Tài liệu Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa trên địa bàn tỉnh thái bình và chế tạo thử nghiệm auto vaccine phòng bệnh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------------ TRẦN THỊ HUỆ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ BỆNH PHÙ ĐẦU Ở LỢN SAU CAI SỮA TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH THÁI BÌNH VÀ CHẾ TẠO THỬ NGHIỆM AUTO - VACCINE PHÒNG BỆNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thái Nguyên - 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn Ket-noi.com kho tai lieu mien phi ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------------ TRẦN THỊ HUỆ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ BỆNH PHÙ ĐẦU Ở LỢN SAU CAI SỮA TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH THÁI BÌNH VÀ CHẾ TẠO THỬ NGHIỆM AUTO - VACCINE PHÒNG BỆNH CHUYÊN NGÀNH: THÚ Y Mã Số: 60. 62. 50 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: TS. Đặng Xuân Bình Thái Nguyên- 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ. Tác giả Trần Thị Huệ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn Ket-noi.com kho tai lieu mien phi ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt 2 năm học tập, với nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể, đến nay luận văn của tôi đã hoàn thành. Nhân dịp này, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn và cảm ơn chân thành tới thầy giáo hướng dẫn TS. Đặng Xuân Bình đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới cán bộ, công nhân viên Bộ môn Công nghệ vi sinh – Viện Khoa học và sự sống - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Sau Đại học – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Tôi xin chân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Chi cục Thú y tỉnh Thái Bình, cán bộ trạm thú y và các trang trại, gia trại chăn nuôi lợn tại các huyện Hưng Hà, Kiến Xương,Thái Thụy tỉnh Thái Bình đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Trong quá trình thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự quan tâm, động viên sâu sắc của gia đình bạn bè và đồng nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành trước mọi sự giúp đỡ quý báu đó. Thái Bình, tháng 9 năm 2011 Tác giả Trần Thị Huệ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... ii MỤC LỤC ...................................................................................................iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................... vii DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................... viii MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................ 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.............................................................................. 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3 1.1. Đặc điểm bệnh phù đầu lợn .............................................................................. 3 1.2. Vai trò của vi khuẩn E. coli trong bệnh phù đầu lợn.......................................... 4 1.2.1. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn E. coli .......................................................... 4 1.2.2. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E. coli .......................................................... 8 1.2.3. Biện pháp phòng trị bệnh phù đầu lợn.......................................................... 15 1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ...................................................... 16 1.3.1. Tình hình nghiên cứu ở trong nước .............................................................. 16 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài .............................................................. 19 Chƣơng 2: NỘI DUNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U...... 22 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................. 22 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 22 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu .................................................................................... 22 2.1.3. Thời gian nghiên cứu ................................................................................... 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn Ket-noi.com kho tai lieu mien phi iv 2.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 22 2.2.1. Điều tra một số đặc điểm dịch tễ bệnh phù đầu lợn trên địa bàn tỉnh Thái Bình .. 22 2.2.2. Phân lập vi khuẩn E. coli từ những lợn mắc bệnh phù đầu ........................... 22 2.2.3. Chế tạo auto - vaccine phòng bệnh phù đầu lợn ........................................... 23 2.3. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 23 2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 23 2.4.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ .................................................................. 23 2.4.2. Thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn. ............................................................. 25 2.4.3. Xác địnhserotype kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn phân lập được .......... 27 2.4.4. Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được ....................................................................................... 28 2.4.5. Kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập trên chuột bạch .............. 31 2.4.6. Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được ...................................................................................................... 32 2.4.7. Chế tạo auto - vaccine .................................................................................. 32 2.4.8. Phương pháp tiêm phòng: ............................................................................ 35 2.4.9. Phương pháp xử lý số liệu............................................................................ 35 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CƢ́U VÀ THẢO LUẬN ................................ 36 3.1. Điều tra một số đặc điểm dị ch tễ bệnh phù đầu lợn nuôi trên địa bàn tỉnh Thái Bình .................................................................................................... 36 3.1.1. Tình hình bệnh phù đầu lợn trong các năm 2008, 2009, 2010 ...................... 36 3.1.2. Tình hình bệnh phù đầu theo địa điểm ......................................................... 37 3.1.3. Điều tra tình hình lợn chết do mắc bệnh phù đầu ......................................... 41 3.1.4. Điều tra tình hình lợn mắc bệnh phù đầu theo mùa ...................................... 44 3.1.5. Điều tra tình hình lợn mắc bệnh phù đầu theo lứa tuổi ................................. 46 3.2. Phân lập vi khuẩn E. coli từ mẫu bệnh phẩm lợn mắc bệnh phù đầu ............... 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn v 3.3. Giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của chủng vi khuẩn E. coli phân lập được .............................................................................................. 50 3.4. Xác định một số serotype kháng nguyên O của các chủng phân lập ................ 51 3.5. Xác định yếu tố bám dính của chủng vi khuẩn E. coli phân lập được .............. 53 3.6. Xác định khả năng gây dung huyết của chủng vi khuẩn E. coli phân lập được .... 54 3.7. Xác định khả năng sản sinh độc tố đường ruột của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được ....................................................................................... 55 3.8. Xác định độc lực của chủng vi khuẩn phân lập ............................................... 57 3.9. Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược của vi khuẩn E. coli phân lập được .............................................................................................. 58 3.10. Chế tạo và kiểm nghiệm auto - vaccine phòng bệnh phù đầu lợn .................. 61 3.10.1. Bồi dưỡng kháng nguyên phục vụ chế auto - vaccine ................................. 61 3.10.2. Kiểm tra đánh giá chất lượng auto - vaccine trong phòng thí nghiệm ......... 62 3.11. Thử nghiệm an toàn auto - vaccine trên lợn thí nghiệm ................................. 63 3.12. Khảo sát đáp ứng miễn dịch của lợn thí nghiệm sử dụng auto - vaccine ........ 64 3.13. Thử nghiệm khả năng bảo hộ lợn thí nghiệm của auto - vaccine với chủng E. coli phân lập............................................................................................ 65 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................. 67 1. Kết luận ............................................................................................................. 67 2. Đề nghị .............................................................................................................. 68 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ... 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 70 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn Ket-noi.com kho tai lieu mien phi vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Cs : Cộng sự CFU : Colony Forming Unit ĐC : Đối chứng E. : Escherichia EDP : Edema Disease Principle ETEC : Enterotoxigenic E. coli BHI : Brain Heart Infusion broth P : Độ tin cậy PCR : Polymerase Chain Reaction LT : Heat Labile toxins N : Dung lượng mẫu KHT : Kháng huyết thanh RR : Relative Risk PBS : Phosphate Buffered Saline ST : Heat Stable toxins Stx : Shiga toxin TN : Thí nghiệm VT : Verotoxin Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Tình hình bệnh phù đầu lợn trong các năm 2008, 2009, 2010 ................ 36 Bảng 3.2. Kết quả điều tra tình hình lợn mắc bệnh phù đầu tại 3 huyện thuộc tỉnh Thái Bình năm 2010 ........................................................................ 38 Bảng 3.3. So sánh nguy cơ mắc phù đầu lợn giữa các huyện tại tỉnh Thái Bình .............. 40 Bảng 3.4. Kết quả điều tra tình hình lợn chết do mắc bệnh phù đầu ....................... 41 Bảng 3.5. So sánh nguy cơ chết ở lợn mắc bệnh phù đầu sau cai sữa giữa các huyện ... 43 Bảng 3.6. Kết quả điều tra tình hình lợn mắc bệnh phù đầu theo mùa .................... 44 Bảng 3.7. Kết quả điều tra tình hình lợn mắc bệnh phù đầu theo lứa tuổi ............... 46 Bảng 3.8. Kết quả phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm lợn mắc bệnh phù đầu sau cai sữa... 48 Bảng 3.9. Kết quả giám định đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được ......................................................................................... 50 Bảng 3.10. Kết quả xác định serotype kháng nguyên O của vi khuẩn E. coli phân lập được ......................................................................................... 52 Bảng 3.11. Kết quả xác định yếu tố bám dính của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được ......................................................................................... 53 Bảng 3.12. Kết quả xác định khả năng gây dung huyết của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được .............................................................................. 54 Bảng 3.13. Kết quả xác định khả năng sản sinh độc tố của chủng vi khuẩn E. coli phân lập được .................................................................................. 56 Bảng 3.14. Kết quả thử độc lực của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập ............... 57 Bảng 3.15. Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hóa dược của vi khuẩn E. coli phân lập được .............................................................................. 59 Bảng 3.16. Kết quả bồi dưỡng kháng nguyên E. coli chế tạo auto - vaccine tại Thái Bình ..... 61 Bảng 3.17. Kết quả kiểm nghiệm chất lượng auto - vaccine trong phòng thí nghiệm ... 62 Bảng 3.18. Kết quả thử an toàn auto - vaccine ở lợn thí nghiệm ............................ 63 Bảng 3.19. Kết quả khảo sát hiệu giá kháng thể ở lợn thí nghiệm sau khi tiêm auto – vaccine ........................................................................................ 64 Bảng 3.20. Kết quả bảo hộ lợn thí nghiệm bằng auto – vaccine ............................. 65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn Ket-noi.com kho tai lieu mien phi viii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Cơ chế gây bệnh phù đầu lợn của E. coli (Bertschinger. H. U, Nielsen. N. O, 1992) ................................................................................ 9 Hình 2.1. Sơ đồ phân lập giám định vi khuẩn E. coli ............................................. 26 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả bảo hộ của vắc xin trên thực địa .................................................................................................. 35 Hình 3.1. Biểu đồ vể tỷ lệ mắc bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa tại 03 huyện của tỉnh Thái Bình ........................................................................................ 39 Hình 3.2. Biểu đồ về tỷ lệ lợn chết do mắc bệnh phù đầu ở 03 huyện của tỉnh Thái Bình ............................................................................................... 42 Hình 3.3. Biểu đồ về tỷ lệ mắc bệnh phù đầu lợn theo mùa vụ ............................... 45 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ mắc bệnh phù đầu theo lứa tuổi lợn ...................... 47 Hình 3.5. Biểu đồ về tỷ lệ phân lập vi khuẩn E. coli từ lợn mắc bệnh phù đầu ................ 49 Hình 3.6. Biểu đồ về tỷ lệ đề kháng của E. coli với từng loại kháng sinh. .............. 61 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Với phương thức đa dạng hóa vật nuôi tại các địa phương trên phạm vi cả nước, ngành chăn nuôi lợn của nước ta đã liên tục phát triển. Các sản phẩm từ chăn nuôi lợn đã đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng nội địa và xuất khẩu. Theo thông báo của Cục chăn nuôi [67], tính đến 1/4/2010 đàn lợn của cả nước có 27,3 triệu con, tăng 3,06% so với cùng kỳ năm 2009. Sản lượng thịt lợn hơi 6 tháng đầu năm 2010 đạt 1,77 triệu tấn. Các vùng có số đầu lợn nhiều là đồng bằng sông Hồng (7,2 triệu con); Khu vực Đông Bắc 4,6 triệu con); đồng bằng sông Cửu Long (3,6 triệu con); Bắc Trung Bộ (3,4 triệu con); miền Đông Nam Bộ (2,4 triệu con). Các tỉnh, thành phố có số đầu lợn lớn trên 1 triệu con là Hà Nội, Đồng Nai, Nghệ An, Bắc Giang và Thái Bình. Bên cạnh những kết quả đạt được, lợn nuôi tại Thái Bình thường xuyên mắc một số bệnh truyền nhiễm và ký sinh trùng, đặc biệt là bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa. Bệnh xảy ra gây thiệt hại kinh tế đáng kể do tỷ lệ chết khá cao, từ 40 - 100%, tập trung ở những lợn béo, khỏe ăn tốt nhất đàn. Lợn bệnh bị sốt 1 - 2 ngày sau đó thân nhiệt hạ, có khi dưới mức bình thường. Lợn bệnh bị sưng đầu, mí mắt. Do sưng hầu nên lợn bệnh giảm kêu, khó thở, có triệu chứng thần kinh như đi xoay vòng theo một chiều nhất định, yếu hai chân sau, nằm co giật, bốn chân giãy liên tục hoặc thẳng cứng trước khi chết. Mổ khám bệnh tích thấy ở tá tràng, ruột non có những đoạn tụ máu, xung huyết. Xuất phát từ tình hình thực tiễn sản xuất của nghề chăn nuôi lợn trên địa bàn tỉnh Thái Bình, căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm và năng lực nghiên cứu khoa học của Bộ môn Công nghệ vi sinh - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa trên địa bàn tỉnh Thái Bình và chế tạo thử nghiệm auto - vaccine phòng bệnh”. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn Ket-noi.com kho tai lieu mien phi 2 2. Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh phù đầu lợn tại tỉnh Thái Bình. - Chế tạo và thử nghiệm vắc xin tại chỗ (auto - vaccine) phòng bệnh phù đầu lợn. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Bổ sung tư liệu khoa học về đặc điểm dịch tễ bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa trên địa bàn tỉnh Thái Bình, đặc tính sinh vật học và yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli gây bệnh; kết quả chế tạo và thử nghiệm auto - vaccine phòng bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa sử dụng auto - vaccine. - Sử dụng auto - vaccine phòng bệnh phù đầu ở lợn sau cai sữa, tăng hiệu quả kinh tế chăn nuôi, góp phần phát triển bền vững nghề chăn nuôi lợn trên địa bàn tỉnh Thái Bình. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm bệnh phù đầu lợn Căn cứ các tài liệu nghiên cứu, bệnh phù đầu ở lợn con cai sữa được mô tả lần đầu tiên vào năm 1938 ở Châu Âu (Bertschinger. H. U, Nielsen. N. O, 1992) [39]. Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào cuối thập niên 60 của thế kỷ 20 và ngày càng gia tăng với sự phát triển của hình thức chăn nuôi công nghiệp tập trung (Đào Trọng Đạt và cs, 1996) [4]. Vi khuẩn E. coli gây bệnh phù đầu thường xuyên có mặt trong đường tiêu hóa của lợn với một số lượng rất nhỏ. Khi xuất hiện các yếu tố bất lợi với sức đề kháng cơ thể lợn như cai sữa, thay đổi thời tiết hoặc thức ăn, quần thể E. coli gây bệnh sẽ phát triển nhanh đến mức tạo ra một lượng lớn EDP (Edema Disease Principle) gây tổn thương thành mạch quản, làm thay đổi áp suất thẩm thấu dẫn đến phát sinh phù. Bệnh phù đầu thường xảy ra sau khi cai sữa 1 - 2 tuần và tuổi lợn con mắc bệnh thường gặp từ 4 - 12 tuần tuổi. Đôi khi bệnh phù đầu xuất hiện rất sớm có khi 4 ngày tuổi hoặc rất muộn ở lợn con. Bệnh phù đầu thường thấy xuất hiện ở những lợn con phát triển nhanh khỏe mạnh và thông thường những lợn con béo tốt nhất trong đàn mắc bệnh đầu tiên. Diễn biến của bệnh trong vòng 4 - 14 ngày. Tỷ lệ mắc bệnh trung bình khoảng 15% đàn lợn con và 30 - 40% số ổ lợn, tỷ lệ chết nằm trong khoảng 50 - 90%. Sức đề kháng đối với bệnh tật khác nhau phụ thuộc vào đặc tính di truyền của lợn. Những lợn dễ mẫn cảm với bệnh E. coli gây bệnh lưu trú và phát triển ở ruột non, sản sinh EDP (Edema Disease Principle) hấp thu vào máu gây tổn thương thành mạch quản (Bertschinger. H. U, Nielsen. N.O, 1992) [39]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn Ket-noi.com kho tai lieu mien phi 4 Các yếu tố stress tạo điều kiện cho bệnh phù đầu bùng phát sau khi cai sữa lợn con có thể là: - Tiêm chủng vắc xin. - Vận chuyển mua bán lợn con. - Sắp xếp lại đàn - Thay đổi thức ăn đột ngột - Biến động thời tiết làm cho lợn con bị lạnh. Bị lạnh đột ngột dẫn đến giảm nhu động ruột sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho E. coli gây bệnh và phát triển ở ruột non tới mức có thể gây bệnh. Đây là một yếu tố stress thường gặp cần được lưu ý đề phòng. Sự thừa dinh dưỡng cũng tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển ở ruột non. Vì vậy cần có chế độ chăm sóc nuôi dưỡng hợp lý đối với lợn con cai sữa. 1.2. Vai trò của vi khuẩn E. coli trong bệnh phù đầu lợn 1.2.1. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn E. coli Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1974) [22], trực khuẩn ruột già E. coli còn có tên gọi Bacterium coli commune, thuộc họ trực khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceace), loại vi khuẩn thường trú trong ruột già của động vật máu nóng, được Escherich phân lập từ phân trẻ em vào năm 1885. E. coli thường xuất hiện rất sớm ở phần ruột sau của người và động vật sơ sinh (sau khi đẻ 2h), ít khi ở dạ dày hoặc ruột non. Theo Quinn. P/J el al (1994) [63], E. coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, di động được do có lông, vi khuẩn không sinh nha bào, có giáp mô. Đường kính chiều ngang vi khuẩn dưới 1µm, chiều dài thay đổi, kích thước trung bình của tế bào vi khuẩn từ 0,3 - 0,6 x 2 - 3µm. Vi khuẩn bắt màu Gram âm (Gram negative). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 - Đặc tính nuôi cấy E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, có thể sinh trưởng, phát triển được từ 5 - 450C, pH từ 5,5 - 8, thích hợp ở 370C, pH = 7,2 - 7,4. Môi trường nước thịt: Phát triển tốt, môi trường đục, cặn màu tro lắng xuống đáy, có mùi Indol (phản ứng Indol dương tính). Trên môi trường thạch thường: vi khuẩn phát triển, sau 24 giờ tạo thành những khuẩn lạc dạng S, hơi vồng, tròn hơi nhẵn, đường kính 2 - 3 mm, màu xám nhạt. Môi trường thạch MacConkey: Hình thành những khuẩn lạc dạng S, màu đỏ cánh sen (do lên men đường lactoza, sinh hơi), (trên môi trường này khuẩn lạc Salmonella có màu trắng đục). - Môi trường thạch Brilliant green: Khuẩn lạc dạng S màu vàng chanh (trên môi trường này khuẩn lạc Salmonella màu đỏ). - Môi trường thạch Brilliant green: Khuẩn lạc dạng S màu vàng chanh (trên môi trường này khuẩn lạc Salmonella màu đỏ). - Môi trường thạch máu: Khuẩn lạc dạng S hoặc M (11 - 25%), có thể dung huyết hoặc không. Nếu nhuộm vi khuẩn từ khuẩn lạc nhày sẽ thấy giáp mô của vi khuẩn. - Môi trường thạch Deoxycholate citrat: Vi khuẩn E. coli không mọc do không sử dụng được nguồn cacbon từ citrat. - Môi trường thạch Triple Sugar Iron (TSI): Vi khuẩn phát triển nhưng không sản sinh H2S, không làm đen môi trường (vi khuẩn Salmonella sinh H2S nên làm đen môi trường). - Cấu trúc kháng nguyên Vi khuẩn E. coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp, ngoài 3 loại kháng nguyên thông thường, còn có thêm kháng nguyên bám dính F. Các độc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn Ket-noi.com kho tai lieu mien phi 6 tố Shiga E. coli sản xuất liên quan đến bệnh phù đầu nhất thường thuộc về 4 type huyết thanh đặc biệt: O138: K81: NM, O139: K12: H1, O141: K85ab: H4, và O141: K85ac: H4. - Kháng nguyên O (somatic) Có bản chất lipopolysaccharide, là thành phần cấu trúc của vách tế bào vi khuẩn. Khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết. Do vậy, kháng nguyên O (poly O) luôn được sử dụng để giám định đối với các chủng vi khuẩn E. coli sau khi phân lập. - Kháng nguyên K (capsule) Có bản chất polysaccharide, là giáp mô của vi khuẩn. Tỷ lệ số chủng E. coli tạo khuẩn lạc nhày (dạng M) chiếm 11 - 25%. Kháng nguyên K được coi là một trong các yếu tố độc lực của E. coli, có tác dụng kháng đại thực bào, bảo vệ sự toàn vẹn của vi khuẩn. Kháng nguyên K có hai nhiệm vụ sau: + Hỗ trợ trong phản ứng ngưng kết của kháng nguyên O, nên thường ghi liền công thức serotype của vi khuẩn là Ox: Ky như E. coli O139: K88, O149: K88… + Tạo ra hàng rào bảo vệ cho vi khuẩn chống lại tác động của ngoại cảnh và hiện tượng thực bào, yếu tố phòng vệ của vật chủ. - Kháng nguyên H (flagellar) Là thành phần lông của vi khuẩn, có bản chất protein, kém bền vững hơn so với kháng nguyên O. Kháng nguyên H không phải yếu tố độc lực của vi khuẩn, nhưng có khả năng tạo miễn dịch mạnh. Phản ứng miễn dịch xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O. Kháng nguyên H của vi khuẩn E. coli không có vai trò bám dính, không có tính độc và cũng không có ý nghĩa trong đáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít được quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có ý nghĩa rất lớn trong xác định giống loài của vi khuẩn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn 7 Phương pháp chế kháng nguyên lông (H): Vi khuẩn được nuôi cấy lắc trong môi trường flagellum broth (2% nước peptone, 1% cao thịt bò, 0,5% glucose), ở 370C trong 24h. Canh khuẩn sau khi tăng sinh được ly tâm với tốc độ 15.000 vòng/phút ở 40C trong 1h, loại bỏ dịch nổi, sau đó tiếp tục ly tâm, rửa cặn 3 lần bằng dung dịch PBS (Phosphate Buffered Saline), chắt bỏ dung dịch rửa và thu cặn vi khuẩn. Lông của vi khuẩn được tách bằng máy đồng nhất mẫu và thu hoạch bằng cách ly tâm tốc độ 10.000 vòng/phút ở 4 0C trong 30 phút rồi thu dịch nổi theo phương pháp của Fujita và cs, 1981) [47]. Kháng nguyên F (Fimbriae) Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu mô ruột và trên lớp màng nhày để xâm nhập và gây bệnh, đồng thời chống lại khả năng đào thải vi khuẩn của nhu động ruột. Yếu tố bám dính thay đổi theo điều kiện môi trường và khả năng biến dị của từng serotype. Chính yếu tố bám dính và độc tố tạo nên quá trình sinh bệnh của E. coli. Hầu hết các chủng E. coli gây bệnh đều sản sinh ra một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính như F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F41, F18, trong đó yếu tố bám dính F4 & F18 có vai trò quan trọng nhất trong quá trình gây bệnh ở lợn con. Các chủng không gây bệnh thì không có kháng nguyên bám dính. Cho đến nay, đã xác định có ít nhất 170 serotype kháng nguyên O, 70 serotype kháng nguyên K, 56 serotype kháng nguyên H và sự phát triển một cách nhanh chóng các kháng nguyên F. - Kháng nguyên độc tố Các chủng E. coli gây bệnh ở lợn con theo mẹ thường sản sinh độc tố đường ruột (Enterotoxin). Độc tố đường ruột có bản chất là protein ngoại bào (Exotoxin), có tác động gây độc trực tiếp trên tế bào biểu mô của ruột non (Nagy B, Fekete Pzx, 1999) [61]. Có hai loại độc tố, loại không chịu nhiệt (heat labile toxins, viết tắt là LT), bị vô hoạt ở 600C sau 15 phút và loại độc tố chịu nhiệt (heat stable toxins, viết tắt là ST), chịu được 100 0C trong 15 phút. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn Ket-noi.com kho tai lieu mien phi 8 1.2.2. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E. coli Vi khuẩn E. coli có sẵn trong ruột của động vật, bình thường vi khuẩn không gây tác hại trên ký chủ (103 CFU/g phân). Khi mật số tăng lên cao (106- 109 CFU/g phân) thì nó sẽ trở nên gây bệnh, bệnh thường xảy ra dưới ảnh hưởng của nhiều yếu tố: Dinh dưỡng, sự thiếu hụt kháng thể sữa đầu, khí hậu thời tiết, nhiệt độ, ẩm độ, trạng thái stress, loạn khuẩn đường ruột, sự có mặt của chủng E. coli mang yếu tố gây bệnh vv… Sự lây nhiễm chủ yếu là đường tiêu hóa thông qua thức ăn, nước uống. Thông thường môi trường axit của dạ dày là chất diệt khuẩn đối với E. coli , sự tăng lên của pH trong dạ dày được tìm thấy ở lợn con đã cai sữa ở giai đoạn 5 - 6 tuần tuổi so với những con lợn đang bú sữa có thể là nguyên nhân làm tăng số lượng E. coli tồn tại trong môi trường axit của dạ dày và đi vào ruột. Đây là một nhân tố quan trọng làm cho lợn sau cai sữa mẫn cảm đặc biệt với vi khuẩn E. coli. Sự lây nhiễm trong ruột non phụ thuộc vào khả năng chống lại các tác dụng tẩy sạch của chất tiết và nhu động. Các nghiên cứu về hình thái học cho rằng E. coli chiếm bề mặt niêm mạc của ruột non, đặc biệt là khoảng giữa hồi tràng và không tràng. Các nhân tố xác định sự tạo thành dịch ruột và dưỡng chấp, số lượng và các loại dinh dưỡng được hấp thụ và các cơ chế về tiêu hóa, thấm hút của đường tiêu hóa có liên quan đến sự chiếm giữ vi khuẩn E. coli. Sự tạo thành dịch ruột và dưỡng chấp có ảnh hưởng lớn đến loại và mật độ các vi khuẩn đường ruột. Sự dư thừa dinh dưỡng có thể là một yếu tố hỗ trợ cho sự chiếm giữ của E. coli. Các type E. coli gây bệnh phù đầu cho lợn thường tập trung vào một số type kháng nguyên O, như O138, O139 và O141, có khả năng gây dung huyết, sản sinh yếu tố bám dính F4, F5, F6, F18, F107, sản sinh độc tố đường ruột ST, LT và độc tố VT. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn 9 Để có thể gây bệnh, trước hết vi khuẩn E. coli thực hiện quá trình cố định vào tế bào nhung mao ruột bằng nhiều yếu tố bám dính. Sau đó nhờ khả năng xâm nhập, vi khuẩn sẽ xâm nhập vào tế bào biểu mô của thành ruột. Sản sinh VT gây tổn thương thành mạch, thay đổi áp suất thẩm thấu làm dịch thoát ra và tích tụ lại tổ chức cơ thể gây phù. Phù thũng thấy chủ yếu ở vùng đầu như mí mắt, vùng hầu làm thay đổi tiếng kêu của con vật; não bị phù thũng và chèn ép gây nhũn não, dẫn đến những triệu chứng thần kinh: những cơn co giật, 2 chân sau liệt, sau đó có những biểu hiện thần kinh nhẹ hay đâm đầu vào tường, đi lại không định hướng. Hình 1.1. Cơ chế gây bệnh phù đầu lợn của E. coli (Bertschinger. H. U, Nielsen. N. O, 1992) [39] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn Ket-noi.com kho tai lieu mien phi 10 Các yếu tố gây bệnh của E. coli bao gồm khả năng kháng khuẩn, yếu tố bám dính, khả năng xâm nhập, yếu tố dung huyết và khả năng sản xuất độc tố. Các chủng vi khuẩn E. coli không có các yếu tố trên thì không có khả năng gây bệnh. Dựa vào các yếu tố gây bệnh nói trên, người ta đã phân loại vi khuẩn E. coli thành các loại sau: Enterotoxigenic E. coli (ETEC), Enteropathogenic E. coli (EPEC), Adherence Enterotoxigenic E. coli (AEEC) và Verotoxingenic E. coli (VTEC) (Lê Văn Tạo, 1997) [26]. * Yếu tố kháng khuẩn: Nhiều chủng vi khuẩn E. coli có khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác gọi là Colicin. Vì vậy, yếu tố này cũng được coi là một trong các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli gây bệnh (Smith. H. W và cs, 1967) [65]. Trong điều kiện bình thường, các chủng E. coli không độc tạo Colicin ức chế sự phát triển của các chủng E. coli gây bệnh; ngược lại Colicin của các chủng E. coli độc lực cao lại ức chế sự phát triển của các chủng E. coli khác. Quá trình tạo Colicin là một đặc tính di truyền ổn định của các chủng E. coli. Đặng Xuân Bình và cs (2008) [2] đã xác định yếu tố cạnh tranh Colicin ở các chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh phân trắng lợn con tại Thái Nguyên, Hà Tây cũ (Hà Nội), Cao Bằng, Bắc Ninh chiếm tỷ lệ chung 26,5%. * Yếu tố bám dính: Để gây bệnh, các chủng VTEC phải bám dính lên trên tế bào biểu mô của ruột non. Hầu hết các chủng VTEC đều mang 1 hoặc nhiều yếu tố bám dính như F4, F5, F6, F107.… Ở lợn sau cai sữa mắc bệnh phù đầu thường mang các yếu tố bám dính sau: - F4: Hay còn gọi là K88, là một kháng nguyên không chịu nhiệt. Bằng các phương pháp huyết thanh học cho thấy có ít nhất 3 loại biến thể khác nhau của F4 là F4ab, F4ac và F4ad (Orkov và cs (1964) [62] và Guinee và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn