng trƣng to, chất chứa vón thành cục dạng bã đậu; tại các vùng tổn thƣơng thấy tập trung nhiều tế bào lympho, đại thực bào, hồng cầu và bạch cầu. Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán 130 mẫu gà nuôi tại huyện Cam Ranh và Ninh Hòa, phát hiện 17 con nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis, với tỷ lệ nhiễm từ 10 – 20%. Qua phân tích thống kê cho thấy, gà nuôi theo phƣơng thức thả vƣờn có tỷ lệ nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis cao hơn so với nuôi theo phƣơng thức công nghiệp; tỷ lệ nhiễm đơn bào xiii trên gà ở mùa khô cao hơn so với mùa mƣa; và không có sự sai khác về tỷ lệ nhiễm đơn bào giữa các nhóm tuổi. Từ khóa: Histomonas meleagridis, gà, đặc điểm sinh học, tỷ lệ nhiễm, Khánh Hòa xiv PHẦN MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Khánh Hoà là một tỉnh ven biển thuộc Nam Trung Bộ, ngành chăn nuôi gà của tỉnh có truyền thống từ lâu đời, đã góp phần quan trọng để cải thiện kinh tế, nâng cao đời sống hàng ngày của ngƣời dân. Những năm gần đây nhờ có nhiều chính sách khuyến khích, sự đa dạng con giống, phong phú nguồn thức ăn, công tác thú y đƣợc quan tâm... nên chăn nuôi gà có nhiều thuận lợi để phát triển. Tuy nhiên việc tập trung với số lƣợng lớn đã khiến cho việc kiểm soát bệnh gặp rất nhiều khó khăn. Trong những năm gần đây, tình hình dịch bệnh trên đàn gà ở nƣớc ta diễn ra khá phức tạp, mặc dù công tác Thú y đã đƣợc Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, ngành Thú y đặc biệt chú trọng. Nguyên nhân có thể do thời tiết khí hậu thay đổi, điều kiện chăn nuôi chuyển từ chăn nuôi nhỏ lẻ sang chăn nuôi với quy mô lớn, trong khi đó các điều kiện về bảo vệ sức khỏe cho vật nuôi còn nhiều bất cập. Những năm gần đây một số bệnh đã xảy ra và gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi gà nhƣ: Bệnh Đầu đen, bệnh cầu trùng, bệnh Newcastle, bệnh tụ huyết trùng, bệnh thƣơng hàn...Đặc biệt là bệnh Đầu đen do đơn bào Histomonas meleagridis ký sinh trên gà đã làm ảnh hƣởng không nhỏ đến hiệu quả chăn nuôi nhƣ: Gà còi cọc, chậm lớn, giảm sản lƣợng thịt, trứng,... Bệnh Đầu đen (Blackhead disease) là một bệnh xảy ra chủ yếu ở gà ta và gà tây do một loại đơn bào Histomonas meleagridis gây ra. Bệnh lần đầu xuất hiện ở một số tỉnh phía Bắc, đến nay bệnh cũng đã phát hiện đƣợc ở một số tỉnh phía Nam nhƣ Phú Yên, Khánh Hòa, Đồng Nai...Bệnh xảy ra hết sức đột ngột và có những triệu chứng đặc trƣng nhƣ đứng dang rộng chân, sã cánh, xù lông, sốt cao, vài ngày sau phân có lẫn máu. Da mép, mào, tích có màu xám xanh rồi dần chuyển thành xanh đen. Bệnh tích chủ yếu tập trung ở manh tràng và gan. Cho đến nay ở nƣớc ta chỉ có một vài nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm đơn bào Histomonas meleagridis trên gà (Lê Văn Năm, 2010; Nguyễn Đức Tân, 2014)...Nhìn chung có thể nói các nghiên cứu về bệnh chƣa đƣợc đề cập nhiều ở Việt Nam. Từ những yêu cầu thực tế đó, đồng thời nhằm làm rõ hơn mối quan hệ giữa đơn bào Histomonas meleagridis và vật chủ tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của đơn bào Histomonas meleagridis ký sinh trên gà”. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định đƣợc đặc điểm hình thái cấu tạo, vòng đời của Histomonas meleagridis. - Xác định đƣợc triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của bệnh do đơn bào Histomonas meleagridis gây ra. - Chẩn đoán Histomonas meleagridis bằng kỹ thuật PCR. 3. Đối tƣợng và phạm vị nghiên cứu 3.1. Đối tƣợng nghiên cứu Đơn bào Histomonas meleagridis trên gà ở các lứa tuổi. 3.2. Phạm vi nghiên cứu - Địa điểm lấy mẫu tại Cam Ranh và Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa. - Địa điểm xét nghiệm mẫu: Phân viện Thú y Miền Trung Nha Trang; Bộ môn Ký sinh trùng và bộ môn bệnh lý, Khoa chăn nuôi thú y, Đại học Nông Nghiệp Hà Nội. - Thời gian: Tháng 5/2014 – Tháng 5/2015 4. Ý nghĩa của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Đề tài là công trình nghiên cứu có hệ thống về Histomonas meleagridis bao gồm: Đặc điểm hình thái, cấu tạo, vòng đời; Bệnh tích đại thể và vi thể. Đây cũng là lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán bệnh. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Các kết quả của đề tài là cơ sở cho việc xây dựng biện pháp phòng chống bệnh do Histomonas meleagridis trên gà, nhằm giảm thiểu những tác động có hại, góp phần phát triển chăn nuôi theo hƣớng bền vững. 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Lịch sử bệnh do đơn bào Histomonas meleagridis trên thế giới và tại Việt Nam Bệnh đầu đen lần đầu tiên đƣợc phát hiện vào năm 1893 trên gà Tây ở Rhode Island. Bệnh đã gây ra nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi gà (McDougald, 2002). Tác giả Bold Smith (1895) đã nghiên cứu các tài liệu từ các ổ dịch bệnh ở Rhode Island và tạm đặt tên cho sinh vật gây bệnh là Amoeba meleagridis. Bệnh đầu đen sau đó nhanh chóng lan rộng xuống vùng ven biển phía Đông, miền Trung Tây và phía Tây khắp nƣớc Mỹ. Mặc dù nhu cầu về thịt gà cao nhƣng số lƣợng gà Tây giảm từ 11 triệu gia cầm trong năm 1890 (trƣớc khi bùng phát bệnh đầu đen đầu tiên) xuống mức trung bình 3,7 triệu gà Tây mỗi năm trong thập kỷ 1910 1920. Bệnh cũng đã xuất hiện và gây ra thiệt hại to lớn cho các đàn gà ở New England (McDougald, 2002a; Tyzzer, 1920). Các nhà nghiên cứu đã xem xét các tác nhân gây bệnh và cho rằng bệnh do một loại nấm gây ra, trong khi một số nhà nghiên cứu khác lại tin rằng đó là động vật đơn bào có tên Trichomonas (McDougald, 2002). Tyzzer (1920) lần đầu tiên chính thức mô tả về triệu chứng bệnh với những biểu hiện bất thƣờng ở da vùng đầu, ban đầu da có màu xanh tím sau đó nhanh chóng trở nên thâm đen và đặt tên là bệnh đầu đen (Blackhead disease), Tyzzer đã tách ra và đặt tên đơn bào là Histomonas meleagridis (Tyzzer, 1920a, 1920b). Trong thời gian này, bệnh nhanh chóng đƣợc phát hiện ở các khu vực khác nhƣ ở Đông Âu, Tây Âu, Nhật Bản...(McDougald, 2002). Trong khi ở Việt Nam, bệnh do đơn bào Histomonas meleagridis là bệnh còn khá mới mẻ đối với cán bộ thú y và ngƣời chăn nuôi gia cầm ở nƣớc ta nên bệnh chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều. Lê Văn Năm (2011) đã quan sát thấy hàng loạt đàn gà nuôi tập trung thả vƣờn tại một số tỉnh phía Bắc nhƣ Bắc Giang, Thái Nguyên, Hà Nội bị mắc bệnh. Ông cho biết các trang trại chăn nuôi gà thịt đang bị nhiễm giun kim rất nặng; mà giun kim đƣợc biết đến nhƣ một vector sinh học truyền bệnh Đầu đen. Vai trò của giun kim và trứng của nó cũng nhƣ trứng của giun đất đƣợc xem nhƣ vật mang ký sinh trong thời gian dài cảm nhiễm. 3 Kết quả khảo sát tình hình chăn nuôi và dịch bệnh tại 3 xã huyện Yên Thế (Bắc Giang) từ tháng 6/2011 – 3/2013 cho thấy tỷ lệ gà nuôi thả vƣờn nhiễm bệnh trên 20%. Cho tới nay, ở miền Trung và miền Nam bệnh cũng đã xuất hiện ở một số tỉnh nhƣ Phú Yên, Khánh Hòa, Đồng Nai.. (Lê Văn Năm, 2011; Nguyễn Hữu Nam và cộng sự, 2013). 1.2. Đặc điểm chung của Histomonas meleagridis 1.2.1. Hệ thống phân loại Đơn bào Histomonas meleagridis có hệ thống phân loại nhƣ sau (Adl và cộng sự, 2005; Cepicka và cộng sự, 2010): Giới: Protozoa Nghành: Sarcomastigophora Lớp: Zoomastigophora Bộ: Trichomonadida Họ: Monocercomonadidae Giống: Histomonas Loài: Histomonas meleagridis 1.2.2. Đặc điểm hình thái và cấu tạo Histomonas meleagridis là một loại đơn bào đa hình thái: Hình trùng roi (một roi), hình amip và hình lƣới hợp bào, tùy thuộc vào giai đoạn phát triển để có hình dạng tƣơng ứng phù hợp (Lê Văn Năm, 2011; McDougald, 2002). Histomonas meleagridis với hình amip có kích thƣớc 8 – 30 µm, hình roi thì có kích thƣớc từ 20 – 30 µm và bé nhất khi Histomonas meleagridis ở thể hình lƣới 5 – 10 µm, nhƣng ở thể hợp bào (bao gồm nhiều Histomonas meleagridis ở thể lƣới) thì chúng có kích thƣớc to cực đại đến 60 – 80 µm. Trong các dạng hình thái thì hình roi là phổ biến nhất và dễ nhận biết nhất bởi chúng có hai nhân (một nhân to và một nhân nhỏ), từ nhân to mọc ra một roi duy nhất, dạng này thƣờng tìm thấy trong phân gia cầm (Smith, 1895). 4 Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của Histomonas meleagridis (Milks, 1908) A, B: Histomonas meleagridis ở dạng hình amip C: Histomonas meleagridis ở dạng hình roi Tyzzer (1920a) và Zaragatzki (2010) đã nghiên cứu về hình thái học và mô tả sự tồn tại của Histomonas meleagridis có 3 giai đoạn khác biệt: - Giai đoạn 1: Đơn bào Histomonas meleagridis đƣợc quan sát thấy ở vùng ngoại vi khu vực bị tổn thƣơng. Chúng xuất hiện chân giả, có kích thƣớc 30 µm, trong các mô bào thì có dạng hình cầu và đƣờng kính khoảng 8 – 17 µm và chúng đều di động kiểu amip. Ở khu vực ngoại vi ký sinh trùng có sự phân bố của các hạt glycogen, khu vực trung tâm có thành phần chủ yếu là carbonhydrate. Lớp carbonhydrate vững chắc dƣới màng tế bào này cản trở sự xâm nhập của các hạt glycogen vào bên trong. Đồng thời lớp carbonhydrate này cũng có tác dụng giúp Histomonas meleagridis chống lại các điều kiện bất lợi trong một thời gian ngắn. Một số nghiên cứu cho thấy, cấu trúc đặc biệt này cho phép Histomonas meleagridis truyền nhanh và lây nhiễm với nhiều loài chim trong một thời gian khá ngắn. - Giai đoạn 2: Đơn bào Histomonas meleagridis giai đoạn này có kích thƣớc lớn hơn và khác nhau trong khoảng từ 12 - 21µm, đơn bào có các tế bào chất ƣa kiềm và một lƣợng nhỏ chất dạng lƣới hoặc dạng hạt ở xung quanh hạt nhân. - Giai đoạn 3: Đơn bào Histomonas meleagridis có kích thƣớc nhỏ hơn khoảng từ 5 – 22 µm và có sự xuất hiện của lớp màng kép giống với cấu trúc u nang của ký sinh trùng. Các tế bào kích thƣớc nhỏ ở giai đoạn này đƣợc đặc trƣng bởi cấu trúc dạng hạt khác nhau. Đơn bào Histomonas meleagridis chuyển động theo hai phƣơng thức xoắn vặn hoặc theo kiểu làn sóng và đơn bào có đời sống sống kỵ khí (Lê Văn Năm, 2011). 5 Về cấu tạo, đơn bào Histomonas meleagridis có từ một đến hai nhân và có hệ thống màng thay đổi, không có ty thể (ty thể đƣợc thay bằng hydrogenosomes) (Smith, 1895). Tƣơng tự nhƣ Giardia và Entamoeba, Histomonas meleagridis cũng tạo ra năng lƣợng kỵ khí bằng cách sử dụng hydrogenosomes để chuyển đổi pyruvate và malate thành hydrogen, acetate, carbon dioxide và ATP (Muller, 1909; Brown và cộng sự, 1998). Nguồn gốc của hydrogenosome chƣa đƣợc nghiên cứu rõ ràng nhƣng đã có những nhận định hydrogenosome có chung một tổ tiên với ty thể (Tachezy và cộng sự, 2001). Từ một số kết quả nghiên cứu thu đƣợc trƣớc đây của Zaragatzki và cộng sự (2010) thì thành phần tế bào đặc trƣng ở giai đoạn amip và hình cầu của Histomonas meleagridis có sự tồn tại của một nhân với một hạch nhân, bộ máy Golgi, mạng lƣới nội chất, hydrogenosomes, một roi duy nhất, có nhiều ribosome và một số lƣợng lớn hạt glycogen trong tế bào chất và không bào. 1.2.3. Chu trình sinh học Đơn bào Histomonas meleagridis gây bệnh cho gia cầm thông qua đƣờng ăn uống, khi gia cầm nuốt phải trứng giun kim Heterakis gallinarum có chứa Histomonas meleagridis. Sau khi đi xuống ruột của gia cầm, Histomonas meleagridis đƣợc giải phóng khỏi trứng giun, chui vào niêm mạc manh tràng, sinh sôi nảy nở qua hình thức phân đôi tạo ra nhiều Trophozoite và sinh sản mạnh nhất ở thể lƣới hay thể hợp bào. Một số Histomonas meleagridis tiếp tục phát triển cùng với sự phát triển của giun kim từ giai đoạn ấu trùng, qua giai đoạn giun non cho đến khi giun trƣởng thành ở manh tràng gà, đẻ trứng và từ đây chúng theo phân để thải trứng ra ngoài (Griffiths, 1978). Khi ra khỏi ký chủ, thể hình roi và thể amip Histomonas meleagridis chỉ sống đƣợc 24 h, trong khi đó ở thể lƣới chúng có thể tồn tại hàng năm trong trứng giun kim Heterakis gallinarum (Griffiths, 1978). Nhiệt độ là một yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng tồn tại và khả năng gây bệnh của Histomonas meleagridis. Histomonas meleagridis ở dạng hình roi không thể tồn tại trong môi trƣờng đông lạnh và chỉ có thể sống ở nhiệt độ 4°C trong vòng 23 giờ (Zaragatzki và cộng sự, 2010). 6