Tài liệu Nghiên cứu mối liên quan giữa số lượng, chất lượng tinh trùng trước và sau lọc rửa với tỷ lệ có thai của kỹ thuật iui tại bệnh viện trường đại học y hà nội.

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong cuộc sống của mỗi người, gia đình và con cái luôn là nguồn hạnh phúc chính và là động lực của sự trường tồn nòi giống. Khi một cặp vợ chồng không thể thực hiện chức năng sinh sản họ sẽ phải đối mặt với nhiều áp lực của gia đình và xã hội. Vì vậy vô sinh (VS) không đơn thuần là một loại bệnh lý của y học mà còn là vấn đề lớn của xã hội. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), VS là tình trạng không có thai sau một năm chung sống vợ chồng, sinh hoạt tình dục đều đặn và không sử dụng bất kỳ biện pháp tránh thai nào [1]. Tùy theo từng nước tỉ lệ này thay đổi từ 10% - 18%. Ở Việt Nam tỷ lệ VS ngày càng tăng cao. Tỷ lệ này theo Nguyễn Khắc Liêu là 13%, trong đó nguyên nhân do chồng là 40%, do vợ là 40% số còn lại là không rõ nguyên nhân[2]. Bơm tinh trùng vào buồng tử cung (Intra Uterine Insemination - IUI) có hoặc không kích thích buồng trứng kèm theo thường là phương pháp điều trị đầu tiên và được áp dụng rộng rãi với các hướng dẫn về chỉ định cho những cặp vợ chồng vô sinh không rõ nguyên nhân, có kháng thể kháng tinh trùng, lạc nội mạc tử cung nhẹ, vô sinh do thiểu hoặc nhược tinh nhẹ...IUI là phương pháp điều trị rẻ hơn, ít xâm lấn hơn, đơn giản hơn trước khi thực hiện các phương pháp khác cho những bệnh nhân vô sinh như ICSI, IVF... Trên thế giới phương pháp thụ tinh nhân tạo bằng cách bơm tinh trùng (TT) tươi vào buồng tử cung (BTC) đã được đề cập từ nhiều năm nay. Từ những năm 1970 - 1980 kỹ thuật IUI sử dụng TT đã được lọc rửa được áp dụng đã làm thay đổi hẳn bộ mặt của kĩ thuật thụ tinh nhân tạo, đặc biệt là các ưu điểm về kĩ thuật và mức độ an toàn của nó so với các phương pháp bơm tinh dịch tươi. Trong các nghiên cứu trước đây tỷ lệ có thai của IUI thay đổi theo tiêu chí lựa chọn bệnh nhân, sự hiện diện của các yếu tố vô sinh khác 2 nhau, phương pháp kích thích buồng trứng, số chu kỳ tiến hành, các tham số của tinh dịch trước và sau chuẩn bị, phương pháp chuẩn bị tinh trùng…[3-10]. Ở Việt Nam hiện nay, phương pháp nàyđã được triển khai rộng rãi đến tuyến tỉnh và các trung tâm y tế có cán bộ được đào tạo và có đủ trang thiết bị đáp ứng cho kỹ thuật này. Nguyễn Xuân Bái và cộng sự (2012) nghiên cứu tại trung tâm công nghệ phôi - Học viện Quân Y thấy tỷ lệ có thai là 9,7% và tỷ lệ này có mối liên hệ với số lượng và chất lượng của TT người chồng[8]. Theo Đỗ Tiến Dũng (2012) tỷ lệ có thai là 17,7% trong đó nguyên nhân do chồng (TT yếu, bất thường phóng tinh) chiếm 15,8%[11]. Bệnh viện Trường Đại học Y Hà Nội đã triển khai phương pháp điều trị này từ năm 2012, tuy nhiên chưa có một nghiên cứu nào thống kê, đánh giá kết quả của phương pháp và mối liên quan với số lượng và chất lượng của tinh trùng. Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài với mục tiêu nghiên cứu là: 1. Đánh giá đặc điểm mẫu tinh dịch trước và sau lọc rửa của bệnh nhân điều trị vô sinh tại Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. 2. Nhận xét kết quả và một số yếu tố liên quan của kỹ thuật bơm tinh trùng đã lọc rửa vào buồng tử cung. 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1. Định nghĩa, tình hình và nguyên nhân vô sinh 1.1.1. Định nghĩa về vô sinh Theo Tổ chức Y tế thế giới, VS là tình trạng không có thai sau một năm chung sống vợ chồng, sinh hoạt tình dục đều đặn và không sử dụng bất kỳ biện pháp tránh thai nào [1]. Đối với những trường hợp mà nguyên nhân VS đã tương đối rõ ràng thì việc tính thời gian không còn được đặt ra. Ví dụ phụ nữ vô kinh, đàn ông liệt dương, hoặc với các cặp vợ chồng mà vợ trên 35 tuổi, sau 6 tháng mong muốn có con mà không có thai cũng đã được coi là VS, cần được khám và điều trị sớm. VS nguyên phát (VS I) là chưa có thai lần nào, còn VS thứ phát (VS II) là trong tiền sử đã từng có thai ít nhất 1 lần. VS nam là VS có nguyên nhân hoàn toàn do người chồng, VS nữ là khi nguyên nhân hoàn toàn do người vợ. VS không rõ nguyên nhân là trường hợp khám và làm các xét nghiệm thăm dò kinh điển hiện có mà không phát hiện được nguyên nhân nào có thể giải thích được[2]. 1.1.2. Tình hình và nguyên nhân vô sinh Thế giới: tùy từng nước, tỷ lệ VS thay đổi từ 10% - 18%, đột xuất có nơi lên tới 40%. Tại Pháp VS chiếm khoảng 1/6 các cặp vợ chồng, Ở Hoa Kỳ năm 1999 tỷ lệ này là 15% [2],[12]. Về nguyên nhân VS theo tổ chức Y tế thế giới năm 1985, khoảng 20% là không rõ nguyên nhân, 80% có nguyên nhân trong đó VS nữ 40%, VS nam 40% và do cả hai là 20% [2],[3],[12].Theo Irvine, tần suất VS nam được báo cáo bởi nhiều nghiên cứu lớn thay đổi từ khoảng 20% - 60% [13]. 4 Theo điều tra dân số quốc gia năm 1982, VS chiếm 13%[2]. Nguyễn Viết Tiến và cộng sự điều tra các cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ năm 2009 tại 8 tỉnh đại diện cho 8 vùng sinh thái trong cả nước Việt Nam thì tỷ lệ VS chung trên toàn quốc là 7,7%, trong đó VS nguyên phát là 3,9%, VS thứ phát là 3,8%[14]. Theo Cung Thị Thu Thủy (2009), nghiên cứu tại 4 tỉnh phía bắc, tỷ lệ VS chung là 7,1%, VS nguyên phát là 3,6%, VS thứ phát là 3,5%[15]. Theo nghiên cứu của Nguyễn Khắc Liêu và cộng sự tại Viện Bảo vệ Bà mẹ và Trẻ sơ sinh[16] trong các năm 1993 - 1997 trên 1000 trường hợp VS đầy đủ các xét nghiệm thăm dò về độ thông của đường sinh dục nữ, về phóng noãn, về TT, thấy tỉ lệ VS nữ chiếm 55,4%, VS nam 35,6% và VS không rõ nguyên nhân 10%. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thành Như và cộng sự (2001) tại bệnh viện Bình Dân [17]nguyên nhân VS do nam đơn thuần là 30% và do cả hai vợ chồng là 20%. Nghiên cứu của Đào Xuân Hiền tại Bệnh viện Phụ Sản Trung ương (BVPSTW) (2007) trên 300 cặp vợ chồng, tỷ lệ VS do vợ là 38,6%, do chồng là 20,5%, cả hai vợ chồng là 6% còn lại 34,9% không rõ nguyên nhân [18]. Theo Đỗ Tiến Dũng (2012) cũng tại BVPSTW tỷ lệ có thai là 17,7% trong đó nguyên nhân do chồng (tinh trùng yếu, bất thường phóng tinh) chiếm 15,8%, do vợ 41,8%, cả 2 là 2,8%, không rõ nguyên nhân là 39,6% [11]. 1.2. Sự thụ thai Sự thụ thai bao gồm hai quá trình: sự thụ tinh và sự làm tổ của phôi. Thụ tinh là sự kết hợp của một tế bào đực (tinh trùng) và một tế bào cái (noãn) để tạo thành một tế bào mới là hợp tử [19]. 5 1.2.1. Tinh trùng và tinh dịch đồ 1.2.1.1. Tinh trùng bình thường Tinh trùng (TT) bình thường với kích thước 5,0 x 3,5 µm, có đầu hình oval đều đặn, với phần acrosome dễ xác định chiếm khoảng 40 - 70% phần chóp nhọn của đầu. Dưới phần đáy của đầu kéo dài thành một đuôi (flagellium) được gắn cân xứng với phần đầu. Ngay dưới phần đầu, phần đầu tiên của đuôi được coi như là phần giữa (mid-piece) có vẻ như to hơn 1 chút so với phần đuôi, chiều ngang tối đa là 1µm và dài khoảng 7,0 - 8,0 µm. Đường kính phần đuôi từ 0,4-0,5 µm và dài khoảng 50 µm. Đuôi không được bị cuộn hay có đường kính không đồng nhất. Phần đuôi cũng không được gẫy khúc một cách bất thường và có điểm cuối dễ nhìn thấy. Để tuân thủ trong việc đánh giá hình dạng, tất cả những dạng không nằm trong ranh giới giới hạn bình thường kể trên đều được coi là bất thường [20]. Hình 1.1. Hình dạng và kích thước tinh trùng bình thường[20] 6 1.2.1.2.Sự chọn lọc tinh trùng trong tự nhiên Trong chu kỳ tự nhiên, quanh thời điểm phóng noãn, chất nhầy cổ tử cung (CTC)có tác dụng như một hàng rào ngăn cản sự xâm nhập của bạch cầu, prostaglandin (PG) và các tác nhân gây nhiễu khác có trong tinh dịch. Hơn nữa, với tác dụng như một màng lọc, chất nhầy CTC chỉ cho phép những TT di động nhanh, có hình dạng và kích thước bình thường đi qua CTC để vào trong buồng tử cung (BTC). Ngoài ra, để tăng cường khả năng thụ tinh, chất nhầy CTC còn có tác dụng như một nơi chứa TT tạm thời. Từ nơi chứa này, TT sẽ lần lượt được phóng thích vào lòng tử cung (TC) và di chuyển lên vòi tử cung (VTC). Dựa vào hiện tượng xảy ra trong cơ thể, người ta đã xây dựng nên các nguyên lý cơ bản của việc chuẩn bị TT để sử dụng trong các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản. Theo đó, tinh dịch và những TT chết, bất động hay có hình dạng bất thường phải được loại bỏ, để cuối cùng thu được nhiều TT với chất lượng tốt nhất. Ngoài ra, trong quá trình chuẩn bị TT, các chất ngăn cản phản ứng khả năng hoạt hóa cũng bị loại bỏ, và trong một số trường hợp, người ta có thể thêm vào những chất kích thích phản ứng này xảy ra. 1.2.1.3. Sức sống và khả năng hoạt hóa của tinh trùng Sức sống và năng lực hoạt động của TT biểu lộ bằng sự chuyển động nhờ đuôi của nó. Nhờ đuôi, TT có thể tự chuyển động trong đường sinh dục của người nữ (âm đạo, TC, VTC) với tốc độ 2 - 4 mm/phút. Ở người những TT khỏe là những TT còn chuyển động được sau 50 giờ sau khi xuất tinh. Những TT yếu thường chết sau 15 phút. Trên tinh dịch đồ (TDĐ), để đánh giá khả năng thụ tinh, người ta xác định tinh dịch tốt phải chứa 80% TT chuyển động sau khi xuất tinh 1 giờ hoặc 50% TT chuyển động sau xuất tinh 12 giờ hoặc 25% TT chuyển động sau xuất tinh 28 giờ [21]. Giảm khả năng thụ tinh nếu giảm tỷ lệ phần trăm TT có khả năng chuyển động. 7 Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sức sống và năng lực của TT thụ tinh cho noãn: ở môi trường kiềm, TT chuyển động tích cực nhưng mau chóng sử dụng hết chất dinh dưỡng nên chết sớm. Nồng độ CO2 trong môi trường cao do TT thải ra sẽ làm giảm năng lực hoạt động của TT. Mật độ của TT trong một đơn vị thể tích đóng vai trò quan trọng. Nếu mật độ đó giảm, sức sống và năng lực TT thụ tinh cho noãn cũng giảm. Nhiệt độ môi trường ảnh hưởng nhiều đến khả năng hoạt động và sức sống của TT. Nhiệt độ thấp duy trì sức sống và năng lực của TT, nhiệt độ từ 36 - 400C sẽ làm cho TT hoạt động mạnh và di chuyển nhanh nhưng lại làm cho TT suy kiệt và chết. Nhiệt độ cao trên 400C thì TT hoạt động rất kém và rất nhanh chết. 1.2.1.4. Tinh dịch đồ Trong quá trình khám và chẩn đoán một cặp vợ chồng VS, tinh dịch đồ là một xét nghiệm thường quy, bắt buộc. Tinh dịch đồ (TDĐ) là một xét nghiệm đơn giản, dễ thực hiện cũng là xét nghiệm cơ bản, đầu tiên được làm để đánh giá bước đầu khả năng sinh sản của người chồng [21]. Để chuẩn hóa các kết quả giúp cho việc nghiên cứu và thực hành lâm sàng, WHO đã đưa ra các tiêu chuẩn của mẫu tinh dịch bình thường vào năm 1980. Các tiêu chuẩn này được thay đổi vào các năm 1987, 1992, 1999 và 2010. Bảng 1.1. Một số giá trị bình thường của TDĐ Chỉ số TDĐ Thể tích Độ ly giải pH Mật độ tinh trùng(/ml) Tổng số tinh trùng Di động Tỷ lệ sống Hình dạng bình thường Bạch cầu 1999 ≥ 2 ml < 60 phút 7,2 – 8 ≥ 20x106 ≥ 40x106 A > 25% Hoặc A+B ≥ 50% ≥ 75% ≥ 30% < 1x106 2010 ≥ 1,5 ml < 60 phút ≥ 7,2 ≥ 15x106 ≥ 39x106 PR ≥ 32% hoặc PR + NP ≥ 40% ≥ 58% ≥ 4% < 1x106 8 * Độ di động của TT được đánh giá như sau: Trong tiêu chuẩn WHO 1999: A: di động tiến tới, nhanh. Ở nhiệt độ 370C, soi trên kính hiển vi tốc độ di chuyển của TT ≥ 25 µm/giây tương đương 5 lần chiều dài đầu, 1/2 lần chiều dài đuôi và ≥ 20 µm/giây ở nhiệt độ 200C. B: di động tiến tới, chậm. C: di động không tiến tới (nhúc nhích tại chỗ < 5 µm/giây). D: không di động Trong đó A là chỉ số quan trọng. Trong tiêu chuẩn WHO 2010: PR (progressive motility): di động tiến tới, khi TT di động nhanh, thành đường thẳng hoặc vòng tròn lớn mà không tính đến tốc độ di chuyển. NP (non - progessive motility): di động không tiến tới hoặc di động tại chỗ bao gồm tất cả những di động còn lại bao gồm di chuyển thành vòng tròn nhỏ, đuôi di động rất khó khăn đầu mới nhúc nhích hoặc chỉ quan sát thấy đuôi nhúc nhích. Nghiên cứu của Willem Ombelet (2014) đã chỉ ra bốn yếu tố quan trọng của tinh dịch ảnh hưởng đến tỷ lệ có thai là tổng số TT, số lượng TT di động, hình thái TT bình thường, tỷ lệ di động. Trong đótác giả nhấn mạnh rằng tỷ lệ hình thái TT bình thường ≥ 4% và tỷ lệ TT di động ≥ 30% là hai tiêu chuẩn khắt khe để có kết quả khả quan sau IUI [22]. Một nghiên cứu của Mac Leod và Wang (1979) đã phát hiện ra rằng có 10% số người đàn ông khỏe mạnh trong độ tuổi sinh sản có mật độ TT < 20 x 106/ml. Thêm vào đó, mật độ TT thấp được coi là thông số có ý nghĩa với sức khỏe sinh sản [23]. Theo kinh điển, giới hạn bình thường của mật độ TT là 40 x 106/ml, hiện nay WHO lấy giới hạn là 15 x 106/ml. Tuy nhiên trên thực tế, theo kinh 9 nghiệm của Nguyễn Khắc Liêu, mật độ TT tối thiểu để có thai tự nhiên được tính là 40 x 106/ml. Nếu TT ở dưới giới hạn này không có nghĩa là VS mà là khả năng có thai bị giảm [24]. 1.2.1.5. Các bệnh lý rối loạn quá trình tạo tinh trùng Khả năng sinh sản của nam giới phụ thuộc vào số lượng, chất lượng của tinh trùng và các yếu tố đảm bảo sự di chuyển của tinh trùng từ nơi nó được sinh ra vào đường sinh dục nữ và kết thúc là gặp được noãn bào[25]. Các bệnh lý rối loạn quá trình tạo TT chia làm hai nhóm: - Rối loạn quá trình tạo TT do rối loạn các hormon hướng sinh dục (nguyên nhân trước tinh hoàn). - Rối loạn TT do bệnh lý của tinh hoàn (nguyên nhân tại tinh hoàn).  Rối loạn quá trình tạo TT do rối loạn các hormon hướng sinh dục  Suy giảm hormon hướng sinh dục nguyên phát: thiếu hụt hormon vùng dưới đồi, những rối loạn chức năng hoặc bất thường hình thái của vùng dưới đồi dẫn đến suy giảm GnRH. Điều này dẫn đến thay đổi quá trình sinh tổng hợp và chế tiết hormon hướng sinh dục, giảm nồng độ LH, FSH trong máu. Hậu quả quá trình sinh tinh bị giảm một phần hoặc hoàn toàn.  Suy giảm hormon hướng sinh dục do tăng quá nhiều hormon khác: - Sản xuất quá nhiều androgen: androgen không chỉ được tổng hợp ở riêng tế bào Leydig mà còn được tổng hợp ở tuyến thượng thận.  Rối loạn quá trình tạo TT do các bệnh lý của tinh hoàn  Các bệnh lý của tinh hoàn do rối loạn gen: Gồm các rối loạn nhiễm sắc thể giới tính trong quá trình biệt hóatinh hoàn: Hội chứng Klinefelter: là bệnh rối loạn số lượng nhiễm sắc thể (47,XXY). Tổn thương tinh hoàn diễn ra một cách từ từ.  Rối loạn quá trình tạo TT tại tinh hoàn do một số nguyên nhân khác: tổn thương tế bào dòng tinh do ngoại môi: các tế bào dòng tinh trong ống sinh tinh phân chia với tốc độ cao để tạo TT. Vì vậy nhiều tác động ngoại cảnh có thể ảnh hưởng tới quá trình tạo tinh trùng. 10 1.2.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng tinh trùng Gần đây theo nhiều nghiên cứu trên thế giới người ta nhận thấy mật độ tinh trùng có xu hướng giảm đi. Câu hỏi đặt ra là: điều gì làm suy giảm khả năng sinh tinh và chất lượng TT. Qua các nghiên cứu người ta thấy sự giảm sút chất lượng TT liên quan tới các tác nhân vật lý, hóa học, các bệnh lý nhiễm trùng cấp và mãn tính, các bệnh lây truyền qua đường tình dục, tiền sử dùng thuốc, tiền sử phẫu thuật hoặc chấn thương sinh dục[26].  Tuổi Liệu khi người nam giới có tuổi sự sản sinh TT có ít đi không vàchất lượng tinh trùng có ảnh hưởng không? Vào năm 2000 trong nghiên cứu ở Đức của Krause thực hiện trên 253 người đã đưa ra kết quả là: thể tích tinh dịch, số lượng và độ di động của TT không thay đổi theo tuổi [27]. Gần đây năm 2005 một báo cáo của Bairdvà cộng sự khi tiến hành nghiên cứu và thấy có sự tăng lên đáng kể sự bất thường chromosomes trong TT của các nam giới lớn tuổi[28]. Theo thời gian, khi người đàn ông có tuổi khối lượng cơ sẽ giảm, khối lượng mỡ trong cơ thể tăng vậy liệu khi chỉ số BMI cao ( Body Mass Index) thì khả năng sản sinh tinh trùng có ảnh hưởng không? Đó là một câu hỏi mà các nhà khoa học quan tâm. Một nghiên cứu được thực hiện gầy đây ở trung tâm hỗ trợ sinh sản Atlanta, Mỹ báo cáo kết quả nghiên cứu từ 117 nam giới trong đó 66 người có chỉ số BMI cao. Người ta nhận thấy có mối liên hệ giữa những người đàn ông có chỉ số BMI cao và sự suy giảm nồng độ testosteron ở những người này. Nồng độ testosteron trong máu ở những người này giảm 24% so với những người trong nhóm chứng. Hơn thế nữa cũng trong nghiên cứu này đã lưu ý rằng những người đàn ông có chỉ số BMI cao thì có tuýp TT không bình thường [29]. 11  Ảnh hưởng của bệnh tật, các thuốc điều trị bệnh tới chất lượng TT Một số bệnh tật ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sinh sản ở nam giới,quai bị là một trong số đó. Nếu mắc quai bị trước tuổi dậy thì, ít xảy ra biến chứng nhưng nếu mắc sau dậy thì, tỷ lệ biến chứng là 10-35%, dẫn đến viêm 1 hoặc 2 bên tinh hoàn, hậu quả là sự giảm sút về số lượng và chất lượng TT. Bệnh giãn tĩnh mạch thừng tinh được đề cập nhiều tới như là một nguyên nhân gây giảm chất lượng và số lượng TT. Một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ bệnh nhân bị giãn tĩnh mạch thừng tinh trong số những người bị vô sinh chiếm khoảng 20 – 40% các trường hợp. Tuy nhiên trong số nam giới bình thường cũng có khoảng 15% bị giãn tĩnh mạch thừng tinh[30]. Cơ chế của giãn tĩnh mạch thừng tinh gây vô sinh có thể là do làm tăng nhiệt độ tại tinh hoàn, thiếu oxy hoặc do trào ngược các chất chuyển hóa từ tuyến thượng thận đến tinh hoàn mà các chất này có ảnh hưởng đến quá trình sản xuất TT. Các bất thường có thể gặp trong xét nghiệm tinh dịch đồ của bệnh nhân giãn tĩnh mạch tinh là: giảm mật độ TT, giảm khả năng di động của TT, tăng tỷ lệ TT có hình dáng bất thường. Ở nam giới bị giãn tĩnh mạch tinh thì 90% các mẫu tinh dịch có tình trạng giảm di động TT, và 65% có mật độ TT< 20 triệu/ml. Tổn thương tế bào dòng tinh còn do dùng các loại thuốc. Đa số các tế bào dòng tinh bị các hoá chất chống ung thư ức chế ở pha tổng hợp tế bào và phân bào. Trong nghiên cứu của Wai Yee Wong và cộng sự về yếu tố bệnh tật ảnh hưởng tới chất lượng TT thực hiện ở Nerthelands nhận thấy trong nhóm người có tiền sử bệnh tật, có tiền sử dùng thuốc thì yếu tố gây nguy cơ cho TT nhất là dùng kháng sinh (p = 0,002), những người có bệnh về dạ dày và dùng thuốc điều trị dạ dày (p=0,02) kế đến mới là những người bị bệnh quai bị (p = 0,04)[31]. 12 Kháng sinh có thể tác động lên các ty thể của tế bào (người). Sự tác động này có thể ảnh hưởng đến hoạt động của tế bào và đặc biệt đối với TT sẽ ảnh hưởng đến khả năng di động của chúng [37]. Một số thuốc có thể gây rối loạn các hormon hướng sinh dục, phần lớn là kháng lại androgen làm ảnh hưởng tới quá trình sinh TT như: Halothan có thể gây viêm gan nhiễm độc hoặc một số thuốc như Ketoconazol, Cimetidin, Quinin, Phenytoin có khả năng ức chế Cytocrom P450 C17(CYP 19). Vì vậy, các thuốc này có thể làm giảm quá trình sinh tinh. Bệnh lây truyền đường tình dục như giang mai có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh tinh bởi nó tác động trực tiếp đến tinh hoàn và mào tinh gây viêm lan toả mô kẽ, kết hợp với viêm nội mạc và hình thành các gôm giang mai. Bệnh lậu và bệnh phong không được điều trị cũng là nguyên nhân gây viêm tinh hoàn làm giảm khả năng sinh tinh [32].  Ảnh hưởng của môi trường đến chất lượng tinh trùng Vào năm 2004 Stoy J và cộng sự đã tiến hành một nghiên cứu thuần tập trên 1747 người đàn ông trong độ tuổi từ 18 đến 39 làm công việc nặng nhọc trên 30 giờ trong tuần thấy rằng mật độ TT trong nhóm này này giảm đi đáng kể so với nhóm chứng[33]. Cũng trong thời gian này một nghiên cứu khác của Wu JQ trên 562 người đàn ông khoẻ mạnh ở 7 tỉnh khác nhau của Trung Quốc nhận thấy rằng có sự khác nhau rất rõ rệt về chất lượng TT ở các vùng khác nhau và yếu tố môi trường có ảnh hưởng tới sự giảm sút chất lượng TT[34]. Tới năm 2006 Stefankiewicz J báo cáo về nghiên cứu của mình được thực hiện ở những người nam giới tuổi từ 15 đến 44 ở Ba Lan. Ông nhận thấy nguyên nhân gây suy giảm TT dẫn đến vô sinh thường thấy ở những người đàn ông bị stress [35]. 13  Ảnh hưởng của thuốc lá, rượu và các chất kích thích tới chất lượng của TT Qua rất nhiều nghiên cứu và thực nghiệm người ta nhận ra rằng: hút thuốc lá và uống rượu nhiều có thể ảnh hưởng có hại tới khả năng sinh sản của nam giới. Cả hai tính chất: số lượng và độ di động của TT đều có thể bị ảnh hưởng bởi hút thuốc lá, mặc dù uống nhiều rượu có thể làm giảm số lượng TT, nhưng ảnh hưởng chính của nó là làm tổn thương tới sự chế tiết testosteron, rượu làm tăng quá trình phân hủy hormon này, cũng như biến đổi ngược lại thành estrogen. Điều này làm giảm ham muốn tình dục. Nghiện rượu còn là một nguyên nhân lớn gây liệt dương. Năm 2003 Wai Yee Wong và cộng sự thực hiện một nghiên cứu giữa 92 người vô sinh và 73 người bình thường ở Hà Lan cũng khẳng định hút thuốc lá thực sự ảnh hưởng tới tinh trùng [31]. Ở Ba Lan năm 2006 có báo cáo nghiên cứu của Stefankiewicz J. Tác giả nhận thấy có mối liên quan giữa những người hút thuốc lá và tình trạng ít TT ở những người này [35]. Gần đây tháng 1 năm 2007 Ramlau-Hansen và cộng sự đã có một nghiên cứu cắt ngang thực hiện trên 2562 người đàn ông làm các nghề khác nhau. Kết luận của nghiên cứu là những người nghiện thuốc lá nặng có số lượng tinh trùng giảm 19% so với những người không nghiện thuốc lá. Người ta tìm thấy có sự liên quan giữa thuốc lá và suy giảm nồng độ testosteron cũng như nồng độ LH. [61]. Nghiện cần sa nặng sẽ làm giảm nồng độ testosteron trong máu, giảm mật độ TT trong tinh dịch [29]. 14 1.2.2. Noãn bào Trong buồng trứng có các noãn bào nguyên thủy. Trẻ sơ sinh gái từ khi mới lọt lòng có từ 1.200.000 - 1.500.000 nang noãn nguyên thủy. Tuy vậy từ dậy thì đến mãn kinh chỉ có khoảng 400 - 500 nang trưởng thành, số còn lại thoái hóa và teo đi [19]. - Nang nguyên thủy phát triển thành nang De Graff. Trong nang De Graff có noãn và các tế bào hạt. - Noãn trưởng thành phải có đường kính từ 100 - 150 µm. Nó được phóng ra từ nang De Graff với nhiều lớp tế bào hạt bao quanh. - Cấu trúc noãn có màng trong suốt bọc quanh trong chứa nguyên sinh chất có nhân to lệch sang một phía. Khi noãn đã phóng ra ngoài thì loa VTC hứng lấy noãn đưa về VTC. Màng đáy Vỏ nang Gò noãn Noãn Dịch nang Nang nguyên thủy Nang sơ cấp Nangthứ cấp Nang tam cấp Mạch máu Nang vượt trội Sự phóng noãn Bạch thể Hoàng thể Hình 1.2. Sơ đồ minh họa cơ chế phóng noãn[30] 15 1.2.3. Sự di chuyển của tinh trùng và noãn 1.2.3.1. Sự di chuyển của tinh trùng Khi giao hợp, TT được trộn với dịch của túi tinh, tuyến tiền liệt và ống dẫn tinh, hỗn hợp dịch này được gọi là tinh dịch chứa TT. TT được phóng vào âm đạo, đọng ở cùng đồ sau của âm đạo. pH tinh dịch là 7,2 - 7,8 trong khi pH âm đạo thường < 5,0 do đó ngay sau khi phóng tinh, tinh dịch đông, vón cục nhờ các enzym đông đặc của dịch tuyến tiền liệt tác dụng vào fibrinogen có trong tinh dịch để bảo vệ TT khỏi môi trường acid của âm đạo và giữ TT ở vị trí gần CTC, tránh chảy ngược ra ngoài. Môi trường âm đạo sau đó bị kiềm hoá do pH kiềm của tinh dịch. Sự ly giải bắt đầu xảy ra, nhờ tác động của fibrinolysin có trong dịch tuyến tiền liệt và giải phóng TT. Các cơ chế này làm tăng tối đa số lượng TT vào được đến CTC. Trong giai đoạn phóng noãn, do ảnh hưởng của estrogen, chất nhầy CTC nhiều và loãng hơn, thuận lợi cho sự di chuyển của TT vào CTC. Niêm mạc CTC có nhiều kẽ. Rất nhiều TT sau khi đi vào CTC bị giữ ở các kẽ này. Sau đó TT tiếp tục từ các kẽ này đi lên vào BTC. Sự di chuyển của TT trong BTC nhờ đuôi vận động và được hỗ trợ bởi nhiều yếu tố: sự co giãn của cơ trơn TC, dịch trong lòng TC và nếp gấp niêm mạc tử cung (NMTC), sự co giãn của cơ trơn VTC, các nhung mao của biểu mô VTC và môi trường của VTC. Trong thời gian di chuyển tại TC và VTC đầu TT được hoạt hoá. Quá trình này tạo sự thay đổi của màng ở đầu TT, làm tiền đề cho phản ứng cực đầu và sự thụ tinh với noãn sau này. 1.2.3.2. Ảnh hưởng của chất nhầy cổ tử cung đối với sự thâm nhập của tinh trùng CTC người có cấu trúc hình trụ, thành dầy thuôn về phía lỗ ngoài CTC. Tuyến nhầy CTC là một hệ phức tạp các khe, tụ lại với nhau tạo thành các khoang ảo của tuyến. Cấu trúc của các khe thay đổi theo lứa tuổi, tình trạng bệnh tật và các giai đoạn của vòng kinh [36]. 16 Biểu mô CTC bao gồm các dạng tế bào chế tiết khác nhau và có nhiều các hạt chế tiết. Dịch tiết của các tế bào này góp phần tạo nên chất nhầy CTC. Chất nhầy CTC được chế tiết bởi các tế bào biểu mô trụ và những tế bào này thay đổi theo chu kỳ nội tiết của vòng kinh. Các hormon của buồng trứng điều khiển hoạt động chế tiết chất nhầy CTC: estrogen kích thích sự sản sinh nhiều dịch nhầy còn progesteron thì ức chế hoạt động chế tiết của các tế bào biểu mô tuyến này. Ở những người phụ nữ bình thường, trong độ tuổi sinh đẻ, lượng dịch nhầy được sản sinh trong một ngày thay đổi từ 0,5 ml ở giữa vòng kinh xuống 0,1 ml ở các giai đoạn khác của vòng kinh. Sự thay đổi chu kỳ về độ đậm đặc của chất nhầy CTC có thể ảnh hưởng tới khả năng thâm nhập và sự sống còn TT [37]. TT có khả năng thâm nhập vào chất nhầy CTC bắt đầu vào khoảng ngày thứ 9 của vòng kinh 28 ngày và tăng lên một cách từ từ tới thời điểm phóng noãn. Sự thâm nhập của TT thường bị giảm sau khi phóng noãn 1 - 2 ngày. Những TT di động được hướng theo sợi nhầy vào CTC, ở đó nó được phóng thích từ từ vào BTC và vào vòi Fallop. CTC và sự chế tiết chất nhầy của nó ảnh hưởng tới TT như sau [38]: 1- Làm tăng khả năng thâm nhập của TT vào chất nhầy xung quanh thời điểm phóng noãn và làm giảm khả năng này vào những thời điểm khác của vòng kinh. 2- Bảo vệ TT khỏi bị ảnh hưởng của các tác nhân có hại trong môi trường âm đạo và khỏi bị thực bào. 3- Bổ sung năng lượng dự trữ cho TT. Nếu chất nhầy CTC có độ nhớt cao (đặc) và có nhiều bạch cầu, TT thâm nhập vào CTC kém và mất khả năng hoạt động. Điều này cũng xảy ra khi chất nhầy CTC của người vợ có kháng thể kháng TT [39]. 17 1.2.3.3. Sự di chuyển của noãn Đoạn đường đi của noãn ngắn hơn so với TT, nhưng noãn không tự di chuyển được, nó phải dựa vào các yếu tố xung quanh. Khi vỡ nang Graff, noãn thoát ra và nằm ở bề mặt của buồng trứng (ở giai đoạn noãn bào cấp II). Trước khi phóng noãn, những tua của loa VTC chuyển động mạnh, quét trên khắp BT. Khi được phóng thích ra khỏi buồng trứng, noãn được bọc ngoài bởi một màng trong suốt và lớp tế bào hạt [40]. Sau đó noãn được hút về VTC (chưa rõ cơ chế này) trong đó chỉ biết rằng chỉ có sự hoạt động của các tua VTC, yếu tố "hướng tâm" của chất dịch chuyển động về phía loa vòi đã có sẵn trong ổ bụng. Khi tới lỗ của loa VTC noãn sẽ vượt qua và di chuyển vào trong VTC khá nhanh, chỉ vài giờ sau là tới chỗ TT. Ngoài ra, nồng độ estrogen cao trong giai đoạn phóng noãn đã kích thích sự co bóp các cơ trơn nên đã đẩy noãn đi nhanh hơn. Noãn và TT sẽ gặp nhau và thụ tinh khoảng 1/3 ngoài của VTC. 1.2.4. Sự thụ tinh và làm tổ Có khoảng vài trăm TT đến được 1/3 ngoài VTC để gặp noãn. Sự thụ tinh diễn ra ở đoạn bóng của VTC. Dưới tác dụng của các lông chuyển và sự co thắt của cơ trơn VTC, phôi di chuyển trong dịch VTC về hướng BTC. Phôi đến BTC khoảng 4 - 5 ngày sau thụ tinh. Ở trong BTC phôi tiếp tục phân chia trong môi trường dịch tiết của NMTC vài ngày trước khi làm tổ. Trong thời gian đó NMTC được chuẩn bị cho quá trình làm tổ dưới ảnh hưởng của progesteron do buồng trứng tiết ra trong gian đoạn hoàng thể. 1.2.4.1. Những điều kiện của sự thụ tinh - Phải có giao tử cái, đã được phóng ra khỏi vỏ nang. - Phải có giao tử đực, đó là TT, với số lượng và chất lượng đầy đủ. - Phải có sự tiếp xúc giữa noãn và TT, hoặc bằng giao hợp xuất tinh tự nhiên, hoặc bằng thụ tinh nhân tạo, hoặc bằng thụ tinh ống nghiệm. 18 - Phải có sự đâm xuyên của TT vào noãn và có kết hợp giữa hai tiền nhân đực và cái để thành trứng, có khả năng phát triển nhanh thành phôi, thành thai. Sự đâm xuyên này có thể tự nhiên, có thể qua phương pháp bơm tinh trùng vào noãn [19]. 1.2.4.2. Những điều kiện của sự làm tổ - VTC phải thông tốt có nhu động thích hợp, sinh lý, để trứng di chuyển vào trong BTC được. - NMTC phải được chuẩn bị trước bằng estrogen, rồi estrogen và progesterone để đạt được khả năng chế tiết tốt, trở thành màng rụng. Chất chế tiết này là chất nuôi dưỡng trứng ở giai đoạn lơ lửng trong BTC, chưa làm tổ ngay. - Trứng phải ở giai đoạn phôi nang để có những nguyên bào nuôi bao quanh ở bên ngoài tiết enzym tiêu protein, làm huỷ tế bào NMTC, vùi sâu vào NMTC và bám chắc được vào NMTC. - Khi trứng đã bám chắc được vào NMTC, các enzym của các nguyên bào nuôi phải tiếp tục làm lỏng được tế bào của NMTC biến chúng thành chất dinh dưỡng ban đầu cho trứng, đồng thời giúp cho trứng lún sâu được vào lòng của NMTC và làm tổ [19]. Ở mỗi giai đoạn còn có nhiều yếu tố khác tham gia vào sự hình thành thai nghén và sinh đẻ. Chỉ cần thiếu một trong những yếu tố trên đây là không thực hiện được thai nghén và sinh đẻ. Có khoảng vài trăm TT đến được 1/3 ngoài VTC để gặp noãn. Sự thụ tinh diễn ra ở đoạn bóng của VTC. Dưới tác động của các lông chuyển và nhu động của cơ trơn VTC, phôi di chuyển trong dịch của VTC về hướng BTC. Phôi đến BTC khoảng 4 - 5 ngày sau khi thụ tinh. Ở trong BTC phôi tiếp tục phân chia trong môi trường dịch tiết của NMTC vài ngày trước khi làm tổ. Trong thời gian đó, NMTC được chuẩn bị cho quá trình làm tổ dưới ảnh hưởng của progesterone do buồng trứng tiết ra trong giai đoạn hoàng thể [19]. 19 1.3. Lọc rửa tinh trùng Có nhiều kỹ thuật lọc rửa TT đã được mô tả, đa số có sử dụng môi trường Earle và để hỗ trợ cho độ di động và sức sống của TT, người ta dùng thêm môi trường Ham’s F10, môi trường HTF (human tubal fluid). Để có một mẫu TT tốt, tinh dịch phải được ly tâm tách TT khỏi tinh tương càng sớm càng tốt, vì khi ra khỏi cơ thể ở trong tinh tương lâu, độ di động và sức sống của TT sẽ bị giảm, đồng thời tinh tương cũng hạn chế cực đầu và năng lực thụ tinh của TT. Có nhiều phương pháp lọc rửa TT khác nhau và việc lựa chọn phương pháp nào là phụ thuộc vào mẫu TT. Nhìn chung các phương pháp lọc rửa TT chia ra làm ba nhóm khác nhau. Nhóm thứ nhất là lọc rửa dựa trên khả năng bơi của TT ra khỏi tinh dịch để vào môi trường, kỹ thuật của phương pháp này là tạo một lớp môi trường phủ lên trên lớp tinh dịch, TT sẽ bơi vào lớp môi trường, hút lấy lớp môi trường chứa nhiều TT này để sử dụng, đây là nguyên tắc của phương pháp bơi lên và bơi xuống. Nhóm thứ hai là lọc rửa dựa trên thang nồng độ bằng cách tạo một lớp tinh dịch phía trên các cột thang nồng độ khác nhau rồi đem ly tâm, TT sẽ được lọc qua các lớp thang nồng độ tùy thuộc vào tỷ trọng, sau đó ly tâm lấy cặn ở phía dưới có nhiều TT để sử dụng. Nhóm thứ ba là phương pháp lọc rửa cổ điển bằng cách trộn đều TT với môi trường sau đó ly tâm, lấy cặn để sử dụng. Hai nhóm phương pháp đầu được sử dụng nhiều còn nhóm phương pháp thứ ba ít được áp dụng. 1.3.1. Các phương pháp lọc rửa tinh trùng 1.3.1.1. Phương pháp bơi lên (swim- up) Nguyên tắc: phương pháp này có thể được thực hiện bằng cách đặt một lớp môi trường lên phía trên lớp tinh dịch đã ly giải hoặc đặt lớp tinh dịch xuống dưới môi trường, TT có khả năng thoát khỏi lớp tinh dịch phía dưới và bơi lên bề mặt thoáng của môi trường nhờ khả năng tự di chuyển nhờ đuôi. 20 Phương pháp thực hiện: + Cho vào mỗi ống nghiệm loại (15 ml, đáy nhọn) 1,5 ml môi trường nuôi cấy. + Cho 1 ml tinh dịch đã ly giải thật nhẹ nhàng xuống đáy lớp môi trường. + Đặt ống nghiệm trong tủ cấy 45 - 50 phút, nghiêng 450. + Dùng pipett Pasteur hút khoảng 0,7 - 1 ml môi trường trên cho vào ống nghiệm 5 ml đã có sẵn 2 ml môi trường nuôi cấy chuẩn bị sẵn, trộn đều. + Ly tâm 300 vòng trong 10 phút. + Hút bỏ hết phần môi trường phía trên, để lại 0,3 - 0,4 ml cặn. + Trộn đều cặn, lấy một giọt cho vào buồng đếm kiểm tra độ di động và mật độ. + Phần còn lại thực hiện kỹ thuật IUI. 1.3.1.2. Phương pháp bơi xuống Dựa trên mô tả của Ericson, mẫu TT được đặt trên một hay nhiều lớp môi trường có chứa albumin bò, đặt trong tủ ấm 370C trong một giờ, những con TT sống sẽ bơi xuống lớp có albumin. Lớp thang nồng độ albumin đã được đề nghị sử dụng khi muốn tách lấy TT Y (1988). 1.3.1.3. Phương pháp dùng thang nồng độ Nguyên tắc: các hóa chất dùng để lọc rửa TT ở các nồng độ khác nhau có chức năng lọc, loại bỏ TT chết, dị dạng, di động kém và các thành phần khác trong tinh dịch. Phần tinh dịch lọc rửa, rửa hai lần với môi trường nuôi cấy để loại bớt hóa chất trong bước lọc. Cách thực hiện: + Tạo hai lớp môi trường vào ống nghiệm sil - select 90% và 45%: cho mỗi lớp 1 ml. + Cho khoảng 1 ml tinh dịch đã ly giải hoàn toàn lên trên thật nhẹ nhàng. + Ly tâm ở 300 - 500 g trong vòng 15 phút.