Tài liệu Nghiên cứu khả năng sử dụng kỹ thuật realtime-pcr phát hiện sacbrood virus gây bệnh trên ong mật tại hà nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ----------------
------------------ NGUYỄN THỊ THOA NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG KỸ THUẬT REALTIME-PCR PHÁT HIỆN SACBROOD VIRUS GÂY BỆNH TRÊN ONG MẬT TẠI HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ----------------
------------------ NGUYỄN THỊ THOA NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG KỸ THUẬT REALTIME-PCR PHÁT HIỆN SACBROOD VIRUS GÂY BỆNH TRÊN ONG MẬT TẠI HÀ NỘI CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHẠM HỒNG THÁI TS. NGUYỄN VĂN GIANG HÀ NỘI – 2013 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất cứ công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ trong việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. TÁC GIẢ LUẬN VĂN Nguyễn Thị Thoa Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành bản luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực học hỏi của bản thân tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ tận tình của các thầy cô giáo, gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Hồng Thái - Bộ môn Côn trùng - Khoa Nông học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội và TS. Nguyễn Văn Giang - Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Khoa Công nghệ sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã hết lòng ủng hộ và khích lệ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện ñề tài này, ñã dành nhiều thời gian và công sức chỉ dẫn, giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện ñề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Hà Viết Cường - Khoa Nông học trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội và ThS. Trịnh Thị Thủy - Khoa Công nghệ sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo bộ môn Vi sinh vật và bộ môn Sinh học phân tử– Khoa Công nghệ sinh học - trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội và tập thể cán bộ nhân viên Ban ñào tạo sau ñại học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện ñề tài. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp. Hà Nội, ngày 10 tháng09 năm 2013 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Nguyễn Thị Thoa Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC HÌNH ix MỞ ðẦU 1 Chương 1 ỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Tầm quan trọng của ngành ong 3 1.1.1 Thế giới 3 1.1.2 Việt Nam 4 1.1.3 Các loài ong ở Việt Nam 5 1.1 Các dịch bệnh chính ñược ghi nhận trên ong mật 6 1.2 Tình hình nghiên cứu về Sacbrood virus 7 1.2.1 Lịch sử phát hiện và tác hại của bệnh virus ấu trùng túi 7 1.2.2 Triệu chứng bệnh ấu trùng túi 8 1.2.3 Cách thức lan truyền của SBV 9 1.2.4 Tác nhân gây bệnh 9 1.3 Các kỹ thuật chẩn ñoán cổ ñiển 11 1.3.1 Kỹ thuật RIA (Radio Immuno Assay) 11 1.3.2 Kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 12 1.3.3 RT – PCR (Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction) 12 1.4 Kỹ thuật Realtime- PCR 13 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 21 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv 2.1.1 Thời gian 21 2.1.2 ðịa ñiểm 21 2.2 ðối tượng và vật liệu nghiên cứu 21 2.2.1 ðối tượng 21 2.2.2 Vật liệu nghiên cứu 21 2.3 Nội dung nghiên cứu 21 2.4 Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Thu thập mẫu ong 22 2.4.2 Thí nghiệm bảo quản mẫu ong 23 2.4.3 Chẩn ñoán bệnh lâm sàng 23 2.4.4 Tách chiết RNA tổng số từ mẫu ñã thu thập 24 2.4.5 Xác ñịnh khả năng chẩn ñoán của hai kỹ thuật PCR ñể phát hiện virus gây bệnh trên ong mật 2.5 26 ðánh giá về ñộ nhạy của phương pháp chẩn ñoán ñể xác ñịnh nồng ñộ của virus trên ong bệnh 29 2.5.1 Pha loãng mẫu RNA 29 2.5.2 Phản ứng Realtime – PCR 29 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 30 Ảnh hưởng của kỹ thuật lấy mẫu và bảo quản mẫu bệnh lên khả năng phát hiện 30 3.2 Ảnh hưởng của kỹ thuật tách chiết RNA lên khả năng phát hiện SBV 32 3.2.1 Tách chiết RNA tổng số từ các mẫu ñã thu thập 32 3.3 Khảo sát tính ñặc hiệu của cặp mồi 32 3.3.1 Nghiên cứu lựa chọn cặp mồi 32 3.3.2 Thử nghiêm khả năng phát hiện Sacbrood virus trên ong mật tại Hà Nội 35 3.4 Nghiên cứu, khảo sát khả năng phát hiện của Realtime- PCR 37 3.5 ðánh giá mức ñộ ñặc hiệu của cặp mồi trong kỹ thuật q- PCR 40 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v 3.6 Xác ñịnh ñộ nhạy của kỹ thuật chẩn ñoán SBV trên ong mật 3.6.1 Khả năng chẩn ñoán của hai phương pháp one step RT – PCR và 42 Realtime – PCR 42 3.6.2 Khả năng phát hiện SBV ở mức ñộ pha loãng mẫu gốc 46 3.6.3 Khảo sát khả năng phát hiện SBV theo thời gian biểu hiện bệnh tích trên ñàn ong. 3.7 50 Xây dựng quy trình kỹ thuật chẩn ñoán bệnh ấu trùng túi do virus Sacbrood bằng Realtime – PCR 52 3.7.1 Tách chiết RNA mẫu Ong 52 3.7.2 Tiến hành phản ứng One step Reverse Transcription – PCR (RT 3.7.3 – PCR) 53 Tiến hành phản ứng Realtime – PCR 55 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 56 1 Kết luận 56 2 ðề nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 60 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CSBV Chinese Sacbrood Virus (Virus gây bệnh ấu trùng túi Trung Quốc) CP Concentration Point (ðiểm tập trung) Ct Cycle Threshold (Chu kỳ ngưỡng) DsRNA Double-stranded RNA (RNA mạch kép) DWV Deformed Wing Virus ( Virus xoăn cánh ong) ELISA Enzyme-Linked immunosorbent assay ( Phản ứng ELISA) EU European Union ( Liên minh Châu Âu) FAO Food and Agriculture Organization ( Tổ chức Nông lương) IFA Indirect Fluorescent Antibody ( Kháng thể huỳnh quang gián tiếp) KBV Kashmir Bee Virus ( Virus Kashmir) M Marker MRL Minimum Residue Limits (Dư lượng giới hạn tối thiểu) ORF Open Reading Frame ( Khung ñọc mở) OTC Oxytetracycline (Kháng sinh diệt khuẩn Oxytetracycline) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) qRT-PCR RT-PCR Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp ñịnh lượng theo thời gian thực) Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp phiên mã ngược) SBV Sacbrood Virus (Virus gây bệnh ấu trùng túi) SsRNA Single-stranded RNA (RNA mạch ñơn) Tm Temperature Melting ( Nhiệt ñộ nóng chảy) TSBV Thai Sacbrood Virus (Virus gây bệnh ấu trùng túi Thái Lan) UK United Kingdom ( Vương Quốc Anh) US United States ( Hợp chủng quốc Hoa Kì) VINAPI Vietnam National Apiculture Joint Stock Company ( Công ty Cổ phần Ong Trung ương) Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii DANH MỤC BẢNG STT 3.1 Tên bảng Trang Kiểm tra RT-PCR phát hiện SBV trên các mẫu ấu trùng ong ñược bảo quản bằng các phương pháp khác nhau 30 3.2 Kết quả tách chiết RNA 32 3.3 Danh sách các cặp mồi sử dụng (Grabensteiner et al., 2001) 33 3.4 Kết quả RT-PCR cho SBV với các cặp mồi SB 1f-2r, SB 14f-15r và SB11f - SB12r với các mẫu ong mật thu tại 11 huyện trên ñịa bàn Hà Nội 36 3.5 Chất lượng RNA sau khi tách chiết bằng TRIzol-LS 37 3.6 ðỉnh nhiệt ñộ nóng chảy của 14 mẫu kiểm tra và ñối chứng 39 3.7 Ngưỡng chu kỳ sản phẩm RNA của SVB bắt ñầu nhân bản 39 3.8 Kết quả chẩn ñoán của hai phương pháp RT – PCRvà Realtime - PCR 43 3.9 Kết quả chẩn ñoán của Realtime - PCR 45 3.10 Kết quả Realtime – PCR của các mẫu pha loãng 46 3.11 Giá trị bước nhảy của ngưỡng chu kỳ khi pha loãng nông ñộ gốc 48 3.12 Kết quả Realtime – PCR của mẫu M50 pha loãng 48 3.13 Số lượng bản sao DNA/ µl và chu kỳ khuếch ñại (Yoo et al., 2012) 50 3.14 Giá trị ngưỡng chu kỳ của phản ứng Realtime- PCR ñối với các ấu trùng ở ñàn ong thí nghiệm Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 51 viii DANH MỤC HÌNH STT 1.1 Tên hình Trang Biểu ñồ khuếch ñại vẽ lên các ñường biểu diễn khuếch ñại của các mẫu thử và mẫu chuẩn 1.2 16 Biểu ñồ chuẩn ñường biểu diễn chuẩn mối quan hệ giữa số lượng bản DNA ñích và chu kỳ ngưỡng tương ứng 17 2.1 Bánh tổ ong nội có biểu hiện bệnh ATT 22 2.2 Bánh tổ ong ngoại có biểu hiện của bệnh ATT 22 2.3 ðuôi ấu trùng hình túi nước 22 2.4 Ấu trùng có biểu hiện nhọn ñầu 22 2.5 Mẫu ong 24 2.6 Mẫu ấu trùng ñược chuẩn bị ñể tách chiết RNA 24 2.7 Dụng cụ chuẩn bị cho tách chiết RNA 25 2.8 Tách chiết RNA 25 2.9 Vị trí cặp mồi SB1f – SB2r trên bộ gen của virus SBV (Grabensteiner et al., 2001) 3.1 26 RT-PCR phát hiện SBV bằng cặp mồi SB-1F/SB-2R từ các mẫu RNA chiết từ mẫu ấu trùng ong bệnh ñược bảo quản trong ethanol 70 % (nhiệt ñộ phòng) 3.2 30 RT-PCR phát hiện SBV bằng cặp mồi SB-1F/SB-2R từ các mẫu RNA chiết ngay lập tức từ mẫu ấu trùng ong bệnh sau khi thu thập từ ñàn bệnh 3.3 RT-PCR phát hiện SBV bằng cặp mồi SB-1F/SB-2R từ các mẫu RNA chiết từ mẫu ấu trùng ong thu thập từ ñàn bệnh và bảo quản lạnh 3.4 31 31 Kết quả kiểm tra tính ñặc hiệu của 5 cặp mồi với mẫu RNA tách từ ấu trùng biểu hiện dương tính. Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 34 ix 3.5 Kết quả RT-PCR cho SBV với cặp mồi SB1f - SBr2 với các mẫu ong mật thu tại 11 huyện trên ñịa bàn Hà Nội 3.6 35 Mối tương quan giữa hàm lượng và ñộ tinh sạch của RNA tổng số của 14 mẫu ong ñược tách chiết. 38 3.7 ðỉnh nóng chảy của 14 mẫu khảo sát và mẫu ñối chứng âm. 38 3.8 ðường khuếch ñại của 14 mẫu thí nghiệm và ñối chứng âm 40 3.9 Tỉ lệ chẩn ñoán của hai phương pháp RT – PCR và Realtime – PCR 44 3.10 ðường biểu diễn khuếch ñại của các mẫu pha loãng 47 3.11 Mối quan hệ tuyến tính thuận giữa các mức pha loãng nồng ñộ với giá trị ngưỡng chu kỳ 47 3.12 ðường biểu diễn khuếch ñại của mẫu M50 pha loãng 49 3.13 ðường biểu diễn ñỉnh nóng chảy của mẫu M50 pha loãng 49 3.14 Biểu hiện bệnh tích của ấu trùng sau khi bị nhiễm SBV 50 3.15 Triệu chứng bệnh tích của virus ấu trùng túi 51 3.16 ðường cong khuếch ñại sản phẩm RNA virus 52 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp x MỞ ðẦU 1. Tính cấp thiết của ñề tài Việt Nam là quốc gia có khí hậu nhiệt ñới gió mùa, có nguồn hoa và nguồn mật phong phú rất phù hợp cho phát triển nghề nuôi ong mật. Do ñó, nghề nuôi ong lấy mật từ lâu ñã và ñang ñóng một vai trò quan trọng bởi nó không những mang lại lợi nhuận kinh tế to lớn cho người nuôi ong mà còn cung cấp nhiều những ích lợi trong xã hội cũng như với môi trường. Tuy nhiên ong mật rất hay bị tấn công bởi một số loại bệnh do vi khuẩn và nguy hiểm hơn cả là bệnh do virus, bởi vì bệnh do virus không thể ñiều trị bằng thuốc kháng sinh ñược. Trong các bệnh virus trên ong thì bệnh ấu trùng túi là một trong những bệnh virus nghiêm trọng nhất trên ong mật hiện nay. Virus này ñều thuộc chi iflavirus, cùng có mặt ở khắp các lục ñịa và các nơi nuôi ong và gây thiệt hại rất lớn cho người nuôi ong và ngành nuôi ong. Sacbrood virus (SBV) gây bệnh chết ấu trùng ong và là 1 virus quan trọng bậc nhất trên ong khắp thế giới kể cả Việt Nam. SBV nhiễm cả ong Apis mellifera và Apis cerana (Phùng Hữu Chính 2008, Thái et al., 2011). Ấu trùng túi do sacbrood virus gây ra, bệnh làm chết ấu trùng chủ yếu ở giai ñoạn sau vít nắp và tiền nhộng. Khả năng lây nhiễm của virus là rất lớn, một ấu trùng bị chết có thể lây nhiễm cho 3000 ấu trùng lành. Mặt khác, việc xác ñịnh loại virus gây bệnh trên ong mật từ trước ñến này vẫn dựa trên những phương pháp truyền thống như: sử dụng kính hiển vi, RIA, ELISA…Tuy các phương pháp chẩn ñoán cổ ñiển trên có ñộ nhạy không cao và khó chẩn ñoán ở giai ñoạn bệnh còn tiềm ẩn. Gần ñây, các nhà khoa học ñang phát triển một phương pháp chẩn ñoán mới không những có khả năng ñịnh tính (phát hiện sự tồn tại của virus) mà còn có khả năng ñịnh lượng (biết ñược chính xác nồng ñộ của virus gây bệnh) ñó chính là kỹ thuật Realtime – PCR. Realtime - PCR là một cải biên của phương pháp PCR dựa trên chức năng 5’-3’ polymerase của Taq DNA polymerase do Holland và cộng sự công bố năm 1991. Trong phản ứng real-time PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 1 vào DNA mạch ñôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen ...) hoặc tác nhân dùng ñánh dấu mẫu dò ñặc hiệu (FAM, HEX ...). Việc phát triển thêm những phương pháp chẩn ñoán hiện ñại, chính xác ñể phát hiện sớm những virus tiềm tàng ở những giai ñoạn ñầu là hết sức cần thiết giúp những người nuôi ong hạn chế ñược sự thất thoát về kinh tế cũng như tình trạng dư thừa kháng sinh trong mật. Chính vì lý do ñó mà chúng tôi quyết ñịnh nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu khả năng sử dụng kỹ thuật Realtime-PCR phát hiện Sacbrood virus gây bệnh trên ong mật tại Hà Nội” làm tiền ñề cho việc chẩn ñoán, ñề xuất các biện pháp phòng chống hiệu quả. 2. Mục ñích, yêu cầu 2.1. Mục ñích Tìm ra ñộ nhạy, tính ñặc hiệu tối ưu và mối quan hệ giữa nồng ñộ virus với sự biểu hiện bệnh tích ñể từ ñó xây dựng ñược kĩ thuật chẩn ñoán sớm. 2.2. Yêu cầu - Xác ñịnh ñược cặp mồi ñặc hiệu. - Xác ñịnh ñộ nhạy của kỹ thuật chẩn ñoán. - Xây dựng ñược quy trình kỹ thuật chẩn ñoán. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Bước ñầu ứng dụng kỹ thuật Realtime- PCR ñể phát hiện và ñịnh lượng SBV phục vụ cho chẩn ñoán và theo dõi ñiều trị. ðộ ñặc hiệu của Realtime – PCR cao hơn rất nhiều so với PCR cổ ñiển, cho ñộ chính xác cao và kết quả ñáng tin cậy. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Có thể phát hiện bệnh khi còn ở giai ñoạn tiềm ẩn, không mất thời gian ñiện di ñể ñọc kết quả và phản ứng diễn ra trong hệ thống kín nên tránh ñược khả năng ngoại nhiễm. Chính vì vậy mà rất cần thiết phát triển phương pháp này rộng rãi trong lĩnh vực nông nghiệp như chẩn ñoán bệnh cây, bệnh côn trùng… Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tầm quan trọng của ngành ong 1.1.1. Thế giới Ong mật có thể bị tấn công bởi rất nhiều yếu tố. Một vài yếu tố ñóng vai trò như vector truyền bệnh cho ong mật. Bệnh có thể lây lan rộng rãi do sự nhập cư hay do những người buôn bán kinh doanh ñàn ong và các thiết bị dùng trong nghề nuôi ong. Ngày nay, do sự tăng trưởng phát triển về kinh tế mà các ñàn ong có thể ñược vận chuyển ñến những nơi rất xa thậm chí là từ châu lục này ñến châu lục khác, do ñó mà bệnh càng có cơ hội lây lan rộng hơn (FAO, 2006). Virus gây bệnh trên ong mật (Apis mellifera) ñược nghiên cứu mạnh mẽ trong suốt giai ñoạn cuối thập kỷ. Nhìn chung thì virus trên ong mật thường lây lan rộng và hầu hết chúng không có biểu hiện bệnh tích rõ ràng (Allen and Ball, 1996; Ball and Allen, 1991; Ball and Balley, 1997). Bệnh Sacbrood trên ong ngoại (Apis mellifera) ñược phát hiện từ năm 1964 (Bailey et al., 1964). Tuy nhiên, ở A. cerana virus này ñược báo cáo lần ñầu tiên vào năm 1976 ở Thailand. Do sự khác biệt về tính chất lý hóa và huyết thanh của virus mà virus có tên gọi là Thai Sacbrood Virus (TSBV) ñể phân biệt với virus Sacbrood của A. mellifera (Bailey et al., 1982). Sự tồn tại của TSBV trong các ñàn ong A. cerana ở miền Bắc ấn ñộ ñược nghiên cứu bằng kính hiển vi ñiện tử và phương pháp huyết học trong phòng thí nghiệm (Rana et al., 1986, 1987). Chinese Sacbrood Virus (CSBV) là tác nhân gây bệnh của bệnh sacbrood Trung Quốc, ñặt ra một mối ñe dọa nghiêm trọng cho ong mật Apis cerana, và có xu hướng làm sụp ñổ các ñàn ong gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi ong (Liu et al., 2010). Mặc dù sacbrood ñược mô tả lần ñầu tiên vào năm 1913 và ñược cho là tác nhân gây bệnh vào năm 1917, SBV ñã không ñược mô tả cho ñến năm 1964. SBV là virus ñầu tiên trên ong mật ñược giải trình tự toàn bộ. Ở Mỹ, toàn bộ trình tự chuỗi nucleotide của SBV gần ñây mới ñược xác ñịnh. Bằng cách sử dụng RT – PCR ñể phát hiện trực tiếp, nhanh chóng và chuẩn xác các loại virus. Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 3 RT – PCR ñược chứng minh là một công cụ chẩn ñoán nhanh chóng, ñặc hiệu và nhạy bén ñể phát hiện trực tiếp axit nucleic của SBV trong những mẫu ong bị lây nhiễm. Sản phẩm khuếch ñại ñược giải trình tự và phân tích phả hệ cho thấy tồn tại ít nhất ba kiểu gen của SBV. Sử dụng phương pháp uniplex RT – PCR ñể kiểm tra các dòng ong cho thấy sự có mặt của một số loại virus bao gồm BQCV, DWV, KBV, SBV và mô tả việc nhiễm hỗn hợp các loại virus ở ong từ các dòng ong khác nhau. Báo cáo năm 2004 về “Sự lây nhiễm ña virus trên ong mật và sự dị biến hệ gen của các virus trên ong mật” là báo cáo ñầu tiên về sự nhiễm hỗn hợp 4 loại virus trên ong mật và cũng là báo cáo ñầu tiên về việc sử dụng phương pháp multiplex RT – PCR trong việc chẩn ñoán sự lây nhiễm ña virus trong các dòng ong mật. Vào năm 1971, mới chỉ tìm ra ba loại virus lây nhiễm trên ong mật (Bailey, 1971) nhưng 5 năm sau ñó còn số này ñã tăng lên là sáu (Bailey, 1976). Chỉ có rất ít thông tin về sự xuất hiện của virus ong ở A. mellifera ở ðan mạch là có sẵn cũng như không có cuộc ñiều tra toàn diện nào ñược thực hiện. Một cuộc ñiều tra dựa trên phương pháp RT – PCR ñược xuất bản bởi Tentcheva et al. (2004) (ABPV, BQCV, CBPV, DWV, KBV) và Grabensteiner et al. (2001) (SBV) ñã ñược thực hiện ở ðan Mạch chúng có thể là những loại virus nguy hiểm bậc nhất châu Âu. Cuộc ñiều tra dựa trên mẫu ong của những người nuôi ong với tỉ lệ chết cao bất thường vào mùa ñông hay có nghi ngờ ñã nhiễm virus. Sự xuất hiện, tỉ lệ lây nhiễm và sự phân bố của ABPV, BQCV, CBPV, DWV, KBV, SBV ñã ñược ñiều tra ở 90 dòng ong ở Áo bị mắc những triệu chứng suy giảm các cá thể trong ñàn ñột ngột, bại liệt…bằng cách sử dụng RT – PCR. Sự phá hoại do ký sinh trùng cũng ñược ghi chép lại. 1.1.2. Việt Nam Ở Việt Nam, không có nhiều những nghiên cứu về SBV trên A. mellifera ñược xuất bản. Virus lây nhiễm trên ong mật chưa ñược xác ñịnh. Một vài nhà nghiên cứu ở Việt Nam ñã có những ñiều tra sơ bộ ñể áp dụng chẩn ñoán bệnh lây nhiễm trên ong mật như SBV (Lê Thanh Hòa et al., 2004; Phạm Hồng Thái et al., 2011) bẳng sử dụng chẩn ñoán phân tử. Báo cáo “Chẩn ñoán phân tử của Sacbrood Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 4 virus và Deformed wing virus lây nhiễm trên ong mật ở miền Bắc Việt Nam” là báo cáo ñầu tiên về bệnh SBV và DWV sử dụng RT – PCR làm công cụ chẩn ñoán dùng mồi ñặc hiệu của ong mật ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam vào năm 2010. Các kỹ thuật chẩn ñoán bằng sinh học phân tử hầu như ñược sử dụng còn rất khiêm tốn trong công tác phát hiện sớm bệnh virus hại ong mật. Trong ñó Realtime - PCR là kỹ thuật chẩn ñoán nhanh, chính xác và ñịnh lượng ñược nồng ñộ virus vẫn chưa có nhiều công bố ở nước ta. Chính vì thiếu sự chẩn ñoán sớm nên không ñưa ra ñược cách phòng trị tốt. Người nuôi ong thường không phân biệt ñược nguyên nhân gây bệnh cho ong là gì nên ñã lạm dụng kháng sinh và gây tồn dư kháng sinh trong mật ong. 1.1.3. Các loài ong ở Việt Nam Hai loài ong nuôi phổ biến nhất ở nước ta là ong nội A.cerana và ong ngoại A.mellifera. Hai loài này có những ñặc ñiểm khác nhau và bổ sung cho nhau. Ong nội A.cerana là giống ong bản ñịa ở Việt Nam, Trung Quốc và một số nước khác. Ở nước ta, ong nội phân bố rộng khắp cả nước ngoại trừ rừng tràm U Minh (Phạm Hồng Thái, 2003). Ong nội có ñặc tính chăm chỉ, chịu ñược ñiền kiện sống bất lợi, ít dịch bệnh hại, chất lượng mật cao, tuy nhiên năng suất mật thấp, hung dữ và dễ bốc bay, chia ñàn. Ong nội có thể nuôi ở các quy mô từ hộ gia ñình tới nuôi chuyên nghiệp, nhưng nó thích hợp hơn với kiểu nuôi ong quy mô nhỏ trong gia ñình, và cung cấp sản phẩm phục vụ tiêu dùng trong nước. ðể phát triển ong nội, cần chọn các ñàn có tính tụ ñàn cao, chọn giống ong tốt và quan tâm tới phòng bệnh ñể nâng cao năng suất mật. Ong ngoại A.mellifera có nguồn gốc từ châu Âu, châu Phi, ñược nhập vào nước ta từ những năm 60 với hình thức thương mại và ñã thích nghi với ñiều kiện nước ta. Loài ong này phát triển tốt ở những nơi có nguồn hoa tập trung, thích hợp với kiểu nuôi ong chuyên nghiệp với trình ñộ chuyên môn hóa cao. Ong ngoại có kích thước lớn hơn ong nội, khả năng tụ ñàn và dự trữ mật cao hơn, mật ong ngoại chủ yếu xuất khẩu. Nhưng ở những nơi có nguồn hoa rải rác và ñiều kiện khắc nghiệt thì việc nuôi ong ngoại là không thể. Việc nhập ong A.mellifera cũng mang theo các loài ký sinh và bệnh như Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 5 bệnh thối ấu trùng châu Âu, bệnh ấu trùng túi , bệnh bào tử trùng Nosema…cho các loài ong bản ñịa. Ngoài ra còn một số loài ong hoang dã như ong khoái (A.dorsata), ong ñá (A.laboriosa), ong ruồi (A.florea). Tuy nhiên việc khai thác mật của các loài này chiếm tỉ lệ nhỏ và chủ yếu là khai thác, săn bắt trong tự nhiên. 1.1. Các dịch bệnh chính ñược ghi nhận trên ong mật Có rất nhiều dịch hại ong ñã ñược ghi nhận trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Các loài gây hại cho ong khá ña dạng từ ñộng vật, côn trùng, tới các vi sinh vật nhỏ bé như vi khuẩn hay virus. Một số loài chim ăn ong như chim xanh (Merops apiaster), chim én (Cypselus spp), chim chèo bẻo (Dicurunus spp), nhện, thạch sùng, thằn lằn thường bắt ong khi chúng ñi làm về. Vào mùa mưa thì các loài cóc, nhái thường xuất hiện trước cửa tổ ong bắt ong. Các loài vật hại này với số lượng lớn thì sẽ làm giảm số ong trong ñàn nhanh chóng. Các côn trùng hại ong như sâu ăn sáp còn gọi là sâu phá bánh tổ (Galleria mellonenlla, Achroia griselle), trưởng thành của sâu là một loài ngài thuộc họ ngài ñêm (Noctuidae). Các loài kiến vồng (Oecophylla smaradina), kiến lửa (Solemy spp), kiến ñen (Monomorium indicum)…. thường gây hại cho ong ở các vùng nhiệt ñới, khi tấn công ñàn ong chúng ăn cả ấu trùng, nhộng, ong và mật. Ong bò vẽ (Vespa orientalis) là loài phá ong cũng rất mạnh. Ngoài ra còn có chuồn chuồn cũng là côn trùng ăn thịt phá hại ong. Khi bị tấn công mạnh thì ñàn ong có thể bốc bay bỏ tổ. Một số trường hợp ñàn ong bị bệnh ngộ ñộc hóa học. Chất hóa học có thể là thuốc bảo vệ thực vật, thuốc trừ cỏ, thuốc diệt côn trùng… mà ong bị dính phải khi ñi làm hoặc thuốc ñược phun gần nơi ñặt ong. Khi bị ngộ ñộc ong chết với số lượng lớn ngoài cửa tổ, một số bò dưới ñất, một số vừa nhảy vừa xoay. ðàn càng ñông thì số lượng ong chết càng nhiều. Các loài ve khí sinh của ong có chí lớn (Varroa jacobsoni) thuộc họ Varroidac chủ yếu ký sinh trên nhông ong ñực, chí nhỏ (Tropilaelaps clareaes) chỉ ký sinh trên ấu trùng, ve Neocypholaelaps indica Evans ăn phấn hoa … Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 6 Bệnh ỉa chảy nosema do một loài nguyên sinh ñộng vật gây ra có tên là Nosema apis, bệnh này có thể chữa ñược bằng thay chúa và cho ong ăn kháng sinh. Các bệnh gây hại trên ấu trùng do vi khuẩn có bệnh thối ấu trùng châu Âu và thối ấu trùng châu Mỹ. Thối ấu trùng châu Âu (European floubrood) ñược phát hiện ở châu Âu, do liên cầu khuẩn Melissococus pluton gây ra, và còn ñược gọi là thối ấu trùng tuổi nhỏ. Bệnh xuất hiện cả ở A.mellifera và A.cerana. Biện pháp chữa trị là thay chúa và sử dụng kháng sinh. Bệnh thối ấu trùng châu Mỹ do trực khuẩn Bacillus larvae gây ra. Bệnh này gây hại nghiêm trọng nhất ñặc biệt ở vùng cận nhiệt ñới và ôn ñới. Khi gặp ñiều khiện bất thuận, vi khuẩn hình thành nha bào, các nha bào này có thể tồn tại trong ñất, bánh tổ khoảng 10 năm, khi gặp ñiều kiện thuận lợi có thể hoạt ñộng trở lại ở tất cả các thời ñiểm trong năm. Bệnh virus trên ong ñược quan tâm nghiên cứu nhiều trong vài thập kỷ gần ñây bởi sự xuất hiện ngày càng nhiều các loại virus và mức ñộ gây hại của chúng. Hầu hết các bệnh virus trên ong không có triệu chứng rõ ràng. 18 loài virus trên ong mật ñã ñược phát hiện và một số ñã ñược giải mã genome (Lê Quang Trung và cs). Các virus thường truyền qua bọ ký sinh hoặc nhờ sự tiếp xúc giữa các con ong trong ñàn. Một số bệnh virus như: Acute bee paralysis virus (ABPV) hay (APV) ñược xem như là tác nhân truyền nhiễm phổ biến của ong. ABPV lan truyền cùng với sự phá hoại của bọ ký sinh Varroa destructor, cùng Israel acute paralysis virus (IAPV) gây bệnh bại liệt ở ong. Nó thuộc họ Dicistroviridae ,cùng Kashmir bee virus (KBV), và Black queen cell virus (BQCV- làm ấu trùng chúa ñen và chết). Deformed Wing Virus (DWV) làm biến dạng cánh ong, và Sacbrood virus (SBV) gây thối ấu trùng túi thuộc họ iflaviridae, và là picornavirus. 1.2. Tình hình nghiên cứu về Sacbrood virus 1.2.1. Lịch sử phát hiện và tác hại của bệnh virus ấu trùng túi Sacbrood virus ñược ghi nhận lần ñầu tiên năm 1913, và ñược xác ñịnh là do virus gây ra năm 1917 trên ong Apis mellifera, bệnh có mặt khắp các lục ñịa và các vùng nuôi ong, nhưng gây thiệt hại không ñáng kể, có thể tự khỏi và không ñược coi là bệnh nguy hiểm. Cho tới khi dịch lớn sảy ra ở Thụy Sĩ, tiêu diệt nhiều ñàn ong từ năm 1943- 1946 (Phùng Hữu Chính 2008). Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 7 ðối với ong Apis cerana, bệnh xuất hiện thành dịch lần ñầu tiên ở Trung Quốc năm 1972 và tiêu dệt nhiều ñàn ong ở Thái lan vào năm 1976 (Phùng Hữu Chính và Vũ Văn Luyên, 1999). Năm 1981, Bailey ñã phân lập ñược chủng virus gây bệnh trên ong A.cerana ở Thái Lan có ñặc tính sinh lý sinh hóa khác với sacbrood trên A.mellifera và ông ñặt tên là Thai sacbrood virus (TSBV). Sau ñó, TSBV lại gây dịch ở bang Bihar của Ấn ðộ vào năm 1979 và trong năm 1980 nó ñã lan rộng từ ðông sang Tây ở miền Bắc nước này. Nepal từ năm 1981 tới 1984, TSBV ñã lây nhiễm ra khắp cả nước và làm thiệt hại tới 89% tổng số ñàn ong Apis cerana của nước này. Ở Ấn ðộ, hàng triệu ñàn ong ñã bị mất do SBV chỉ tính riêng năm1990 (Lê Quang Trung et al., 2009). Ở Việt Nam, dịch bệnh do SBV gây nên sảy ra năm 1974 khi một số ñàn ong cao sản của Viện ong Bắc Kinh ñược nhập về Hà Nội sau ñó ñã lan tràn ra toàn miền Bắc và tiêu diệt 90% số ñàn ong. Dựa trên các triệu chứng lâm sàng, các kỹ thuật viên của công ty ong, các chuyên gia bệnh trong nước và nước ngoài kết luận là bệnh ấu trùng túi. Phải tới năm 1989 mới xác ñịnh chính xác sự có mặt của Thai sacbrood virus ở nước ta (Phùng Hữu Chính 2008, Vũ Văn Luyện. 1999; Phạm Hồng Thái. 2004). Những năm gần ñây, bệnh virus ấu trùng túi ñã làm giảm 40-80% năng suất mật ở A.mellifera (Phùng Hữu Chính, 2008). Chinese sacbrood là một virus phổ biến gây thiệt hại nghiêm trọng với nghề nuôi ong Trung Quốc. ðây là bệnh gây hại lớn nhất cho ấu trùng ong nhưng cũng có thể ảnh hưởng tới sức khỏe và hành vi của ong mật trưởng thành. Nó ñược quan sát ñầu tiên ở tỉnh Guangdong năm 1972 và nhanh chóng lan ra toàn Trung Quốc và các nước ðông nam á, dẫn ñầu phá hoại ngành công nghiệp ong ở các vùng này. Các nhà khoa học Trung Quốc ñã xác ñịnh nguyên nhân gây bệnh là virus có tên China sacbroodvirus, thuộc họ virus RNA nhỏ, picornaviridea (Zhang et al.2001) 1.2.2. Triệu chứng bệnh ấu trùng túi Triệu chứng ñầu tiên là sự xuất hiện của các ấu trùng yếu hoặc chết. Ấu trùng chết sớm sau khi ñạy nắp nhưng trước khi hóa nhộng. Ấu trùng chết có thể ñược tìm thấy ở lỗ tổ ñã vít nắp và chưa vít nắp khi bệnh nặng. Bánh tổ bị bệnh, nắp vít lỗ tổ lõm xuống, bị ong thợ cắn thủng, có ấu trùng nhọn ñầu nhô lên miệng lỗ tổ. Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 8 Màu sắc của ấu trùng bệnh từ trắng ngà chuyển sang trắng bệch, vạch phân ñốt không rõ. Triệu chứng ñiển hình nhất của bệnh là khi gắp ấu trùng túi lên phía ñuôi ấu trùng hình thành túi nhỏ có dịch trong suốt hoặc vàng nhạt. Thân ấu trùng chuyển sang vàng nhạt rồi nâu nhạt hay nâu xám, chóp ñầu nghiêng về phía bụng. Ấu trùng mới chết không có mùi, khi khô thành vảy cứng nhẵn dạng thuyền. ðàn ong bị bệnh ấu trùng túi nhẹ thì giảm số quân trong ñàn, nên lụi ñàn, năng suất mật thấp. Khi bị bệnh nặng có thể 90% số ấu trùng tuổi lớn chết và ñàn ong sẽ bỏ tổ bốc bay (Phùng Hữu Chính, Vũ Văn Luyện. 1999). 1.2.3. Cách thức lan truyền của SBV Khả năng lây nhiễm của virus gây bệnh thối ấu trùng túi là rất lớn, một ấu trùng chết có thể lây nhiễm cho 3000 ấu trùng lành, hay chất lỏng trong ấu trùng chết có chứa 1mg virus ñủ ñể gây nhiễm cho toàn bộ ấu trùng ong thợ của 1000 ñàn khỏe. Nhưng sức chống chịu của virus không cao, nó mất khả năng gây bệnh khi ñun ở 59o C trong 10 phút. Ở nhiệt ñộ phòng virus có thể tồn tại 3 tuần. Ở các ấu trùng chết ñã khô không còn khả năng gây bệnh. Theo Ball thì trong cơ thể ong trưởng thành, virus nhân lên và tích lũy chủ yếu ở phần ñầu của ong bị nhiễm nhiều hơn các phần khác của cơ thể. Phần lớn chúng tồn tại ở phần não và tuyến dưới hầu, một phần chiết của ñầu chứa khoảng 109 phân tử virus. Còn trong một ấu trùng túi chết có 1012 phân tử virus, tương ñương với 1% khối lượng cơ thể ấu trùng. Và trong phòng thí nghiệm chỉ cần 100 phân tử virus ñể lây nhiễm ong thành công trong giai ñoạn nhộng mắt trắng, ñây là thời ñiểm lây nhiễm thuận lợi nhât. Trong ñàn ong, bệnh lan truyền là nhờ ong thợ khi chúng làm vệ sinh tổ, chúng ăn hoặc gắp bỏ các ấu trùng bệnh, hàm, chân và lông dính virus, khi cho các ấu trùng khoe ăn thì bệnh sẽ lan truyền. Bệnh lây nhiễm giữa các ñàn là do ong ăn cướp mật, lấy chung nguồn thức ăn, ñặc biệt là nguồn phấn hoa, do người nuôi ong nhập cầu ong từ ñàn bệnh vào ñàn khỏe…. 1.2.4. Tác nhân gây bệnh 1.2.4.1. ðặc ñiểm của Sacbrood virus Bộ gen của SBV ñược Ghosh và các cộng sự giải mã và công bố năm 1999. ðây Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 9