Tài liệu Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành: 8. 42. 02. 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN XUÂN VŨ Thái Nguyên - 2020 i LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” là trung thực, được thực hiện tại Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm- Đại học Thái Nguyên. Ngoài ra, trong bài báo cáo có sử dụng một số nguồn tài liệu tham khảo đã được trích dẫn rõ ràng và được phép công bố. Em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về tính trung thực của các nội dung khác trong đề tài của mình. Học viên ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân. Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến giáo viên hướng dẫn T.S Nguyễn Xuân Vũ đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các cán bộ, quý đồng nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020 Học Viên iii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Từ, thuật ngữ Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ viết tắt (cả tiếng Anh và tiếng Việt) CT Công thức LSD Least Singnificant Difference Test – Sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa CV Coeficient of Variation – Hệ số biến động MT Môi trường TN Thí nghiệm AS Acetosyringone LB Left border- ranh giới trái RB Right border-ranh giới phải MS Murashige Skoog iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Diện tích lúa gieo trồng từ năm 2015 - 2019 ...............................................9 Bảng 1.2. Sản lượng lúa từ năm 2015 - 2019 ...............................................................9 Bảng 2.1. Danh mục giống nghiên cứu ......................................................................19 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của NaOCl 3% tới hiệu quả khử trùng mẫu (sau 7 ngày nuôi cấy) ..................................................................................................29 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa ...................................................................................................30 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D đến tỷ lệ tái sinh mô sẹo ở một số giống lúa (sau 14 ngày) ...............................................................................................................33 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi một số giống lúa ............34 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh ở một số giống lúa .............35 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến khả năng tiếp nhận gen GUS của một số giống lúa ...................................................................................................37 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hiệu quả chuyển gen ở một số giống lúa......................................................................................................................39 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng tiếp nhận gen GUS của một số giống lúa ...................................................................................................40 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen ..................42 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen .........43 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ hygromycin đến hiệu quả chọn lọc mô sẹo chuyển gen ..................................................................................................................44 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tình hình sản xuất và diện tích lúa toàn cầu năm 2018 [16] ........................6 Hình 1.2. Tỷ trọng sản xuất lúa theo vùng năm 2018 ...................................................7 Hình 1.3. Vi khuẩn A. tumefaciens ............................................................................10 Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ......................10 Hình 1.5. Cấu trúc Ti-plasmid ....................................................................................11 Hình 1.6. Cấu trúc T-DNA .........................................................................................12 Hình 1.7. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens ................13 Hình 2.1. T-DNA của plasmid pCambia3301 mang gen bar và gen gus, mỗi gen điều kiển bởi CaMV 35S promoter (LB: ranh giới trái, RB: ranh giới phải). ............20 Hình 3.1. Mô sẹo tái sinh trên môi trường N6 (A) và MS (B) ở giống lúa Bao thai sau 7 ngày nuôi cấy. ..................................................................31 Hình 3.2. Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa (sau 14 ngày). A- Nếp 87; B- Bao thai; C- Khang dân; D- Đoàn kết....................33 Hình 3.3. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi của một số giống lúa (sau 28 ngày). A-Đoàn kết; B- Nếp 87 ; C-Khang dân; D- Bao thai .........................34 Hình 3.4. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi của một số giống lúa (sau 28 ngày). A-Nếp 87; B- Đoàn kết; C-Khang dân; D- Bao thai .........................35 Hình 3.5. Biểu hiện gen GUS ở mô sẹo 3 ngày tuổi của giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D). .................................................................38 Hình 3.6. Biểu hiện gen GUS ở nồng độ AS 100 µM ở giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D). .................................................................40 Hình 3.7. Biểu hiện gen GUS sau 3 phút lây nhiễm với vi khuẩn ở giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D). .......................................41 Hình 3.8. Biểu hiện gen GUS sau 3 ngày đồng nuôi cấy ở giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) và Nếp 87 (D). .................................................................43 Hình 3.9. Chọn lọc tế bào chuyển gen trên môi trường hygromycin 10mg/l (A), 15 mg/l (B), 20 mg/l (C) và 25 mg/l (D) ....................................................................44 vi MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT................................................. iii DANH MỤC BẢNG ........................................................................................... iv DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. v MỤC LỤC .......................................................................................................... vi MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 2. Mục đích nghiên cứu ........................................................................................ 3 3. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .......................................................... 3 4.1. Ý nghĩa khoa học .......................................................................................... 3 4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................... 3 Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................... 4 1.1. Vai trò của cây lúa ........................................................................................ 4 1.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất lúa trên thế giới ........................................ 5 1.2.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa trên thế giới .......................................5 1.2.2. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới ....................................................................6 1.3. Tình hình nghiên cứu vẩn xuất lúa tại Việt Nam ........................................... 7 1.3.1. Nghiên cứu chọn tạo giống lúa ở Việt Nam. ......................................................7 1.3.2. Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam .....................................................................8 1.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật .. 10 1.4.1. Đặc điểm chung về vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens..............................10 1.4.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid và T-DNA ...........................................11 1.4.3. Cơ chế biến nạp gen thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens vào thực vật ...........12 1.5. Hệ thống gen chỉ thị sử dụng để biến nạp vào tế bào thực vật thông qua vi khuẩn A. tumefaciens được sử dụng trong nghiên cứu .................................... 14 1.5.1. Gen gusA ..........................................................................................................14 1.5.2. Gen bar ..............................................................................................................14 vii 1.6. Một số phương pháp biến nạp gen ở lúa ...................................................... 14 1.6.1. Phương pháp vi tiêm .........................................................................................14 1.6.2. Chuyển gen bằng xung điện..............................................................................15 1.6.3. Chuyển gen qua ống phấn (pollen tube) ...........................................................15 1.6.4. Chuyển gen bằng súng bắn gen ........................................................................15 1.7. Chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens ............................................ 16 1.8. Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro cây lúa trên thế giới và Việt Nam ..... 16 1.9. Tình hình nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen cây lúa trên thế giới và Việt Nam ....................................................................................................... 17 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 19 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu................................................................ 19 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................19 2.1.2. Vật liệu sử dụng và phạm vi nghiên cứu ..........................................................19 2.1.3. Thiết bị sử dụng ................................................................................................ 20 2.2. Địa điểm và thời gian tiến hành ................................................................... 20 2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ......................................................... 21 2.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa ........21 2.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng chuyển gen ở một số giống lúa ...................................................................................23 2.4. Điều kiện bố trí thí nghiệm .......................................................................... 26 2.5. Phương pháp theo dõi, đánh giá. ................................................................. 26 2.5.1. Các chỉ tiêu theo dõi .........................................................................................26 2.5.2. Các chỉ tiêu đánh giá .........................................................................................26 2.6. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................... 27 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 29 3.1. Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh invitro của một số giống lúa ............. 29 3.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của NaOCl đến hiệu quả vô trùng mẫu nuôi cấy ........29 3.1.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo .......................30 3.1.3. Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo ở một số giống lúa .................32 3.1.4. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa ...............33 viii 3.1.5. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi ở một số giống lúa Việt Nam .....................................................................................................................35 3.2. Kết quả nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen................................................. 36 3.2.1. Ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến hiệu quả biến nạp gen ...................................36 3.2.2. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hiệu quả biến nạp gen .............................38 3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến hiệu quả chuyển gen ở một số giống lúa ......39 3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen .........................41 3.2.5. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen ..................42 3.2.6. Ảnh hưởng của nồng độ hygromycin đến hiệu quả chọn lọc chuyển gen ........43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................ 45 1. Kết luận ......................................................................................................... 45 2. Kiến nghị ....................................................................................................... 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 47 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba loại cây lương thực chính quan trọng hàng đầu của con người, cung cấp từ 60 đến 70% calories [25]. Trên thế giới, cây lúa nước được xếp vào vị trí thứ 2 sau cây lúa mì về diện tích và sản lượng.Việt Nam một đất nước đã gắn liền với nền văn minh lúa nước, cây lúa có vai trò đặc biệt quan trọng, trong sản xuất lương thực, đóng góp sản lượng cao nhất (60%) và được canh tác với diện tích 4.126,4 nghìn ha, với quy mô giảm qua các năm, phân tán, manh mún do sự phát triển của công nghiệp hoá. Hiện nay, diện tích đất nông nghiệp bình quân/hộ chỉ vào khoảng 0,46 ha và trung bình được chia thành 2,83 mảnh [7]. Trong khi dân số đang không ngừng tăng lên, việc tạo ra bộ giống có năng suất cao, chất lượng tốt là yêu cầu cấp thiết trong giai đoạn hiện nay. Các giống lúa đột biến dựa trên việc sử dụng tác nhân đột biến làm biến đổi bộ gen cho kích thước hạt dài, giá trị dinh dưỡng, năng suất cao, đồng thời tạo ra cây lúa kháng thuốc diệt cỏ đồng hợp tử, nhạy cảm với nhiệt độ thấp, đặc biệt là ở giai đoạn non. Việc tạo ra các giống lúa có khả năng chống chịu được với điều kiện bất lợi ngoại cảnh đặc biệt là hạn hán có ý nghĩa quan trọng đối với việc duy trì và tăng năng suất lúa gạo, góp phần giữ ổn định an ninh lương thực quốc gia. Sự phát triển của công nghệ sinh học cho phép chọn tạo ra những giống cây trồng, vật nuôi mới phù hợp với mục đích sử dụng. Việc chỉnh sửa bộ gen cũng có thể được sử dụng để sửa đổi gen lúa tạo ra các giống lúa an toàn và từ đó tăng giá trị trong mỗi sản phẩm lúa gạo. Việt Nam khí hậu ôn hòa, đất đai phì nhiêu, điều kiện tự nhiên phù hợp với phát triển nền nông nghiệp lúa nước, diện tích đồng bằng ven sông lớn như đồng bằng sông Cửu Long 4.081,63 ha và đồng bằng Sông Hồng 2.126,3ha [7]. Lượng mưa trung bình vào khoảng 700 – 5000mm,…là những thế mạnh giúp chúng ta phát triển lĩnh vực nông nghiệp. Thế nhưng, khi đi sâu vào thực tế, gạo Việt Nam vẫn còn tồn đọng một số hạn chế nhất định bên cạnh những ưu điểm vang danh bấy lâu. Hiện nay, phương pháp dùng để chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens không được xem là có hiệu quả với cây một lá mầm [19, 30]. Tuy nhiên, có nhiều 2 công trình nghiên cứu báo cáo việc biến nạp gen thành công vào lúa nhờ vi khuẩn A. tumefaciens. Chan et al (1992) là những người đầu tiên chuyển gen vào callus lúa mặc dù khi đó không thu được cây chuyển gen [9]. Đến năm 1993, nhóm nghiên cứu này đã tạo ra được cây lúa japonica chuyển gen đầu tiên nhờ vi khuẩn A. tumefaciens bằng cách nuôi cấy phôi non. Hiện nay, biến nạp gen vào lúa nhờ vi khuẩn A. tumefaciens là phương pháp được lựa chọn sử dụng hơn cả, do số bản sao của gen biến nạp được chèn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ thấp, bền vững [20]. Đặc biệt, phương pháp này cho hiệu quả chuyển gen cao, khả năng chuyển được đoạn DNA có kích thước lớn và chi phí thấp. Các nghiên cứu tạo giống truyền thống chủ yếu dựa trên các phương pháp lai tạo nên hiệu quả đạt được không thực sự cao. Một số ứng dụng mới trong chọn giống cây trồng nhờ dùng chỉ thị phân tử, gây đột biến... tuy đã đạt được một số kết quả nhất định nhưng vẫn có những hạn chế. Phương pháp chuyển gen ra đời được ví như “chìa khóa đa năng” để mở những nút thắt vốn gây rất nhiều khó khăn cho các nhà chọn tạo giống truyền thống nhằm tạo ra một giống cây trồng “hoàn hảo” hơn khi chúng được kết hợp với nhau. Với hướng nghiên cứu này, các gen quy định những tính trạng quan tâm được chủ động chuyển vào lúa, từ đó tạo ra cácgiống lúa mang các đặc tính như mong muốn của con người. Những năm gần đây, ngành lúa gạo của Việt Nam gặp nhiều khó khăn cả về điều kiện khí hậu, giá và thị trường xuất khẩu. Bên cạnh đó, các thách thức về biến đổi khí hậu, thiếu hụt nguồn nước, thoái hóa đất,…đang ngày càng hiện rõ. Duy trì sản lượng lúa gạo lớn là một chính sách đã được áp dụng từ lâu. Nghị quyết 63/2009/NQ-CP về đảm bảo an ninh lương thực quốc gia yêu cầu duy trì sản lượng lúa 41-42 triệu tấn đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu khoảng 4 triệu tấn gạo/năm. Đây là một chính sách sản lượng nhằm hướng tới hai mục tiêu an ninh lương thực trong nước và xuất khẩu với một chỉ tiêu cứng nhắc. Chính sách khuyến khích sản lượng cao dẫn đến nhiều hệ quả bất lợi cho nông dân trồng lúa. Chính vì vậy, hướng tiếp cận nghiên cứu nguồn gen lúa gạo Việt Nam phục vụ cho công tác bảo tồn đa dạng sinh học nguồn gen ngành lúa được lưu giữ trong phòng thí nghiệm cũng như ngoài thực địa dùng làm nguyên liệu ban đầu để tuyển chọn và phát triển thương mại phục vụ nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu. Vì vậy, 3 các nghiên cứu phải đặt trong hệ thống khép kín, tương tác lẫn nhau từ khâu điều tra, xác định, phân loại, chọn, tạo giống, tới kỹ thuật nuôi trồng và định hướng thị trường tiêu thụ sản phẩm tập trung và bền vững. Nhằm tận dụng và phát triển nguồn gen lúa của Việt Nam chưa được khai thác một cách hợp lý và khoa học. Việc nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phục vụ cho công tác tạo giống lúa chuyển gen đáp ứng nhu cầu thực tiễn sản xuất là cần thiết. Xuất phát từ những vấn đề trên tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”. 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phục vụ cho công tác tạo giống lúa chuyển gen đáp ứng nhu cầu thực tiễn sản xuất. 3. Đối tượng nghiên cứu Một số giống lúa : Khang dân, Bao thai, Đoàn kết và Nếp 87 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Đề tài tạo cơ sở lý luận cho việc nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa, xây dựng và hoàn thiện được quy trình nghiên cứu chuyển gen của một số giống lúa Việt Nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Phân tích, đánh giá những mặt thuận lợi, tiềm năng lợi thế và hạn chế để tiếp cận hướng nghiên cứu, kỹ thuật tái sinh, kỹ thuật nhân nhanh bằng phương pháp in vitro cho sự phát triển của từng giai đoạn đảm bảo ý nghĩa thực tiễn là bảo tồn và phát triển nguồn gen lúa gạo Việt Nam. Việc nghiên cứu nguồn gen lúa gạo Việt Nam phục vụ cho công tác bảo tồn đa dạng sinh học nguồn gen được lưu giữ trong phòng thí nghiệm cũng như ngoài thực địa dùng làm nguyên liệu ban đầu để tuyển chọn và phát triển thương mại phục vụ nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu. 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vai trò của cây lúa Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng được trồng chủ yếu ở Châu Á, đặc biệt là khu vực Đông Nam Á trong đó có Việt Nam. Lúa gạo là nguồn lương thực chủ yếu nuôi sống hàng tỷ người trên thế giới. Sản lượng lúa gia tăng trong thời gian qua đã mang lại sự an sinh cho con người, đặc biệt đối với dân nghèo: gạo là nguồn cung cấp thức ăn chủ yếu. Các nước nghèo thường dùng gạo là nguồn lương thực chính, khi thu nhập tăng lên mức tiêu thụ gạo có xu hướng giảm xuống, thay thế bằng các loại thức ăn cung cấp nhiều protein và vitamin hơn. Ở Việt Nam hiện nay mức tiêu thụ gạo bình quân vẫn còn ở mức cao, khoảng 120 kg/người/năm. Tuy nhiên có thể nói, trên khắp thế giới, ở đâu cũng có dùng đến lúa gạo hoặc các sản phẩm từ lúa gạo. Khoảng 40% dân số trên thế giới lấy lúa gạo làm nguồn lương thực chính. Trên thế giới có hơn 110 quốc gia có sản xuất và tiêu thụ gạo với các mức độ khác nhau. Lượng lúa được sản xuất ra và mức tiêu thụ gạo cao tập trung ở khu vực Châu Á. Năm 1980, chỉ riêng ở Châu Á đã có hơn 1,5 tỷ dân sống nhờ lúa gạo, chiếm trên 2/3 dân số Châu Á. Con số này theo ước đoán đã tăng lên gần gấp đôi. Lúa là cây trồng thân thiết, lâu đời nhất của nhân dân ta và nhiều dân tộc khác trên thế giới, đặt biệt là các dân tộc ở Châu Á. Mặc dù năng suất lúa ở các nước Châu Á còn thấp nhưng do diện tích sản xuất lớn nên Châu Á vẫn là nguồn đóng góp rất quan trọng cho sản lượng lúa trên thế giới (trên 90%). Các quốc gia dẫn đầu về sản lượng lúa theo thứ tự là Trung Quốc, Ấn Độ, Indoniesia, Bangladesh, Việt Nam, Thái Lan và Myanmar tất cả đều nằm ở Châu Á. Như vậy, có thể nói Châu Á là vựa lúa quan trọng nhất thế giới. Gạo là thức ăn giàu dinh dưỡng. So với lúa mì, gạo có thành phần tinh bột và protein hơi thấp hơn, nhưng năng lượng tạo ra cao hơn do chứa nhiều chất béo hơn. Ngoài ra, nếu tính trên đơn vị 1 hecta, gạo cung cấp nhiều calo hơn lúa mì do năng suất lúa cao hơn nhiều so với lúa mì. Giả sử một người trung bình cần 3200 calo mỗi ngày thì một hecta lúa có thể nuôi 2055 người/ngày hoặc 5,63 người/năm, trong khi lúa mì chỉ nuôi được 3,67 người /năm, bắp 5,3 người/năm. Hơn nữa, trong gạo lại có chứa nhiều acid amin, thiết yếu như: Lysine, Threonine, Methionine, Tryptophan… hơn hẳn lúa mì. Đối với một số quốc gia như Việt Nam, Thái Lan, Miến Điện (Myanmar), Ai Cập lúa gạo chiếm một vị trí quan 5 trọng trong nền kinh tế quốc dân, không phải chỉ là nguồn lương thực mà còn là nguồn thu ngoại tệ để đổi lấy thiết bị, vật tư cần thiết cho sự phát triển của đất nước. Điều này chỉ rõ vị trí của lúa gạo trong cơ cấu lương thực thế giới và trong đời sống kinh tế quốc tế. Việt Nam là một trong những nước có nghề truyền thống trồng lúa nước cổ xưa nhất thế giới. Nông nghiệp trồng lúa vừa đảm bảo an ninh lương thực quốc gia, vừa là cơ sở kinh tế sống còn của đất nước. Dân số nước ta đến nay hơn 90 triệu người, trong đó dân số ở nông thôn chiếm gần 80% và lực lượng lao động trong nghề trồng lúa chiếm khoảng 70% lực lượng lao động cả nước. Điều đó cho thấy lĩnh vực nông nghiệp trồng lúa thu hút đại bộ phận lực lượng lao động cả nước, đóng vai trò rất lớn trong nền kinh tế quốc dân. Bên cạnh đó, ưu thế lớn của nghề trồng lúa còn thể hiện rõ ở diện tích canh tác trong tổng diện tích đất nông nghiệp cũng như tổng diện tích trồng cây lương thực. Ngành trồng trọt chiếm 4/5 diện tích đất canh tác trong khi đó lúa giữ vị trí độc tôn, gần 85% diện tích lương thực. Theo số liệu sơ bộ của Tổng cục Hải quan, tính chung cả năm 2019 cả nước xuất khẩu 6,37 triệu tấn gạo, tương đương 2,81 tỷ USD, tăng 4,1% về lượng nhưng giảm 8,4% về kim ngạch so với năm 2018. Giá xuất khẩu đạt 440,7 USD/tấn, giảm 12,1%. Kết quả báo cáo tổng kết 7 tháng đầu năm 2020, Việt Nam xuất khẩu khoảng 3,9 triệu tấn gạo, đạt kim ngạch 1,9 tỉ USD, tăng 10,9% về giá trị so với cùng kỳ năm trước. Đặc biệt là giá gạo xuất khẩu của Việt Nam tăng cao, vượt Thái Lan, Ấn Độ và Pakistan. Đây là lần thứ 2 Việt Nam có thể trở lại vị trí xuất khẩu gạo số 1 thế giới. 1.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất lúa trên thế giới 1.2.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa trên thế giới * Nghiên cứu tái sinh invitro và chuyển gen Tái sinh cây từ mô sẹo được thông báo lần đầu tiên ở loài cây ngũ cốc bởi Tamaoki và Ullstrup năm 1958. Cho đến nay mô sẹo đã được tạo ra từ các mô lúa khác nhau như lát cắt thân, hoa non, bao phấn, tiểu bào tử, đỉnh rễ, bao lá mầm, trụ dưới lá mầm, hạt trưởng thành. Hiện nay, hạt trưởng thành và hạt non (phôi non) được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu nhiều nhất vì các vật liệu này cho mô sẹo có tỷ lệ tái sinh cây cao hơn. Năm 1985, tái sinh cây từ phôi trưởng thành ở các giống lúa Japonica được thông báo bởi Fujimura và cộng sự [17]. Tạo mô sẹo và tái sinh cây ở các giống lúa 6 indica từ phôi non được thông báo bởi Koetije và cộng sự năm 1989 nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các giống lúa Indica có sự khác nhau đáng kể về phản ứng tạo mô sẹo và tái sinh cây. Do đó, để cải thiện hiệu quả tạo mô sẹo và tái sinh cây, cần thiết tối ưu hóa môi trường cho các giống lúa indica. Lin và Zhang (2005) đã tối ưu hóa môi trường và các điều kiện nuôi cấy phục vụ biến nạp gen cho hiệu quả cao ở các giống lúa indica [26]. Lin và Zhang đã chỉ ra rằng nguyên nhân chính thu được tỷ lệ biến nạp thành công thấp ở các giống lúa indica (so với các giống lúa japonica) có thể do hiệu quả tái sinh của các giống lúa indica thấp hơn. Họ đã tìm ra được hai môi trường mới để cấy chuyển, phân hóa mô sẹo và sử dụng quy trình tái sinh cây để biến nạp cho các giống lúa indica. Hiei và cộng sự (2008) đã tối ưu hóa quy trình biến nạp cho các giống lúa indica bằng Agrobacterium tumerfaciens sử dụng phôi non của hạt non sau thu phấn 8-12 ngày. Quy trình đã được áp dụng để biến nạp thành công với hiệu quả cao (trên 7 dòng/phôi) cho các giống lúa indica IR8, IR24, IR26, IR36, IR54, IR64, IR72, Xin Qing Ai 1, Nan Jin 11 và Suewon 258 [20]. 1.2.2. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới Theo cơ quan FAO tại Rome, sản xuất lúa thế giới trong 2018 tương đối thuận lợi đạt đến 782 triệu tấn, tăng 1,6% so với năm 2017, mặc dù điều kiện khí hậu bất thường xảy ra tại nhiều nơi, với diện tích trồng toàn cầu khoảng 168 triệu ha. Hình 1.1. Tình hình sản xuất và diện tích lúa toàn cầu năm 2018 [16] 7 Hình 1.2. Tỷ trọng sản xuất lúa theo vùng năm 2018 Châu Á, sản xuất lúa đứng đầu châu lục chiếm gần 90,7% tổng sản ngạch thế giới hay đạt đến 594,7 triệu tấn. Ở Châu Phi, sản xuất 22,6 triệu tấn, hay 3,4% mặc dù gặp hạn hán và ngập lụt tại vài nơi ở Burkina Faso, Gambia, Niger, Tanzania và Madagascar. Ở Châu Mỹ, sản xuất lúa đạt đến 33,8 triệu tấn, Brazil là nước sản xuất lúa lơn nhất của vùng, năm 2018 với sản lượng 11,3 triệu tấn. Ở Châu Âu, sản xuất trong 2018 khoảng 3,6 triệu tấn lúa. Hai nước trồng lúa lớn của Châu Âu là Ý và Tây Ban Nha. Châu Úc, năm 2018 Sản ngạch lúa thu hoạch đạt đến 815.964 tấn. 1.3. Tình hình nghiên cứu vẩn xuất lúa tại Việt Nam 1.3.1. Nghiên cứu chọn tạo giống lúa ở Việt Nam. 1.3.1.1. Chọn tạo giống bằng lai hữu tính Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự (2015) nghiên cứu giống lúa nếp N31 có năng suất, chất lượng tốt và thời gian sinh trưởng ngắn ngày được chọn tạo bằng phương pháp lai hữu tính giữa tổ hợp lai hai giống nếp DT22 và giống nếp N87-2 (N98) [2]. 8 1.3.1.2. Chọn tạo giống bằng công nghệ tế bào * Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro Phan Thị Hương và cộng sự (2014) đánh giá khả năng tạo mô sẹo và tái sinh của bảy giống lúa bao gồm BM9630, NV1, NV2, NV3, J02 (thuộc nhóm japonica), Hương Cốm và BC15 (thuộc nhóm indica) [4]. Tỷ lệ tạo mô sẹo của các giống lúa nghiên cứu trong khoảng 72-98%; trong đó, giống Hương cốm, NV1 và J02 có tỷ lệ tạo mô sẹo trên 90% (tương ứng 97%, 92% và 98%). Môi trường tạo mô sẹo thích hợp đối với giống Hương cốm và các giống japonica là môi trường muối N6 + vitamin B5 + 3 mg/l 2,4-D + 100 mg/l myo-inositol + 500 mg/l Lproline + 500 mg/l L-glutamin + 300 mg/l casein hydrolysate + 30 g/l sucrose. 1.3.1.3. Nghiên cứu chuyển gen Nguyễn Thị Hồng Châu và cộng sự (2003) đã thực hiện chuyển gen vào giống lúa C71 thông qua A.tumerfaciens. Nhóm tác giả đã sử dụng môi trường MS làm nền, cho tất cả các giai đoạn nuôi cấy, chuyển gen và tái sinh. Gen được chuyển gồm 3 gen là CryIA(b), CryIA(c) (gen mã hóa cho protein độc tố trừ sâu của vi khuẩn Bt và gen Xa21 – gen kháng bệnh bạc lá). Vật liệu là giống lúa C71. Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo callus của giống lúa C71 khoảng 92%. Tỷ lệ biến nạp gen CryIA(c) đạt 6,6%. Tác giả cũng cho rằng khả năng tái sinh của lúa indica là thấp hơn so với japonica. Thời gian cho cây chuyển gen mất từ 4,5 đến 5 tháng [1]. Ngoài kết quả tổng hợp ở trên, còn nhiều công trình khác nghiên cứu về công nghệ nuôi cấy mô tế bào lúa và chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn. 1.3.2. Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam Việt Nam có truyền thống trồng lúa lâu đời, lúa gạo là một lương thực quan trọng và chủ yếu nhất đối với người dân Việt Nam, lúa gạo ngoài dùng làm lương thực cho người, thức ăn cho vật nuôi còn dùng để chế biến các sản phẩm khác… Đặc biệt với một nước dân số đông tới khoảng trên 90 triệu người, việc tự sản xuất lúa là rất quan trọng. Việt Nam có điều kiện tự nhiên thích hợp cho cây lúa có 2 vựa lúa chính là đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long. Diện tích sản xuất lúa được xếp hạng 5 và xuất khẩu gạo đứng thứ 3 trên thế giới, gạo Việt Nam đã được xuất khẩu sang gần 160 quốc gia và vùng lãnh thổ, chiếm 15% thị phần gạo toàn cầu và cũng bước đầu thâm nhập được các thị trường có yêu cầu chất lượng cao, như: Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ, EU,… 9 - Về gieo trồng: Diện tích gieo trồng các vụ lúa ở nước ta từ năm 2015 đến năm 2019 có sự thay đổi qua các năm, được thể hiện qua Bảng 1.1. Bảng 1.1: Diện tích lúa gieo trồng từ năm 2015 - 2019 2015 Diện tích lúa Đông xuân (Nghìn ha) 3168,0 2016 3128,9 2872,9 1735, 7737,1 2017 3117,1 2876,7 1711,4 7705,2 2018 3120,1 2785,0 1683,3 7570,4 2019 3120 2010 1621,9 6751,9 Năm Diện tích lúa Hè thu (Nghìn ha) 2869,1 Diện tích lúa Mùa (Nghìn ha) 1790,9 Tổng diện tích (Nghìn ha) 7828,0 (Nguồn: Tổng cục Thống kê, 2019)[7] Nhìn chung từ năm 2015 đến năm 2019, tổng diện tích gieo trồng ở nước ta có xu hướng giảm đi, do nhiều nơi người dân chuyển đổi dần từ trồng lúa sang trồng các cây nông nghiệp (điều, cao su, tiêu,...) cho giá trị kinh tế cao hơn; một số địa phương cũng phải ưu tiên dành đất nông nghiệp cho phát triển công nghiệp, kết cấu hạ tầng và đô thị hóa. Điều này làm ảnh hưởng rất lớn đến vấn đề an ninh lương thực quốc gia. - Về thu hoạch Sản lượng lúa thu hoạch thay đổi qua các năm từ 2015 – 2019 và được trình bày tại bảng 1.2: Bảng 1.2. Sản lượng lúa từ năm 2015 - 2019 Năm 2015 Sản lượng lúa Đông Xuân (Nghìn tấn) 21091,7 Sản lượng lúa Hè Thu (Nghìn tấn) 15341,3 Sản lượng lúa Mùa Tổng sản lượng (Nghìn tấn) (Nghìn tấn) 8658,0 45091,0 2016 19646,6 15232,1 8286,4 43165,1 2017 19415,8 15461,2 7861,9 42738,9 2018 20603,0 15111,3 8264,9 43979,2 2019 20470,0 10950,0 8090,0 43450,0 (Nguồn Tổng cục Thống kê, 2019) [7] 10 Từ năm 2015 đến năm 2019, sản lượng lúa các mùa vụ sụt giảm qua các năm, chỉ có năm 2018 là sản lượng có tăng so với năm 2017. Nguyên nhân là do diện tích gieo trồng bị thu hẹp dần, người dân dần chuyển sang loại nông sản cho thu nhập cao hơn. Điều này đã ảnh hưởng rất lớn đến tình hình xuất khẩu gạo của Việt Nam. 1.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật 1.4.1. Đặc điểm chung về vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens Hình 1.3. Vi khuẩn A. tumefaciens A.tumefaciens là loài vi khuẩn đất, có dạng hình gậy, kích thước 2,5-3,0 x 0,70,8µm, dạng đơn bào, không tạo ra bào tử, có vỏ và lông roi, là vi khuẩn hiếu khí, nhuộm màu gram âm (-), khuẩn lạc tròn và rìa nhẵn. A.tumefaciens là loài vi khuẩn gây ra bệnh khối u hình chóp ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm. Chỉ rất ít thực vật một lá mầm thuộc họ Liliaceae và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối u hình chop [1]. Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens