Tài liệu Nghiên cứu khả năng thủy phân protein của alpha-chymotrypsin và papain khi bị viêm

BỘ Y T Ế TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG THUỶ PHÂN PROTEIN CỦA a-CHYMOTRYPSIN VÀ PAPAIN KHI BỊ VIÊM KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c s ĩ ĐẠI HỌC KHOÁ 1995-2000 Người thực hiện : Sinh viên Lê Thị Diễm Hồng Người hướng dẫn : PGS. TS. iNguyễn Xuân Thắng Nơi thực hiện : Bộ môn hoá sinh-Vi sinh Thòi gian thực hiện: 6/03 đến 23/05/2000 HÀ NỘI, 5-2000 ĩ n i LƠ I CAM- Ơ9Í Em xin được bàv tỏ ỉòng biết ơn chân ửiầnh, lờ i cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Xuân Thắng, người ửiầv đã n h iệt tình hướng dẫn và h ế t lòng giúp đỡ em hoàn thành bẩn khoầ luận nầỵ. ẼĨĨ1 xừl thành cẩm ơn cha mẹ, các thây giáo, cô giáo trưởng đại học Dược Hà N ộ i đặc biệt là cấc thầỵ giáo, cô giảo, các cô k ỹ thuật viên Bộ môn Hoá Sinh - Vi sinh đã động viên, giúp đỡ em n h iệt tình trong suốt thời gian học tập và thưc hiện đ ề tài. Hà Nội, ửiáng 5 năm 2000 Sinâ viên Lê Tili (Diêm J-Cồng MỤC LỤC Mục lụ c ........................................................................................................................ 1 Chú giải chữ viết tá t.................................................................................................. 2 Phần I: Đặt vấn đề..................................................................................................... 3 Phần II: Tổng quan................................................................................................... 4 1. Tổng quan lý thuyết về viêm.......................................... ....................................4 2. Các mô hình nghiên cứu gây viêm thực nghiệm..............................................10 3. Tổng quan về enzym chống viêm...................................................................... 11 Phần III: Kết quả thực nghiệm............................................................................ 14 1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm................................................. 14 2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét.................. ...................................................17 3. Bàn luận............................................................................................................. 32 Phần IV: Kết luận và đề xuất................................................................................. 35 A. Kết luận............................................................................................................. 35 B. Đề xuất............................ ................................................................................... 36 Tài liệu tham khảo....................................................................................................37 CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT Ịrr Immunoglobulin Globulin miễn dịch IL Interleukin INF Interferon NSAID Non-steroid anti-inflammatory drug Thuốc chống viêm phisteroid PAF Platelet activating factor Yếu tố hoạt hoá tiểu cầu TNF Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỂ Viêm là quá trình bệnh lý rất phố biến, gặp trong nhiều bệnh, do nhiều nguyên nhân gây ra. Nhìn chung, viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể, giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây viêm. Nhưng nếu viêm nặng và kéo dài sẽ dẫn đến những rối loạn chức năng của các cơ quan bộ phận của cơ thể, gâv nhiều ảnh hưởng xấu cho cơ thể và có thể gây nguy hại tới tính mạng của người bệnh. Để đáp ứng được yêu cầu đó, ngưòd ta đã nghiên cứu ra nhiều loại thuốc chống viêm như thuốc chống viêm Steroid, thuốc chống viêm phi Steroid (NSAID). Bên cạnh tác dụng tốt, chúng vẫn còn chứa đựng những yếu tố bất lợi đối với cơ thể như gây suy giảm miễn dịch, xốp xương, loãng xương, kích ứng đường tiêu hoá, ... Chính vì vậv, các thuốc chống viêm có chứa các enzym như protease (papain, a-chymotrypsin) được chế tạo từ những chất gần gũi với cơ thể con người đã và đang được nghiên cứu. Các enzym protease này có vai trò rất quan trọng trong điều trị như kích thích tiêu hoá, chống viêm... Trước đây, ở Việt Nam đã có nhiều côns trình nghiên cứu về protease nhưng chủ yếu để ứng dụng chúng trong phònơ chốns suy dinh dưỡng ở trẻ em mà chưa quan tâm tìm hiểu tác dụng chống viêm và cơ chế chống viêm của chúng. Do đó, chúns tôi đã tiến hành đề tài: ”Nghiên cứu khả năng thuỷ phân Protein của a - Chymotrypsin và papain khỉ bị viêm”. Đê tài này nhằm một sô mục tiêu sau đây: 1. Nghiên cứu khả nãns phân huv protein ở nhữns trạng thái biến tính khác nhau của a-chymotrypsin và papain. 2. Góp phần tìm hiểu cơ chế chống viêm của papain và achvmotrypsin. 3. Tìm hiểu cơ chế tác dụng của chât sây viêm trên in vivo và cơ chế chống viêm trên in viĩro. PHẦN II: TỔNG QUAN 1. Tổng quan lý thuyết về viêm: Theo Ado (1973), viêm là một phản ứng tại chỗ của các mạch máu tổ chức liên kết và hệ thần kinh đối với nhân tố gây bệnh và mối liên hệ của nó đối với tính phản ứng của cơ thể. Theo Vũ Triệu An, viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể mà nền tảng của nó là phản ứng tế bào, phản ứng này được hình thành và phát triển phức tạp dần trong quá trình tiến hoá của sinh vật [4]. Trong từ điển Bách Khoa Dược học định nghĩa: Viêm là một phản ứng tại chỗ của cơ thể, do các mô bị kích thích hoặc bị thương tổn. Đó là một phản ứng phức tạp của các mô liên kết và của mần hoàn mao mạch ở nơi bị tác động, được biểu hiện bằng các triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau và rối loại chức phận [12]. 1.1. Nguyên nhân gây viêm: [4], [8] Có nhiều nguyên nhân gây viêm, có thể chia thành hai nhóm như sau: 1.1.1. Nguyên nhân bên ngoài: - Sinh vật: Do nhiễm vi khuẩn, virus, ký sinh trùng - Vật lý: Cơ học (đụng đập, chấn thương), nhiệt (bỏng nóng hoặc bỏng lạnh), bức xạ ion. - Hoá học: Các chất hoà tan gây hoại tử tế bào như các dung dịch hoá chất (acid, kiềm, muối, ...) hoặc các chất đặc gây thực bào của bạch cầu. 1.1.2. Nguyên nhân bên trong: Các nguyên nhân bên trong có thể gập như hoại tử tổ chức, xuất huyết, tắc mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡng (viêm tắc động mạch), do phản ứng kháng nguyên kháng thể ... 4 Tuy nhiên, rất khó phân biệt rõ ràng hai loại nguyên nhân gây viêm như trên vì trong thực tế, các nguyên nhân bên ngoài thường kèm theo các biến đổi trong cơ thể và từ đó tạo ra các nguyên nhân bên trong. 1.2. Những phản ứng chính tại ổ viêm: Tại ổ viêm có hai loại phản ứng chính xảy ra: [4], [8]. 1.2.1 Phản ứng tuần hoàn: Phản ứng này xảy ra rất sớm sau tổn thương và phát triển ở mức độ khác nhau, phụ thuộc vào sự trầm trọng của tổn thương mô và theo một trình tự sau: 1.2.1.1. Co mạch chớp nhoáng ở các tiểu động mạch xảy ra ngay khi có tác nhân kích thích, do hưng phấn thần kinh co mạch và các cơ tron bị kích thích. 1.2.1.2. Xung huyết động mạch, giãn tiểu động mạch, mao mạch và tiểu tĩnh mạch: Sau khi co mạch chớp nhoáng ở các tiểu động mạch là hiện tượng giãn mạch. Đầu tiên là giãn các tiểu động mạch rồi mao mạch và tiểu tĩnh mạch dẫn đến tăng tuần hoàn tại chỗ nhằm cung cấp năng lượng cho hoạt động tại ổ viêm (gây nóng và đỏ) và đưa nhiều bạch cầu tới ổ viêm làm nhiệm vụ bảo vệ. Nguyên nhân của hiện tượng giãn mạch là do ba yếu tố chính: a. Hưng phấn thần kinh giãn mạch ở vùng động mạch và tiểu động mạch. b. Do tác động của các yếu tố thể dịch có mặt tại ổ viêm như histamin, bradykinin, leucotrien... gây co tế bào nội mô; hoặc các cytokin (IL-1, TNF, INF-y ...) gây nên sự tái tổ chức cấu trúc bộ xương tế bào, dẫn đến hình thành những vùng nối gian bào rộng, những lỗ hổng giữa các tế bào. c. Các sợi liên kết ở vùng mao mạch và tiểu động mạch bị tổn thương, làm giảm trương lực thành mạch, gây giãn mạch. 5 1.2.1.3. Phản ứng tuần hoàn quá mạnh trên dẫn tới các rối loạn nghiêm trọng như giãn mạch cực độ, dòng máu chảy chậm dần, gây tăng tính thấm thành mạch làm thoát dịch rỉ viêm giàu protein vào các mô quanh huyết quản. Do sự chèn ép của dịch ri viêm và do một số yếu tố mạch máu như liệt thần kinh vận mạch, tế bào nội mạc sưng to, tăng độ nhót cửa máu... gây ứ máu làm mất tuần hoàn từ động mạch sang tĩnh mạch, thiếu ôxy, gây rối loạn chuvển hoá nghiêm trọng, tổn thương tổ chức và viêm phát triển toàn diện (biểu hiện lâm sàng là phù và đau). 1.2.2. Phản ứng tế bào: Đây là phản ứng cơ bản nhất phản ánh khả năng bảo vệ của cơ thể chống viêm và trong phản ứng này, bạch cầu đóng vai trò quan trọng nhất. Do tốc tộ tuần hoàn chậm lại, các bạch hầu, chủ vếu là bạch cầu đa nhân trung tính dạt vào thành mạch, bám vào nội mô rồi dừng lại tại một điểm, gọi là vách tụ cầu. Dưới tác dụng của các chất trang gian hoá học như IL-l, TNF và nội độc tố, bạch cầu và tế bào nội mô bộc lộ hai loại phân tử dính trên bề mặt là selectin, integrin. Nhờ đó, khả năng dính của bạch cầu với tê bào nội mô tăng lên rõ rệt. Sau khi dính vào tế bào nội mô, bạch cầu chuyển động nhẹ dọc theo bề mặt nội mô, luồn những chân giả vào kẽ hở giữa các tế bào nội mô. ơiúng xuyên qua vùng nối đã dãn rộng giữa các tế bào nội mô để xen vào giữa tế bào nội mô và màng đáy, và từ đó đi vào khoảng gian bào ngoài mao mạch. Hiện tượng bạch cẩu vận động hướng tới ổ viêm được coi là hiện tượng hoá ứng động bạch cầu. Tác dụng này là do ổ viêm có một số chất có tác dụng gây hoá ứng động: các sản phẩm của vi khuẩn (các peptid có acid amin tận cùng là Nformyl-methionin), các thành phần của hệ thống bổ thể bị hoạt hoá (C3a, C5a, C5b,6,7), các sản phẩm chuyển hoá của acid arachidonic theo đường lipoxygenase hoá (đặc biệt là Ịeucotnen B4), các cytokin, các mảnh vụn sợi 6 tạo keo và các sản phẩm phân huỷ tế bào. tơ huyết và các sán phám phân huv của tơ huyết. [8] Tại ổ viêm, các bạch cầu được hoạt hoá và khi được hoạt hoá, khả năng thực bào của chúng tăng lên rõ rệt. Quá trình thực bào diễn ra như sau: mới đầu bạch cầu tiếp cận vói đối tượng thực bào, rồi bao vây và nuốt đối tượng thực bào bao gồm tất cả vi khuẩn và các mảnh tế bào bị phân huỷ tại ổ viêm. Khi bị thực bào, nghĩa là khi đối tượng đã lọt vào trong thực bào thì có thể xảy ra năm khả năng: [4] + Đối tượng thực bào bị tiêu đi nhờ vai trò của lisosom: Khi các vi khuẩn bị thực bào, chúng tập trung ở khôns bào và gắn với màng bào tương tạo thành thể phagosom, phagosom liên kết với ĩysosom thành phaaolvsomo chứa nhiều hydrolase acid: các men này đóng vai trò phân tiuv vi trùng đổng thời tiêu huỷ cả tế bào thực bào. + Đối tượng thực bào không bị tiêu huỷ, mà tồn tại lâu trong tế bào như bụi than trong thực bào ở phổi (gây bệnh bụi than) ... + Đối tượng thực bào không bị tiêu huỷ và có thể theo thực bào đi nơi khác gây những ổ viêm mới (như trong bệnh lao mãn tính). + Đối tượng thưc bào có thể bi nhả ra mà đại thực bào không chết. ơ . . • o + Đối tượng thực bào làm chết thực bào như vi trùng lao, hay liên cầu khuẩn. 1.3. Các chất trung gian hoá học tham gia vào quá trình viêm: Trong phản ứng viêm có sự tham gia của rất nhiều chất trung gian hoá học. Các chất này được giải phóng ra ngay khi có tác động ban đầu của viêm và trong suốt quá trình viêm, duy trì và khuếch đại phản ứng viêm. Các chất trung gian hoá học gổm có: 7 1.3.1. Các protein của huyết tương: [8] - Hệ thống bổ thể, trong đó đáng chú ý nhất là các thành phần C3a và C5a làm tăng tính thấm thành mạch và gây giãn mạch, chủ yếu là do giải phóng histamin từ các dưỡng bào. C5a cũng hoạt hoá đường chuyển hoá lipoxygenase của acid arachiđonic ở các bạch cầu đa nhân trung tính và các bạch cầu đơn nhân, gây giải phóng tiếp các chất trung gian hoá học của viêm. C5a còn là tác nhân hoá ứng động mạch vđi bạch cầu. - Bradykinin, một chất gây giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch được giải phóng từ 0C2- globulin khi hệ thống kinin bị hoạt hoá dưới tác dụng của yếu tố Hageman (yếu tố x n của đường đông máu nội sinh). - Hệ thống đông và tiêu tơ huyết: Hệ thống đông máu là một ỉoạt những protein của huyết tương có thể bị hoạt hoá bởi yếu tố Hageman. Bưđc cuối cùng của quá trình là sự chuyển fibrinogen thành fibrin do tác động của thrombin. Trong quá trình biến đổi này, các fibrinopeptid được hình thành, nó sây tăng tính thấm mao mạch và có hoạt tính hoá ứng động với bạch cầu. 1.3.2. Các amỉn hoạt mạch: [8] - Histamin: được hình thành sẵn có trong các hạt và được giải phóng do sự mất hạt của các dưỡng bào khi đáp ứng vói các kích thích: tổn thương vật lý (chấn thương, bỏng), phản ứng miễn dịch làm gắn các kháng thể với các dưỡng bào, các đoạn của bổ thể được gọi là các độc tố gây phản vệ (C3a và C5a), các protein giải phóng histamin xuất phát từ bạch cầu, các neuropeptid, các cytokin (IL-1, IL-8). Histamin gây giãn các tiểu động mạch và tăng tính thấm thành mạch của các tiểu tĩnh mạch. - Serotonin: có tác động tương tự như Histamin, được giải phóng từ các tiểu cầu bị kích thích khi chúng kết dính sau khi tiếp xúc vói sợi tạo keo, ADP, các phức hợp nguyên kháng - kháng thể, hoặc do yếu tố hoat hoá tiểu cáu 8 (PAF) có nguồn gốc từ các dưỡng bào trong các phản ứnợ do tác động trung gian của IgE. 1.3.3. Các chất chuyển hoá của Acỉd arachidonỉc: [8] Các chất chuyển hoá của acid arachidonic như prostaglandin, prostacyclin, thromboxan (chuyển hoá theo đường cyclooxvgenase), leucotrien (chuyển hoá theo đường lipoxygenase). Acid arachidonic là một thành phần bình thường của màng lipid và được giải phóng do tác động của phospholipase A2. Các chất chuvển hoá của nó như prostacyclin và thromboxan đóng vai trò quan trọng trong điều hoà đông máu. Trong viêm, prostaglandin A2 làm tăng tốc độ dòng máu và kết hợp với các yếu tố khác gây tăng tính thấm thành mạch và gây đau. Prostagỉanđin A2 có hiệu quả chống viêm vì nó làm tăng mức AMP vòng và ức chế chức năng hiệu ứns của tẽ bào viêm. Còn các leucotrien là các chất trung gian tiền viêm mạnh, có tác dụng hoá ứng động bạch cầu. 1.3.4. Yếu tô hoạt hoá tiểu cầu (PAF): [8] PAF là một dẫn xuất của phospholipid màng được sinh ra sau khi hoạt hoá phospholipase A2 và thường được giải phóng đổng thời với các chất chuyển hoá của acid arachidonic. Nhiều loại tế bào có khả năng tổng hợp PAF như bạch cầu đa nhân, đại thực bào, dưỡng bào, tiểu cầu, tế bào nội mô. tế bào biểu mô. PAF hoạt hoá mạnh bạch cầu đa nhân trung tính, kích thích sự dính và xuyên mạnh của bạch cầu, giải phóng các men của thể tiêu, sinh oxy phản ứng và các eicosanoid, gây hoạt hoá và kết dính tiểu cầu. 1.3.5. Các cytokin: [8] Các cytokin là những polypeptid do nhiều loại tế bào sản xuất ra (chủ yếu là Lympho bào và đại thực bào bị hoạt hoá), tham gia vào các phản ứn£ miẻn dịch tế bào và cũng siữ vai trò quan trọng trong phản ứng vièm. Các 9 cytokin chính gồm các yếu tố hoại tử u (TNF a và P) và các interleukin (IL-l. IL-6, IL-8...). TNF, IL-1, IL-6 tham gia phát triển phản ứng viêm tại chỗ hoặc hệ thống, một số phản ứng có thể trở thành mãn tính. Tại chỗ, chíing làm hoạt hoá nội mô, tăng tổng hợp các phân tử dính của tế bào nội mô. Chúng còn gây sốt, làm tăng lượng bạch cầu đa nhân trang tính, tăng sinh nguyên bào sợi và kích thích tổng hợp collagen... Còn IL-8 là một tác nhân hoá ứng động và hoạt hoá mạnh đối với bạch cầu đa nhân trung tính. Nó là chất cảm ứng mạnh của các cytokin khác, chủ yếu là TNF và DL-L 2. Các mô hình nghiên cứu gây viêm thực nghiệm: [18] Như đã nêu ở trên, viêm là quá trình bệnh lý rất phổ biến, gặp trong nhiều bệnh với các cơ chế gây viêm phức tạp do nhiều nguyên nhân và yếu tố sây viêm gây ra. Nhưng để có mô hình gây viêm trong thực nghiệm người ta thường dùng các phương pháp: 2.1. Gây viêm bàng cơ học: Trên chuột cốns hoặc chuột nhắt trắng, cạo lông và nạo mất một phần bề mặt da để gây viêm. 2.2. Gây vièm bằng bỏng: Dùng que sắt nung nóng ở nhiệt độ thích hợp thường 200°c, gây viêm bằng cách gây bỏng. 2.3. Gây viêm bằng hoá chất: 2.3.1. Sử dụng Kaolin: Gây viêm chuột bằng cách tiêm hỗn dịch kaolin 10% vào chân hoặc bàn chân chuột cống trắng hoặc chuột nhắt trắng [18]. 2.3.2. Sử dụng Formol: Tiêm dung dịch Formol 2%vào chân, bàn chân chuột cống trắng hoặc chuột nhắt trắng [19]. Ỉ0 2.3.3. Sử dụng Dextran: Tiêm dung dịch Dextran 6% vào chân, bàn chân chuột cống trắng hoặc chuột nhắt trắng. Ngoài các hoá chất trên còn dùng dầu eroton 1% [18] và các chất khác. Tất cả quá trình gây viêm trên đều có cơ chế chung là gây biến tính protein bình thường của súc vật thí nghiệm tại nơi tiêm. Những protein lạ này sẽ tạo nên những phản ứng viêm do vậy khi cơ thể loại bỏ các loại protein bị biến tính sẽ làm cho quá trình viêm giảm đi. Điều này có thể được giải thích tại sao việc sử dụng protease như a-chymotrypsin hoặc papain có vai trò trong quá trình chống viêm mà trong bản khoá luận này muốn quan sát điều đó. 3. Tổng quan ve enzym chống viêm: Các thuốc chống viêm hoá dược, bên cạnh khả năng chống viêm, còn chứa đựng nhiều tác dụng phụ như gây loét dạ dày, dễ làm chả)' máu, ... Vì vậy, trên thế ơiới, người ta đang hướng đến sử dụng các enzym có tác dụng chống viêm như trypsin, a-chymotrvpsin, papain, ... Các enzym nàv có ưu điểm là tương đối gần gũi với cơ thể con người nên phần nào giúp tránh được những tác dụng không mong muốn. Trong bản khoá luận này chúng tôi nghiên cứu hai enzym chống viêm đó là papain và a-chymotrypsin. 3.1. Papain: 3.1.1. Cấu tạo, tính chất của papaiìt: Papain được lấv từ nhựa quả đu đủ xanh Carica papaya L. Papayaceae [7], [12]. Papain ở dạng kết tinh hav bột có màu trắng hơi vàng, dễ tan trong nước và glycerin, không tan trong phần lớn các dung môi hữu Cứ. Papain có phân tử lượng 23400 [12]. Cấu trúc bậc 1 của nó gổm 212 acid amin với trung tâm hoạt độns; là cystein ở vị trí 25 có mang nhóm - SH. Papain là một [’rotease tương đối bền. Nó ổn định và hoạt động trong khoáng PH tương đối il rộn°- từ pH = 4- 9. Tác dụng tiêu hoá protein của Dapain tiến hành tốt nhất ở môi trường pH = 6,4 - 6,5. Nhiệt độ thích nghi khá cao, có thể đến 80°c, nhưng cao hơn 90°c sẽ mất tác dụng [7]. Papain được hoạt hoá bởi các chất khử (Ví dụ: Thioglycolai:, glutathion, cystein, sulfid, bisulfid, thiosulfat cvaniđ), là nbữns chất làm cho trung tâm hoạt động của papain ở dạng nhóm - SH. Papain bị bất hoạt khi nhóm - SH bị oxy hoá, chuyển thành liên kết disulfua. Các chất ức chế papain là các chất oxy hoá, các thuốc thử phản ứng với nhóm - SH (ví dụ nhu' iodoacetat, iodoacetamid, methyl bromid, N-ethylmaleimid), các ion kim loại nặng (ví dụ, Zn2+, Fe2+, Cu2+, Pb2+, Hg2+) và các muối thuỷ ngân hữu cơ. Sự bất hoạt papain clưới tác động của các kim loại nặng có tính thuận nghịch, nó được phục hồi khi có mặt EDTA và các chất khử (ví dụ như cystein). [16] 3.1.2. Tác dụng sinh học và dược lý của papain: Papain làm mềm thịt ăn, làm trong đổ uống, làm mềm da. Papain phân huỷ protein, đổns thời cũng được dùng làm xúc tác trong tổng hợp các chất angiotensin, dynorphin, enkaphalin, peptid... [12]. Men papain có tác dụng như men pepsin của dạ dày và nhất là giống men trypsin của tuỵ tạng trong sự tiêu hoá các chất thịt. Papain có tác dụng trị giun đũa, giun kim, sán lợn, làm một số vi trùng Gram (+) và Gram (-) ngừng phát triển. Papain còn có tác dụng làm đông sữa, tác dụng giảm độc đối với toxin và toxanbumin, alacaloid [7], [16]. Papain còn có tác dụng chống viêm, chống phù. Nó có khả năng tiêu huỷ các mô chết mà không làm ảnh hưởng tới các mô xung quanh. [16] Nhờ các tác dụng trên, trong y dược người ta sử dụng papam làm thuốc tẩy giun, trị các chứng khó tiẻu, chậm tiêu, viêm dạ dày - ruột, hỗ trợ trong các trường hợp viêm, phù. sau phẫu thuật, chấn thương, nhiễm trùns. [16] 12 3.2. a - Chymotrypsin: 3.2.1. Cấu tạo và tính chất của a - Chymotrypsin: CL - Chymotrypsin có nguồn gốc từ tuỵ lợn, bò... đã được nghiên cứu từ lâu. a - Chymotrypsin được lấy từ tuỵ bò bằng cách chiết với nước acid. [12, 138]. Đặc trung quan trọng của nó là khả năng tiêu protein ở pH = 8 [3]. C6chymotrvpsin thuộc loại serin-protease [2] ưu tiên cắt các liên kết tyrosin, tryptophan, phenylalanin, leucin, thủy ngân các liên kết peptid, amid, este. [15] Trong dịch tuỵ lúc đầu a - Chymotrypsin được sản sinh dưới dạng không hoạt động đó là a - chymotrypsinogen do những tế bào hình hạt nho của tuỵ tạo ra. Sau đó dịch tuỵ chuyển cc - chymotrypsinosen đến tá tràng, ở đây ct - chymotrypsinogen được men trypsin hoạt hoá thành a-ctiymotrypsin [12]. cc-chymotrypsin cắt các liên kết peptid có nhóm carboxyl của các acid amin thơm. [3] 3.2.2. Tác dụng của a - Chymotrypsin: Có tác dụng của một enzym phân giải protein, a-chymoưypsin được dùng uống, tiêm bắp hoặc dùng tại chỗ đê chống viêm và điều trị một số chấn thương, với tính chất là một endopeptidase tuyến tuỵ. Ngoài ra a- chymotrypsin còn được chỉ định trong các trường hợp chống phù nề, kháng viêm trong chấn thương, viêm nhiễm, dùng tại chỗ hoặc tiêm bắp trong các khoa: nội, tai mũi họng, phụ, ngoại (chấn thương và chỉnh hình), da liễu... [ 12]. 13 PHẦN ĨĨI: KẾT QUẢ THựC NGHIỆM 1. Nguyên vật ỉiệu và phương pháp thực nghiệm: 1.1. Nguyên vật liệu: 1.1.1. Enzym: ] .1.1.1. Papain đông khô: dạng tinh thể đã sơ bộ tinh chế bằng phương pháp đông khô thu được từ nhựa mủ quả đu đủ xanh (Carica papaya L. Papayaceae) lấy ở Gia Lâm - Hà Nội. Ll.1.2. a-chymotrypsin dạng kết tinh 21 JU katal (450 E.A.Ư) của hãng Leurquin. 1.1.2. Cơ chất: 1.1.2.1. Lòng trắng trứng. Cân 2g ỉòng trắng trứng sống, cho 1 ít NaCl 0,9% vào hoà tan, cho nước vừa đủ 100ml. Khuấy đều thu được cơ chất lòng trắng trứng sốns 2%. Đun sôi cách thuỷ lọc qua gạc thu được lòng trắng trứng chín 2%. 1.1.2.2. Cơ chất thịt lợn. Câu 2g thịt lợn sống, nghiền trong cối vói nước cho mịn, đổng thể, thêm nước đủ 100ml, lọc qua gạc thu được dịch thịt lợn sống 2%. Đun sôi cách thuỷ, đổng thể, lọc qua gạc được dịch thịt lợn chính 2%. 1.1.3. Thuốc thử: 1.1.3.1.Dung dịch acid Tricloacetic 10% Acid tricloacetic 10g Nước cất vừa đủ 100 ml ỉ .1.3.2. Dung dịch đệm phosphat 0,03M (pH = 7,5) Na2HP04.12H20 10,7451 g KH2P 04 4,0827 g Nước cất vừa đủ 1000.0 mỉ 14 1.1.3.3. Dung dịch NaCl 0,9% NaCl 9g Nước cất vừa đủ 100 ml 1.1.3.4. Dung dịch Gomall: Hoà tan l,5g CuS04.5H20 và 6,0 g NaKC4H40 6.4H20 trong 500 mi nước cất. Thêm 300ml dung dịch NaOH 10% (30g NaOH/300ml H20 ) vừa thêm vừa lắc đều. Thêm lg KI rồi thêm nước cất vừa đủ 1000 ml lắc kỹ, bảo quản trong lọ kín. Chú ý: Bỏ đi khi có cặn. 1.1.4. Súc vật thí nghiêm: Chuột nhắt trắng thuần chủng giếng Swiss, đực và cái, nuôi trong cùng điều kiện, cân nặng 20-22 gram, do viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp. 1.1.5. Dụng cụ máy móc: - Máy đo quang (UV-Vis) Trung Quốc 752 - Máy li tâm Hettich - Máy điều nhiệt Mtakutesz - Tủ lạnh, Tủ sấy. 1.2. Phương pháp nghiên cứu: 1.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzym: 1.2.1.1. Nguyên tắc xác định: Dưới tác dụng của enzym, protein bị thuỷ phân giải phóng ra các peptid có các acid amin. Xác đinh lượng protein còn lại bằng cách tủa với acid tricloacetic. Tủa này phản ứng với thuốc thử Gomall tạo màu tím hổng. Đo quang phổ hấp thụ, ở bước sóng À,=530 nm, cuvet lcm 1.2.1.2. Kỹ thuật tiến hành: *Pha loãng men đến độ pha loãng thích hợp: - Đối với papain: pha loãng trong đệm phosphat pH =7,5. - Đối với a - chymotrypsin: pha loãng trona dung dịch NaCl 0,9% 15 * Xác đinh khả năng thuỷ phân của papain. Thuốc thử Ống cơ chất (ml ) Ong thử (ml) Lòng trắng trứng 2,0 2,0 A. tricloacetic 10% 2,5 0 Ị 0 0,1 1 0,5 0,5 Ị Dịch men đã pha loãng Cystein 0,04M Lắc đều, ủ ấm 37° trong thời gian theo dõi thích hợp. Sau thời gian ủ ấm cần thiết, cho vào ống thử: 2,5ml acid tricloacetic 10% lắc đều để ở nhiệt độ phòng 10 phút. Đem ly tâm lấy tủa, rồi thực hiện phản ứng với 4ml thuốc thử Gomall. Lắc đều cho tan hoàn toàn tủa. Để nhiệt độ phòng 30 phút. Đo mật độ quang ở Ằ, = 530 nm, cuvet lem Chú ý: dùng cystein để hoạt hoá papain. * Xác định khả năng thuỷ phân protein của a - Chymotrypsin. Thuốc thử Ị Ống cơ chất (mi) Ống thư (mi) Lòng trắng trứng 2,0 A.tricloacetic 10% 2,5 Dung dịch NaHC03 2% 2,0 ° 1,9 Dịch men đã pha loãng 0 0,1 Ị 2,0 I I Lắc đều, ủ ấm 40° trong thời gian theo dõi thích hợp. San thời gian ủ cần thiết cho vào ống thử: 2,5ml acid tricloaccetic 10%. Lắc đều cỉể ở nhiệt độ phòng 10 phút. Đem ly tâm lấy tủa rổi thực hiện phản ứng với 4mỉ thuốc thử Gomall. Lắc đều cho tan hoàn toàn tủa. Để ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đo mật độ quang ở X = 530 nm, cuvet lcm. 1.2.2. Phương pháp nghiên cứu tác dụng tiêu protein biến tính của a chymotrypsin và papain: lồ ! .2.2.1. In vitro: Tác dụng của a - chymotrvpsin và napain thuỷ phân các ioai protein gâv biến tính bằng nhiệt, acid, kiểm: Lòng trắng trứng, nhũ dịch thịt ỉợn được gâv biến tích ở nhiệt độ khác nhau, nồng độ acid, nồng độ kiềm ở thời gian khác nhau. Sau đó xác đinh tv ỉệ rìhần trăm protein bị thuv phân 30 với lượng protein lúc đầu. Kỹ thuật tiến hành như phươns pháp đã nêu ở trên. 1.2.2.2. In vivo : Chuột được gây biến tính bằng Formol, Dextran, Kaolin. a. Gâv viêm bằng Formol: Chuột nhắt trắng được tiêm vào một bên đùi bởi 0,05ml dung dịch Formol 2%. Đùi bên kia không tiêm để đối chứng. Sau khi tiêm 24 giờ, giết chuột, lấy thịt đùi chân tiêm và chân khòns tiêm chế tạo cơ chất và xác định sự chênh lệch tỷ lệ phần trăm tiêu protein. b. Gây viêm bằng Dẽxtran. Chuột nhắt trắng đượe tiêm vào một bèn đùi bởi 0,05 ml dung dịch Dextran 6%. Đùi bèn kia không tiêm đê đối chứng, Sau khi tiêm 24 giờ, giết chuột, rồi tiến hành như ỏ' chuột gây viêm bằng Formol. c. Gâv viêm bằng Kaolin. Chuột nhắt trắnạ được tiêm vào một bên đùi bởi 0,05 rai hỗn dich • o * • Kaolin 10%. Đùi bên kia không tiêm để đối chứng, Sau khi tiêm 24 giờ. giết chuột, rồi tiến hành như ở chuột gây viêm bằng Formol. 2. Kết quá thực nghiệm và nhận xét: 2.1. Khả năng tiêu proteỉn của a - chymotrypsin: 2.1.1. Cơ chất lòng trắng trứng: 2.1.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ gâv biến tính cơ chất lòng trắng trứng đối với khả năng thuv phàn của a - chymotrypsin. Để nghièn cứu ảnh hưởng của nhiệt độ gây biến tính cơ chất lòng trắng trứns đối với khả năng thuỷ phủn của a - chvmotrypsin, thí nghiệm được tiến \ . li Q Oĩ 17 v KL \ ' \ bfĩ~.y hành như sau: sây biến tính cơ chất lòng trắna trứng ở các nhiệt đỏ khác nhau: 50°c, 70°c, 87°c, 100°c trong thời gian 10 phút. Sau đó xác định khá năn 2 thuỷ phân protein của a-chymotrypsin đối với cơ chất đã biến tính trong cùng điều kiện ở 40°c trong 30 phút. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 1. Bảug 1; Ảnh huởíig của nhiệt độ gây biến tính cơ chất ỉòng tráng trứng đối với khả năng thuỷ phàn của a - chymoírypsin. % protein bi thuỷ phản iỊ Ghi chú: 50 0,98 70 5,5 87 61,8 100 72.7 1 ị Kết quả trên là trung bình của 3 lần thí nghiệm a - Chymotrypsin sử dụng có hàm lượnơ lmg. Nhận xét: Qua bảng trên cho thấy: Nhiệt độ gây biến tính càng cao, khả năng thuỷ phân protein lòng trắng trứng biến tính của cc - Chymotrypsin càng lớn. ở nhiệt độ 50°c, protein lòng trắng trứng biến tính của a - Chymotrypsin hầu như không bị thuỷ phân, ở nhiệt độ 100°c, protein lòng trắng trứng biến tính bị thuỷ phân cao nhất là 72,7%. 2.1.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ acid gây biến tính cơ chất lòng trắng trứng đối vói khả năng thuỷ phân của a - Chymotrypsin. Với mục đích tìm hiểu ảnh hưởng của nồng độ acid gây biến tính cơ chất lòng trắng trứng đối với khả năng thuỷ phân của a - Chymotrypsin. Chúng tòi đả tiến hành thí nghiệm: gây biến tính cơ chất lòng trăng trứng bằng acid HC1 15% để đạt nồng độ gây biến tính là 5% trong thời gian khác nhau: 10 phút. 20 phút: 40 phút, 60 phút. Sau đó xác đinh khả năng thuv phân protein lòng trắng trứng biến tính của a - Chymotrypsin trong cùng điều kiện. 18