Tài liệu Nghiên cứu khả năng tạo chất diệt khuẩn enterocin p tái tổ hợp nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------------- Phạm Thùy Linh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO CHẤT DIỆT KHUẨN ENTEROCIN P TÁI TỔ HỢP NHẰM ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------------Phạm Thùy Linh NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO CHẤT DIỆT KHUẨN ENTEROCIN P TÁI TỔ HỢP NHẰM ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 62 42 40 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS Trương Nam Hải 2. GS. TS Phạm Văn Ty Hà Nội – 2011 MỞ ĐẦU Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có khoảng 250 - 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Trong 7 tháng đầu năm 2008, đã xảy ra 106 vụ ngộ độc thực phẩm, gần 5000 ngƣời mắc và 43 ngƣời đã tử vong. Có nhiều nguyên nhân dẫn tới ngộ độc thực phẩm trong đó nguyên nhân do nhiễm vi sinh vật và các độc tố của chúng chiếm hơn 80%, chủ yếu là do các chủng thuộc loài vi khuẩn Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Clostridium botulinum, C. perfringens, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Toxoplasma gondii và Escherichia coli O157:H7 [53]. Các vi khuẩn này phát triển ngay cả ở nhiệt độ thấp (4-6o C), trong thịt ƣớp lạnh, thịt nguội, phô mai chƣa tiệt trùng... gây ra những rối loạn tiêu hóa, mất cân bằng điện giải, kiệt sức. Trƣờng hợp nặng có thể dẫn đến tử vong nếu không chữa trị đúng cách và kịp thời. Trong những năm gần đây, tình trạng ngộ độc thực phẩm có liên quan đến L. monocytogenes đã bùng phát tại nhiều nƣớc trên thế giới. Với đặc điểm dịch tễ học phức tạp, Listeria đã đƣợc Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization – WHO) xếp vào nhóm tác nhân sinh học có nguy cơ cao trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm. Listeria phân tán rộng rãi trong môi trƣờng đất, nƣớc, phân gia súc nên rất dễ lây nhiễm qua thực phẩm. Tác hại của loại vi khuẩn này không chỉ dừng lại ở việc gây ra ngộ độc thực phẩm mà chúng còn gây ra các bệnh lý nguy hiểm đặc biệt cho thai phụ nhƣ gây nhiễm trùng phôi thai, sẩy thai, viêm não, nhiễm trùng máu... [99]. Một nguyên nhân khác gây ngộ độc thực phẩm là do chính những chất phụ gia bảo quản hoặc chất tạo màu, tạo mùi trong quá trình xử lý, chế biến. Thực phẩm hiện nay đƣợc bảo quản chủ yếu dựa vào các phụ gia tổng hợp hóa học hoặc qua các chu trình xử lý nhiệt độ, áp suất... Điều này khiến ngƣời tiêu dùng lo ngại về những tác động lâu dài có hại đến sức khỏe cũng nhƣ đặt ra yêu cầu ngày càng tăng về độ “tự nhiên”, giảm tối đa quy trình xử lý của thực phẩm. Bởi vậy, song song với vấn 1 đề vệ sinh an toàn thực phẩm, nhu cầu về phƣơng pháp bảo quản thực phẩm cũng nhƣ các chất bảo quản thực phẩm mới, các chất diệt khuẩn an toàn có nguồn gốc sinh học, không độc hại đối với sức khỏe con ngƣời đang là một nhu cầu cấp thiết ở hầu khắp các nƣớc trên thế giới. Bacteriocin là nhóm các chất hiện đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trên Thế giới nhằm đƣa vào ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm. Đây là các peptide hoặc protein do vi khuẩn sinh ra, có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại vi sinh vật gây bệnh và gây hƣ hỏng thực phẩm dù ở nồng độ rất thấp nhƣng lại an toàn đối với ngƣời sử dụng do dễ bị bất hoạt và phân hủy dƣới tác động của các protease trong hệ tiêu hóa. Trong số đó, enterocin P (EntP) đƣợc sinh tổng hợp từ chủng Enterococcus faecium P13, có phổ kháng khuẩn tƣơng đối rộng đối với các vi khuẩn Gram dƣơng gây bệnh thƣờng đƣợc phát hiện trong thực phẩm nhƣ C. perfringens, C. botulinum, S. aureus... và đặc biệt là L. monocytogenes. EntP khá bền nhiệt, có thể đảm bảo hoạt tính sau khi xử lý ở 100 o C trong 60 phút hoặc ở 121o C trong 15 phút. Hoạt tính này ổn định trong một thời gian dài khi đƣợc bảo quản ở - 20o C hoặc 4o C [21]. EntP còn có khả năng hoạt động trong khoảng pH rộng, từ 2 đến 11. Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn Enterococcus có khả năng sản sinh enterocin lại thƣờng sinh ra các độc tố nên việc lên men, thu hồi enterocin ở dạng sạch, đủ tiêu chuẩn sử dụng trong thực phẩm gặp nhiều khó khăn. Với mục tiêu tổng hợp EntP theo con đƣờng tái tổ hợp nhằm chủ động điều khiển sinh tổng hợp enterocin hiệu suất cao, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tinh sạch sản phẩm, ứng dụng vào bảo quản thực phẩm, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng tạo chất diệt khuẩn enterocin P tái tổ hợp nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm”. Công trình đƣợc thực hiện tại phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và đƣợc hỗ trợ kinh phí thực hiện từ đề tài cấp nhà nƣớc do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn chủ quản “Nghiên cứu công nghệ sản xuất và sử dụng chất diệt khuẩn sinh học (nisin và enterocin) dùng trong bảo quản nông sản thực phẩm”. 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN 1.1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BACTERIOCIN Trong quá trình đấu tranh sinh tồn, vi sinh vật thƣờng tiết ra những chất có khả năng kìm hãm, ức chế và tiêu diệt các vi sinh vật khác có sự cạnh tranh với chúng về nơi sống và nguồn dinh dƣỡng nhƣ các axit hữu cơ, diacetyl, acetoin, peroxide hidro, reuterin, reutericyclin, các peptide kháng nấm... [36, 54, 55, 72], trong số đó phổ biến nhất là bacteriocin. Bacteriocin là peptide hoặc protein do vi khuẩn tổng hợp, có hoạt tính kháng khuẩn [25, 34, 43]. Bacteriocin đầu tiên đƣợc Gratia phát hiện vào năm 1925 với tên gọi là principe V do một chủng E. coli sinh ra. Năm 1946, Gratia và Fredericq đã đổi tên bacteriocin này thành “colicin”. Thuật ngữ bacteriocin đƣợc Jacob và cộng sự đề xuất từ năm 1953 [17, 86, 87]. Tƣơng tự “ase” sử dụng trong enzyme, tiếp tố “in” hoặc “cin” dùng để biểu thị các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn. Tiếp tố này đƣợc viết thêm vào tên chi hoặc tên loài. Ví dụ, bacteriocin tiết ra từ E. coli đƣợc gọi là colicin, từ Bacillus subtilis đƣợc gọi là subtilin... Các chữ cái đứng sau tên bacteriocin chỉ thứ tự bacteriocin đƣợc tìm ra ở cùng một loài. Ví dụ, lactacin F là bacteriocin thứ 6 đƣợc tìm ra từ loài thuộc chi Lactobacillus [53]. Bacteriocin đƣợc phát hiện ở hầu hết các loài vi khuẩn, đặc biệt một số loài có khả năng tiết hàng chục bacteriocin khác nhau [86]. Vi khuẩn cổ (Archaea) cũng có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn giống bacteriocin gọi là archaeocin, điển hình là họ halocin sinh ra bởi vi khuẩn cổ thuộc chi Halobacterium [87, 92]. Cho tới nay đã có hàng trăm bacteriocin đƣợc phát hiện và nghiên cứu. Chúng rất đa dạng về chủng sản sinh, kích thƣớc phân tử, tính chất vật lý hóa học, độ bền, phổ kháng khuẩn và cơ chế tác động [31]. Tập hợp gen cấu trúc và gen điều hòa sinh tổng hợp bacteriocin ở vi khuẩn cũng rất đa dạng, có thể nằm trong hệ gen (plantaracin A và sackacin 674), trong plasmid (pediocin) [91], hoặc thậm chí nằm trong các 3 transposon nhƣ nisin đƣợc sinh ra từ L. lactis [83]. Mặc dù vậy, cho tới nay, trong số hàng trăm bacteriocin đƣợc phát hiện và nghiên cứu, mới chỉ có nisin là bacteriocin duy nhất đƣợc Tổ chức Nông lƣơng (Food and Agriculture Organization – FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) công nhận là chất bảo quản thực phẩm từ năm 1969 và đƣợc sử dụng rộng rãi tại hơn 50 quốc gia trên Thế giới [17]. Cùng có hoạt tính kháng khuẩn tuy nhiên bacteriocin hoàn toàn khác biệt với chất kháng sinh dùng trong y học. Đa phần các bacteriocin có phổ kháng khuẩn không rộng, chủ yếu ức chế hoặc tiêu diệt các vi khuẩn khác có mối quan hệ gần gũi hoặc tƣơng đồng, có sự cạnh tranh trực tiếp về nơi sống và nguồn dinh dƣỡng [67]. So sánh bacteriocin và các kháng sinh dùng trong y tế [25] Đặc tính Bacteriocin Kháng sinh Mục đích ứng dụng Tổng hợp Hoạt tính Cơ thế tác động tế bào đích Yêu cầu tƣơng tác Thực phẩm Từ ribosom Phổ hẹp Ảnh hƣởng tới kết cấu màng tế bào Đôi khi cần cắt ngắn phân tử Y tế Sản phẩm trao đổi chất bậc 2 Phổ đa da ̣ng Tùy thuộc phƣơng thức hoạt động Đích đặc hiệu Phƣơng thức hoạt động Hầu hết là tạo lỗ trên màng tế bào chất (một số ít có thể ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp thành tế bào) Chƣa thấy Màng tế bào hoặc các đích nội bào Độc tính/tác dụng phụ Có Trong bối cảnh vi sinh vật kháng thuốc hiện nay, song song với việc phát triển các kháng sinh phổ rộng dùng trong y tế thì việc nghiên cứu những bacteriocin đặc hiệu với nhóm vi khuẩn nhằm đƣa vào ứng dụng cũng đang là một vấn đề đƣợc quan tâm đặc biệt trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm và các sản phẩm chăm sóc sức khỏe. 1.1.2. PHÂN LOẠI BACTERIOCIN Bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn đa dạng và phong phú, đƣợc tiết ra bởi 4 nhiều chủng vi khuẩn khác nhau, đƣơ ̣c chia thành hai nhóm lớn là bacteriocin của vi khuẩn Gram âm và bacteriocin của vi khuẩn Gram dƣơng. Vi khuẩn gram dƣơng có quá trình điều hòa sinh tổng hợp bacteriocin đặc hiệu, trong khi các bacteriocin từ vi khuẩn Gram âm đƣợc tổng hợp chỉ phụ thuộc vào hệ thống điều hòa thông thƣờng của tế bào chủ trong những điều kiện bất lợi. Quá trình tiết bacteriocin ở vi khuẩn Gram dƣơng không giết chết bản thân vi khuẩn chủ, trong khi đó bacteriocin của vi khuẩn Gram âm thƣờng đƣợc giải phóng thông qua quá trình tiêu bào [85]. 1.1.2.1. Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm Vi khuẩn Gram âm sản sinh một loạt các bacteriocin rất đa dạng về kích thƣớc và phƣơng thức hoạt động, đƣợc đặt tên theo chi (nhƣ klebicin của Klebsiella pneumoniae) hay theo loài của vi khuẩn sản xuất (nhƣ colicin của E. coli, marcescin của Serratia marcescens, alveicin của Hafnia alvei, cloacin của Enterobacter cloacae...). Tính riêng ở E. coli, các nhà khoa học đã phát hiện đƣợc hơn 30 loại bacteriocin. Tuy nhiên, đến nay các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin và sự đa dạng của chúng vẫn chƣa đƣợc hoàn toàn sáng tỏ. Việc nghiên cứu những thông tin này là rất cần thiết, không chỉ giúp phân loại các quần thể vi khuẩn trong môi trƣờng tự nhiên mà còn tìm ra các bacteriocin có đặc tính mới cho nghiên cứu [87]. Bacteriocin từ vi khuẩn Gram âm đƣợc phân thành ba nhóm dựa vào kích thƣớc: Nhóm 1: bacteriocin dạng colicin (colicin-like bacteriocin - CLB) kích thƣớc lớn (25-80 kDa), nhóm 2: các microcin kích thƣớc nhỏ hơn (<10 kDa) và nhóm 3: bacteriocin dạng đuôi phage (phage tail-like bacteriocin) gồm các tiểu đơn vị peptit lắp ghép. Colicin cũng nhƣ các CLB đƣợc sinh ra từ các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, có phổ kháng khuẩn hẹp, đặc hiệu với các vi khuẩn Gram âm. Colicin là các bacteriocin đầu tiên đƣợc phát hiện và mô tả đặc tính. Chúng có kích thƣớc lớn (25-80 kDa), hoạt động thông qua tƣơng tác với thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào của vi khuẩn đích, ngăn chặn tổng hợp thành tế bào, tăng tính thấm của màng tế bào đích và hình thành lỗ trên màng tế bào (các bacteriocin có kích thƣớc 5 449 đến 629 amino axit) hoặc thể hiện hoạt tính nuclease đối với DNA, rRNA hoặc tRNA đích (các bacteriocin có kích thƣớc 178 đến 777 amino axit) [68, 87]. Yếu tố di truyền của colicin là các cụm gen phân bố trên plasmid và đƣợc sắp xếp thành gen colicin mã hóa cho protein gây độc, gen miễn dịch mã hóa cho protein chịu trách nhiệm miễn dịch đặc hiệu với tế bào sản xuất (bằng cách gắn và làm bất hoạt protein độc), và gen phân giải mã hóa cho protein tham gia vào việc giải phóng colicin thông qua phân giải tế bào chủ [26]. Quá trình sinh tổng hợp của một số bacteriocin thuộc nhóm này đƣợc điều khiển bởi cơ chế gây chết cho chính tế bào chủ [87]. Microcin có cấu trúc tƣơng tự nhƣ bacteriocin lớp II của vi khuẩn Gram dƣơng: Đó là các peptide có kích thƣớc nhỏ (<10 kDa), đƣợc tổng hợp nhiều nhất khi tế bào ở pha cân bằng. Hai đại diện thuộc nhóm này là colicin V (đƣợc coi là một microcin vì có kích thƣớc phân tử là 6 kDa) và microcin C7 (peptide kháng khuẩn có kích thƣớc nhỏ nhất, 1,177 kDa, đã đƣợc mô tả cho đến nay) [87]. Bacteriocin dạng đuôi phage là các hạt hình que đề kháng với nuclease và protease tƣơng tự nhƣ đuôi của thể thực khuẩn (bacteriophage), tiêu diệt tế bào vi khuẩn nhạy cảm thông qua tác động lên màng tế bào. Các bacteriocin này đƣợc cho là những phage khiếm khuyết hoặc có nguồn gốc từ phage tiến hóa theo hƣớng tạo nên bacteriocin. Điển hình nhƣ pyocin R2 (do Pseudomonas spp sinh ra) có thể là phần còn lại của phage P2, còn pyocin F2 thì tƣơng đồng với phage lambda [85, 87]. 1.1.2.2. Bacteriocin của vi khuẩn Gram dƣơng Các bacteriocin do vi khuẩn Gram dƣơng tiết ra phong phú và đa dạng hơn nhiều so với vi khuẩn Gram âm. Theo Klaenhammer, bacteriocin của vi khuẩn Gram dƣơng có thể đƣợc chia thành bốn nhóm dựa trên các đặc điểm về di truyền và sinh hóa nhƣ sau [67]: 6 Bảng 1.1. Phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dƣơng Lớp Lớp I Đặc điểm Các lantibiotic (chứa lanthionine và - Phân lớp Ia (phân tử mạch thẳng, kích thƣớc phân tử < 4 kDa) lanthionine) Ib (phân tử hình cầu, kích thƣớc phân tử từ 1,8 – 2,1 kDa) Lớp II Các bacteriocin bền nhiệt, không bị biến đổi sau dịch mã, kích thƣớc phân tử < 10 kDa IIa (bacteriocin dạng pediocin, có khả năng kháng Listeria) IIb (bacteriocin gồm 2 peptide) IIc (các bacteriocin còn lại của lớp II) Đại diện Nisin A Nisin Z Subtilin Epidermin Mersacidin Actagardin Mutacin II Bảng 2 Plantaricin EF Plantaricin JK Lactococcin 972 Lớp III Các bacteriocin có kích thƣớc phân tử > 30 kDa Helveticin J Millericin B Lớp IV Các bacteriocin có bản chất là glycoprotein hoặc lipoprotein Lactocin 27 Lacstrepcin Lớp I: Lantibiotic Lớp này gồm các peptide có kích thƣớc nhỏ (< 5 kDa), có thành phần amino acid bị cải biến mạnh sau khi dịch mã. Điểm khác biệt cơ bản của lantibiotic với các lớp bacteriocin khác là có chứa các amino acid hiếm nhƣ lanthionine (Lan), methyllanthionine (MeLan), dehydroalanine và dehydrobutyrine [73]. Dựa vào đặc điểm về cấu trúc, điện tích và cơ chế kháng khuẩn, lớp I còn đƣợc chia nhỏ thành hai phân lớp [45, 75]: - Phân lớp Ia: Gồm các lantibiotic có cấu trúc thẳng, tích điện (+). Chúng tác động đến các vi khuẩn đích bằng cách hình thành nên các lỗ trên màng tế bào chất thông qua sự tƣơng tác không đặc hiệu với màng. Một số đại diện cho phân lớp này là nisin A và Z, subtilin, epidermin. - Phân lớp Ib: Trái với phân lớp Ia, phân lớp Ib gồm các lantibiotic nhỏ, hình cầu, tích điện (-) hoặc không tích điện nhƣ mersacidin, actagardin, cinnamycin và 7 mutacin A. Hoạt tính kháng khuẩn của chúng dựa trên sự ức chế hoạt động của các enzyme đặc hiệu, từ đó ức chế quá trình sinh tổng hợp ở thành tế bào vi khuẩn. Bateriocin nổi bật nhất trong nhóm I là nisin. Đƣợc sinh ra từ các chủng Lactococcus lactis subsp. lactis phân lập từ sữa và các thực phẩm từ rau [50, 56] và chủng L. lactis BB24 phân lập từ xúc xích lên men khô Tây Ban Nha [21, 22], nisin là bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng đối với một loạt các vi khuẩn Gram dƣơng trong đó có S. aureus và L. monocytogenes. Thêm vào đó, nisin ngăn chặn sự phát triển của bào tử Bacillus spp. và Clostridium spp. Cho tới nay, nisin là bacteriocin đƣợc nghiên cứu tƣờng tận nhất và là bacteriocin duy nhất đƣợc toàn Thế giới công nhận là chất bảo quản thực phẩm sinh học dùng cho pho – mát, các sản phẩm sữa và đồ hộp [33]. Lớp II Lớp II gồm các peptide bền nhiệt có kích thƣớc <10 kDa và không chứa lanthionine (non-lantibiotic). Các peptide này có trình tự amino acid không bị cải biến sau dịch mã. Phần lớn chúng tác động lên tế bào đích bằng cách tạo lỗ trên màng sinh chất, gây thất thoát các nội chất của tế bào ra ngoài môi trƣờng. Những peptide này đƣợc chia thành ba phân lớp: - Phân lớp IIa: gồm các bacteriocin có cấu trúc dạng pediocin (có một trình tự bảo thủ –Tyr-Gly-Asn-Gly-Val-Xaa-Cys– ở đầu N). Phân lớp IIa bao gồm các peptide có hoạt tính kháng Listeria mạnh với kích thƣớc nhỏ (<10 kDa), gồm từ 3748 amino acid, bền nhiệt và các amino acid không bị cải biến sau dịch mã. Bacteriocin thuộc phân lớp này có sự tƣơng đồng cao (40 - 60%) về cấu trúc và trình tự các amino acid, tiêu diệt tế bào đích bằng cách tác động lên màng sinh chất. Các peptide này tích điện (+) ở pH trung tính, điểm đẳng điện pI dao động trong khoảng từ 8 đến 10 [34]. Hiện nay, đây đƣợc coi là nhóm chất kháng khuẩn sinh học hứa hẹn nhất về khả năng ứng dụng trong công nghệ bảo quản thực phẩm và trong y học. Chúng có thể ức chế sự sinh trƣởng của nhiều loại vi khuẩn Gram dƣơng gây hƣ hỏng thực phẩm và các vi khuẩn gây bệnh nhƣ B. cereus, C. perfringens, S. aureus, và L. monocytogenes [25, 34]. Một số bacteriocin đại diện 8 cho nhóm này nhƣ pediocin AcH/PA1, mesentericin Y 105, sakacin A, sackacin P, carnobacteriocin B2... đƣợc tổng kết ở bảng 1.2 [37]. Bảng 1.2. Một số bacteriocin thuộc phân lớp IIa Bacteriocin Carnobacteriocin B2 Curvacin A Divercin V41 Divergicin M35 Enterocin P Enterocin A Leucocin A Leucocin C Mundticin Mesentericin Y105 Plantaricin 423 Pediocin PA-1 Pediocin AcH Pediocin SJ-1 Piscicolin 126 Sakacin P Sakacin A Vi khuẩn sản xuất Loài Carnobacterium piscicola Lactobacillus curvatus Carnobacterium divergens Carnobacterium divergens Enterococcus faecium Enterococcus faecium Leuconostoc gelidum Leuconostoc mesenteroides Enterococcus mundtii Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus plantarum Pediococcus acidilactici Pediococcus acidilactici Pediococcus acidilactici Carnobacterium piscicola Lactobacillus sakei Lactobacillus sakei Chủng LV17 LTH1174 V41 M35 P13 CTCA92/T136 UAL 187 TA33a ATO6 Y105 423 PAC 1.0 AcH SJ-1 JG126 674 706 - Phân lớp IIb: là các bacteriocin đa thành phần, chủ yếu gồm hai chuỗi peptide. Hoạt tính kháng khuẩn của chúng phụ thuộc vào hoạt động bổ trợ lẫn nhau của hai chuỗi. Hầu hết các peptide riêng rẽ vẫn có hoạt tính kháng khuẩn, nhƣng hoạt tính này mạnh hơn khi có mặt chuỗi peptide thứ hai (enterocin L50A và L50B) [9, 23]. Trƣờng hợp ngoại lệ là hai peptide lactococcin G và lactococcin M không còn khả năng kháng khuẩn khi đứng riêng lẻ một mình. - Phân lớp IIc: là các bacteriocin còn lại của lớp II. Các bacteriocin thuộc nhóm này gồm hai loại chính là có chứa cysteine (đại diện là thiolbiotic và cystibiotic) và không có chứa cysteine (đại diện là lactococin A và acidocin B). Lớp III Lớp III gồm các bacteriocin có khối lƣợng phân tử lớn (>30 kDa), dễ bị phân 9 hủy dƣới tác động của nhiệt độ. Phần lớn các peptide nhóm này đƣợc tiết ra bởi các chủng thuộc chi Lactobacillus. Điển hình nhƣ helveticin J do L. helveticus tiết ra hay lactacin B do chủng L. acidophilus sinh ra. Các bacteriocin thuộc lớp này vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu rộng rãi [17, 80]. Lớp IV Lớp IV bao gồm các bacteriocin có cấu tạo phức tạp, có bản chất là glycoprotein (lactocin 27) [94] hoặc lipoprotein (lacstrepcin) [69]. Hoạt tính sinh học của các bacteriocin này cần có sự tham gia của thành phần carbohydrate hoặc lipid trong cấu trúc. Gần đây, Kemperman đã bổ sung thêm một lớp bacteriocin mới (lớp V), gồm các bacteriocin có cấu trúc dạng vòng. Đây là các peptide đƣợc biến đổi sau dịch mã, hình thành liên kết cộng hóa trị nội phân tử giữa đầu N và đầu C tạo cấu trúc vòng cho peptide trƣởng thành [66]. Các thành viên thuộc nhóm này là enterocin AS-48 (tiết ra bởi E. faecalis), circularin A (tiết ra bởi C. beijerinckii ATCC25752), gassericin A (tiết ra bởi L. gasseri LA39)... 1.1.3. PHỔ KHÁNG KHUẨN CỦA BACTERIOCIN Bacteriocin từ vi khuẩn Gram âm đƣợc xem là những chất kháng khuẩn phổ hẹp, chủ yếu tác động tới những vi khuẩn có quan hệ gần gũi trong cùng nơi sống, gây chết tế bào đích bằng cách tạo lỗ trên màng sinh chất hoặc bằng phân cắt axit nucleic (DNA, rRNA và tRNA) [86]. Bacteriocin từ vi khuẩn Gram dƣơng có phổ kháng khuẩn vô cùng đa dạng, từ lactococcin A, B và M là các bacteriocin đƣợc sinh ra từ các chi Lactococcus và Lactobacillus, chỉ có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn Lactococcus, cho tới nisin A, có khả năng tiêu diệt một loạt các vi khuẩn bao gồm các chi: Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Gardnerella, Lactococcus, Listeria, Micrococcus, Mycobacterium, Propionibacterium, Streptococcus, và thậm chí cả một số vi khuẩn Gram âm nhƣ: Campylobacter, Haemophilus, Helicobacter và Neisseria [76, 86]. Klaenhammer đã chỉ ra rằng bacteriocin từ vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn đa dạng, không chỉ đối với các loài có quan hệ gần gũi hay 10 cạnh tranh về nơi sống [67]. Quan sát hoạt tính của các bacteriocin phân tử lƣợng thấp các nhà nghiên cứu đã nhận thấy: (i) một số chủng trong cùng một loài nhất định có thể mẫn cảm trong khi các chủng khác lại đề kháng với cùng một loại bacteriocin; (ii) một chủng mẫn cảm với một bacteriocin có thể có một vài tế bào trong quần thể đề kháng đƣợc với bacteriocin đó; (iii) một chủng có thể mẫn cảm với một bacteriocin trong khi lại đề kháng với một bacteriocin dạng tƣơng tự; (iv) các tế bào của chúng sản sinh bacteriocin này có thể mẫn cảm với một bacteriocin khác; (v) bào tử của chủng mẫn cảm với một bacteriocin có thể đề kháng với bacteriocin đó và chỉ trở nên mẫn cảm khi nảy mầm, (iv) dƣới các điều kiện thông thƣờng, vi khuẩn Gram âm không mẫn cảm với các bacteriocin từ vi khuẩn Gram dƣơng, vi khuẩn Gram âm chỉ bị ức chế bởi các bacteriocin tinh chế từ vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria – LAB) dƣới những điều kiện làm suy yếu thành tế bào (nhƣ các axit hữu cơ, EDTA...) hay dƣới áp lực môi trƣờng nhƣ pH, đông lạnh, gia nhiệt nhẹ hay áp suất hơi nƣớc cao [59, 63, 64]. Nhiều tác giả cho rằng, hàm lƣợng cystein có liên quan tới phổ kháng khuẩn của các LAB-bacteriocin bởi việc hình thành liên kết thiol giữa các gốc cysteine có thể đóng vai trò sinh học tƣơng tự nhƣ sự hoạt hóa gốc thiol của độc tố sinh ra từ vi khuẩn Gram âm. Bởi vậy, tác giả cho rằng các cystibiotics, thiolbiotics và bacteriocin không chứa cysteine sẽ có hoạt tính kháng khuẩn tƣơng ứng là rộng, trung bình và hẹp [59]. Mặc dù chƣa đƣợc xác định đầy đủ, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự hình thành cầu disulfide trong các bacteriocin dạng pediocin PA1, enterocin A, enterocin P và divercin V41 có thể là thiết yếu đối với khả năng kháng khuẩn của các non - lantibiotic này [13, 19]. Dựa theo phổ kháng khuẩn, bacteriocin cũng có thể đƣợc chia thành 3 nhóm: (i) nhóm bacteriocin phổ hẹp: chỉ kháng lại các chủng cùng loài với chủng sản xuất (lactococcin A, caseicin 80) hoặc các loài trong cùng một chi (lactocin 27, lactacin B); (ii) nhóm bacteriocin phổ trung bình: có khả năng ức chế các chi khác của vi khuẩn lactis và vi khuẩn Gram dƣơng bao gồm cả các chủng gây ngộ độc thực phẩm L. monocytogenes, S. aureus, C. perfringens, C. botulinum. Đại diện cho 11 nhóm này có lacticin F, lacticin 481, plantaricin C, plantaricins S và T; và nhóm bacteriocin phổ rộng, có khả năng ức chế một dải rộng các vi khuẩn Gram dƣơng, bên cạnh các chi đã đƣợc kể ở trên còn có thêm Propionibacterium spp. và Bacillus spp. Nisin, pediocin AcH/PA-1, leucocin S và enterocin L50 là các bacteriocin tiêu biểu thuộc nhóm này [22, 24, 50, 56]. 1.1.4. ỨNG DỤNG CỦA BACTERIOCIN Đối với vi sinh vật, bacteriocin là vũ khí để cạnh tranh dinh dƣỡng và không gian sống giữa các loài, giúp cân bằng sinh thái vi sinh vật [91]. Đối với con ngƣời, các peptide kháng khuẩn này cũng có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong bảo quản thực phẩm, trong nông nghiệp, trong lĩnh vực y tế cũng nhƣ chăm sóc sức khỏe cho con ngƣời [88]. 1.1.4.1. Ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm Thực phẩm hiện nay đƣợc bảo quản chủ yếu dựa vào các chất phụ gia tổng hợp hóa học hoặc các chu trình xử lý nhiệt độ, áp suất... Điều này khiến ngƣời tiêu dùng lo ngại về những ảnh hƣởng có hại đến sức khỏe cũng nhƣ đặt ra yêu cầu ngày càng tăng về độ “tự nhiên” của thực phẩm. Vì vậy, một giải pháp có nhiều tiềm năng hiện nay là sử dụng các chất kháng khuẩn sinh học để ức chế hay tiêu diệt các vi sinh vật không mong muốn. Bacteriocin, đặc biệt là các bacteriocin từ vi khuẩn lactic có nhiều đặc tính thích hợp để đƣợc ứng dụng làm chất bảo quản: đây là các hợp chất an toàn, không hoạt động và không gây độc trên tế bào ngƣời, dễ dàng bị bất hoạt bởi các protease trong hệ tiêu hóa, rất ít ảnh hƣởng tới hệ khuẩn chí đƣờng ruột, bền nhiệt và ổn định trong các pH, có phổ kháng khuẩn khá rộng đối với nhóm các vi khuẩn gây ngộ độc và hƣ hỏng thực phẩm. Phƣơng thức kháng khuẩn của bacteriocin là hoạt động trên màng sinh chất của vi khuẩn. Bacteriocin không có hiện tƣợng kháng chéo với các chất kháng sinh, các yếu tố di truyền đƣợc quy định trên plasmid, thuận lợi cho việc thao tác di truyền [43]. Các bacteriocin đã biết tới ngày nay hầu hết đều đƣợc phát hiện trong những thực phẩm nhƣ thịt và các sản phẩm sữa, nơi thƣờng có mặt vi khuẩn lactic. Trên thực tế, vi khuẩn lactic đã đƣợc con ngƣời sử dụng từ xa xƣa để chế biến và bảo quản thịt, sữa, các loại rau củ. 12 Nghiên cứu 40 chủng L. lactis dạng dại, các tác giả đã phát hiện 35 chủng trong số đó có sản sinh bacteriocin [25]. Sử dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm có thể mang lại nhiều lợi ích: tăng thời hạn sử dụng của thực phẩm, hạn chế sự truyền mầm bệnh trong chuỗi thức ăn, giảm thiệt hại kinh tế do hƣ hỏng thực phẩm, hạn chế sử dụng chất bảo quản hóa học cũng nhƣ giảm bớt nhiệt độ và áp suất trong quá trình xử lý, vì vậy bảo đảm đƣợc giá trị dinh dƣỡng nhất là hàm lƣợng vitamin, hƣơng vị và màu sắc tự nhiên của thực phẩm [43]. Thịt lên men đã đƣợc dùng phổ biến từ xa xƣa ở khắp thế giới, trong đó có các loại xúc xích lên men bán khô (semidry sausage) với những nhãn hiệu nổi tiếng nhƣ Chorio, Summer... và lên men khô nhƣ Peperoni, Salami. Để sản xuất, ngƣời ta thƣờng dùng các vi khuẩn lactic nhƣ L. plantarum, L. pentosus, L. sake, L. curvatus, L. pentosaceus, L. acidilactic... với chức năng axit hóa, chống oxi hóa, đặc biệt là sinh tổng hợp bacteriocin để tránh nhiễm trùng, đảm bảo đƣợc chất lƣợng và vệ sinh an toàn thực phẩm, nhiều loài còn tạo hƣơng thơm đặc trƣng. Bacteriocin đƣợc sử dụng rất phổ biến trong công nghệ đóng hộp hoa quả. Khi khử trùng các hộp hoa quả, nếu tăng nhiệt độ lên cao sẽ làm nhũn cũng nhƣ mất đi màu sắc và hƣơng vị tự nhiên của hoa quả, nhƣng nếu thêm một lƣợng nhất định bacteriocin thì có thể làm giảm nhiệt độ khử trùng mà vẫn giữ đƣợc chất lƣợng sản phẩm. Có ba phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng trong việc bảo quản thực phẩm bằng bacteriocin [17]: - Ủ thực phẩm với giống bảo vệ (thƣờng là vi khuẩn lactic) để tạo bacteriocin tại chỗ (in situ). Trong trƣờng hợp này, khả năng sinh trƣởng và tạo bacteriocin của LAB trong sản phẩm là yếu tố quyết định. - Bổ sung bacteriocin tinh chế hoặc bán tinh chế vào thực phẩm nhƣ một chất bảo quản. - Sử dụng thành phẩm của quá trình lên men trƣớc đó với chủng sinh bacteriocin nhƣ là một thành phần trong qui trình chế biến thực phẩm. 13 Sử dụng chủng sinh bacteriocin làm giống khởi động Thông thƣờng giống khởi động (Starter cultures) là hỗn hợp các loài vi sinh vật có vai trò tạo màu, tạo mùi thơm, hƣơng vị đặc trƣng, làm giảm độ pH, ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn có hại trong thực phẩm. Khi đƣợc sử dụng nhƣ một chủng trong giống khởi động, chủng sinh bacteriocin phải tạo đƣợc lƣợng bacteriocin đủ lớn để chống lại các vi khuẩn khác mà không làm ảnh hƣởng đến chức năng của giống khởi động ban đầu. Do đó, giống khởi động phải kháng với bacteriocin. Các giống khởi động nuôi cấy cùng bacteriocin thƣờng đƣợc sàng lọc bằng cách nuôi cấy phụ lặp lại, với nồng độ bacteriocin tăng dần để chọn lọc các giống thích nghi hay bằng biến đổi gen. Ví dụ, chủng Enterococcus sinh enterocin AS-48 đƣợc sử dụng làm giống nuôi cấy kết hợp với một giống khởi động thƣơng mại trong sản xuất phomat không làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của giống khởi động hay đặc tính hóa sinh của phomat tạo ra đồng thời lƣợng bacteriocin đƣợc tạo ra trong phomat đủ đảm bảo ức chế B. cereus [32, 53]. Sử dụng chủng sinh bacteriocin làm probiotic Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về probiotic tăng lên nhanh chóng. Nhiều sản phẩm probiotic đã xuất hiện trên thị trƣờng dƣới dạng viên bọc, bột, sữa chua làm giàu và nhiều loại thực phẩm khác. Thuật ngữ probiotic bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là vì sự sống, theo tiếng Việt là trợ sinh. Theo đó, probiotic là “những vi sinh vật sống mà khi đƣa vào cơ thể một lƣợng đủ lớn sẽ tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [40]. Vi sinh vật sử dụng cho các sản phẩm probiotic là nấm men, vi khuẩn (đặc biệt là nhóm LAB). Ví dụ, L. acidophilus là LAB lên men đồng hình đƣợc tìm thấy trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời và động vật. Chúng đƣợc bổ sung vào các sản phẩm sữa lên men thƣơng mại nhƣ sữa chua acidophilus. Những vi khuẩn này có tác động tích cực đến sức khỏe con ngƣời nhờ khả năng sinh bacteriocin – giúp ức chế hay tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh. Probiotic từ LAB ngăn ngừa hiệu quả sự rối loạn hệ khuẩn chí đƣờng ruột và thƣờng đƣợc sử dụng để điều trị tiêu chảy do các nguyên nhân khác nhau. Bacteriocin giúp vi sinh vật có lợi cạnh tranh với vi sinh vật bản địa cũng nhƣ hệ vi 14 khuẩn đƣờng ruột gây bệnh nhƣ Helicobacter pylori, E. coli và Salmonella [44, 53]. 1.1.4.2. Ứng dụng bacteriocin trong y tế và chăm sóc sức khỏe Sự gia tăng nhanh chóng và lan tràn của các vi sinh vật kháng đa thuốc trong những năm gần đây đang đặt ra những yêu cầu về một giải pháp thay thế trong cuộc chiến điều trị các bệnh nhiễm trùng. Một trong những hạn chế của việc sử dụng các chất kháng sinh phổ rộng là tiêu diệt hầu hết các loài vi khuẩn không kháng thuốc. Vì vậy, bên cạnh hiện tƣợng kháng đa thuốc đang ngày càng lan rộng trong các quần thể vi khuẩn gây bệnh còn là sự mất cân bằng của quần thể các vi sinh vật hội sinh. Bacteriocin hứa hẹn là các chất diệt khuẩn thế hệ mới với nhiều ƣu điểm vƣợt trội có thể giải quyết thế lƣỡng nan này. Với phổ kháng khuẩn hẹp, tính đặc hiệu tế bào đích cao, bacteriocin đƣợc xem là các “dƣợc phẩm thiết kế” (designer drugs), là giải pháp cho vấn đề kiểm soát các bệnh nhiễm trùng đang đặt ra nhiều thách thức hiện nay [81, 86]. 1.1.4.3. Ứng dụng bacteriocin trong nông nghiệp Hàng năm trên thế giới các bệnh ở cây trồng đã gây thiệt hại từ 12-15% tổng giá trị mùa màng. Phần lớn các bệnh này là do vi khuẩn có hại gây ra. Hệ vi khuẩn sống trên thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Nơi sống và phƣơng thức sống của chúng cũng rất khác nhau. Chúng có thể ký sinh trên lá hoặc rễ, hay nhiễm vào trong các mô của thực vật nhƣ các vi khuẩn kí sinh, cộng sinh hoặc vi khuẩn gây bệnh. Trong quá trình sống, nhiều vi khuẩn đã tiết ra bacteriocin nhằm cạnh tranh không gian sống và nguồn dinh dƣỡng, tuy nhiên mới chỉ có một số ít bacteriocin từ những vi khuẩn này đƣợc nghiên cứu, mô tả đặc tính di truyền và hóa sinh. Dựa trên cơ sở này, các nhà khoa học đã đề xuất một phƣơng pháp kiểm soát bệnh cây trồng do vi khuẩn gây ra bằng cách sử dụng các chủng sinh bacteriocin hoặc sử dụng trực tiếp các bacteriocin đã điều chế. Hiện nay, một số bacteriocin nhóm này đã đƣợc sản xuất và bán trên thị trƣờng, điển hình là agrocin K48, một bacteriocin do Agrobacterium radiobacter K48 sinh ra, có khả năng kháng Agrobacterium tumifaciens gây bệnh mụn cây (crown gall disease) cho nhiều loại cây trồng [65]. Ngoài vi khuẩn gây bệnh, nấm cũng là một mối đe dọa lớn đối với cây trồng. 15 Magnusson (2003) đã nghiên cứu các vi khuẩn lactic (LAB) phân lập từ nhiều môi trƣờng khác nhau và thấy rằng 10% các chủng vi khuẩn này sinh ra bacteriocin có khả năng ức chế Aspergillus fumigatus và 4% tiết bacteriocin có hoạt tính kháng loại mốc này rất mạnh [71]. Một ví dụ khác là syringomycin E và G do Pseudomonas syringae 508 tiết ra có thể tiêu diệt bào tử của V. inaequalis [27]. 1.2. ENTEROCIN P 1.2.1. CÁC Enterococcus: VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP ENTEROCIN Enterococcus đƣợc mô tả lần đầu tiên năm 1899, là một chi lớn thuộc nhóm LAB. Enterococcus gồm các cầu khuẩn Gram dƣơng, kỵ khí tùy tiện, thƣờng tồn tại dƣới dạng cặp và chuỗi, lên men đồng hình tạo L(+)LA (axit lactic đồng phân hình học dạng L). Hiện nay, các nhà khoa học đã xác định đƣợc hơn 26 loài thuộc chi Enterococcus, phân thành 8 nhóm loài (species section) dựa trên quan hệ phát sinh loài, trong đó, E. faecalis và E. faecium là hai loài chiếm ƣu thế [38]. Enterococcus có nguồn gốc từ đƣờng tiêu hóa của ngƣời và động vật máu nóng, phân bố rất rộng rãi trong không khí, nƣớc, chất thải, đất... [71]. Đa số các chủng vi khuẩn thuộc nhóm Enterococcus có khả năng sinh ra bacteriocin. Bacteriocin này đƣợc gọi là các enterocin và hầu hết đều thuộc lớp II. Phần lớn các enterocin đƣợc tinh chế và xác định đặc tính di truyền nhiều năm nay đều từ E. faecalis và E. faecium. Enterococcus có ý nghĩa lớn trong vi sinh vật học môi trƣờng, thực phẩm và y học. Chúng giữ vai trò quan trọng trong quá trình chín, tạo kết cấu mùi vị thực phẩm lên men nhƣ pho mat, xúc xích..., tăng cƣờng giá trị dinh dƣỡng thực phẩm [71]. Một số chủng của Enterococcus, điển hình là E. faecium SF68 đã đƣợc nghiên cứu và sử dụng nhƣ một probiotic ở ngƣời, đặc biệt là trong điều trị tiêu chảy [93]. Enterococcus có vai trò bảo quản quan trọng trong các thực phẩm chế biến từ thịt nhờ khả năng tạo ra một loạt các enterocin khác nhau, một số chủng thậm chí có khả năng sinh ra nhiều loại enterocin. Trong số đó, đáng chú ý là các enterocin có hoạt tính kháng Listeria spp. – nguyên nhân chính gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm và các bệnh lý nguy hiểm ở ngƣời trong thời gian gần đây. Hoạt tính kháng Listeria 16 có thể đƣợc giải thích bởi thực tế Enterococci và Listeria có quan hệ gần gũi về mặt phát sinh. Một ƣu điểm nữa là enterocin có khả năng chịu nhiệt và khoảng pH dao động rộng. Do vậy, tiềm năng ứng dụng của các enterocin từ Enterococcus là rất lớn [53]. Tuy nhiên, một số chủng của Enterococcus sinh độc tố và không có khả năng tổng hợp mạnh enterocin. Thâ ̣m chí , một số loài phân lập từ thức ăn có thể chứa các yếu tố gây độc, trong đó E. faecalis chứa nhiều rủi ro tiềm ẩn. Một vấn đề đáng chú ý nữa là tính kháng kháng sinh của một số chủng, đặc biệt là các chủng kháng vancomycin gây khó khăn trong điều trị bệnh nhiễm trùng [53, 87]. Do vậy việc sử dụng Enterococcus nhƣ là các probiotic cần đƣợc nghiên cứu và kiểm tra kỹ lƣỡng. Đồng thời, việc tạo enterocin tái tổ hợp ứng dụng trong bảo quản thực phẩm và y tế đƣợc xem là giải pháp tối ƣu. 1.2.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA ENTEROCIN P Enterocin P (EntP) là một bacteriocin dạng pediocin, thuộc lớp IIa, do chủng E. faecium P13 (phân lập lần đầu tiên từ xúc xích lên men khô Tây Ban Nha) sinh ra. EntP có phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng ức chế mạnh các vi khuẩn gây gây thối hỏng và ngộ độc thực phẩm nhƣ S. aureus, C. perfringens, C. botulinum... và đặc biệt là L. monocytogenes. Dựa vào cấu trúc gen, EntP thuộc nhóm IIa [20]. Mặt khác, peptide này cũng đƣợc một số tác giả xếp vào phân lớp IIc do nó đƣợc tiết ra ngoại bào theo cơ chế của bacterocin phân lớp IIc. Do vậy mà ở một số bài báo, tùy theo quan điểm phân loại của từng tác giả mà EntP thuộc phân lớp IIa hay IIc. Phân tử EntP ban đầu đƣợc tổng hợp tại ribosome gồm 71 amino acid, trong đó 27 amino acid đầu tiên là peptit tín hiệu dẫn có vai trò đƣa peptide ra ngoài môi trƣờng. Sau khi đƣợc tiết ra ngoài, đoạn peptide này bị cắt bỏ để tạo EntP dạng hoạt động gồm 44 amino acid, có khối lƣợng phân tử 4493 Da. 17 Bảng 1.3. Hoạt tính kháng khuẩn của enterocin P tinh sạch từ dịch nuôi chủng E. faecium P13 [21] Loài / Chủng MIC (ng/ml) Loài / Chủng MIC (ng/ml) Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 - E. faecalis TNO EF 238 L. bulgaricus ATCC 11842 - S. carnosus TNO MC1 139 L. casei ATCC 334 - Listeria innocua TNO BL86/26 395 286 L. curvatus NCFB 2739 17 B. cereus ATCC 9139 L. fermentum ATCC 9338 1 Clostridium sporogenes TNO C22/10 L. helveticus ATCC 15009 - C. tyrobutyricum TNO 3,5CT L. plantarum CNDO 1193 - NCDO 1754 412 L. reuteri DSM 20016 - Propionibacterium sp. TNO P4 37 NO P6 144 L. sake NCB 2714 4 559 26 ASC 148 - C. perfringens CECT 376 4 L. salivarius NCFB2747 - C. botulinum CECT 551 259 L. monocytogenes NCTC 7973 35 Pediococcus acidilactici ASCL50 ASC 347 69 - FVM LI5sv1/2 33 P. pentosaceus TNO FBB61 136 NCTC5105 18 TNO FBB63 18 FVM LI1sv4 39 - FVM Scott A 125 TNO PC1 Leuconostoc cremoris TNO DB1275 - L. cremoris INRA CNRZ117 - FRI 196E 407 L. lactis INRA CNRZ148 - FRI 349 221 L. lactis INRA CNRZ150 - FRI 361 294 22 FRI 472 269 L. lactis ASC BB24 Enterococcus faecium ASC T136 Staphylococcus aureus FRI137 190 2 EntP khá bền nhiệt, hoạt tính kháng khuẩn của EntP có thể duy trì ở 100o C trong 60 phút hoặc ở 121o C trong 15 phút. Hoạt tính này ổn định trong một thời gian dài khi đƣợc bảo quản ở - 20o C hoặc 4o C. EntP còn có khả năng hoạt động 18