Tài liệu Nghiên cứu in vitro khả năng làm probiotic cho tôm sú của một số chủng bacillus phân lập được từ trùn quế

CHƯƠNG 1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU IN VITRO KHẢ NĂNG LÀM PROBIOTIC CHO TÔM SÚ CỦA MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ TRÙN QUẾ Mã số: Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Văn Minh TP. HCM, 07/2012 CHƯƠNG 2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU IN VITRO KHẢ NĂNG LÀM PROBIOTIC CHO TÔM SÚ CỦA MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ TRÙN QUẾ Mã số: Thành viên đề tài: ThS. Nguyễn Văn Minh ThS. Dương Nhật Linh CN. Đỗ Bảo Ngọc CN. Trần Thị Khánh Linh CN. Hà Bảo Yến TP. HCM, 07/2012 M CL C ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 4 1.1. BỆNH DO VI KHUẨN VIBRIO TRÊN TÔM [1,8,46] ........................................... 5 1.2. PHƯƠNG ÁN XỬ LÝ BỆNH VÀ NHỮNG TÁC ĐỘNG TIÊU CỰC CỦA VIỆC DÙNG THUỐC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN [9] .............................. 8 1.2.1. Tác động đến môi trường sinh thái. ................................................................ 9 1.2.2. Ảnh hưởng tới vật nuôi thủy sản ..................................................................... 9 1.2.3. Gây hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh [9,14] ......................... 10 1.2.4. Ảnh hưởng tới sức khỏe con người ............................................................... 10 1.3. PROBIOTIC - CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN .. 11 1.3.1. Định nghĩa về probiotic ................................................................................. 12 1.3.2. Đặc điểm chung cho probiotic [6], [14] ........................................................ 13 1.3.3. Vai trò của probiotic trong nuôi trồng thủy sản [5,10,34,41] ....................... 14 1.3.4. Cơ chế tác động của probiotic trong nuôi trồng thủy sản ............................. 16 1.4. VI KHUẨN BACILLUS ........................................................................................ 20 1.4.1. Đặc điểm chung của chi Bacillus .................................................................. 21 1.4.2. Dinh dưỡng và tăng trưởng ........................................................................... 22 1.4.3. Quá trình tạo bào tử của Bacillus .................................................................. 22 1.4.4. Một số ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản ............................. 24 1.5. TRÙN QUẾ, MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN.................................................................................................. 25 1.5.1. Trùn quế và phân trùn quế ............................................................................ 25 1.5.2. Ứng dụng của trùn và phân trùn quế trong nuôi trồng thủy sản ................... 27 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 29 2.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...................................................... 30 i 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................... 30 2.1.2. Môi trường .................................................................................................... 31 2.1.3. Thiết bị - dụng cụ .......................................................................................... 31 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................................... 33 2.2.1. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 33 2.2.2. Tái phân lập Bacillus spp. ............................................................................. 34 2.2.3. Thử đối kháng ............................................................................................... 35 2.2.4. Thử nghiệm đồng nuôi cấy [37] .................................................................... 36 2.2.5. Thí nghiệm đánh giá tính an toàn của các chủng Bacillus spp. .................... 37 2.2.6. Xử lý kết quả ................................................................................................. 41 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.................................................................... 42 3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP BACILLUS SPP. ............................................................... 43 3.2. KẾT QUẢ THỬ ĐỐI KHÁNG .............................................................................. 45 3.2.1. Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc ............................... 45 3.2.2. Thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch lớp kép..................................... 47 3.3. THỬ NGHIỆM ĐỒNG NUÔI CẤY ...................................................................... 52 3.3.1. Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus spp. với V. parahaemolyticus ......................................................................................... 53 3.3.2. Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus spp. với V. alginolyticus ..... 61 3.3.3. Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus spp. với V. harveyi ............. 68 3.4. THỬ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS SPP. ............................................................................................................................. 76 3.4.1. Thử khả năng gây dung huyết ....................................................................... 76 3.4.2. Thử nghiệm tính an toàn của các chủng Bacillus spp. lên ấu trùng tôm sú .. 77 3.5. THÍ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG VÀ MẬT ĐỘ GÂY NHIỄM THÍCH HỢP CỦA CÁC CHỦNG VIBRIO LÊN ẤU TRÙNG TÔM SÚ .............................. 79 ii 3.5.1. Ảnh hưởng của Vibrio parahaemolyticus lên tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú .................................................................................................................. 79 3.5.2. Ảnh hưởng của Vibrio alginolyticus lên tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú ..... 81 3.5.3. Ảnh hưởng của Vibrio harveyi lên tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú ............... 82 3.6. THÍ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẢO VỆ CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS SPP. LÊN ẤU TRÙNG TÔM SÚ ........................................................... 83 3.6.1. Khả năng bảo vệ ấu trùng tôm sú của các chủng Bacillus spp. chống lại V. parahaemolyticus ......................................................................................... 84 3.6.2. Khả năng bảo vệ ấu trùng tôm sú của các chủng Bacillus spp. chống lại Vibrio alginolyticus ...................................................................................... 85 3.6.3. Khả năng bảo vệ ấu trùng tôm sú của các chủng Bacillus spp. chống lại Vibrio harveyi............................................................................................... 86 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 88 4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................................. 89 4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 89 TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................. 91 PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 96 iii DANH M C CÁC BẢNG Bảng 2.1 Kết quả tái phân lập ........................................................................................ 43 Bảng 2.2 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc..................... 46 Bảng 2.3 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch lớp kép. ......................... 48 Bảng 2.4 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. parahaemolyticus (tính trên LOG10 CFU/mL) ................................................................................. 53 Bảng 2.5 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F10 với V. parahaemolyticus (tính trên LOG10 CFU/mL) ................................................................................. 54 Bảng 2.6 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V. parahaemolyticus (tính trên LOG10 CFU/mL) ................................................................................. 55 Bảng 2.7 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V. parahaemolyticus (tính trên LOG10 CFU/mL) ................................................................................. 57 Bảng 2.8 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V. parahaemolyticus (tính trên LOG10 CFU/mL) .................................................................................. 58 Bảng 2.9 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V. parahaemolyticus (tính trên LOG10 CFU/mL) ................................................................................. 59 Bảng 2.10 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. alginolyticus (tính trên LOG10 CFU/mL) ......................................................................................... 61 Bảng 2.11 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F10 với V. alginolyticus (tính trên LOG10 CFU/mL) .................................................................................. 62 Bảng 2.12 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V. alginolyticus (tính trên LOG10 CFU/mL) ................................................................................. 63 Bảng 2.13 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V. alginolyticus (tính trên LOG10 CFU/mL) ................................................................................. 64 Bảng 2.14 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V. alginolyticus (tính trên LOG10 CFU/mL) ................................................................................. 65 Bảng 2.15 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V. alginolyticus (tính trên LOG10 CFU/mL) ................................................................................. 66 Bảng 2.16 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. harveyi (tính trên LOG10 CFU/mL) ......................................................................................... 68 Bảng 2.17 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F10 với V. harveyi (tính trên LOG10 CFU/mL) ......................................................................................... 69 Bảng 2.18 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V. harveyi (tính trên LOG10 CFU/mL) ......................................................................................... 70 Bảng 2.19 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V. harveyi (tính trên LOG10 CFU/mL) ......................................................................................... 71 Bảng 2.20 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V. harveyi ........................... 72 iv Bảng 2.21 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V. harveyi (tính trên LOG10 CFU/mL) ......................................................................................... 73 Bảng 2.22 Kết quả khả năng gây dung huyết ................................................................ 76 Bảng 2.23 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung Bacillus spp. ................ 78 Bảng 2.24 Tỷ lệ sống (%) của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung Vibrio spp. ............ 79 Bảng 2.25 Tỷ lệ sống (%) của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ ở thí nghiệm ....................... 83 v DANH M C CÁC ĐỒ THỊ Biểu đồ 2.1 Thử khả năng đối kháng của các chủng Bacillus spp. đối với V. parahaemolyticus theo thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ ............................. 50 Biểu đồ 2.2 Thử khả năng đối kháng của các chủng Bacillus spp. đối với V. alginolyticus theo thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ ..................................... 50 Biểu đồ 2.3 Thử khả năng đối kháng của các chủng Bacillus spp. đối với V. harveyi theo thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ .......................................................... 51 Biểu đồ 2.4 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F2 ở những mật độ khác nhau .......................................................... 54 Biểu đồ 2.5 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F10 ở những mật độ khác nhau. ........................................................ 55 Biểu đồ 2.6 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F11 ở những mật độ khác nhau ......................................................... 56 Biểu đồ 2.7 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F27 ở những mật độ khác nhau ......................................................... 57 Biểu đồ 2.8 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F28 ở những mật độ khác nhau ......................................................... 58 Biểu đồ 2.9 Sự biến đổi mật độ của V. parahaemolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F33 ở những mật độ khác nhau. ........................................................ 60 Biểu đồ 2.10 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F2 ở những mật độ khác nhau ..................................................................... 62 Biểu đồ 2.11 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F10 ở những mật độ khác nhau. ................................................................... 63 Biểu đồ 2.12 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F11 ở những mật độ khác nhau .................................................................... 64 Biểu đồ 2.13 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F27 ở những mật độ khác nhau .................................................................... 65 Biểu đồ 2.14 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F28 ở những mật độ khác nhau .................................................................... 66 Biểu đồ 2.15 Sự biến đổi mật độ của V. alginolyticus khi đồng nuôi cấy với chủng F33 ở những mật độ khác nhau .................................................................... 67 Biểu đồ 2.16 Sự biến đổi mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F2 ở những mật độ khác nhau ............................................................................. 69 Biểu đồ 2.17 Sự biến đổi mật độ của V .harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F10 ở những mật độ khác nhau ............................................................................. 70 Biểu đồ 2.18 Sự biến đổi mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F11 ở những mật độ khác nhau ............................................................................. 71 Biểu đồ 2.19 Sự biến đổi mật độ của V.harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F27 ở những mật độ khác nhau ............................................................................. 72 vi Biểu đồ 2.20 Sự biến đổi mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F28 ở những mật độ khác nhau ............................................................................. 73 Biểu đồ 2.21 Sự biến đổi mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với chủng F33 ở những mật độ khác nhau ............................................................................. 74 Biểu đồ 2.22 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung Bacillus spp. ............ 78 Biểu đồ 2.23 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung V.parahaemolyticus .................................................................................... 80 Biểu đồ 2.24 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung V.alginolyticus ........ 81 Biểu đồ 2.25 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung V. harveyi ................ 82 Biểu đồ 2.26 Khả năng bảo vệ của các chủng Bacillus spp. chống lại V. parahaemolyticus ........................................................................................ 84 Biểu đồ 2.27 Khả năng bảo vệ ấu trùng tôm sú bởi các chủng Bacillus spp. chống lại V. alginolyticus ...................................................................................... 85 Biểu đồ 2.28 Khả năng bảo vệ của các chủng Bacillus spp. chống lại V. harveyi ........ 86 vii DANH M C CÁC H NH Hình 1.1. Bệnh phát sáng ở tôm [40] ............................................................................... 8 Hình 1.2. Sự tương tác của hệ vi sinh vật trong môi trường nuôi trồng thủy sản [34] .. 15 Hình 1.3. Mặt cắt ngang của bảo tử B. subtilis ............ Error! Bookmark not defined. Hình 2.1Quy trình thí nghiệm ........................................................................................ 33 Hình 2.2 Phương pháp cấy vạch thẳng vuông góc......................................................... 36 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đồng nuôi cấy ........................................................... 37 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghệm đánh giá tính an toàn của các chủng vi khuẩn thử nghiệm lên ấu trùng tôm sú ........................................................................ 38 Hình 2.5 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng và mật độ gây nhiễm thích hợp của các chủng Vibrio spp. lên ấu trùng tôm sú ................................................. 40 Hình 2.6 Sơ đồ thí nghiệm khả năng bảo vệ của các chủng Bacillus spp. lên ấu trùng tôm sú. ............................................................................................... 40 Hình 2.7 Thuần hóa tôm Hình 2.8 Toàn cảnh bố trí thí nghiệm .................... 41 Hình 2.9 Hộp bố trí thí nghiệm ...................................................................................... 41 Hình 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus spp. trên NA sau 24h nuôi cấy. ........................ 45 Hình 3.2 Nhuộm gram Bacillus spp. .............................................................................. 45 Hình 3.3 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc ................................. 47 Hình 3.4 Thử nghiệm khả năng đối kháng bằng phương pháp đổ thạch lớp kép .......... 52 Hình 3.5 Khuẩn lạc Vibrio spp. khi trãi trênTCBS ........................................................ 76 Hình 3.6 Kết quả thử khả năng gây dung huyết............................................................. 77 viii DANH M C CÁC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA One-way analysis of variance CFU Đơn vị khuẩn lạc Cs Cộng sự DC Đối chứng LB Luria Bertani NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth PL Postlarvae (hậu ấu trùng) TCBS Thiosulphate citrate bile salts sucrose ix BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc _______________ _________________ THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Thông tin chung: - Tên đề tài: nghiên cứu in vitro khả năng làm probiotic cho tôm sú của một số chủng Bacillus phân lập được từ trùn quế - Mã số: - Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Văn Minh - Đơn vị của chủ nhiệm đề tài: Khoa Công nghệ sinh học - Thời gian thực hiện: 7/2011-7/2012 2. Mục tiêu: đánh giá in vitro khả năng làm probiotic cho tôm sú của một số chủng Bacillus phân lập được từ trùn quế 3. Tính mới và sáng tạo: - Chưa có công trình khoa học nào đề cập đến tuyển chọn vi khuẩn tiềm năng probiotic từ trùn quế. Kết quả nghiên cứu trên sẽ góp phần cung cấp thêm cơ sở khoa học cho vai trò và tác dụng của trùn quế trong nuôi trồng thuỷ sản. - Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu này có tính mới, chưa được tác nào trong nước sử dụng để nghiên cứu và công bố. 4. Kết quả nghiên cứu: thu được 03 chủng Bacillus (F11, F10 và F2) có khả năng kiểm soát đồng thời 3 chủng Vibrio gây bệnh và an toàn đối với ấu trùng tôm sú. 5. Sản phẩm: - Sản phẩm khoa học: + 03 chủng Bacillus (F11, F10 và F2) có khả năng kiểm soát đồng thời 3 chủng Vibrio gây bệnh và an toàn đối với ấu trùng tôm sú. x + 01 bài báo cáo oral “khả năng kiểm soát Vibrio gây bệnh của một số chủng Bacillu phân lập từ trùn quế” tại Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc Khu vực phía Nam lần thứ II năm 2011 và bài này cũng đã đăng trên tạp chí khoa học Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. + 01 bài báo khoa học “nghiên cứu tính an toàn và khả năng bảo vệ ấu trùng tôm sú của một số chủng Bacillus phân lập từ trùn quế trong điều kiện phòng thí nghiệm” sẽ đăng trên tạp chí Khoa học Trường ĐH Mở TPHCM (đã phản biện, nhận bài và chờ xuất bản). - Sản phẩm đào tạo: + Hỗ trợ đào tạo 03 cử nhân Công nghệ sinh học chuyên ngành vi sinh + Sản phẩm khác: một số hình ảnh và kết quả nghiên cứu được dùng trong bài giảng lý thuyết môn vi sinh ứng dụng (chương ứng dụng vi sinh vật trong nuôi trồng thuỷ sản). 6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng: - Tiếp tục nghiên cứu thêm 1 vài nội dung để hoàn thiện sản phẩm. - Viết một số bài báo đăng trên tạp chí về nông nghiệp, thủy sản nhằm thông tin các kết quả nghiên cứu. - Chuyển giao kết quả nghiên cứu cho các đơn vị sản xuất chế phẩm phục vụ nuôi trồng thuỷ sản. Cơ quan chủ trì xác nhận Ngày 03 tháng 08 năm 2012 KT. HIỆU TRƯỞNG Chủ nhiệm đề tài PHÓ HIỆU TRƯỞNG (Ký, Họ và tên) Nguyễn Văn Minh xi INFORMATION ON RESEARCH RESULTS 1. General information: - Project title: In vitro evaluation of probiotic potential for shrimp aquaculture of Bacillus spp. isolated from Perionyx excavatus - Code number: - Coordinator: Nguyen Van Minh, M.Sc - Implementing institution: Faculty of Biotechnology – Ho Chi Minh City Open University - Duration: from July 2011 to July 2012 2. Objective(s): In vitro evaluation of probiotic potential for shrimp aquaculture of Bacillus spp. isolated from Perionyx excavatus 3. Creativeness and innovativeness: - No scientific research referring to the selection of potential probiotic bacteria from Perionyx excavates. This research results will contribute to provide further scientific basis for the role and effects of Perionyx excavates in aquaculture. - The methods used in this study are new and have not used, researched and published by any domestic work. 4. Research results: Bacillus strains (F10, F11 and F2) have been recognized to be safe for black tiger shrimp larvae and have protected them against three pathogenic Vibrios. 5. Products: - Scientific products: + The three Bacillus strains (F10, F11 and F2) have been recognized to be safe for black tiger shrimp larvae and have protected them against three pathogenic Vibrios. xii + One (01) oral report regarding to “Control of pathogenic Vibrio spp. by Bacillus spp. isolated from Perionyx excavatus” has been presented at the 2nd National Biotechnology Conference in Southern of Vietnam in 2011 and published in Journal of Agricultural and Rural Development. + One (01) article “In vitro evaluation of safety and protection capability of some Bacillus strains isolated from Perionyx excavatus on black tiger shrimp larvae” that will be published in Journal of science of Ho Chi Minh City Open University. (accepted). - Training products: + Trained three (03) Bachelors of Biotechnology (major in microbiology). + Other products: some images and research results are used in teaching microbiological applications’ theory (Chapter - application of microorganisms in aquaculture). 6. Effects, transfer alternatives of reserach results and applicability:  Continuing further research to improve our products.  Results of this study will be communicated and published in the Journal of Agriculture or Aquaculture.  Transfer the research results to organizations for producing bio-products served in aquaculture. xiii ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Thủy sản là một trong những ngành mang lại lợi nhuận cao cho nền kinh tế quốc dân và thu hút nhiều lao động. Trong khoảng 10 năm gần đây, ngành thủy sản nói chung và nuôi trồng thủy sản nói riêng đã và đang phát triển mạnh mẽ. Bên cạnh những thành tựu và sự phát triển của ngành thì vấn đề nuôi tôm ở Việt Nam còn nhiều vấn đề tồn đọng mà quan trọng nhất là dịch bệnh đã gây nhiều tổn thất cho người nuôi tôm nói riêng và ngành thủy sản nói chung. Tình trạng ô nhiễm môi trường đang xảy ra nghiêm trọng trong nuôi trồng thủy sản do phần lớn các chất hữu cơ dư thừa từ thức ăn, phân và các rác thải khác đọng lại dưới đáy ao nuôi. Có rất nhiều nghuyên nhân dẫn đến bệnh tôm, đáng quan tâm là nhóm vi khuẩn Vibrio spp., thường xuyên hiện diện và gây hại nghiêm trọng trên tôm sú, trong nhóm này có V. harveyi và V. parahaemolyticus là các lòai vi khuẩn có độc lực cao, gây bệnh phát sáng trên ấu trùng tôm sú. Các lòai Vibrio spp. khác như: V. vulnificus, V. alginolyticus, V. splendidus, được xem là nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên tôm sú thương phẩm. Khi Vibrio spp. xuất hiện trong nước với mật độ cao, có thể gây chết hàng loạt ấu trùng và tôm sú, đôi khi tỷ lệ chết lên đến 100 %. [3, 7] Mặc dù phải đương đầu với những bất lợi nhưng tôm nói riêng và sản phẩm thủy sản nói chung vẫn là mặt hàng xuất khẩu mũi nhọn đem lại nhiều lợi ích kinh tế. Vấn đề đặt ra hiện nay là tìm ra những giải pháp hạn chế tối đa các tác nhân gây bệnh cũng như nỗ lực thực hiện các kỹ thuật nuôi hợp lý và hiệu quả mà vẫn đảm bảo được sự phát triển bền vững. Ngày nay, sử dụng chế phẩm sinh học được xem như là giải pháp thay thế kháng sinh, được coi là một công cụ hữu hiệu để giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trong ao nuôi, khống chế dịch bệnh, tăng sức đề kháng và đã tạo nền tảng vững chắc cho phần lớn hoạt động nuôi trồng thủy sản trên thế giới. Khác với biện pháp hóa học và kháng sinh, chế phẩm sinh học cung cấp một phương thức an toàn, bền vững đối với người nuôi và tiêu dùng. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về việc sử dụng các men vi sinh để cải thiện môi trường nuôi thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng còn tương đối ít. Trong những năm gần đây Bộ Thủy sản đã cho phép 2 lưu hành sử dụng nhiều chế phẩm vi sinh và nhiều nơi đã làm quen với việc sử dụng các chế phẩm vi sinh này và có kết quả khá tốt. Mô hình nuôi tôm sú bằng chế phẩm vi sinh ES-01 và BS-01 của Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh học phục vụ nuôi trồng thủy sản Sóc Trăng góp phần đưa năng suất tôm nuôi nhiều trang trại đạt tới 12 tấn/ha/vụ. Nhiều hộ nuôi tôm có xử lý chế phẩm vi sinh cho thấy môi trường nước luôn ổn định, tôm phát triển nhanh khắc phục được nhiều khó khăn về thời tiết, môi trường, chi phí đầu tư, dịch bệnh, tăng năng suất.[39]. Ở Cà Mau, việc áp dụng mô hình nuôi tôm bằng chế phẩm EM.ZEO bước đầu mang lại hiệu quả khả quan, giữ cho môi trường của ao luôn sạch, tôm khoẻ mạnh mà hoàn toàn không sử dụng các loại hoá chất độc hại, kháng sinh. Trong suốt quá trình nuôi, tôm phát triển tốt và không bị nhiễm bệnh.[45] Có rất nhiều hệ vi sinh vật đã được dùng trong sản xuất chế phẩm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản. Nhưng Bacillus spp. vẫn được xem là đối tượng quan trọng vì đã có nhiều tài liệu cho rằng chế phẩm có sử dụng Bacillus spp. giúp thủy sản sinh trưởng nhanh, tăng sức đề kháng, chống lại một số loài gây bệnh - được báo cáo nhiều nhất là khả năng đối kháng với Vibrio spp. và khả năng tạo bào tử của nó. Theo báo cáo của nhóm tác giả Nguyễn Văn Minh và cs (2010) thì một số chủng Bacillus spp. phân lập được từ trùn quế và phân trùn quế có khả năng chịu muối mật, pH acid dạ dày và khả năng đối kháng tốt đối với một số vi khuẩn gây bệnh cho động vật thủy sản [4]. Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu in vitro khả năng làm probiotic cho tôm sú của một số chủng Bacillus phân lập được từ trùn quế” Trong nghiên cứu này, các chủng Bacillus spp. đã được phân lập từ trùn quế tiếp tục được nghiên cứu khả năng đối kháng với một số vi khuẩn Vibrio spp. gây bệnh và đánh giá tính an toàn đối với ấu trùng tôm sú trong điều kiện phòng thí nghiệm. Thành công của đề tài sẽ cung cấp thêm cơ sở khoa học cho việc phát triển thành chế phẩm vi sinh trong việc phòng và trị bệnh do vi khuẩn, đặc biệt do nhóm Vibrio spp. gây ra trong các trại sản xuất tôm giống hay tôm nuôi công nghiệp. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. BỆNH DO VI KHUẨN VIBRIO TRÊN TÔM [1,8,46] Vibriosis được dùng để chỉ tất cả các dạng nhiễm khuẩn do vi khuẩn thuộc giống Vibrio gây ra và gây bệnh phổ biến nhất đối với tôm. Vibrio sp. tìm thấy phổ biến ở trong nước biển và ven bờ, trong nước bể ương tảo, bể ương Artemia, trong bể ương ấu trùng. Hầu hết các loài Vibrio đều cần có muối để phát triển. Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả các loài Vibrio và nhiều loài là nhu cầu tuyệt đối, chúng không phát triển trong môi trường không muối. Một số loài là tác nhân gây bệnh cho người và động vật biển. Sự hiện diện của Vibrio sp. trong ao nuôi như là quần thể vi khuẩn tự nhiên, hầu hết các Vibrio sp. là tác nhân gây bệnh cơ hội, khi tôm bị sốc do môi trường biến đổi xấu hoặc bị nhiễm các bệnh khác như virus, nấm, ký sinh trùng. Tôm yếu không có sức đề kháng, các loài vi khuẩn Vibrio sp. có cơ hội gây bệnh nặng, tôm sẽ chết từ rải rác tới hàng loạt. Tuy nhiên, một số loài như V.harveyi lại là tác nhân gây bệnh chính, đây là loài vi khuẩn gây bệnh phát sáng, chúng có thể gây chết hàng loạt ở các bể ấp trứng tôm ở Châu Á. Khó có thể chỉ định loài nào của nhóm Vibrio gây bệnh nhiều hay ít vì khả năng gây bệnh rất khác nhau giữa các loài. Trong hầu hết các trường hợp, tôm thường bị hại ở một mức độ nào đó trước khi bị nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, có những chủng vi khuẩn Vibrio gây bệnh khi chỉ cần những bất lợi ở mức thấp của điều kiện môi trường. Những chủng khác chỉ gây bệnh khi tôm đã bị tổn thương nghiêm trọng. Có nhiều dạng nhiễm bệnh Vibrio: - Dạng cấp tính cục bộ hay toàn bộ. - Dạng mãng tính cục bộ hay toàn bộ. Một số dạng bệnh bộc phát được gọi bằng những tên riêng, chẳng hạn như “hội chứng tôm chết sau một tháng tuổi” thường được xem là bệnh do Vibrio spp, và các dạng nhiễm khuẩn khác có liên quan đến sự suy thoái môi trường ao nuôi. Nếu để tảo đáy phát triển ở ao trong thời kỳ đầu của chu kỳ nuôi thì chúng có thể bị phân hủy sau đó. Lúc này, tôm có khuynh hướng tiếp xúc với lớp vật chất đang 5