Tài liệu Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà shan tuyết hà giang

MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 1.Lý do chọn đề tài ................................................................................................. 10 2.Mục đích nghiên cứu ........................................................................................... 11 3.Nhiệm vụ nghiên cứu .......................................................................................... 11 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ..................................................................... 11 5. Những đóng góp mới của của đề tài ................................................................. 11 6. Phương pháp nghiên cứu................................................................................... 12 NỘI DUNG.............................................................................................................. 13 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 13 1.1. Giới thiệu về kombucha .................................................................................. 13 1.1.1. Nguồn gốc ...................................................................................................... 13 1.1.2. Đặc điểm cấu tạo ........................................................................................... 13 1.1.3. Hệ vi sinh vật trong kombucha ..................................................................... 14 1.1.3.1. Acetobacter ................................................................................................. 14 1.1.3.2. Nấm men ..................................................................................................... 15 1.1.3.3. Giống vi khuẩn lên men lactic ................................................................... 18 1.2. Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha ....................................... 19 1.3. Giới thiệu về trà lên men kombucha ............................................................. 23 1.3.1. Thành phần của trà đường lên men ............................................................ 23 1.3.2. Công dụng của trà đường lên men............................................................... 23 1.3.3. Một số lưu ý khi sử dụng .............................................................................. 25 1.4. Nguyên liệu....................................................................................................... 25 1.4.1. Đặc điểm của trà ........................................................................................... 25 1.4.1.1. Nguồn gốc và đặc tính thực vật ................................................................. 25 1.4.1.2. Phương pháp sản xuất trà xanh ................................................................ 26 1.4.1.3. Đặc điểm của trà xanh ............................................................................... 26 1.4.1.4. Chỉ tiêu đánh giá chất lượng trà xanh ...................................................... 27 1.4.2. Đặc điểm của trà Shan truyết Hà Giang ...................................................... 28 1.5. Tình hình nghiên cứu kombucha ở trong và ngoài nước ............................ 30 1.5.1. Trên thế giới .................................................................................................. 30 1.5.2. Ở Việt Nam .................................................................................................... 32 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 35 2.1. Nguyên liệu, thiết bị, hóa chất ........................................................................ 35 2.1.1. Nguyên liệu chính ......................................................................................... 35 2.1.2. Hóa chất và thiết bị ....................................................................................... 35 2.1.3. Các loại môi trường ...................................................................................... 36 2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................ 36 2.2.1. Phương pháp vi sinh ..................................................................................... 36 2.2.1.1. Phương pháp phân lập nấm men và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram .................................................................................................... 36 2.2.1.2. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật .................................. 37 2.2.1.3. Bảo quản chủng giống ............................................................................... 38 2.2.1.4. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men ......................... 38 2.2.2. Phương pháp hóa sinh .................................................................................. 38 2.2.2.1. Xác định đường khử ................................................................................. 38 2.2.2.2. Xác định độ cồn ......................................................................................... 41 2.2.2.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh dưỡng khoáng đến quá trình lên men kombucha ................................................. 42 2.2.2.4. Phương pháp xác định khả năng lên men các loại đường ...................... 43 2.2.2.5. Phương pháp xác định khả năng hình thành hợp chất loại tinh bột ...... 43 2.2.2.6. Phương pháp nghiên cứu sự sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường cao ................................................................................................................ 44 2.2.3. Phương pháp cảm quan ................................................................................ 44 2.2.4. Xử lí số liệu bằng thống kê toán học ............................................................ 46 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN............................. 48 3.1. Phân lập và sơ bộ định loại chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang ................................................................ 48 3.1.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men kombucha....................... 48 3.1.2. Định loại sơ bộ chủng nấm men có khả năng lên men kombucha ............ 49 3.1.2.1. Hình thái tế bào học và hình thức sinh sản của các chủng nấm men .... 49 3.1.2.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa và thạch nghiêng ....................... 50 3.1.2.3. Một số đặc tính sinh hóa của các chủng nấm men .................................. 51 3.2. Tuyển chọn chủng nấm men lên men kombucha ......................................... 51 3.2.1. Hoạt lực lên men .......................................................................................... 52 3.2.2. Chất lượng cảm quan của kombucha được lên men từ 5 chủng ............... 53 3.3. Động thái phát triển của hai chủng nấm men M1, M2 ................................ 53 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển của 2 chủng nấm men M1 và M2 trong môi trường lên men ....... 55 3.4.1. Ảnh hưởng của hàm lượng đường glucose ................................................. 56 3.4.2. Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 .......................................................................... 59 3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ MgSO4.7H2O................................... 60 3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với quá trình lên men kombucha........................................................................................................ 61 3.5.1.Ảnh hưởng của hàm lượng men giống ......................................................... 61 3.5.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu ......................................................................... 63 3.5.3.Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men tới quá trình lên men .............................. 64 3.6. Xây dựng quy trình lên men kombucha ....................................................... 65 3.6.1. Quy trình lên men kombucha quy mô gia đình ........................................... 65 3.6.2. Xây dựng quy trình lên men kombucha quy mô PTN ................................. 66 3.6.3. Kiểm tra, đánh giá chất lượng sản phẩm..................................................... 70 3.6.3.1. Đánh giá chất lượng sản phẩm kombucha bằng phương pháp cảm quan ......................................................................................................................... 70 3.6.3.2. Kiểm tra chất lượng sản phẩm .................................................................. 70 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 72 1. KẾT LUẬN ......................................................................................................... 72 2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 73 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị và các bạn. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung – Người đã trực tiếp hướng dẫn, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban Giám hiệu Trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh, các thầy cô giáo và các anh chị, sinh viên trong phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Sinh đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất và những kiến thức cơ bản phục vụ cho mục đích nghiên cứu của tôi. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những người thân trong gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng 7 năm 2013 Học viên Lâm Thị Hồng Liên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật. Đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả đã công bố. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, ngày 12 tháng 7 năm 2013 Học viên Lâm Thị Hồng Liên DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CLCQ: Chất lượng cảm quan MT: Môi trường Nxb: Nhà xuất bản TP: Thành phố TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam ĐHSP: HG: Đại học sư phạm Hà Giang DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các chỉ tiêu cảm quan của trà xanh ................................................... 27 Bảng 1.2.: Các chỉ tiêu hoá lý của trà xanh ........................................................ 28 Bảng 2.1. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha ..................... 45 Bảng 2.2. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu ................................................... 46 Bảng 2.3 . Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm........................... 46 Bảng 3.1. Đặc điểm sinh hóa của các chủng nấm men...................................... 51 Bảng 3.2. Hàm lượng khí CO 2 giải phóng sau 7 ngày lên men của 5 chủng nấm men............................................................................................................ 52 Bảng 3.3. Chất lượng cảm quan của các chủng nấm men……………………...44 Bảng 3.4. Động thái phát triển của 2 chủng nấm men M1, M2 ........................... 54 Bảng 3.5. Hàm lượng ethanol, hàm lượng đường khử, độ pH trong dịch lên men của hai chủng M1, M2 ................................................................................ 46 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men của chủng nấm men M1 ...................................................................................................... 56 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men của chủng nấm men M2 ...................................................................................................... 57 Bảng 3.8. Khả năng lên men của chủng M1 trên môi trường có hàm lượng (NH4)2SO4 ở các mức khác nhau. ...................................................................... 59 Bảng 3.9. Khả năng lên men của chủng M2 trên môi trường có hàm lượng (NH4)2SO4 ở các mức khác nhau. ...................................................................... 60 Bảng 3.10. Khả năng lên men của chủng M1 trên môi trường có hàm lượng MgSO4.7H2O khác nhau .................................................................................... 60 Bảng 3.11. Khả năng lên men của chủng M1 trên môi trường có hàm lượng MgSO4.7H2O khác nhau .................................................................................... 61 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tỷ lệ men giống M1 tới quá trình lên men kombucha…………………………...………………………………….53 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tỷ lệ men giống tới quá trình lên men kombucha……………………...……………………………………….53 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men kombucha……...54 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men…………….55 Bảng 3.16 . Đánh giá chất lượng sản phẩm kombucha bằng phương pháp cảm quan ………………………………………………………………………….70 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Kombucha…………………………………………………………..5 Hình 1.2. Lớp màng kombucha…………………………………………….....5 Hình 1.3. Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men ....... …….……….20 Hình 1.4. Cây chè cổ thụ Shan tuyết Hà Giang……………………….…….20 Hình 1.5. Chè cổ thụ Shan tuyết Hà Giang…………………………….……20 Hình 3.1. Tế bào nấm men M1 và M2 trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần………………………………………………………….............40 Hình 3.2. Sinh sản nảy chồi và phân cắt ở nấm men……………………..…40 Hình 3.3. Ảnh chụp khuẩn lạc chủng nấm men M1, M2 trên môi trường thạch đĩa……………………………………………………………………….……41 Hình 3.4. Ảnh chụp chủng nấm men M1, M2 trên môi trường thạch nghiêng41 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường sót trong dịch lên men ở các hàm lượng đường khác nhau của chủng nấm men M1, M2………….…………...48 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn hàm lượng ethanol sinh ra trong dung dịch lên men ở các hàm lượng đường khác nhau của chủng nấm men M1 và M2……......49 Hình 3.7. Kết quả thử nghiệm đánh giá sản phẩm kombucha……………….62 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Uống trà là một thú vui tao nhã, một nét văn hóa cổ truyền của người Á Đông nói chung và người Việt Nam nói riêng. Bây giờ văn hóa uống trà cũng có nhiều thay đổi với nhiều chủng loại trà khác nhau, mỗi hương vị lại có một nét đặc trưng riêng. Trước đây đơn giản chỉ có trà xanh, ngày nay với sự phát triển cao về chất lượng cuộc sống đã cho ra nhiều loại trà không những có hương vị thơm từ các loại hoa mà nó còn có tác dụng cho sức khỏe. Hiện nay ở nước ta đang xuất hiện một loại thuốc bổ ở dạng lỏng như trà mà mọi người gọi là trà "thủy sâm" hay còn gọi là kombucha. Thực ra đây chính là một loại thức uống có từ rất lâu được gọi tên là "The Remedy for Immortality" nghĩa là "Phương thuốc Trường sinh". Thủy sâm thực sự chỉ là một loại cái giấm phát triển dưới dạng một váng nhầy dày và dai, màu trắng. Loại giấm này sinh sôi nhanh trong môi trường nước chè (trà) pha đường. Thành phần trà kombucha có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ. Vì đây là sản phẩm lên men nên chứa khoảng 0,5-1% cồn, acid axetic, acid gluconic, acid glycuronic, acid L-lactic, acid cacbonic, acid caprilic, acid xitric, acid oxalic, acid usnic, nhiều vitamin nhóm B như B1, B2, B3, B5, B6, B12, vitamin C, acid folic, amino acid và một số hợp chất có tác dụng kháng sinh, sát trùng và giải độc. Kombucha còn chứa một lượng nhỏ cafein vì nó được lên men từ các loại trà như trà xanh, trà đen, trà ô long. Ở Việt Nam, trên thị trường đã có bán các loại kombucha dưới dạng đóng chai, đồ hộp, nước giải khát nhập khẩu từ nước ngoài. Trên thế giới, đã có rất nhiều nghiên cứu về kombucha như: các nghiên cứu về thành phần các chất, vitamin có trong kombucha; tác dụng của kombucha trong việc bảo vệ cơ thể con người tránh các tác hại của hóa chất, tia phóng xạ; các nghiên cứu về sự cố định đạm của một số chủng vi khuẩn được phân lập từ kombucha. Tuy nhiên, ở Việt Nam các công trình nghiên cứu về kombucha vẫn chưa đầy đủ, hoàn chỉnh. Đặc biệt là về khu hệ nấm men cũng như những nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với quá trình lên men kombucha. Do đó, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang’’. Trên cơ sở nghiên cứu này có thể lựa chọn được các chủng nấm men dùng cho lên men kombucha. 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 3.1. Phân lập và sơ bộ định loại một số chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang. 3.2. Tuyển chọn chủng nấm men lên men kombucha. 3.3. Động thái phát triển của hai chủng nấm men M1, M2 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển của 2 chủng nấm men M1 và M2 trong môi trường lên men. 3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với quá trình lên men kombucha. 3.6. Xây dựng quy trình sản xuất kombucha. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Các chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang. 5. Những đóng góp mới của của đề tài Là công trình nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về kombucha trên đối tượng trà Shan tuyết Hà Giang. Đặc biệt, đã tiến hành phân lập, tuyển chọn được chủng nấm men có khả năng lên men kombucha. Từ đó, xây dựng quy trình công nghệ lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm. 6. Phương pháp nghiên cứu 6.1. Phương pháp vi sinh: gồm có phương pháp phân lập nấm men và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram; Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật; Bảo quản chủng giống; Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men. 6.2. Phương pháp hóa sinh: bao gồm phương pháp Xác định hàm lượng đường khử; Xác định độ cồn; Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh dưỡng khoáng đến quá trình lên men kombucha. 6.3. Phương pháp cảm quan 6.4. Xử lí số liệu bằng thống kê toán học. NỘI DUNG CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về kombucha 1.1.1. Nguồn gốc Kombucha đã được sử dụng phổ biến qua hơn 200 năm ở vùng Viễn Đông và khoảng hơn 100 năm ở Đông Âu. Một số tài liệu ghi chép cho thấy có một số cư dân sống tại vùng Caucase đã thọ trên trăm tuổi. Những người sống trường thọ như vậy còn tìm thấy tại một số làng mạc ở Poltaya, Ukraine, Tây Tạng và Tây Ban Nha. Những người trường thọ ở Nga cho biết họ sống lâu như vậy nhờ từ hàng trăm năm nay họ có thói quen dùng loại trà lên men kombucha. Thời xưa người Kargasoks tin tưởng rằng trà nấm này có tác dụng giúp họ được sống khỏe và kéo dài tuổi xuân. Cho nên khi một nữ du khách quý tộc người Nhật đến thăm thắng cảnh ở làng Kargasok, trông thấy những người già ở đây khoẻ mạnh lạ thường, gương mặt họ không có nếp nhăn và ít lộ vẻ già nua. Bà lấy làm ngạc nhiên và hỏi rõ thì được biết dân chúng ở đây có thói quen uống kombucha hằng ngày. Bà đã xin một ít nấm để làm giống và mang về Nhật rồi sau đó chia với bạn bè cùng sử dụng. Sau nhiều tuần lễ, các bạn của bà đều vô cùng khen ngợi về sự hữu hiệu của loại nấm này. Có người bảo rằng họ đã hết bệnh huyết áp cao, vết nhăn trên da đã nhạt mờ, tóc bạc trở lại đen từ từ. Do đó trà nấm này được truyền bá khắp cả Nhật Bản [49]. 1.1.2. Đặc điểm cấu tạo Kombucha là môi trường cộng sinh của vi khuẩn và nấm men. Hệ vi sinh vật trong kombucha rất phong phú, chủ yếu là các chủng Acetobacter như: Acetobacter xylinum, Acetobacter ketogenum…và nấm men: Saccharomycodes ludwigii, Saccharomycodes apiculatus, Saccharomyces cerevisiae… Ngoài ra còn có thể có các chủng Lactobacillus, Brettanomyces, Pediococcus, Bacterium gluconicum…Chính sự có mặt của các chủng Acetobacter (đặc biệt là Acetobacter xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha. Acetobacter xylinum có khả năng tạo màng hemicellulose khá dày và chắc, tạo màu xanh với thuốc nhuộm Iod và H2SO4. Kombucha còn được gọi là nấm trà. Chúng sinh trưởng tốt trong môi trường nước trà đường. Bởi vậy, thường được sử dụng để lên men dung dịch trà đường, nên gọi là nấm trà. Trong quá trình lên men kombucha sẽ tạo ra một lớp màng mỏng trên bề mặt dịch trà và dần dần tăng bề dày, hình thành nên một kombucha thứ hai (thường gọi là kombucha con) tách biệt với kombucha ban đầu. Hình dạng và kích thước của kombucha phụ thuộc vào hình dạng tiết diện của bình chứa [49], [53]. Hình 1.1. Kombucha Hình 1.2. Lớp màng kombucha 1.1.3. Hệ vi sinh vật trong kombucha 1.1.3.1. Acetobacter Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadaceae, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể phân lập được các vi khuẩn này từ không khí, đất, nước, lương thực thực phẩm, giấm, rượu, bia, hoa quả… Có khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có ý nghĩa kinh tế. * Đặc điểm chung của chủng Acetobacter Chủng Acetobacter có dạng hình que, tùy điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các tế bào có hình thái khác biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra. Kích thước thay đổi tùy loài (0.3-0.6 x 1.0-8.0μm). Có thể di động (có tiên mao đơn hoặc chu mao) hoặc không di động (không có tiên mao). Hiếu khí bắt buộc, chịu được độ acid cao. Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng hoá nhiều nguồn thức ăn cacbon khác nhau nhưng không sử dụng được tinh bột. Tế bào đứng riêng lẽ hoặc kết thành từng chuỗi. Có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng, khả năng tạo thành váng thay đổi tùy loại: Acetobacter xylinum: tạo thành váng cellulose khá dày và chắc. Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhưng chắc. Acetobacter pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo. Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng dễ tan rã. Acetobacter có khả năng đồng hoá muối (NH4)+ và phân giải pepton. Một số loài đòi hỏi một số acid amin nhất định như acid pantothenic và các chất khoáng K, Mg, Ca, Fe, P, S …ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất hữu cơ. Do đó bia, dịch tự phân nấm men, nước mạch nha, nước trái cây…là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của vi khuẩn Acetobacter. Ngoài khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic, một số loài Acetobacter còn tổng hợp được vitamin B1, vitamin B2, oxy hoá sorbit thành đường sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C) [4], [53]. 1.1.3.2. Nấm men * Hình thái và cấu tạo tế bào Tế bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ… kích thước rất lớn gấp từ 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thước trung bình: Chiều dài: 9 – 10μm, chiều rộng: 2 – 7μm. Hình dạng và kích thước tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau. Nấm men là sinh vật đơn bào, tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bản như: glucan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như kitin…. Màng nguyên sinh chất: gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipit, enzyme permeaza…Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nước, protit, gluxit, lipit và các muối khoáng, enzyme và có các cơ quan trong đó. Nhân tế bào và những thành phần cơ quan con khác: không bào, ty lạp thể, riboxom,…[4], [53]. * Sự sinh sản của nấm men Nấm men có một số hình thức sinh sản: nảy chồi; phân đôi; sinh sản bằng bào tử và hình thành bào tử (tiếp hợp đẳng giao; tiếp hợp dị giao; sinh sản đơn tính) [4]. * Phân loại nấm men Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungi imporfecti) [4], [53]. Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces; Giống Endomyces; Giống Schizosaccharomyces Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti): Crytococus (toscula, tornlopsis); Mycoderma; Candida; Geotrichum (đã được xếp vào lớp nấm mốc); Rhodotorula. * Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men Nấm men cũng như các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, cacbon, nitơ, phospho, kali, magiê…[4], [53]. Dinh dưỡng cacbon: nguồn cacbon cung cấp là các loại đường khác nhau: saccharose, maltose, lactose, glucose…Dinh dưỡng oxy, hydro: được cung cấp cho tế bào từ nước của môi trường nuôi cấy hay dịch. Dinh dưỡng nitơ: nấm men không có men ngoại bào để phân giải protein, nên không thể phân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Dạng hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton, amid, urê. Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat…Các vitamin và chất khoáng: Chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống của nấm men. Phospho: có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều enzyme của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo ra liên kết có năng lượng lớn. Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số acid amin, albumin, vitamin và enzyme. Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men. Sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác. Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men, tham gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin hóa của acid pyruvic. Mangan: đóng vai trò tương tự như magiê. * Cơ chế vận chuyển các chất dinh dưỡng vào trong tế bào nấm men Nấm men hoàn toàn không có cơ quan dinh dưỡng riêng biệt, các chất dinh dưỡng mà nó sử dụng chủ yếu được vận chuyển qua thành tế bào theo hai con đường cơ bản. Thẩm thấu bị động: trên thành tế bào nấm men có những lỗ nhỏ, những lỗ này có tác dụng làm cho chất dinh dưỡng vận chuyển vào trong tế bào từ môi trường bên ngoài nhờ áp suất thẩm thấu, ngược lại chất thải trong quá trình trao đổi cũng được thải ra theo con đường này. Hấp thu chủ động: các thành phần dinh dưỡng không có khả năng xâm nhập vào tế bào theo con đường thứ nhất thì lập tức có hệ permeaza hoạt hóa. Permeaza là một protein hoạt động, chúng liên kết với chất dinh dưỡng tạo thành hợp chất và hợp chất này chui qua thành tế bào trong, tại đây chúng lại tách ra và permeaza lại tiếp tục vận chuyển tiếp [53]. * Quá trình sinh trưởng và phát triển Trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm men tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều. Các nấm men sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh khối rất lớn sau một thời gian ngắn. Trong trường hợp sinh sản theo phương pháp này thì trong dịch nuôi cấy sẽ không có tế bào già. Vì rằng tế bào được phân chia thành hai, cứ như vậy tế bào lúc nào cũng ở trạng thái đang phát triển. Tế bào chỉ già khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế bào không có khả năng sinh sản nữa. Tuy nhiên đa số nấm men sinh sản bằng phương pháp nảy chồi nên hiện tượng phát hiện tế bào già rất rõ. Khi chồi non tách khỏi tế bào mẹ để sống độc lập thì nơi tách đó trên tế bào mẹ tạo thành một vết sẹo. Vết sẹo này sẽ không có khả năng tạo ra chồi mới. Cứ như vậy tế bào mẹ sẽ chuyển thành tế bào già theo thời gian [4], [53]. Để xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời gian hiện nay người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như: xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi hay trên mặt thạch. Đo độ đục của tế bào trong dung dịch nuôi cấy trên cơ sở xây dựng một đồ thị chuẩn của mật độ tế bào [4]. Quá trình sinh trưởng của nấm men trong nuôi cấy không liên tục sinh trưởng theo một đường cong gồm 4 pha: pha tiềm phát (pha lag): nấm men thích nghi với môi trường, số lượng tế bào chưa tăng. Pha lũy thừa (pha log): nấm men sinh trưởng với tốc độ lớn nhất và không đổi, số lượng tế bào trong quần thể tăng lên rất nhanh. Pha cân bằng: số lượng nấm men đạt cực đại và không đổi theo thời gian. Pha suy vong: số tế bào trong quần thể giảm dần do tế bào trong quần thể bị phân hủy ngày càng nhiều, chất dinh dưỡng cạn kiệt. 1.1.3.3. Giống vi khuẩn lên men lactic Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium. Đây là những trực khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện. Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột. Sự phát triển của nó cần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon. Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15 ÷ 500C. Tuy nhiên mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn [53]. 1.2. Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quá trình lên men dịch trà có thể xảy ra như sau: * Lên men ethanol (len men rượu): Hình 1.3. Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men