Tài liệu Nghiên cứu khả năng ức chế hình thành β amyloid gây bệnh alzheimer bởi một số hoạt chất từ hoa hòe (sophora japonica l.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Đỗ Thị Hải Anh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HÌNH THÀNH β-AMYLOID GÂY BỆNH ALZHEIMER BỞI MỘT SỐ HOẠT CHẤT TỪ HOA HÒE (Sophora japonica L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Đỗ Thị Hải Anh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HÌNH THÀNH β-AMYLOID GÂY BỆNH ALZHEIMER BỞI MỘT SỐ HOẠT CHẤT TỪ HOA HÒE (Sophora japonica L.) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội – 2018 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới người thày đã luôn tận tâm chỉ bảo, tạo điều kiện cho em được học tập, trau dồi kiến thức trong suốt thời gian qua – PGS.TS. Nguyễn Quang Huy. Nếu không có sự hướng dẫn, giúp đỡ và động viên liên tục của thày, em sẽ khó có thể hoàn thành được luận văn thạc sĩ này. Tiếp đến, em xin chân thành cảm ơn GS Shunsuke Izumi và PGS.TS. Kazumi Saikusa, phòng thí nghiệm Khoa Toán học và Khoa học sự sống, ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Hiroshima đã hết sức tạo điều kiện, quan tâm và hướng dẫn em làm thí nghiệm trong thời gian em học tập và trao đổi tại ĐH Hiroshima. Dưới sự hướng dẫn của thầy cô, em đã học được rất nhiều điều hay và bổ ích, phục vụ rất nhiều cho quá trình thực hiện đề tài. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô bộ môn Hóa sinh và Sinh học phân tử, các thày cô giáo tại Khoa Sinh học và chuyên viên phòng Đào tạo Sau Đại học trường ĐH Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện cho em hoàn thành chương trình học tập của khóa học. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn ở bên động viên, cổ vũ tinh thần cho em mỗi khi em gặp khó khăn trong suốt thời gian em học tập và thực hiện đề tài. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên cao học Đỗ Thị Hải Anh Đỗ Thị Hải Anh i Sinh học thực nghiệm K25 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3 1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer ........................................................................ 3 1.1.1. Bệnh Alzheimer trên thế giới và Việt Nam ............................................... 3 1.1.2. Đặc điểm lâm sàng của bệnh Alzheimer................................................... 5 1.1.3. Chẩn đoán và phòng ngừa bệnh Alzheimer ............................................. 6 1.1.4. Mối liên hệ giữa stress oxi hóa và bệnh Alzheimer.................................. 9 1.1.5. Vai trò của β-amyloid trong bệnh Alzheimer ......................................... 10 1.2. Tổng quan về flavonoids và các nghiên cứu flavonoids từ thực vật ......... 12 1.2.1. Tổng quan về flavonoids.......................................................................... 12 1.2.2. Giá trị sinh học của flavonoids ............................................................... 15 1.3. Tổng quan về Hoa hòe (Sophora japonica L.) ............................................. 19 1.3.1. Giới thiệu chung ...................................................................................... 19 1.3.2. Thành phần hóa học của cây hoa hòe .................................................... 20 1.3.3. Công dụng của hoa hòe ........................................................................... 21 Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 23 2.1. Nguyên liệu ..................................................................................................... 23 2.1.1. Mẫu thực vật ............................................................................................ 23 2.1.2. Mẫu peptide .............................................................................................. 23 2.2. Hóa chất .......................................................................................................... 23 2.3. Thiết bị thí nghiệm ........................................................................................ 23 2.3.1. Thiết bị tách chiết và xác định hợp chất ................................................. 23 2.3.2. Thiết bị đánh giá khả năng bắt gốc tự do và giảm sự tích tụ peptide βamyloid 24 2.4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 24 Đỗ Thị Hải Anh ii Sinh học thực nghiệm K25 2.4.1. Phương pháp tách chiết........................................................................... 24 2.4.2. Phương pháp sắc ký bản mỏng ............................................................... 25 2.4.3. Phương pháp sắc ký cột ........................................................................... 26 2.4.4. Phương pháp chiết lỏng – lỏng ............................................................... 28 2.4.5. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân .................................................. 29 2.4.6. Phương pháp khối phổ ............................................................................ 31 2.4.7. Phương pháp chuẩn bị mẫu β-amyloid và các dung dịch chất chuẩn, chất tinh sạch ......................................................................................................... 32 2.4.8. Phương pháp bắt gốc tự do DPPH ......................................................... 33 2.4.9. Phương pháp thực nghiệm huỳnh quang Thioflavin T ......................... 35 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 37 3.1. Phân lập và tinh sạch các hợp chất chính có trong dịch chiết................... 37 3.1.1. Phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký bản mỏng ....................... 37 3.1.2. Tinh sạch các chất bằng phương pháp sắc ký cột.................................. 38 3.1.3. Tinh sạch chất bằng phương pháp sắc ký lỏng-lỏng ............................. 40 3.2. Xác định các hợp chất có trong phân đoạn chính ...................................... 42 3.2.1. Xác định cấu trúc chất C2 ....................................................................... 42 3.2.2. Xác định cấu trúc chất C6 ....................................................................... 45 3.3. Đánh giá khả năng làm giảm sự tích lũy β-amyloid ................................... 52 3.3.1. Hoạt tính chống oxi hóa .......................................................................... 52 3.3.2. Hoạt tính làm giảm sự tích tụ peptide β-amyloid ................................... 54 KẾT LUẬN .................................................................................................................. 56 KIẾN NGHỊ ................................................................................................................. 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 57 Đỗ Thị Hải Anh iii Sinh học thực nghiệm K25 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả phân tách dịch chiết nụ hoa hòe bằng phương pháp sắc ký cột ...... 38 Bảng 3.2. Kết quả sắc ký bản mỏng các phân đoạn thu được sau khi chạy sắc ký cột 39 Bảng 3.3. Tổng kết các chất tinh sạch và cao khô thu được từ dịch chiết nụ hoa hòe . 41 Bảng 3.4. Bảng so sánh giá trị peak của quercetin chuẩn với chất C2 ......................... 43 Bảng 3.5. Thành phần nguyên tố của hợp chất C6 ....................................................... 47 Bảng 3.6. Bảng so sánh giá trị peak của Neohesperidin chuẩn và chất C6 .................. 50 Bảng 3.7. Giá trị quét gốc tự do DPPH của các chất .................................................... 53 Đỗ Thị Hải Anh iv Sinh học thực nghiệm K25 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ minh họa quá trình tạo nên đám rối tơ thần kinh [4] ............................ 7 Hình 1.2. Mảng viêm thần kinh do sự tích tụ β-amyloid ở não bệnh nhân Alzheimer [2] .................................................................................................................................. 11 Hình 1.3. Cấu trúc vòng flavonoid ................................................................................ 13 Hình 1.4. Cây hoa hòe ................................................................................................... 20 Hình 2.1. Sơ đồ minh họa cột sắc ký ............................................................................ 27 Hình 2.2. Sơ đồ minh họa hoạt động của hệ ESI-MS/MS ............................................ 32 Hình 3.1. Kết quả sắc ký bản mỏng dịch chiết nụ hoa hòe ........................................... 37 Hình 3.2. Các phân đoạn khác nhau sau khi chạy sắc ký cột ....................................... 39 Hình 3.3. Kết quả sắc ký bản mỏng các chất C2 và C6 khi so sánh với quercetin và rutin chuẩn ..................................................................................................................... 40 Hình 3.4. Chất C6.......................................................................................................... 41 Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của quercetin chuẩn ............................................................... 42 Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của C2 .................................................................................... 43 Hình 3.7. Công thức cấu tạo của chất C2 – quercetin ................................................... 45 Hình 3.8. Phổ khối lượng ESI của chất C6 ................................................................... 46 Hình 3.9. Phổ 1H-NMR của Neohesperidin chuẩn ....................................................... 48 Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của chất C6 .......................................................................... 48 Hình 3.11. Phổ 13C-NMR của Neohesperidin chuẩn ................................................... 49 Hình 3. 12. Phổ 13C-NMR của chất C6 ....................................................................... 49 Hình 3.13. Cấu trúc hóa học của C6 – neohesperidin ................................................... 51 Hình 3.14. Đồ thị đường chuẩn khả năng chống oxi hóa của vitamin C ...................... 52 Hình 3.15. Biểu đồ thể hiện sự tích lũy β-amyloid trong các điều kiện khác nhau ...... 54 Đỗ Thị Hải Anh v Sinh học thực nghiệm K25 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Aβ Β-amyloid DPPH 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl MS Mass Spectrometry – Phổ khối lượng NMR Nuclear Magnetic Resonance – Phổ cộng hưởng từ hạt nhân SSTT Sa sút trí tuệ Đỗ Thị Hải Anh vi Sinh học thực nghiệm K25 MỞ ĐẦU Nhờ sự tiến bộ của khoa học công nghệ và sự phát triển của kinh tế xã hội, cuộc sống của con người ngày càng được cải thiện. Tuổi thọ trung bình của loài người tăng lên là một thành tựu đối với y tế công cộng và là kết quả của sự phát triển kinh tế, xã hội. Tuy nhiên cũng gây thách thức về vấn đề chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cho một số lượng lớn người cao tuổi trong xã hội. Tuổi già làm tăng nguy cơ phát triển các bệnh mạn tính và thoái hóa. Một trong những bệnh mạn tính không lây nhiễm và thoái hóa thường gặp ở người cao tuổi là hội chứng sa sút trí tuệ (SSTT), trong đó bệnh Alzheimer chiếm tới 50-70%. Hiện nay tỉ lệ mắc SSTT tăng theo tuổi theo hàm số mũ rên toàn thế giới, theo báo cáo của Hiệp hội Alzheimer thế giới, có khoảng 50 triệu người mắc bệnh Alzheimer trong năm 2016, và ước tính sẽ lên đến khoảng 150 triệu người vào năm 2050. Sa sút trí tuệ thật sự là một thảm hoạ đối với người cao tuổi. Bệnh gây suy giảm trí nhớ và nhiều lĩnh vực nhận thức khác, kèm theo với những rối loạn về hành vi, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến khả năng hoạt động và chất lượng sống của bệnh nhân. Người mắc bệnh Alzheimer bị mất dần khả năng tự chăm sóc và ngày càng phụ thuộc vào người khác trong việc thực hiện các hoạt động thể chất và tinh thần cơ bản nhất. Chi phí cho điều trị bệnh Alzheimer rất tốn kém, chỉ đứng sau các bệnh tim mạch và ung thư. Vì vậy việc tìm ra các phương pháp phòng ngừa và chữa trị bệnh Alzheimer là vô cùng cần thiết đối với xã hội hiện nay. Việt Nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật phong phú với trữ lượng lớn, có nhiều tiềm năng về cây thuốc. Cây hoa hòe (Sophora japonica L.) là một loại cây được trồng phổ biến ở Việt Nam. Cây vừa cho bóng mát, vừa cung cấp các giá trị khác đặc biệt về kinh tế và y học. Hoa hòe là một vị thuốc được sử dụng rộng rãi trong các bài thuốc y học cổ truyền từ xưa đến nay. Mọi bộ phận của cây, đặc biệt là quả khô, hoa và chồi có giá trị rất lớn trong y học như nụ hoa hòe được dùng làm thuốc cầm máu cho các bệnh đổ máu cam, ho ra máu, ruột chảy máu, tiểu tiện ra Đỗ Thị Hải Anh 1 Sinh học thực nghiệm K25 máu ở dạng thuốc sắc. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng thành phần flavonoids ở trong thực vật có khả năng giúp chống oxi hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, và đặc biệt là khả năng giảm sự tích lũy peptide β-amyloid – một loại peptide gây bệnh Alzheimer. Vì các lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng ức chế hình thành β-amyloid gây bệnh Alzheimer bởi một số hoạt chất từ hoa hòe (Sophora japonica L.)” với mục đích:  Tách chiết và tinh sạch các chất có hoạt tính sinh học từ nụ cây hoa hòe.  Đánh giá khả năng ngăn chặn sự tích tụ peptide β-amyloid in vitro từ một số chất tách từ nụ hoa hoè. Đỗ Thị Hải Anh 2 Sinh học thực nghiệm K25 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer 1.1.1. Bệnh Alzheimer trên thế giới và Việt Nam Bệnh Alzheimer là một bệnh thoái hóa thần kinh, biểu hiện bằng giảm trí nhớ và những rối loạn nhận thức khác, kèm theo các thay đổi về hành vi, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hoạt động nghề nghiệp và xã hội của bệnh nhân. Bệnh tiến triển nặng dần và không hồi phục. Bệnh do bác sĩ Alois Alzheimer phát hiện lần đầu năm 1901, ông là người đầu tiên mô tả lâm sàng và đặc điểm giải phẫu bệnh lý của bệnh bao gồm các búi tơ thần kinh (neurofibrillary tangles) và các mảng dạng tinh bột (amyloid plaque). Sau này bệnh được mang tên ông, gọi là bệnh Alzheimer [18]. Trước kia, bệnh Alzheimer thường được dùng chỉ các trường hợp SSTT với người ở độ tuổi 45-65 với những tổn thương mô học điển hình nên còn được gọi là SSTT trước tuổi già (presenile dementia). Còn khái niệm SSTT tuổi già (senile dementia) được xem là do quá trình lão hoá bình thường của não, chủ yếu do các mạch máu trong não bị “xơ cứng” trong quá trình lão hóa. Từ những năm 70 – 80 của thế kỷ XX, người ta thấy biểu hiện lâm sàng cũng như đặc điểm tổn thương giải phẫu bệnh tương tự ở người trẻ cũng như ở người già nên danh từ bệnh Alzheimer được dùng để chỉ các trường hợp có đặc điểm lâm sàng, tiến triển và giải phẫu bệnh điển hình, bất kể ở lứa tuổi nào [23]. Tuổi càng cao, tỷ lệ mắc SSTT càng nhiều. Cứ sau mỗi năm năm, tỷ lệ mắc bệnh của sa sút trí tuệ toàn bộ lại tăng gần gấp đôi, từ 1,5% ở độ tuổi 60-69 lên 40% ở độ tuổi 90. Một nhóm chuyên gia đã ước tính tỷ lệ mắc bệnh toàn bộ của sa sút trí tuệ ở những người từ 60 tuổi trở lên trên toàn thế giới là 3,9%, Châu Phi là 1,6%, Đông Âu là 3,9%, Trung Quốc 4,0%, Mỹ La tinh 4,6%, Tây Âu 5,4% và Bắc Mỹ 6,4%. Trong các nguyên nhân gây sa sút trí tuệ, bệnh Alzheimer hay gặp nhất chiếm từ 50 đến 70%, Đỗ Thị Hải Anh 3 Sinh học thực nghiệm K25 tiếp đến là sa sút trí tuệ do mạch máu từ 14 đến 25%, còn lại là các nguyên nhân khác [42]. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới, hiện số người mắc SSTT trên toàn thế giới vào khoảng 50 triệu người. Con số này ước tính sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030 (65,7 triệu) và tăng gấp hơn ba lần vào năm 2050 (115,4 triệu người) [60]. Với xu hướng già hoá dân số, cứ sau mỗi khoảng hai mươi năm số người mắc sa sút trí tuệ sẽ tăng gấp đôi. Mặc dù tỷ lệ mới mắc sa sút trí tuệ ở khu vực các nước phát triển cao hơn, nhưng đa số người bị sa sút trí tuệ sống ở các nước đang phát triển. Trung Quốc và các nước khu vực Tây Thái Bình Dương có số người mắc sa sút trí tuệ cao nhất (6 triệu người), tiếp theo là Cộng đồng Châu Âu (5 triệu), Hoa kỳ (2,9 triệu) và Ấn Độ (1,5 triệu). Tỷ lệ tăng số lượng bệnh nhân sa sút trí tuệ dao động rất nhiều theo vùng, ở các nước đang phát triển cao hơn các nước phát triển từ ba đến bốn lần. Hậu quả là tỷ lệ người bị sa sút trí tuệ ở các nước đang phát triển dự đoán sẽ tăng từ 61% (năm 2000) lên 65% (năm 2020) và 71% (năm 2040). Tình hình mắc bệnh Alzheimer cũng có bức tranh tương tự [7]. Ở Việt Nam, theo khảo sát của Bệnh viện Tâm thần tiến hành trên 258 người từ 65 tuổi trở lên được chọn ngẫu nhiên từ cộng đồng tại thành phố Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ mắc SSTT là 7,8% [3]. Nghiên cứu của Bệnh viện Lão khoa Trung ương về tỷ lệ mắc và một số yếu tố liên quan đến SSTT ở người cao tuổi tại huyện Ba Vì, Hà Nội năm 2005 - 2006 cho thấy tỷ lệ người cao tuổi (từ 60 tuổi trở lên) sống tại cộng đồng có SSTT là 4,63%. Cứ sau mỗi khoảng cách 5 tuổi, tỷ lệ mắc bệnh lại tăng lên 1,78 lần [2, 5]. Trong một nghiên cứu về một số đặc điểm dịch tễ học sa sút trí tuệ và suy giảm nhận thức nhẹ ở người cao tuổi Hà Nội (thực hiện trong giai đoạn 2009- 2010) cho thấy tỷ lệ người cao tuổi có sa sút trí tuệ tại xã Thanh Xuân huyện Sóc Sơn, Hà Nội là 5,1% trong tổng số 410 người cao tuổi, ở phường Phương Mai quận Đống Đa, Hà Nội là 3,2% trong tổng số 556 người cao tuổi [7]. Đỗ Thị Hải Anh 4 Sinh học thực nghiệm K25 Tuy chưa có một điều tra mang tính đại diện cho thực trạng sa sút trí tuệ ở người cao tuổi tại Việt Nam nhưng qua một số nghiên cứu đã được tiến hành thì tỷ lệ mắc sa sút trí tuệ và bệnh Alzheimer tại Việt Nam cũng tương tự như ở các nước khác trong khu vực. 1.1.2. Đặc điểm lâm sàng của bệnh Alzheimer Bệnh Alzheimer biểu hiện bằng giảm trí nhớ và những rối loạn nhận thức khác, kèm theo các thay đổi về hành vi [4, 5].  Giảm trí nhớ: là biểu hiện đầu tiên làm cho bệnh nhân và người nhà chú ý. Đây là triệu chứng đặc trưng nhất của bệnh. Trong giai đoạn đầu chủ yếu giảm trí nhớ gần (không còn khả năng ghi nhận các thông tin mới), giảm khả năng hiểu ngữ nghĩa, nhắc đi nhắc lại một chi tiết. Khi bệnh tiến triển nặng hơn, bệnh nhân quên cả những thông tin đã tiếp thu được từ trước, thậm chí quên tên người thân.  Mất ngôn ngữ (aphasia): Giảm ngôn ngữ là triệu chứng nổi bật trong bệnh cảnh lâm sàng của bệnh Alzheimer. Bệnh nhân diễn đạt ý nghĩ của mình ngày càng khó khăn, ngôn ngữ nghèo nàn, không lưu loát, khó tìm từ, nói vòng vo, không hiểu hết lời nói của người đối diện, không thể tiếp xúc cùng lúc với nhiều người. Trong giai đoạn muộn, bệnh nhân không nói gì, mất giao tiếp hoàn toàn gây khó khăn lớn cho mối quan hệ giữa bệnh nhân và người chăm sóc.  Mất sử dụng động tác (apraxia): Gần như tất cả bệnh nhân Alzheimer ở giai đoạn nặng đều có mất sử dụng động tác (apraxia). Hay gặp nhất là mất sử dụng động tác ý-vận (ideomotor apraxia), bệnh nhân không có khả năng chuyển một ý định thành động tác có định hướng không gian chính xác, làm cho bệnh nhân khó thực hiện các hoạt động sinh hoạt hàng ngày.  Mất nhận biết (agnosia), mất khả năng tổng hợp suy luận và rối loạn chức năng thực hiện. Bệnh nhân than phiền là không nhìn rõ đồ vật và vì vậy khó khăn trong việc xác định đồ vật đó. Họ không thể sao chép hoặc miêu tả đồ vật một Đỗ Thị Hải Anh 5 Sinh học thực nghiệm K25 cách chính xác, không thể phân biệt các đồ vật tương tự nhau, không thể nhận biết được tất cả các chi tiết của đồ vật, không thể nhận ra được đồ vật dưới các góc nhìn bất thường hoặc không thể phân biệt các hình chồng lên nhau… Bệnh nhân mất khả năng nhận mặt những người quen, mất khả năng nhận diện loài hoa, loại ô tô…  Suy giảm khả năng thực hiện hoạt động: biểu hiện bằng không có khả năng quản lý các nhiệm vụ phức tạp như chi tiêu trong gia đình hoặc chuẩn bị bữa ăn.  Các triệu chứng về hành vi: là những biểu hiện lâm sàng quan trọng và đôi khi bệnh nhân đến khám vì những triệu chứng này: không thừa nhận bệnh, thờ ơ, rối loạn tâm thần (hoang tưởng, ảo giác), rối loạn cảm xúc (trầm cảm, lo âu), kích động,… Biểu hiện lâm sàng điển hình của bệnh Alzheimer theo mức độ:  Nhẹ: Trí nhớ giảm, có thể không rõ với những người thường xuyên tiếp xúc với bệnh nhân, không thực hiện được các hoạt động phức tạp (ví dụ chuẩn bị bữa ăn, chi tiêu), vẫn tự chăm sóc được bản thân, tính tình trở nên thụ động, ít hoặc không có các biểu hiện về hành vi.  Trung bình: Trí nhớ giảm rõ, không thực hiện được các hoạt động thông thường (như sử dụng bếp, gọi điện thoại), không tự chăm sóc được bản thân (như tắm rửa, trang điểm), có rối loạn hành vi (hội chứng hoàng hôn, hoang tưởng hệ thống - paranoia), kỹ năng giao tiếp xã hội thay đổi, cần người giám sát.  Nặng: Trí nhớ giảm nhiều, chỉ còn những mảnh vụn, không nhận biết được người thân, không thực hiện được mọi hoạt động phức tạp, giảm vận động, cần có người chăm sóc thường xuyên. 1.1.3. Chẩn đoán và phòng ngừa bệnh Alzheimer  Chẩn đoán Xác định bệnh Alzheimer chỉ dựa trên giải phẫu bệnh học. Hai tổn thương đặc trưng nhất của bệnh Alzheimer là mảng lão hóa và đám rối tơ thần kinh. Các tổn Đỗ Thị Hải Anh 6 Sinh học thực nghiệm K25 thương này thường xuất hiện trong não nhiều năm trước khi bệnh biểu hiện đầy đủ trên lâm sàng. Ở các tế bào thần kinh bệnh lý xảy ra hiện tượng các vi ống tan rã, tức là các đơn vị vi quản tách rời nhau, hình thành nên đám rối tơ thần kinh. (hình 1.1). Hình 1.1. Sơ đồ minh họa quá trình tạo nên đám rối tơ thần kinh [4] Tuy nhiên, các kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh hiện đại cũng được xem là có giá trị hỗ trợ chẩn đoán các trường hợp có khả năng là bệnh Alzheimer (probable Alzheimer’s disease). Phương pháp chụp cộng hưởng từ (MRI) sọ não cũng giúp nhận dạng được tình trạng teo vỏ não thùy trong rãnh mũi và teo hồi hải mã ở bệnh nhân Alzheimer. Các chụp hình hệ thần kinh như chụp cắt lớp phát điện tử dương (Positron Emission Tomography/PET) và chụp cắt lớp phát photon đơn (Single Photon Emission Tomography/SPECT) giúp cho thấy có hình ảnh của giảm chuyển hóa hay giảm tưới máu tại các vùng thái dương đỉnh phía sau.  Phòng ngừa: Có rất nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã và đang cố tìm những biện pháp nhằm giảm, hạn chế các yếu tố nguy cơ: Đỗ Thị Hải Anh 7 Sinh học thực nghiệm K25  Liệu pháp hóc môn thay thế: Nhiều nghiên cứu trên thế giới cùng ghi nhận kết quả ở phụ nữ khi dùng liệu pháp thay thế hóc môn đều giảm được triệu chứng sa sút trí tuệ. DHEA (dehydroepiandrosterone) là hóc môn dùng chống lão hóa ở nữ có tác dụng làm giảm nguy cơ bệnh Alzheimer. Ở nam giới thì liệu pháp thay thế bằng testosteron có hiệu quả tương tự như nữ giới [40].  Thuốc kháng viêm không có thành phần steroid: Nhiều nghiên cứu cho thấy dùng các thuốc kháng viêm không có thành phần steroid sẽ chống lại sự tích tụ beta Amyloid trong não [24].  Statin: đây là thuốc làm giảm cholesterol máu. Một vài nghiên cứu cho thấy những người dùng statin giảm được 70% nguy cơ bị sa sút trí tuệ [20].  Chế độ ăn uống  Chất béo: Một nghiên cứu ở Hà Lan cho thấy có mối liên hệ giữa sa sút trí tuệ và chế độ ăn nhiều chất béo toàn phần, chất béo bão hòa và cholesterol. Tuy nhiên mỡ dạng omega-3 có tác dụng chống lão hóa cho tế bào não. Người ta khuyến cáo năng lượng từ chất béo chỉ nên ở mức dưới dưới 30% tổng nhu cầu hàng ngày [46].  Rau quả sậm màu: Nghiên cứu cho thấy các loại rau quả có mầu sẫm có tác dụng bảo vệ não chống lại sự lão hóa.  Đậu nành: Có chứa một thành phần giống estrogen; trên động vật thí nghiệm cho thấy có tác dụng bảo vệ chống lại bệnh Alzheimer. Đậu nành đặc biệt tốt cho phụ nữ sau mãn kinh [16].  Rượu: Nếu dùng lượng vừa phải (một đến hai ly mỗi ngày) thì có tác dụng tốt bảo vệ não do kích thích phóng thích acetylchotine (chất dẫn truyền thần kinh bị khiếm khuyết trong bệnh Alzheimer [47].  Folate và vitamin B12: có tác dụng làm giảm hemocysteine (chất làm tăng nguy cơ Alzheimer và bệnh tim mạch) [45]. Đỗ Thị Hải Anh 8 Sinh học thực nghiệm K25  Vitamin chống oxi hóa: chủ yếu là vitamin E và C, chống sự giải phóng gốc tự do làm tổn thương tế bào.Vắc xin: Dùng vắc xin giúp kích thích cơ thể tạo ra kháng thể đặc hiệu tiêu hủy các phân tử protein liên quan đến bệnh Alzheimer [37]. 1.1.4. Mối liên hệ giữa stress oxi hóa và bệnh Alzheimer Chuyển đổi năng lượng là một trong những quá trình rất cơ bản của cuộc sống. Chuyển đổi năng lượng có từ khi bắt đầu sự sống thông qua các cơ chế đơn giản, ví dụ như việc dịch chuyển các ion trong màng bán thấm có mặt trong tất cả các sinh vật sống. Sự chuyển đổi này là những phản ứng oxi hóa khử, trong đó các electron được truyền trong một chuỗi từ chất cho đầu tiên thông qua các chất trung gian để đến chất nhận cuối cùng. O2 + 4 e- + 4H+ → 2H2O Ở người và các động vật, thường chất nhận cuối cùng là O2. Trong các phản ứng, một phần O2 bị khử để tạo ra O2-, H2O2 và ion OH-. Những chất trung gian này ẩn chứa nguy hiểm vì chúng hoạt động mạnh và do đó khó kiểm soát (ví dụ như OH-), hoặc chúng là tiền chất dễ dàng hình thành các chất phản ứng không kiểm soát được ví dụ như O2•- + NO  peroxynitrite. Các chất oxi hóa khử như O2•-, H2O2, HO• được gọi là các tác nhân oxi hóa (ROS). Các tác nhân oxi hóa được định nghĩa rộng rãi là các chất chứa oxy với khả năng phản ứng hóa học tích cực. Sự sống trong môi trường hiếu khí và với O2 là chất nhận điện tử cuối cùng dẫn đến việc sản xuất ROS liên tục trong cơ thể. Do tầm quan trọng của chuyển đổi năng lượng, hầu hết ROS có nguồn gốc từ chuỗi hô hấp và có khả năng gây nguy hiểm. Vì vậy một số enzyme và các phân tử nhỏ tồn tại để kiểm soát mức ROS. Nhìn chung, ROS được giữ ở mức thấp nhưng chưa loại bỏ được hoàn toàn. Sự tích tụ nồng độ ROS quá cao là nguy hiểm và được xác định là stress oxi hóa. Xem xét vai trò trung tâm của oxy, các hệ thống sản xuất và loại bỏ ROS khác nhau, cách điều hòa các tác nhân này, sự stress oxi hóa được quan sát thấy trong vô số Đỗ Thị Hải Anh 9 Sinh học thực nghiệm K25 các bệnh. Đặc biệt, trong các bệnh thoái hóa thần kinh như Alzheimer và Parkinson, não bộ cho thấy sự tổn thương do oxi hóa và stress oxi hóa một cách rõ ràng. Bộ não có thể đặc biệt nhạy cảm với stress oxi hóa do sự tiêu thụ oxy rất cao của não (chiếm 20% tổng lượng tiêu thụ cơ thể). Quá trình oxi hóa các phân tử sinh học trong bệnh Alzheimer chủ yếu liên quan đến các phân tử sinh học của màng tế bào thần kinh và làm gián đoạn tính toàn vẹn của màng tế bào. Nó liên quan đến quá trình oxi hóa chất béo, protein và axit nuleic. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng stress oxi hóa đóng một vai trò quan trọng trong sinh bệnh học Alzheimer và có liên quan đến sự hiện diện của peptide β-amyloid (Aβ) [12]. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu đã cung cấp các bằng chứng về việc tăng các stress oxi hóa bao gồm:  Tăng sắt, nhôm và thủy ngân trong não bệnh nhân Alzheimer, các ion này kích thích tạo gốc tự do.  Tăng lipid peroxide và giảm axit béo không bão hòa, tăng 4hydroxynonenal – một sản phẩm aldehyde của peroxi hóa lipid.  Tăng sự xuất hiện các protein và tăng quá trình oxi hóa DNA.  Giảm chuyển hóa năng lượng và giảm cytochrome C oxidase. Nghiên cứu cho thấy rằng peptide β-amyloid có khả năng kích hoạt tạo thêm các gốc tự do. Các bằng chứng gián tiếp hỗ trợ cho kết luận này xuất phát từ các nghiên cứu in vitro cho thấy gốc tự do là trung gian thoái hóa thần kinh và liên quan đến sinh bệnh học trong bệnh Alzheimer [61]. 1.1.5. Vai trò của β-amyloid trong bệnh Alzheimer Bệnh Alzheimer được coi như một dạng thoái hóa amyloid – kết quả của quá trình biến đổi bất thường của protein tiền thân amyloid (APP), một protein xuyên màng mà chức năng cho đến nay vẫn chưa được hiểu rõ. Mảng viêm thần kinh (neuritic plaque) nằm ngoài tế bào, chủ yếu chứa amyloid, một chất liệu chứa protein và các yếu tố tế bào (hình 1.2). Dạng amyloid lắng động trong não bệnh nhân Alzheimer là β- Đỗ Thị Hải Anh 10 Sinh học thực nghiệm K25 amyloid (Aβ). Aβ là một peptid chứa các đoạn gồm 39-43 axit amin, được phân giải từ APP. Quá trình phân giải APP là quá trình phân cắt protein trong màng liên quan đến 3 loại enzyme: α-, β- và γ- secretase. Trước tiên APP bị cắt bởi α- hoặc β- secretase. Sản phẩm của lần phân cắt đầu tiên được cắt lại 1 lần nữa nhờ γ- secretase. Sảm phẩm thu được bao gồm 1 phân đoạn protein tan hình thành từ đoạn cắt α- γ- và 1 phân đoạn không tan tự kết tụ (Aβ40 và Aβ42) từ đoạn cắt β- γ-. Đoạn protein vùng carboxyl còn lại từ quá trình biến đổi của APP di chuyển vào trong nhân và hoạt hóa sự biểu hiện các gen [11]. Hình 1.2. Mảng viêm thần kinh do sự tích tụ β-amyloid ở não bệnh nhân Alzheimer [2] Aβ40 là dạng phổ biến nhất của Aβ trong dịch não tủy và huyết tương ở người. Aβ42 kết tụ thành các sợi amyloid nhanh hơn so với Aβ40, Aβ42 có mặt ở cả những mảng lan tỏa mới hình thành cũng như những mảng viêm thần kinh đã hình thành đầy đủ [51]. Aβ sợ có tính chất gây độc ở mức độ in vitro và in vivo [17]. Sự lắng đọng của Aβ cho phép tiên lượng trước các triệu chứng lâm sàng của bệnh Alzheimer Tổng hàm lượng Aβ trong vỏ não tăng lên trong quá trình tiến triển bệnh tương ứng với sự suy giảm nhận thức, và thường xuất hiện trước khi hình thành các đám rối tơ thần kinh [36]. Điều này gợi ý rằng sự bất bình thường trong quá trình biến đổi từ APP đến Aβ Đỗ Thị Hải Anh 11 Sinh học thực nghiệm K25 hoặc sự thoái hóa và phân giải của Aβ có thể là sự biến đổi hóa sinh đầu tiên của bệnh Alzheimer [35]. Sự suy giảm các peptid Aβ cũng có thể góp phần dẫn tới trường hợp mắc Alzheimer thể muộn [27]. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng β-amyloid 1-42 cảm ứng quá trình stress oxi hóa và gây độc thần kinh thông qua các biểu hiện sau:  Aβ1-42 gây ra oxi hóa protein: Khi thêm Aβ1-42 vào các neuron thần kinh dẫn đến sự tăng biểu hiện protein carbonyl và giảm sự sống sót của tế bào so với mẫu đối chứng [57, 62, 63].  Aβ1-42 gây ra peroxi hóa lipid trong màng não: Thêm Aβ1-42 vào môi trường nuôi neuron hoặc màng synaptosomal dẫn đến sự hình thành 4hydroxy-2-nonennal (HNE) hoặc isoprostanes, cả hai sản phẩm của peroxi hóa lipid [33, 34]. 1.2. Tổng quan về flavonoids và các nghiên cứu flavonoids từ thực vật 1.2.1. Tổng quan về flavonoids 1.2.1.1. Khái niệm và nguồn gốc Khái niệm: Là nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong dược liệu nguồn gốc thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa… Phần lớn các flavonoid có màu vàng (bắt nguồn từ flavus có nghĩa là màu vàng), tuy vậy, một số sắc tố xanh, tím đỏ, không màu cũng được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học chúng có cùng khung sườn cơ bản. Flavonoid là hợp chất phenol có cấu trúc khung cơ bản là 1,3-diphenylpropan, nghĩa là hai vòng benzene A và B nối nhau qua dây có 3 carbon, nên thường được gọi là C6-C3-C6 [19]. Nguồn gốc: Cũng giống vitamin C, các flavonoid được phát hiện bởi Albert Szent-gyorgyi (1893-1986). Ông nhận giải Nobel năm 1937 với những khám phá quan trọng về đặc tính của vitamin C và flavonoid. Trong quá trình phân lập vitamin C, Szent-Gyorgyi đã khám phá ra các flavonoid. Ban đầu ông gọi chất này là “vitamin P”, do có khả năng làm giảm tính thấm thành mạch của nó, một trong những triệu chứng Đỗ Thị Hải Anh 12 Sinh học thực nghiệm K25