Tài liệu Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn edwardsiella ictaluri và aeromonas hydrophila trên cá tra ( pangasius hypophthalmus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THUỶ SẢN NGÔ MINH DUNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila TRÊN CÁ TRA ( Pangasius hypophthalmus) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs. Ts. NGUYỄN THANH PHƯƠNG ĐẶNG THỤY MAI THY CAO TUẤN ANH 2007 LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn quý thấy cô khoa Thủy sản đặc biệt là các thầy cô thuộc bộ môn Sinh học và Bệnh học thủy sản đã truyền đạt những kiến thức, những kinh nghiệm quý báo trong suốt quá trình em học tập và nghiên cứu tại trường. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Thanh Phương, chị Đặng Thụy Mai Thy, anh Cao Tuấn Anh và cô Nguyễn Thị Thu Hằng đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô cố vấn Từ Thanh Dung và cô trợ lý cố vấn Phạm Trần Nguyên Thảo cùng các bạn lóp Bệnh học thủy sản K29 đã động viên và hỗ trợ em trong thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu i TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila trên cá tra” được thực hiện bởi hai thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) và Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) trên cá tra giống bằng phương pháp tiêm. Mỗi thí nghiệm gồm có 4 nghiệm thức mật độ vi khuẩn, với 3 lần lặp lại và một nghiệm thức đối chứng. Hai trăm lẻ tám cá tra giống được bố trí vào 26 bể 80L, mật độ 8 con/bể. Không cho cá ăn trong suốt thời gian bố trí thí nghiệm. Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila sử dụng 4 mật độ vi khuẩn 2,16×103 CFU/ml, 2,16×104 CFU/ml, 2,16×105 CFU/ml và 2,16×106 CFU/ml kết quả thu được ở nghiệm thức 2,16×106 CFU/ml có thời gian biểu hiện bệnh lý sớm nhất là 17 giờ sau khi tiêm vi khuẩn cho cá. Không xác định được giá trị LD50 của chủng vi khuẩn A. hydrophila gây cảm nhiễm, vì ở nồng độ vi khuẩn thấp nhất 2,16×106 CFU/ml cá đã có tỉ lệ chết trên 50% (54,17%). Trung Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri sử dụng 4 mật độ vi khuẩn 1×105 CFU/ml, 1×106 CFU/ml, 1×107 CFU/ml và 1×108 CFU/ml kết quả thu được ở nghiệm thức 1×108 CFU/ml có thời gian biểu hiện bệnh lý sớm nhất là 37 giờ sau khi tiêm vi khuẩn cho cá. Chủng vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm 6,5 tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu CFU/ml. có giá trị LD 50= 10 Trong cả hai thí nghiệm, khi quan sát biến đổi mô học ở các cơ quan gan, thận và tỳ tạng chỉ thấy có hiện tượng sung huyết và xuất huyết, không có hiện tượng hoại tử ở các cơ quan. ii MỤC LỤC Trang Lời cảm tạ ........................................................................................................ i Tóm tắt............................................................................................................. ii Mục lục ............................................................................................................ iii Danh sách bảng, danh sách hình...................................................................... iv Danh mục từ viết tắt......................................................................................... v Chương 1: Giới thiệu ....................................................................................... 1 Chương 2: Tổng quan tài liệu .......................................................................... 3 2.1 Đặc điểm sinh học của cá tra ............................................................... 3 2.2 Bệnh xuất huyết do A. hydrophila trên cá tra ...................................... 3 2.3 Bệnh mủ gan do E. ictaluri trên cá tra................................................. 5 Trung Chương 3: Phương pháp nghiên cứu ............................................................... 8 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ....................................................... 8 3.2 Vật liệu nghiên cứu.............................................................................. 8 3.2.1 Dụng cụ thí nghiệm .................................................................... 8 3.2.2 Hóa chất thí nghiệm.................................................................... 8 3.3 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 9 3.3.1 Đối tượng thí nghiêm.................................................................. 9 3.3.2 Bố trí thí nghiệm......................................................................... 10 3.3.3 Phương pháp thu mẫu ................................................................. 10 3.3.4 Phương mẫu @ vi sinh 11 tâm Học liệu ĐH pháp CầnlấyThơ Tài.................................................... liệu học tập và nghiên cứu 3.3.5 Phương pháp xác định LD50 ....................................................... 11 3.3.6 Phương pháp định danh vi khuẩn ............................................... 11 3.3.7 Phương pháp làm tiêu bản mẫu mô học ..................................... 12 Chương 4: Kết quả và thảo luận ...................................................................... 13 4.1 Dấu hiệu bệnh lý của cá sau gây cảm nhiễm ....................................... 13 4.2 Tỷ lệ cá chết và kết quả LD50 sau khi gây cảm nhiễm ....................... 14 4.2.1 Thí nghiệm gây cảm nhiễm A. hydrophila ................................. 14 4.2.2 Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri ........................ 18 4.3 Tổn thương do vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri trên một số cơ quan của cá tra ................................................................................................. 20 4.3.1 Những biến đổi mô học do vi khuẩn A. hydrophila ................... 20 4.3.2 Những biến đổi mô học do vi khuẩn E. ictaluri ......................... 23 4.4 Kết quả tái định danh vi khuẩn ........................................................... 26 4.4.1 Tái định danh vi khuẩn A. hydrophila ....................................... 26 4.4.2 Tái định danh vi khuẩn E. ictaluri ............................................ 27 4.5 Một số hạn chế trong quá trình thí nghiệm.......................................... 28 Chương 5: Kết luận và đề xuất ........................................................................ 29 5.1 Kết luận................................................................................................ 29 5.2 Đề xuất................................................................................................. 29 Tài liệu tham khảo ........................................................................................... 30 Phụ lục ............................................................................................................. 34 iii DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.1 Nồng độ vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm ..................................... 10 Bảng 4.1 Thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh ................................................ 15 Bảng 4.2 Tỉ lệ cá chết trong thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila .................................................................................................. 15 Bảng 4.3 Thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh ............................................... 18 Bảng 4.4 Tỉ lệ cá chết trong thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri......................................................................................................... 18 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu iv DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 4.1 Biểu hiện bên ngoài cá tra bị nhiễm A. hydrophila ......................... 13 Hình 4.2 Nội tạng cá tra nhiễm A. hydrophila bị xuất huyết .......................... 13 Hình 4.3 Cá tra nhiễm E. ictaluri bị đốm trắng ở nội tạng ............................. 14 Hình 4.4 Mô gan cá tra bị nhiễm A. hydrophila ............................................. 22 Hình 4.4 Mô thận và tỳ tạng cá tra bị nhiễm A. hydrophila ........................... 23 Hình 4.5 Mô cá tra bị nhiễm E. ictaluri .......................................................... 26 Hình 4.5 Mô cá tra bị nhiễm E. ictaluri .......................................................... 27 Hình 4.6 Kết quả test các chỉ tiêu sinh hóa của chủng Xương-CĐ3L310 ..... 28 Hình 4.8 Kết quả test các chỉ tiêu sinh hóa của chủng Tỷ-PT207 .................. 29 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu v CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU Trong thời gian gần đây, dịch cúm gia cầm và bệnh lở mồm long móng, bệnh tai xanh ở lợn lan rộng ở nhiều nước trên thế giới. Dịch bệnh cũng đã xuất hiện ở Việt Nam đã làm giảm đáng kể nguồn thực phẩm phục vụ cho đời sống con người. Người tiêu dùng bắt đầu chọn sản phẩm thủy sản dùng làm thực phẩm dinh dưỡng hàng ngày. Theo công bố của bộ thủy sản ngày 05-12-2005 thì kim ngạch xuất khẩu của toàn ngành thủy sản đạt 2,5 tỉ USD (trích dẫn bởi Trần Thị Ngọc Hân, 2006). Điều này cho thấy nhu cầu tiêu thụ sản phẩm thủy sản ở Việt nam hiện nay là rất lớn. Việc quy hoạch vùng nuôi và đẩy mạnh nuôi các đối tượng thủy sản có giá trị xuất khuẩu với mức đầu tư rất cao, quy mô thâm canh hóa tạo ra sản phẩm sạch mà không tác động đến môi trường đang là vấn đề rất quan trọng đặt ra cho các nhà khoa học, những người quản lý và đầu tư nuôi trồng thủy sản. Trung Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là một trong những đối tượng nuôi đang được phát triển với tốc độ nhanh ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Từ những năm 1998–2000, với sự thành công trong hoạt động nghiên cứu xây dựng “Quy trình kỹ thuật sinh sản nhân tạo và ương nuôi cá tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu tra thương phẩm” của Khoa Thủy sản – Đại học Cần Thơ, có thể nói phong trào nuôi cá tra thương phẩm đang phát triển rất mạnh ở vùng ĐBSCL, năng suất và sản lượng nuôi không ngừng tăng: năm 1994 đạt 30.000 tấn, năm 2001 đạt 150.000 tấn, năm 2002 đạt 200.000 tấn, năm 2003 trên 200.000 tấn, năm 2004 trên 300.000 tấn và năm 2005 đã vượt qua 500.000 tấn (Dương Nhựt Long, 2006). Trong “Chương trình hành động về chất lượng và thương hiệu cá tra, basa giai đoạn 2005- 2010” Bộ thủy sản đặt ra chỉ tiêu sản lượng cá tra, basa nuôi phải đạt 1 triệu tấn vào năm 2010 và kim ngạch xuất khẩu đạt 800 triệu USD (Hà Yên, 2005) Việc tăng sản lượng cá tra là vấn đề không khó, điều đáng lưu tâm hiện nay là tình trạng ô nhiễm môi trường nước thường xuyên xảy ra ở các hộ nuôi; nguyên nhân có thể là do nuôi cá với mật độ dày, lượng thức ăn dư thừa nhiều, quản lý chất lượng nước chưa tốt, sử dụng hóa chất và kháng sinh không đúng qui cách… tạo điều kiện cho dịch bệnh thường xuyên bộc phát. Bệnh xảy ra trên cá tra có nhiều nguyên nhân. Tác nhân thường gây bệnh cho cá tra là ký sinh trùng, vi khuẩn, nấm, dinh dưỡng, stress…Trong đó vi khuẩn là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng, làm tỉ lệ hao hụt cao và khó điều trị ở cá tra. Các loại bệnh do tác nhân vi khuẩn gây ra như bệnh đỏ 1 mỏ, đỏ kỳ, xuất huyết đường ruột, trắng da, đốm trắng trên gan…Bệnh xuất huyết (còn gọi là bệnh đốm đỏ) do vi khuẩn Aeromonas và bệnh trắng gan (mủ gan) do vi khuẩn E. ictaluri là bệnh phổ biến và xuất hiện hầu như quanh năm ở cá tra nuôi ao, bè, đăng quần. Chúng đã gây nhiều thiệt hại cho người nuôi trong những năm gần đây. Đầu năm 2006, ở tỉnh An Giang và Đồng Tháp cá chết do bệnh mủ gan lên tới 60% (Bộ tài nguyên môi trường Việt Nam, 2006), bệnh xảy ra làm thiệt hại hàng trăm triệu đồng/hộ nuôi. Từ những vấn đề trên đề tài “Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila trên cá tra” được thực hiện. Mục tiêu đề tài Tìm hiểu đặc điểm sinh lý sinh hóa và khả năng gây bệnh của hai dòng vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila trên cá tra. Nội dung đề tài 1. Xác định LD50 của vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila trên cá tra trong điều kiện gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm với các mật độ vi khuẩn khác nhau. 2. Khảo sát sự biến đổi về cấu trúc mô học ở 3 cơ quan gan, thận, tỳ tạng của cá tra đã gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm sinh học của cá tra Cá tra là một trong những loài cá da trơn ở hạ lưu sông Mê kông thuộc địa phận Việt Nam. Theo Nguyễn Bạch Loan (2004) cá tra có hệ thống phân loại như sau: Bộ: Siluriformes Họ: Pangasidae Chi: Pangasius Loài: Pangasius hypophthalmus Trung Theo Dương Nhựt Long (2006), cá tra phân bố ở lưu vực sông Mê kông, có ở bốn nước: Lào, Việt Nam, Campuchia và Thái Lan. Cá có khả năng sống tốt trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất hữu cơ, oxy hòa tan thấp và có thể nuôi với mật độ rất cao. Cá tra là loài ăn tạp, trong tự nhiên cá ăn được mùn bã hữu cơ, cây cỏ thủy sinh, rau quả, tôm tép, cua, côn trùng, ốc và cá. Tuy nhiên, thức ăn có nguồn gốc động vật giúp cá sinh trưởng và phát triển nhanh hơn. Cá tra không đẻ trong ao nuôi, cũng không có bãi đẻ tự nhiên ở Việt Nam. Cá tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu đẻ ở thượng nguồn sông Campuchia, cá bột theo dòng nước về hạ nguồn sông Mê kông Việt Nam. Trong tự nhiên mùa vụ sinh sản của cá bắt đầu từ tháng 5 đến tháng 7 hàng năm. 2.2 Bệnh xuất huyết do A. hydrophila trên cá tra Theo Từ Thanh Dung (2005), vi khuẩn Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae, bao gồm 3 loài Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria. Bệnh đốm đỏ còn gọi là bệnh xuất huyết, bệnh nhiễm trùng máu, bệnh sởi...là bệnh do vi khuẩn A. hydrophila (theo Bergey 1957, trích dẫn bởi Từ Thanh Dung, 2005). Trong các chủng vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A. hydrophila được xem là chủng gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất, vi khuẩn này gây bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết ở những loài cá nuôi và cá tự nhiên (Lewis & Plumb, 1979). A. hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại Java-Indonesia và gây tỉ lệ tử vong từ 80-90% (Angka, 1990). Trong báo cáo của Saitanu et al., (1982) đã tìm thấy vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết do nhiễm trùng máu trên cá chép. 3 Theo Angka (1990) vi khuẩn này cũng gây bệnh xuất huyết trên cá trê trắng giống (Clarias batrachus) và là tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá basa nuôi trong bè gỗ (Tanasomwang và Saitanu, 1979). Vi khuẩn A. hydrophila còn tìm thấy trên bệnh phẩm cá trê (Clarias sp) (trích dẫn bởi Trần Anh Dũng, 2005). Đặc điểm sinh hoá Aeromonas là vi khuẩn Gram âm, di động, hình que hoặc hình que cầu, hiếu khí và yếm khí không bắt buộc, khử Nitrate, có khả năng lên men, Oxidase dương tính, kháng với O/129 (Từ Thanh Dung, 2005) Điều kiện sống và gây bệnh Ở Châu Âu, bệnh do A. hydrophila trên cá chình thường xuất hiện vào mùa xuân - hè, nhiệt độ nước khoảng 17 oC - 22 oC, khoảng nhiệt độ này cũng được cho là khoảng nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn này phát triển (Esteve et al., 1993). Bên cạnh đó, Groberg (1978) khi gây cảm nhiễm A. hydrophila trên cá hồi giống đã kết luận tỉ lệ chết thường cao ở 20,5oC và 17oC, tỉ lệ chết thấp hơn ở 15oC và 12oC, còn ở 9oC hay thấp hơn nữa thì cá chết rất ít hoặc không thấy các chết (trích dẫn bởi Roselynn and Stevenson, 1988). Trung Báo cáo của Rahman et al., (2000) cũng cho rằng vi khuẩn A. hydrophila có độc lực cao nhất ở 17oC (LD50= 106,03 CFU/ml) và 25oC (LD50= 106,53 tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu CFU/ml) khi tác giả gây cảm nhiễm trên cá vàng (Carassius auratus). Ngoài ra, theo điều tra của Trần Anh Dũng (2005), vào thời gian lũ rút thì các hộ nuôi cá tra ao ghi nhận bệnh xuất huyết xuất hiện cao nhất với 85,4%. Dấu hiệu bệnh lý Theo Bùi Quang Tề (2006) cá bị nhiễm A. hydrophila có biểu hiện chung là da thường đổi màu tối, không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, xuất hiện các đốm xuất huyết đỏ trên thân, các gốc vây, quanh miệng, xuất huyết hậu môn, mắt lồi đục. Ở cá tra và cá basa, xoang bụng xuất huyết, mô mỡ xuất huyết nặng, gan tái nhợt, mật sưng to, thận sưng, ruột dạ dày bóng hơi đều xuất huyết, xoang bụng chứa nhiều dịch nhờn mùi hôi thối. Cá trê giống bị bệnh thường tách đàn và treo râu. Một số thí nghiệm gây cảm nhiễm Rahman et al., (2000) thí nghiệm gây cảm nhiễm A. hydrophila trên cá vàng bằng 4 cách khác nhau: tiêm ở bụng (mật độ vi khuẩn 3x104 - 3×108 CFU/ml), tiêm ở cơ (mật độ vi khuẩn 8x104 - 8×108 CFU/ml), tiêm dưới da (mật độ vi khuẩn 8,5x104 - 8,5×108 CFU/ml) và ngâm vi khuẩn (mật độ vi khuẩn 4,6x104 - 4,6×108 CFU/ml). Sau khi so sánh đã đưa kết luận gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm dưới da thì độc lực của vi khuẩn mạnh nhất với giá trị LD50 4 là 106,4CFU/ml. Bên cạnh đó, Azad et al., (2001) gây cảm nhiễm tiêm vi khuẩn này trên cá rô phi, ở mật độ vi khuẩn 107 CFU/ml đã gây chết trên 80%. Ngoài ra, Đoàn Nhật Phương (2001) thí nghiệm gây cảm nhiễm 15 chủng A. hydrophila trên cá chép bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn từ 103 CFU/ml đến 107 CFU/ml trong thời gian 14 ngày, qua 2 lần thí nghiệm thì các chủng vi khuẩn độc lực mạnh có giá trị LD50 lần lượt là 3,68×106 CFU/ml, 2,64×106 CFU/ml đến 4,52×106 CFU/ml và 1,96×106 CFU/ml đến 1,45×107 CFU/ml. 2.3 Bệnh mủ gan do Edwardsiella ictaluri trên cá tra Vi khuẩn Edwardsiella ictalluri được Hawke (1979) phân lập lần đầu tiên trên cá Nheo nuôi tại Mỹ (Ictalurus punctatus) và được xác định là nguyên nhân gây bệnh ESC (Enteric septicaemia of catfish). Ở Việt Nam, bệnh do E. ictaluri gây ra trên cá tra được gọi là bệnh mủ gan. Bệnh được ghi nhận đầu tiên ở Đồng Bằng Sông Cửu Long vào cuối năm 1998 trên cá tra nuôi bè với dấu hiệu bệnh có nhiều nốt trắng trên gan (Ferguson et al., 2001). Trung Theo Hawke (1981), Plumb và Sanchez (1983) vi khuẩn E. ictaluri còn có khả năng gây bệnh trên một số nhóm cá da trơn khác như blue catfish (Ictalurus furcatus) và white catfish (Ictalurus catus) (trích lược bởi Từ Thanh Dung, tâm Học liệu CầnE.Thơ @được Tàighi liệu học tập nghiên 2005). Ngoài ra, ĐH vi khuẩn ictaluri nhận cũng gâyvà bệnh trên cá cứu trê trắng (Clarias batrachus) ở Thái Lan, trên cá trê xanh (Ictalurus furcatus) và cá trê sông (Ictalurus catus) (Bùi Quang Tề, 2006). Ở Việt Nam, bệnh mủ gan gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế đối với cá tra nuôi thâm canh, tỉ lệ hao hụt lớn ở cá tra giống từ 10% - 90% (Từ Thanh Dung và ctv., 2004). Đầu năm 2006 ở 2 tỉnh An Giang và Đồng Tháp cá chết do bệnh mủ gan lên tới 60% (Bộ tài nguyên môi trường Việt Nam, 2006). Đặc điểm sinh hóa E. ictaluri là loài vi khuẩn thuộc Enterobacteriaceace, gram âm, hình que ngắn, di động yếu hoặc không di động. Catalase dương tính, oxidase âm tính và lên men glucose, không sinh ra H2S và Indole âm tính. Vi khuẩn E. ictaluri phát triển trên môi trường TSA chậm 36-48 giờ ở nhiệt độ 28-30oC (Từ Thanh Dung, 2005). Điều kiện sống và gây bệnh Theo Từ Thanh Dung (2005) bệnh bắt đầu xuất hiện vào tháng 5 và phát triển mạnh nhất vào khoảng tháng 7 đến tháng 10 rồi giảm xuống ở các tháng còn lại. Đặc biệt bệnh mủ gan xuất hiện vào thời gian lũ về là cao nhất với tỉ lệ 87,8% số hộ nuôi cá ghi nhận ở An Giang (Trần Anh Dũng, 2005). Lê Thị Bé 5 Năm (2002) cũng cho rằng bệnh xuất hiện mạnh vào mùa lũ trong năm, nước đục mang nhiều phù sa, chất lượng nước biến động, đồng thời nước chảy mạnh cá dễ bị sốc, giảm khả năng đề kháng đối với mầm bệnh vì vậy bệnh dễ dàng bộc phát. Bệnh xuất hiện ở tất cả các giai đoạn nhưng gây thiệt hại nghiêm trọng ở giai đoạn cá lứa. Khi nhiệt độ nước dao động trong khoảng 26oC - 28oC là điều kiện tốt cho vi khuẩn này gây bệnh trên cá tra (Trương Quốc Phú, 2004). Lương Trần Thục Đoan (2006) khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra ở nhiệt độ khoảng 27,5±0,8oC đã kết luận mật độ vi khuẩn 1×106 CFU/ml và 1×105 CFU/ml có độc lực đủ mạnh để gây chết cá. Theo Plumb (1999), E. ictaluri chỉ thích hợp với điều kiện nhiệt độ khoảng 18oC - 28oC, do đó bệnh do vi khuẩn này xảy ra trên cá trơn thường rơi vào mùa có nhiệt độ thấp. Bên cạnh đó, trong điều kiện thí nghiệm gây cảm nhiễm trên cá nheo giống, bố trí thí nghiệm ở 25oC cho tỉ lệ cá chết cao nhất, thấp nhất ở các nghiệm thức có nhiệt độ 23oC và 28oC và không có cá chết tại các nhiệt độ 17oC, 21oC và 32oC (Francis-Floy et al., 1987). Dấu hiệu bệnh lý Trung Cá bị bệnh không có những dấu hiệu bất thường bên ngoài. Ở giai đoạn mới chớmHọc bệnhliệu cá vẫn bắt mồi. ở giai đoạn nàyvà nếunghiên không phát tâm ĐHcònCần ThơTuy @ nhiên Tài liệu học tập cứu hiện sớm và môi trường nuôi quá bẩn thì bệnh cá sẽ trở nên trầm trọng hơn và rất khó khăn trong điều trị. Khi bị bệnh nặng hơn, cá có biểu hiện gầy, bơi lờ đờ, da nhợt nhạt, có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu môn. Bên trong nội quan (gan, thận, tỳ tạng) xuất hiện những đốm trắng đường kính từ 1-3mm các cơ quan này sưng to và có hiện tượng nhũn ở thận (Từ Thanh Dung và ctv, 2004) Một số thí nghiệm gây cảm nhiễm Wolter và Johnson (1994) gây cảm nhiễm (bằng phương pháp ngâm) trên Cá Nheo Mỹ (15-20 cm) với mật độ vi khuẩn E. ictaluri 1,2.10 6 CFU/ml ở 25oC, tốc độ nước chảy 1L/phút, cho ăn 3% trọng lượng thân/ngày. Tỉ lệ chết dao động từ 38-95,3% trong thời gian thí nghiệm là 7 ngày (trích dẫn từ Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004). Klesius & Sealey (1995) sử dụng E. ictaluri với mật độ 1x10 7 CFU/mL ngâm trong một giờ trên Cá Nheo (14-17 cm). Tỉ lệ chết là 28% trong vòng 5-20 ngày. Gần đây nhất, Williams và Lawrence (2005) đã sử dụng vi khuẩn E. ictaluri R4383 WT và R4383 HM với nồng độ lần lượt là 7,0x10 7 CFU/ml và 7,2x10 7 CFU/ml ngâm trên cá Nheo Mỹ trong thời gian 30 phút, tỉ lệ chết là 90% và 85%. Bên cạnh đó họ cũng sử dụng phương pháp tiêm vi khuẩn 6 E. ictaluri để so sánh với phương pháp ngâm với mật độ vi khuẩn tăng dần. Đối với E. ictaluri R4383 WT tiêm với mật độ 5,2×103 CFU/ml, 5,2×104CFU/ml, 5,2×105CFU/ml thì tỉ lệ cá chết lần lượt là 67,2%, 100% và 100%. Trong khi đó, tiêm E. ictaluri R4383 HM với mật độ vi khuẩn là 5,2×103 CFU/ml, 5,2×104 CFU/ml, 5,2×105 CFU/ml, 5,2×106 CFU/ml gây chết 63,5%, 98,7%, 100% và 100%. Qua kết quả thí nghiệm, họ kết luận rằng không có sự khác nhau về tỉ lệ chết giữa 2 phương pháp ngâm và tiêm. Trung Ngoài ra, Lương Trần Thục Đoan (2006) đã chứng minh rằng ngâm cá tra với mật độ vi khuẩn E. ictaluri mật độ vi khuẩn từ 1x105 CFU/ml đến 1x107 CFU/ml trong 1 giờ, thời gian theo dõi thì nghiệm là 10 ngày thì ở mật độ 1x107 CFU/ ml có tỉ lệ cá chết cao nhất (75% số cá thí nghiệm) so với 2 nồng độ còn lại là 1x105 CFU/ml và 1x106 CFU/ml. Và đưa ra kết luận rằng mật độ vi khuẩn 1x 107 CFU/ml có độc lực cao nhất. Bên cạnh đó, Lương Trần Thục Đoan cũng gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn từ 1x104 CFU/ml đến 1x106 CFU/ml đã cho rằng mật độ vi khuẩn 1x105 CFU/ml và 1x106 CFU/ml có độc lực đủ mạnh để gây chết cá trong thí nghiệm tiêm (ở 1x106 CFU/ml cá chết 100% chỉ sau 5 ngày thí nghiệm) và kết luận rằng phương pháp tiêm vi khuẩn làm cá chết nhanh hơn phương pháp ngâm vi khuẩn trong khoảng thời gian 1 giờ. Trong khi đó, Phan Thị Mỹ Hạnh (2004) tâm Họccảm liệunhiễm ĐH Cần Thơ trên @ Tài liệutiêm họccátập và nghiên cứu khi gây E. ictaluri cá tra, ở mật độ vi khuẩn 1,5×106CFU/ml và 1,5×105CFU/ml làm cá chết 100% sau 6 ngày thí nghiệm. Trần Thị Ngọc Hân (2006) cũng thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn này trên cá tra bằng 2 phương pháp: phương pháp tiêm (mật độ vi khuẩn từ 1x104 CFU/ml đến 1x106 CFU/ml) và phương pháp ngâm (mật độ vi khuẩn từ 1x105 CFU/ml đến 1x107 CFU/ml) đã đưa ra kết luận: trong cùng mật độ vi khuẩn gây cảm nhiễm là 1x105 CFU/ml và 1x106 CFU/ml, cấu trúc mô của mẫu thu ở phương pháp ngâm biến đổi sớm hơn so với phương pháp tiêm. 7 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Đề tài được thực hiện từ tháng 03/2007 đến tháng 06/2007. - Địa điểm nghiên cứu tại trại thực nghiệm bệnh cá và phòng thí nghiệm bệnh học thủy sản - Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Dụng cụ thí nghiệm Trung - Bể composit: 36 bể, mỗi bể 80 lít. - Máy sục khí, hệ thống sục khí, xô nhựa, vợt. - Dụng cụ tiểu phẫu, que cấy, đèn cồn, khay nhựa, bình xịt cồn, giấy tissues, bút lông, kính hiển vi, lame. - Cốc thủy tinh, lọ thủy tinh, đĩa Petri, ống đong. - Ống tiêm, kim tiêm. - Cân điện tử, máy Autolauve, máy ly tâm. - Máy đúc khối, máy cắt lát mỏng, máy xử lý mẫu. - Tủ ấm, liệu tủ lạnh, tủ sấy. tâm Học ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu - Máy ảnh, sổ ghi chép theo dõi hàng ngày. 3.2.2 Hóa chất thí nghiệm - Chlorin, cồn, nước cất, formol (70%, 10%) - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: TSA (Trypticase soya agar), NB (Nutrient broth). - Các loại hóa chất nhuộm Gram. - Các hóa chất Test sinh hóa để định danh các dòng vi khuẩn theo phương pháp truyền thống. - Dung dịch cố định mẫu: NBF (Neutral Buffered Formalin) - Xylen, parafin, sáp ong. - Dung dịch Mayer’ s aldumin. - Dung dịch nhuộm Harris’ s Haematolin & Eosin (H&E). - Keo dán Enterlan. 8 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Đối tượng thí nghiệm ¾ Cá thí nghiệm - Cá tra giống có trọng lượng khoảng 15-20g. - Cá tra giống tương đối đồng cỡ, khỏe mạnh, linh hoạt, da sáng bóng. - Cá giống sau khi mua về được dưỡng trong bể composite nước chảy tràn, có sục khí khoảng 1 tuần và cho cá ăn thức ăn công nghiệp (cho ăn theo nhu cầu). - Kiểm tra tình trạng sức khỏe của cá (chọn ngẫu nhiên 5 con) trước khi tiến hành bố trí thí nghiệm. ¾ Nguồn vi khuẩn Trung - Vi khuẩn được phân lập từ các ao cá Tra bệnh ở An Giang thuộc đề tài “Quan trắc môi trường và xác định tác nhân gây bệnh trên cá da trơn (TraPangasius hypophthamus) và tôm càng xanh (Macrobrachiumrosenbergii) - Mẫu vi khuẩn được trữ vào tháng 11/2006 ở nhiệt độ -80oC. Mã vi khuẩn A. hydrophila: Xương-CĐ3L310 Mã vi khuẩn E. ictaluri: Tỷ-PTK207 - Vi khuẩn trữ được cấy trên môi trường TSA để có khuẩn lạc rồi tiếp tục tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu đem cấy sang trên môi trường TSA để chắc chắn có khuẩn lạc thuần, kiểm tra tính thuần dựa vào các chỉ tiêu về hình thái: hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm gram. - Vi khuẩn đã thuần được nuôi tăng sinh trong 100 ml NB, ủ trong tủ ấm ở 28oC từ 24-48 giờ. - Sau đó vi khuẩn được ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút ở 4oC trong vòng 5 phút. Tiếp đó vi khuẩn sẽ được rửa sạch 3 lần trong nước muối sinh lý bằng cách ly tâm ở 5.000 vòng/phút ở 4oC trong vòng 5 phút (Theo Rahman et al., 2000) - Xác định mật độ vi khuẩn bằng hai cách tiến hành song song 1. Mật độ vi khuẩn được đo bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm. Với OD = 1 tương đương với mật độ vi khuẩn là 1×109CFU/ml (Theo Lương Trần Thục Đoan, 2006). 2. Pha loãng dung dịch vi khuẩn, dùng pipet hút 20µl cho lên môi trường TSA, lặp lại 7 lần (140µl/ độ pha loãng/ dòng vi khuẩn). Cho vi khuẩn phát triển 24-48 giờ ở điều kiện 28oC. Đếm số lượng khuẩn lạc, xác định mật độ vi khuẩn bằng công thức: Tế bào vi khuẩn (CFU/ ml) = Số khuẩn lạc trên đĩa/7 x 50 x Hệ số pha loãng - Pha loãng vi khuẩn với các mật độ và tiến hành bố trí thí nghiệm. 9 3.3.2 Bố trí thí nghiệm Trung - Bể composite được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và chlorin 200 ppm, phơi khô. Sau đó cấp nước vào bể, có sục khí. Nguồn nước là nước máy. • Bể 500L dùng để trữ cá được đặt ngoài trời nơi có mái che. • Bể 80L dùng để thí nghiệm cấp khoảng 50-60L nước. Bể được đặt trong phòng kín. - Thí nghiệm được bố trí trong hệ thống nước tĩnh. - Mật độ cá bố trí thí nghiệm là 8 con/bể. - Không cho cá ăn suốt thời gian bố trí thí nghiệm. - Bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. - Thí nghiệm gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm gồm 4 nghiệm thức với mật độ vi khuẩn khác nhau và nghiệm thức đối chứng tiêm nước muối sinh lý. Bảng 3.1: Nồng độ vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm Nồng độ vi khuẩn (CFU/ml) Nghiệm thức A. hydrophila E. ictaluri 3 1 2,16 × 10 1 × 105 2 2,16 × 104 1 × 106 1 × 107 3 2,16 × 105 6 tâm Học liệu ĐH liệu1 ×học 108 tập và nghiên cứu 4 Cần Thơ 2,16 @ × 10Tài - Tiêm 0,1 ml vi khuẩn cho mỗi con cá, mẫu đối chứng tiêm 0,1 ml dung dịch nước muối sinh lý. Vị trí tiêm ở gốc vi ngực. - Thời gian theo dõi sau khi gây cảm nhiễm là 10 ngày. 3.3.3 Phương pháp thu mẫu - Quan sát và ghi nhận các dấu hiệu bệnh lý, số cá chết cá ở các mốc thời gian 1h, 3h, 6h, 9h, 12h, 18h, 24h, ngày 2,…ngày 14 sau khi gây cảm nhiễm. - Tiến hành thu mẫu cá lờ đờ hay vừa mới chết và ghi nhận lại dấu hiệu bên ngoài và bên trong cơ thể mẫu cá. - Phân lập vi khuẩn ở 3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng. - Thu mẫu mô ở 3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng. Cố định mẫu bằng dung dịch NBF trong lọ nhựa. 10 3.3.4 Phương pháp lấy mẫu vi sinh Mẫu vật: mẫu cá dung để lấy mẫu vi khuẩn phải còn sống hoặc vừa mới chết. Trước khi giải phẫu đặt cá trên khay sạch. Quan sát cá bằng mắt thường, ghi nhận tất cả các biểu hiện bên ngoài: vết thương, điểm xuất huyết, mùi và các triệu chứng của bệnh. Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, tỳ tạng. Khi giải phẫu để tránh nhiễm các tạp khuẩn từ bên ngoài, cần áp dụng các nguyên tắc vô trùng trong quá trình phân lập vi khuẩn. Dụng cụ lấy mẫu được đốt trên đèn cồn trước khi lấy mẫu ở các cơ quan. Dùng cồn 70% sát trùng mặt ngoài của cá và dùng giấy lau sạch các chất nhầy trên cơ thể cá để diệt các tạp khuẩn ký sinh ở phần da cá. 3.3.5 Phương pháp xác định LD50 (Lethal dose: Nồng độ vi khuẩn gây chết cá 50%) Xác định LD50 theo phương pháp của Reed và Muench (1938). Xác định LD50 để biết được khả năng năng gây bệnh của vi khuẩn và so sánh độc lực giữa các chủng vi khuẩn. LD50 = 10a - p.d L% − 50 = @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Trung tâm Học liệu ĐH Cầnp.d Thơ L% − H % ¾ a: số lũy thừa mà tại đó vi khuẩn gây chết cá thấp nhất (trên 50%) ¾ H%: tỷ lệ cá chết cao nhất (dưới 50%) ¾ L%: tỷ lệ cá chết thấp nhất (trên 50%) 3.3.6 Phương pháp định danh vi khuẩn Chỉ tiêu về hình thái - Hình dạng, màu sắc khuẩn lạc - Nhuộm Gram và hình dạng của vi khuẩn. Chỉ tiêu về sinh lý, sinh hóa (Chi tiết xem phần phụ lục A) - Tính di động, - Các phản ứng Oxydase, Catalase, O/129, Decarboxylase, Voges-Proskauer (VP), Indole, Citrate, Ure, Asculin, phản ứng tạo Nitrite từ Nitrate; Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O-F test), khả năng sinh gas và H2S, khả năng thủy phân Starch, Gelatin Định danh vi khuẩn dựa theo phương pháp của Bergey (1974) và dòng chuẩn vi khuẩn dựa theo dòng chuẩn của Inglis et al., (1993). 11 3.3.7 Phương pháp làm tiêu bản mẫu mô (chi tiết ở phần phụ lục B) Thu mẫu ở 3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng. Cố định bằng dung dịch NBF trong lọ nhựa, sau đó thực hiện các bước sau: - Rửa mẫu sau khi cố định - Cắt tỉa và định hướng - Quy trình xử lý mẫu (quy trình xử lý mẫu được thực hiện trên máy) 9 Loại nước 9 Làm trong mẫu (tẩm dung môi trung gian) 9 Tẩm paraffin - Đúc khuôn - Cắt mẫu - Dán mẫu lên lame - Nhuộm mẫu (quy trình nhuộm mẫu được thực hiện trên máy) - Dán lamelle vào lame - Đọc kết quả Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 12 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Dấu hiệu bệnh lý của cá sau gây cảm nhiễm Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri trên cá tra giống được thực hiện trong cùng địa điểm và điều kiện thí nghiệm. Mỗi thí nghiệm gồm có 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức với 3 lần lặp lại và 1 nghiệm thức đối chứng. Kết quả sau khi gây cảm nhiễm ở tất cả các nghiệm thức đều xuất hiện cá chết, trừ nghiệm thức đối chứng. Tổng số cá thí nghiệm là 208 con. Trong quá trình thí nghiệm, cá được gây cảm nhiễm A. hydrophila có những biểu hiện bơi lờ đờ, gầy, có hiện tượng xuất huyết ở các gốc vây, hậu môn, xung quanh miệng. Cá sắp chết thường ngửa bụng, thả trôi theo nước. Giải phẫu bên trong thấy bóng hơi căng phồng, gan tái nhợt hoặc sưng, thận sưng, ruột, tuyến sinh dục, bóng hơi đều xuất huyết. Xoang bụng xuất huyết và có nhiều dịch nhờn, có mùi hôi thối đặc trưng ngay cả khi cá còn sống (Hình 4.1). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu A Hình 4.1 Biểu hiện bên ngoài cá tra bị nhiễm A. hydrophila (¼) A. Cá bị xuất huyết miệng, mắt. B. Cá bị xuất huyết vi bụng và hậu môn Hình 4.2 Nội tạng cá tra nhiễm A. hydrophila bị xuất huyết (¼) 13 Theo Aydin et al., (2004) khi gây cảm nhiễm A. hydrophila trên cá hồi cầu vồng (Oncorhynchus mykiss Walbaum), cá bị bệnh có biểu hiện bơi lờ đờ, bỏ ăn, da tối lại, mang bi sưng, tỳ tạng cũng sưng đỏ, gan và thận bị xuất huyết và có dịch trong ruột. Bùi Quang Tề (2006) cho rằng cá bị nhiễm vi khuẩn này còn có thể xuất hiện các vết loét ăn sâu vào cơ, có mùi hôi thối, trên vết loét còn có nấm và ký sinh trùng ký sinh. Trong khi đó, cá nhiễm E. ictaluri cũng có hiện tượng cá bơi lờ đờ, gầy và xuất huyết hậu môn. Da cá không còn màu xanh đen hay có ánh bạc mà trở nên nhợt nhạt. Cá sắp chết thường nổi đầu. Đặc biệt, khi giải phẫu bên trong nội quan ở gan, thận và tỳ tạng xuất hiện những đốm trắng tròn, nhỏ, đường kính khoảng 1-2,5mm, các cơ quan còn có hiện tượng sưng to. Trong thí nghiệm gây cảm nhiễm E. ictaluri lên cá tra giống, Lương Trần Thục Đoan (2006) cũng ghi nhận được nhưng dấu hiệu bệnh lý như trên, ngoài ra còn có hiện tượng nhũn ở thận. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Hình 4.3 Cá tra nhiễm E. ictaluri bị đốm trắng ở nội tạng ( ¼) Qua những dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và bên trong cho thấy trên cùng một đối tượng vật chủ, cùng điều kiện thí nghiệm và chăm sóc như nhau, nhưng dưới sự xâm nhập của 2 loài vi khuẩn khác nhau thì đều có những biểu hiện bệnh lý đặc trưng khác nhau, đặc biệt là những biểu hiện ở các cơ quan nội tạng. 4.2 Tỷ lệ cá chết và kết quả LD50 sau khi gây cảm nhiễm 4.2.1 Thí nghiệm gây cảm nhiễm A. hydrophila Sau khi gây cảm nhiễm, ở tất cả các nồng độ vi khuẩn đều xuất hiện cá chết và đều biểu hiện bệnh lý rất rõ. Ở các nồng độ vi khuẩn khác nhau thì thời điểm phát sinh bệnh ở các nghiệm thức cũng khác nhau (Bảng 4.1). 14