Tài liệu Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi hoa mười giờ ( portulaca grandiflora ) qua trung gian mô sẹo

Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh Chương 1. Mở đầu 1.1. Đặt vấn đề Hoa mười giờ (Portulaca grandiflora) là cây thân thảo thuộc họ rau sam, mặc dù là một loài cây thân thảo phổ biến và dễ trồng nhưng chính nhờ tính đa dạng và màu sắc sặc sỡ mà loài cây này mới giúp tôn lên vẻ đẹp của những khu vườn hay khuôn viên, đặc biệt là lúc hoa nở rộ. Nuôi cấy in vitro hoa mười giờ để khảo sát điều kiện sinh sống của hoa mười giờ trong ống nghiệm khác thế nào so với điều kiện bên ngoài, ở bên ngoài môi trường tự nhiên hoa mười giờ rất dễ trồng và thời gian phát triển cũng khá nhanh nhưng khi tiến hành nuôi cấy in vitro mất khá nhiều thời gian thì mục đích chính là khảo sát tập tính cũng như điều kiện sống của hoa mười giờ. Đây là loài cây thân có nhiều lông nhỏ gây khó khăn trong việc tạo nguồn mẫu vô trùng. Đó là những bước nghiên cứu ban đầu làm tiền đề cho việc nghiên cứu nuôi cấy hoa mười giờ ra hoa trong ống nghiệm là một loại hình được khá nhiều người ưa thích vì nhìn rất đẹp, có thể kinh doanh được, không phải chăm sóc như hoa ngoài tự nhiên mà cây vẫn tươi tốt. Hoa mười giờ chính là đồng hồ sinh học vì cứ khoảng 8 – 10 giờ sáng là hoa nở rộ, nghiên cứu này cũng để khảo sát vấn đề này xem vì sao hoa mười giờ lại có tập tính này, cũng như hoa quỳnh nở vào lúc 12 giờ đêm, đó chính là điều đặc biệt của loài cây này nhưng khi nuôi cấy trong ống nghiệm với điều kiện không có oxy cây vẫn phát triển tốt nhưng để cây ra hoa và nở cả ngày là điều không dễ chút nào vì nó phá vỡ quy luật tự nhiên của cây, đó là cứ 8 – 10 giờ cây mới cho hoa nở. Đây là vấn đề cần phải nghiên cứu khá lâu và mất nhiều thời gian. Là loài cây rất phổ biến và dễ trồng nên nó có giá trị kinh tế không cao khi chưa tiến hành nuôi cấy in vitro. Đây là bước đầu khai thác giá trị kinh tế của loài cây này, mặc dù khá phổ biến nhưng đây cũng là một loại thuốc nam rất công dụng cùng với một số cây thuốc khác trong họ của nó như loài rau sam rất tốt cho sức khỏe. SVTH: Trần Thị Thu Hiền 1 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh 1.2. Mục đích và yêu cầu 1.2.1. Mục đích Nghiên cứu khả năng nuôi cấy mô cây hoa mười giờ nhằm tạo nguồn mẫu vô trùng ban đầu để cung cấp mẫu thực hiện các nghiên cứu tiếp theo là ra hoa trong ống nghiệm. 1.2.2. Yêu cầu Phải đưa được mẫu vào để tạo mẫu vô trùng, khảo sát mẫu ban đầu ở các môi trường bổ sung chất điều hòa tăng trưởng SVTH: Trần Thị Thu Hiền 2 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh Chương 2: Tổng quan 2.1. Khái quát về kỹ thuật vi nhân giống 2.1.1. Khái niệm  Kỹ thuật nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các cơ quan của thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng (Dương Công Kiên, 2002).  Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng. Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy.  Những năm 70 của thế kỷ XX là thập niên của sự bùng nổ công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Nó là công cụ nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học. Điều quan trọng nhất trong vi nhân giống là việc nghiên cứu vai trò và tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhằm kích thích sự hình thành chồi với số lượng lớn phục vụ cho công tác nhân giống.  Trong vòng 30 năm trở lại đây, kỹ thuật vi nhân giống đã làm được một cuộc cách mạng lớn trong nhân giống thực vật và hiện nay người ta đang hướng tới mục tiêu áp dụng kỹ thuật này để sản xuất cây giống thương mại. Vi nhân giống đã trở thành một phương pháp nhân giống chuẩn và phổ biến đối với nhiều loại cây trồng như: cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây cảnh, cây dược liệu, cây ăn trái và rau xanh. Phương pháp này có những ưu điểm vượt trội so với phương pháp truyền thống: SVTH: Trần Thị Thu Hiền 3 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của cây (trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn) mà ngoài tự nhiên không thể thực hiện được. Có thể sản xuất được số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn, trên một diện tích nhỏ nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại. Cây con tạo ra đồng nhất về mặt di truyền. Tạo cây sạch virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm,… Bảo quản nguồn giống cây in vitro với số lượng lớn nhưng lại chiếm diện tích rất nhỏ. Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm. Tạo dòng toàn cây cái (cây chà là) hoặc toàn đực (cây măng tây) theo mong muốn. Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen.  Bên cạnh những ưu điểm nổi bật thuận lợi cho mục đích nhân giống như đã được đề cập ở trên thì phương pháp vi nhân giống cũng có những nhược điểm cần phải được khắc phục: Giá thành cây con được sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống còn khá cao. Tiến trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần khoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm. Sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế, nghĩa là cây con tạo ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình. Có thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy.  Hiện nay, vấn đề đáng quan tâm nhất trong việc áp dụng kỹ thuật vi nhân giống vào sản xuất thương mại là giá thành sản phẩm tạo ra còn quá cao. Theo Kozai và cộng sự (1992), nguyên nhân chính của vấn đề này là sự thất thoát do nhiễm khuẩn và nấm trong quá trình nuôi cấy, tỷ lệ sống sót thấp của cây SVTH: Trần Thị Thu Hiền 4 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh trong giai đoạn chuyển ra vườn ươm, giá nhân công lao động chiếm 60 – 70% tổng giá thành sản phẩm cần thiết trong quá trình cấy chuyền mẫu cấy sang môi trường mới, giá thành trang thiết bị (thiết bị chiếu sáng, bình nuôi cấy,…) và nguyên liệu cơ bản (đường, agar,…) còn khá cao. Việc cấy chuyền lặp lại nhiều lần làm giảm đáng kể sức sinh trưởng và phát triển của thực vật, có khi còn làm tăng tính bất thường về di truyền của tế bào. Tuy nhiên, hạn chế nghiêm trọng nhất trong kỹ thuật vi nhân giống là tỷ lệ sống sót của cây con sau khi chuyển ra vườn ươm thường rất thấp do sự khác biệt lớn giữa điều kiện môi trường in vitro và ex vitro. 2.1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật  Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên. Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thường.  Nuôi cấy mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của các tế bào đã phân hóa. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo. Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ. Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn. SVTH: Trần Thị Thu Hiền 5 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh  Nuôi cấy tế bào đơn Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn. Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối. Với các cơ chất thích hợp được bổ sung vào trong môi trường tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học. Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách ra và trải trên môi trường thạch. - Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành từng cụm tế bào mô sẹo. - Khi môi trường thạch có tỷ lệ cytokinin auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.  Nuôi cấy protoplast – chuyển gen Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có. Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn thế ở thực vật). Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng. Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài.  Nuôi cấy hạt phấn đơn bội Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo. Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội. 2.1.3. Những vấn đề trong nhân giống vô tính in vitro  Tính bất định về mặt di truyền Tính bất định về mặt di truyền là do tác động của một số chất kích thích sinh trưởng. Tần số biến dị thường khác nhau và không lặp lại. Việc nuôi cấy mô sẹo SVTH: Trần Thị Thu Hiền 6 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh tế bào đơn thường tần số biến dị cao hơn so với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Tần số biến dị xảy ra còn phụ thuộc các yếu tố: - Kiểu di truyền hay giống cây nuôi cấy. - Loại mô cấy. - Số lần cấy chuyền nhiều hay ít, trong đó loại biến dị về nhiễm sắc thể sẽ xuất hiện cao khi thời gian nuôi cấy kéo dài. Số lần cấy chuyền ít và thời gian cấy chuyền giữa hai lần ngắn sẽ làm giảm khả năng gây biến dị.  Sự nhiễm mẫu Do mẫu nhiễm virus hay vi sinh vật. Có thể giảm khả năng lại mẫu bằng cách: - Sử dụng mẫu nuôi cấy là mô phân sinh đỉnh. - Sử dụng các loại kháng sinh như: Amphostericin B, Gentamicin, Vacomicin hoặc Penicillin với nồng độ phụ thuộc vào vật liệu nuôi cấy.  Sự hóa thủy tinh thể Hiện tượng thủy tinh thể là một dạng bệnh lý của cây, cây sẽ bị mất nước khi chuyển cây từ môi trường in vitro ra môi trường ngoài. Nguyên nhân là do cây in vitro có lớp sáp ở bên ngoài biểu bì mỏng, tế bào chứa nhiều phân tử có cực dễ dàng nhận các phân tử nước, về cấu tạo khí khổng của cây thường có hình tròn thay vì hình elip như cây trong tự nhiên, khí khổng mở suốt trong quá trình nuôi cấy và mật độ khí khổng cao. Ngoài ra nhu mô thịt lá và lớp mô bảo vệ mặt ngoài của lá kém phát triển, tế bào chất kém đậm đặc, diệp lục ít so với các cây bình thường nên khi đưa cây ra môi trường ngoài với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác, cây không thể thích nghi dẫn đến stress và chết. Có một số phương pháp hạn chế quá trình hóa thủy tinh thể như sau: - Giảm sự hút nước của cây trong in vitro bằng cách tăng nồng độ đường trong môi trường cấy hoặc dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao. Tuy nhiên, điều này có thể làm giảm sự tổng hợp của diệp lục tố và ức chế sự hình thành chồi. SVTH: Trần Thị Thu Hiền 7 Đồ án tốt nghiệp - GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh Tránh gây thương tổn trên mẫu cấy khi khử trùng và tiếp xúc với môi trường cấy ít nhất. - Ở một số loài có thể sử dụng chất ABA. - Giảm nồng độ đạm trong môi trường cấy. - Giảm C2H2 trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt, tăng cường ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy. 2.1.4. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số lĩnh vực như:  Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp (nuôi cấy tế bào trần).  Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng (nuôi cấy huyền phù tế bào) trên quy mô lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp.  Chọn lọc tế bào có những đặc điểm mong muốn, cho phát triển thành cây con thay vì chọn lọc cây ngoài đồng ruộng (nuôi cấy tế bào đơn).  Sản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn và túi phấn).  Vi nhân giống những giống cây có giá trị khoa học và thương mại.  Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp.  Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử.  Nuôi cấy quang tự dưỡng. 2.1.5. Sự khác nhau giữa nhân giống in vitro cây thân thảo và cây thân gỗ  Các loài cây thân gỗ ít có khả năng tái sinh hơn các loài cây thân thảo.  Các nghiên cứu nhân giống trên cây thân gỗ được bắt đầu trễ hơn so với cây thân thảo.  Việc cảm ứng sự trẻ hóa ở cây thân gỗ khó hơn ở cây thân thảo.  Tốc độ nhân giống cây thân gỗ thấp hơn cây thân thảo. SVTH: Trần Thị Thu Hiền 8 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh  Tác động của trạng thái hưu miên trên sự tăng trưởng của chồi và sự kéo dài của thân cây thân gỗ theo từng thời kì trong năm.  Cây thân gỗ dễ bị ảnh hưởng bởi các chất độc tiết ra trong môi trường nuôi cấy.  Mô của cây thân gỗ khó khử trùng hơn vì đại đa số mọc ở ngoài thiên nhiên.  Cây thân gỗ và cây bụi thường được chọn lọc để nhân dòng sau khi cây đã trưởng thành. Ở giai đoạn này các mô của cây thường rất khó hoặc không thể sử dụng được trong nhân giống in vitro.  Sự đa dạng về mặt di truyền của cây thân gỗ lớn hơn so với cây nông nghiệp và các loại cây thân thảo khác, do đó sau khi nhân giống sẽ thu được nhiều kết quả khác nhau khó kiểm soát.  Cây thân gỗ không thể trồng được trong nhà kính, vì vậy việc thu mẫu bị ảnh hưởng rất nhiều bởi điều kiện khí hậu và các điều kiện tăng trưởng khác. 2.1.6. Sự khác nhau giữa nhân giống in vitro và nhân giống in vivo  Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vivo.  Có thể tạo được một số loài thực vật mà không thể tiến hành in vivo do nhân giống in vitro có thể cảm ứng được sự trẻ hóa của mô.  Sự tăng trưởng của những cây nhân giống vô tính in vitro thường mạnh hơn những cây được nhân giống vô tính in vivo vì những cây này đã được trẻ hóa và sạch bệnh.  Việc nhân giống cây in vitro tạo được những cây sạch bệnh do có sự chọn lọc các đối tượng sạch bệnh để đưa vào nuôi cấy đồng thời cũng có thể xử lý mẫu cấy của các cây có mang mầm bệnh trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy. Các cây sạch bệnh này có thể được trao đổi dễ dàng giữa các nơi với nhau do cây có kích thước nhỏ và không trồng trong đất.  Trong nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng những mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho nên có thể chọn lọc kỹ lưỡng và dễ dàng. SVTH: Trần Thị Thu Hiền 9 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh  Việc nhân giống in vitro giúp làm giảm không gian sử dụng so với nhân giống in vivo và giảm các chi phí về năng lượng đối với các trường hợp các loại cây cần được nhân giống trong nhà kính.  Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp (nguồn dinh dưỡng và điều kiện môi trường) do đó có thể sản xuất cây con quanh năm.  Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro để làm cây mẹ cho các bước nhân giống kế tiếp.  Có thể tạo ra các đột biến điểm trong quá trình nuôi cấy.  Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ra các ngân hàng gen.  Các tế bào trần và huyền phù tế bào là đối tượng hữu dụng trong việc lai soma.  Một số loại cây bị mất khả năng sinh sản hữu tính như các cây đơn bội, cây bất thụ đực, cây bất thụ do đột biến,… có thể được duy trì và nhân giống bằng phương pháp nhân giống in vitro.  Những bất lợi của phương pháp nhân giống vô tính in vitro: - Kiểu gen thực vật không được ổn định trong một số hệ thống nuôi cấy. - Tạo ra những cây không hoàn toàn đúng như mong muốn: mọc um tùm vì một số cây còn giữ được khả năng trẻ hóa trong quá trình nuôi cấy. - Đặc biệt, đối với một số loài cây thân gỗ, việc cảm ứng rễ rất khó thực hiện. Trong một số trường hợp, có những loại cây tạo được rễ in vitro nhưng những rễ này không phù hợp do đó những cây này sẽ tạo mới rễ sau khi được chuyển ra trồng trong đất. - Việc chuyển cây từ trong ống nghiệm ra vườn ươm rất khó đối với một số cây. - Cây khi được chuyển từ phòng thí nghiệm ra vườn ươm rất dễ bị tấn công bởi một số loại bệnh hại do nó đã quen sống trong điều kiện vô trùng. Vì vậy, cần phải xử lý môi trường và giá thể sống của cây thật cẩn thận. SVTH: Trần Thị Thu Hiền 10 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh - Khả năng tái sinh cây có thể bị mất đi do việc cấy chuyền mô sẹo và huyền phù tế bào được lặp lại nhiều lần. - Đối với một số mô, việc vô trùng trước khi đưa vào cấy rất khó thực hiện. - Phương pháp nhân giống in vitro tốn nhiều công lao động làm cho giá thành của cây tăng lên. Hiện nay, các kỹ thuật hiện đại đang được tiến hành như tăng sinh tế bào trong các thiết bị lên men nhưng vẫn còn trong giai đoạn thí nghiệm. 2.1.7. Các bước nhân giống in vitro  Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy Mẫu cấy là mảnh mô thực vật được đặt vào trong môi trường nuôi cấy. Để tiến hành nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý đến tuổi sinh lý của cơ quan được dùng làm mẫu cấy, mùa vụ lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu cấy đó. Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypocloride, sodium dichloroisocyanurate, chlorur thủy ngân,…  Tạo thể nhân giống in vitro Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ callus (mô sẹo). Trong môi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác.  Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp SVTH: Trần Thị Thu Hiền 11 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài.  Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên ngoài, một bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro.  Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm Cây con đã ra rễ được lấy khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ ánh sáng thấp,… Sau khoảng 2 tuần, cây đã bắt đầu thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có thể tăng cường độ chiếu sáng và hạ độ ẩm. Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quy trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất nước và mau héo dẫn đến hiện tượng chết. Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, ẩm độ cao. Cây con thường được cấy trong luống ươm cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm, trong những ngày đầu cần được phủ nylon để giảm sự thoát hơi nước ở lá (thường 7 – 10 ngày kể từ ngày cấy). Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý ra rễ SVTH: Trần Thị Thu Hiền 12 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chất kích thích ra rễ ở nồng độ thấp để rút ngắn thời gian ra rễ. 2.1.8. Quá trình tái sinh cơ quan trong nhân giống in vitro Sự tái sinh cơ quan trong nuôi cấy in vitro là một quá trình phức tạp vì:  Quá trình tái sinh chỉ xảy ra khi mối tương quan cũ được phá vỡ và những mối tương quan mới được hình thành.  Quá trình này bao gồm nhiều giai đoạn khác nhau: Loại bỏ sự phản biệt hóa của các tế bào phản biệt hóa (dẫn đến sự trẻ hóa tế bào). Sự phân chia tế bào (đôi khi dẫn đến sự hình thành mô sẹo): sự hình thành cơ quan bắt đầu xảy ra khi sự phân chia tế bào diễn ra. Sự hình thành cơ quan. Sự phát triển cơ quan.  Sự tái sinh bị giới hạn về số lượng và chất lượng do nhiều nhân tố: nguồn mẫu cấy ban đầu, sự tăng trưởng của mẫu cấy trong điều kiện nhà kính hay ngoài đồng ruộng, vị trí của mẫu cấy trên cây, thời điểm lấy mẫu cấy, hàm lượng hormone nội sinh, kích thước mẫu cấy, phương pháp cấy, chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng, điều kiện sinh lý, một số hợp chất được tiết ra trong quá trình nuôi cấy,… Tất cả những nguyên nhân trên cho thấy quá trình tái sinh rất phức tạp, chúng ta không thể đề cập hết những khía cạnh liên quan nhưng cần lưu ý một số vấn đề sau:  Quá trình tái sinh phức tạp do chịu sự tương tác của nhiều nhân tố khác nhau (môi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ và các chất điều hòa sinh trưởng,…).  Không thể khái quát chung quá trình tái sinh cho tất cả các loài vì mỗi loài khác nhau cần điều kiện tái sinh khác nhau. SVTH: Trần Thị Thu Hiền 13 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh  Khó có thể điều hòa quá trình tái sinh vì khả năng tái sinh của mỗi loài khác nhau: trong những trường hợp này các nhân tố nội sinh đóng vai trò quyết định do đó các yếu tố ngoại sinh như chất điều hòa ảnh hưởng không nhiều.  Sự hình thành rễ bất định thườn đối lập với sự hình thành chồi bất định. Nếu cả hai quá trình này được thúc đẩy đồng thời, cây con tạo ra sẽ mang nhiều thiếu sót. Để thu nhận một cây hoàn chỉnh tốt nhất chúng ta nên tạo chồi bất định trước sau đó cảm ứng tạo rễ. 2.1.8.1. Sự hình thành chồi bất định  Sự hình thành chồi bất định được xem là một trong những phương pháp nhân giống sinh dưỡng trong nuôi cấy mô. Ngày nay một số loài như Saintpaulia, Begonia, Achimenes, Streptocarpus, Lilium, Ferine đang được nhân giống bằng phương pháp này.  Có nhiều điểm giống nhau giữa sự hình thành chồi bất định và rễ bất định: các nhân tố có ảnh hưởng tích cực lên sự hình thành rễ bất định cũng thúc đẩy sự hình thành chồi bất định. Điều này được thể hiện qua một số điểm sau: Sự hình thành chồi bất định ở cây hạt trần chỉ thành công khi sử dụng các bộ phận của cây con (Anonymous, 1984). Đường đóng vai trò rất quan trọng trong sự hình thành chồi và rễ. Sự hình thành chồi hay rễ đều bị ức chế bởi gibberellin và acid abscisic.  Trong đa số trường hợp, ánh sáng thúc đẩy sự hình thành chồi bất định. Tuy nhiên một số loài cây cần điều kiện tối để hình thành chồi bất định: chồi hoa Freesia (Pierik và Steegmans, 1975), các mẫu cấy từ cuống hoa Nerine bowdemi (Pierik và Steegmans, 1985). Economou và Read (1986) cho rằng các mẫu lá của Petunia hybrida tăng trưởng trên môi trường không có cytokinin và được xử lý ánh sáng đỏ tạo ra nhiều chồi hơn những mẫu cấy được xử lý ánh sáng đỏ xa. Tuy nhiên trên môi trường có BA, các mẫu cấy được xử lý ánh sáng đỏ và đỏ xa tạo ra số lượng chồi bằng nhau và nhiều hơn các mẫu cấy trên môi trường không có cytokinin. SVTH: Trần Thị Thu Hiền 14 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh  Nhiệt độ cao thường cần thiết cho sự hình thành chồi nhưng cũng có một số trường hợp ngoại lệ đối với BegoniaI (Heide, 1965) và Streptocarpus (Appelgren và Heide, 1972).  Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự hình thành chồi bất định rất phức tạp: Một số cây không cần auxin hay cytokinin để hình thành chồi bất định như Cardamine pratensis (Pierik và Segers, 1972), Streptocarpus (Appenlgren và Heide, 1972). Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp cytokinin và auxin đều có ảnh hưởng đến quá trình tạo chồi. Hầu hết thực vật cần cytokinin để thúc đẩy tạo chồi trong khi auxin có tác dụng ngược lại (Miller và Skoog, 1953; Nitsch, 1968). Một số loài cần auxin ngoại sinh cho sự tạo chồi như Lilium (Aartrijk, 1984), Hyacinth (Pierik và Steegmans, 1975). Nồng độ cytokinin/auxin cao rất quan trọng cho sự tạo chồi ở nhiều loài thực vật khác nhau, ví dụ như ở loài Begonia (Heide, 1965), Súp lơ (Margara, 1969).  Chúng ta có thể kết luận rằng ở những loài cần cytokinin và auxin cho sự tái sinh chồi, nồng độ cytokinin bao giờ cũng cao hơn nồng độ auxin. Tỉ lệ của hai chất điều hòa sinh trưởng này sẽ quyết định sự hình thành cơ quan (Skoog và Tsui, 1948; Miller và Skoog, 1953). Cytokinin BA rất hiệu quả trong việc thúc đẩy tạo chồi ở nhiều loài thực vật nhưng nếu sử dụng BA ở nồng độ cao sẽ xuất hiện nhiều biến dị (chồi biến dạng).  Trong một số trường hợp, sự kết hợp giữa cytokinin và adenine (sulphate) sẽ tăng hiệu quả tạo chồi (Skoog và Miller, 1975; Nitsch và cộng sự, 1969). Trong một số trường hợp, việc sử dụng một mình adenine cũng có thể cảm ứng tạo chồi: Begonia (Ringle và Nitsch, 1968), cây Thuốc lá (Skoog và Tsui, 1948), Plumbago indica (Nitsch, 1968).  Sự gia tăng nồng độ gibberellin ức chế quá trình tạo chồi: ở loài Begonia rex (Schrandolf và Reinert, 1959), Plumbago indica (Nitsch, 1968)… Acid SVTH: Trần Thị Thu Hiền 15 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh abscisic ức chế sự hình thành chồi bất định mặc dù vẫn có trường hợp cảm ứng sự hình thành chồi như ở cây Ipomoea batatas. 2.1.8.2. Sự hình thành rễ bất định  Rễ bất định được hình thành trên các cơ quan khác nhau của cây, nơi mô của chúng còn giữ khả năng phân sinh.  Quá trình hình thành rễ rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến khả năng sống sót của mẫu cấy khi cây in vitro được chuyển ra vườn ươm.  Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành rễ bất định: đặc điểm di truyền loài, tuổi của mẫu, vị trí mẫu cấy trên thân, kích thước mẫu cấy, vết thương, số lần cấy chuyền, nguồn oxy, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hòa sinh trưởng, than hoạt tính, đường, agar, pH,… 2.1.9. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái in vitro 2.1.9.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển in vitro:  Kiểu di truyền Khả năng tái sinh của thực vật rất đa dạng. Những cây hai lá mầm thông thường có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây hạt trần rất khó tái sinh (trừ khi chúng còn non). Trong số các cây hai lá mầm, Solanaceae, Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae, Cruciferae là những họ thực vật dễ tái sinh nhất. Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi trường tự nhiên (các giống lai Saintpaulia ionantha, Begonia rex, Streptocarpus) thì chúng hầu như dễ tái sinh in vitro. Cũng có những trường hợp ngoại lệ như những đoạn cắt từ lá của Kalanchoe farinacea hầu như không có khả năng hình thành chồi bất định in vivo nhưng có thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này có thể do sự hấp thu các chất điều hòa sinh trưởng có trong môi trường nuôi cấy.  Tuổi của cây SVTH: Trần Thị Thu Hiền 16 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao do đó ở ngũ cốc người ta thường dùng phôi và hạt làm vật liệu nuôi cấy mô. Khi cây già đi, khả năng tái sinh của chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn như trong trường hợp cây bụi. Một vài ví dụ cụ thể chỉ ra sự khác nhau về khả năng tái sinh và phân chia tế bào giữa cây già và cây non in vitro: Hedera helix (Stoutemeyer và Britt, 1965), Lunaria annua (Bajaj và Pierik, 1974) và Anthurium andreanum (Pierik và cộng sự, 1974). Khi mô phân sinh và chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ những đặc tính già hay non trong điều kiện in vitro tùy vào điều kiện ban đầu. Đôi khi qua nhiều lần cấy chuyền, mô phân sinh già từng bước được trẻ hóa do tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào. Điều này được chứng minh trên những đối tượng như Pinus vinifera, Malus sylvestris, Cryptomeria japonica.  Tuổi của mô và cơ quan Những mô còn non và mềm thường dễ nuôi cấy hơn những mô cứng nhưng cũng có nhiều trường hợp ngoại lệ. Các mẫu cấy từ cuống lá còn non tái sinh tốt hơn những mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan của chúng già hơn nên khả năng tái sinh và phân chia tế bào giảm. Khả năng tái sinh của những loài khác nhau tăng lên trong suốt giai đoạn ra hoa: các bộ phận của phát hoa còn non đôi khi tái sinh rất mạnh, ví dụ như Freesia (Bajaj và Pierik, 1974), Lunaria annua (Pierik và cộng sự, 1974), Primula obconica (Coumans và cộng sự, 1979).  Tình trạng sinh lý Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế bào in vitro. Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh hơn trong giai đoạn sinh sản. Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ở giai đoạn sinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản (Robb, 1957). Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông (cuối thu đầu đông) khó nuôi cấy in vitro hơn chồi của những cây đã vượt qua được giai đoạn này (vào mùa xuân trước khi chúng bắt đầu phát triển). SVTH: Trần Thị Thu Hiền 17 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh  Vị trí của mẫu cấy trên cây Ever (1984) đã khảo sát sự ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy lên sự sinh trưởng và phát triển in vitro sau khi tách mẫu ở cây Pseudotsuga menziesii, ông nhận thấy những chồi ban đầu được tách từ những vị trí thấp trên cây phát triển trong môi trường in vitro tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn chồi nách. Sự hình thành các giả hành bất định của mẫu cấy lan dạ hương được tách ra từ phần gốc của vảy hành tốt hơn từ phần đỉnh. Điều này cũng xảy ra tương tự đối với lily (Robb, 1957). Điều đáng lưu ý là những mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc từ các phần khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng in vitro giống nhau.  Kích thước mẫu cấy Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ. Các phần được tách rời khỏi cây tự nó cung cấp chất dinh dưỡng và hormone, do đó mẫu cấy có kích thước càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển. Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất dinh dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái sinh trên môi trường in vitro hơn những cơ quan ít chất dự trữ. Đối với những mẫu bị cắt, phần trăm bề mặt bị tổn thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh. Ảnh hưởng của vết thương lên sự tái sinh của các mẫu cấy từ vảy hành lily đã được Aartrijk (1984) chứng minh.  Vết thương Sự tổn thương trên bề mặt mẫu cấy đóng vai trò quan trọng trong sự tái sinh mẫu cấy. Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng và các chất điều hòa đồng thời ethylene được tạo ra nhiều hơn. Ngoài ra, có thể tăng cường sự hình thành rễ bất định bằng vết thường.  Phương pháp cấy Các mẫu cấy có thể được đặt trên môi trường theo nhiều cách khác nhau: có cực (thẳng đứng với phần gốc cắm xuống môi trường) hoặc không cực (cắm phần ngọn xuống môi trường). Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh SVTH: Trần Thị Thu Hiền 18 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh khi mẫu được cấy không cực (Pierik và Steegmans, 1975). Mẫu tái sinh tốt khi được cung cấp đầy đủ oxy nhưng những nhân tố khác cũng đóng vai trò quan trọng. Phần gốc của mẫu cấy không cực có các chất dự trữ không có khả năng khuếch tán vào trong agar do nó không tiếp xúc với môi trường. Như ở trường hợp tất cả các cây thuộc họ Amaryllidaceae (Pierik và cộng sự, 1974), sự tái sinh chỉ xảy ra ở phần gốc của vảy hành, do đó phương pháp cấy không cực dẫn đến sự hình thành thân hành bất định tốt hơn phương pháp cấy có cực.  Ảnh hưởng của nguồn carbon dioxide và ánh sáng Ở vùng lạnh, những thay đổi trong quá trình sinh trưởng của mẫu cấy xảy ra suốt mùa đông có thể giải thích dựa trên những thay đổi bức xạ. Khi giảm 1% ánh sáng sẽ làm giảm 1% năng suất trong nhà kính nhưng mối tương quan này không đóng vai trò trong trường hợp với những cây con. Điều kiện ánh sáng trong nhân giống những cây cấy ghép có thể đem lại nhiều lợi ích không chỉ trong giai đoạn vườn ươm mà còn có lợi sau khi trong bên ngoài.  Ảnh hưởng của nhân tố khoáng Sự kết hợp giữa muối đa lượng và vi lượng phụ thuộc nhiều vào loại cây thí nghiệm. Môi trường Murashige và Skoog (1962) là môi trường phổ biến nhất vì hầu hết các loài cây có thể thích nghi được. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng dung dịch dinh dưỡng không phải lúc nào cũng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển vì nồng độ muối khoáng trong dung dịch quá cao. Ví dụ cây đồng tiền rất nhạy cảm với muối đa lượng in vitro (Pierik và Seger, 1972). Lloyd và McCown (1980) đã tìm ra một môi trường thích hợp cho một số loài thân gỗ nhạy cảm với muối gọi là môi trường WPM (woody plant medium).  Ảnh hưởng của pH pH của môi trường nuôi cấy thường được điều chỉnh từ 5.5 – 6. pH dưới 5.5 thì agar không đông thành dạng gel hoàn toàn và trên 6 thì gel lại quá cứng. pH của môi trường thường giảm từ 0.6 – 1.3 đơn vị sau khi hấp khử SVTH: Trần Thị Thu Hiền 19 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh trùng. Có một số trường hợp, sau một thời gian nuôi cấy, pH của môi trường giảm dần do sự hình thành một số acid hữu cơ trong môi trường. Điều chỉnh pH bằng cách dùng HCl hay NaOH 1N hoặc 0.1N và nhỏ từng giọt vào trong môi trường, khuấy đều môi trường rồi mới đo. Luôn nhớ phải điều chỉnh pH trước khi thêm agar. 2.1.9.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật  Chất điều hòa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều cao chúng trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng như các chất diệt cỏ dại.  Các chất điều hòa nội sinh có thể được kiểm soát do cơ chế chuyển hóa của tế bào nên chúng được kiểm soát hoặc đào thải khá nhanh. Trái lại các chất điều hòa tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụng trong thực tế.  Auxin Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thường xuyên trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng phối hợp với các cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu. Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy. Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy. Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh. Hàm lượng auxin tự nhiên trong mẫu cấy phụ thuộc vào trạng thái của cây mẹ: tuổi cây mẹ, thời gian thu mẫu trong năm. SVTH: Trần Thị Thu Hiền 20