Tài liệu Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số hợp chất từ nấm biển phân lập tại miền trung việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- PHAN THỊ HOÀI TRINH NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ VI NẤM BIỂN PHÂN LẬP TẠI MIỀN TRUNG VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- PHAN THỊ HOÀI TRINH NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ VI NẤM BIỂN PHÂN LẬP TẠI MIỀN TRUNG VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Phí Quyết Tiến 2. PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân Hà Nội – 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với một số cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành và được sự đồng ý sử dụng số liệu của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Nghiên cứu sinh Phan Thị Hoài Trinh ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và trân trọng nhất của mình đến PGS.TS. Phí Quyết Tiến, Viện Công nghệ sinh học và PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang – những người Thầy đã luôn tận tình giúp đỡ, hướng dẫn khoa học và định hướng nghiên cứu trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn cố PGS.TS. Bùi Minh Lý, người đã truyền niềm đam mê nghiên cứu khoa học, luôn quan tâm và tạo động lực cho tôi từ những ngày đầu thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các Thầy, Cô ở Viện Công nghệ sinh học đã giảng dạy, cung cấp các kiến thức mới để tôi hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương trình đào tạo. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành các nội dung trong chương trình đào tạo. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào tạo ở Viện Công nghệ sinh học và Chuyên viên Nguyễn Thị Minh Tâm ở Học viện Khoa học và Công nghệ đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành các hồ sơ trong quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện NC&UDCN Nha Trang cùng các đồng nghiệp đã luôn ủng hộ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi tập trung nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Hợp phần nhánh số 3 thuộc Dự án điều tra cơ bản và Dự án hợp tác nghiên cứu khoa học giữa Viện NC&UDCN Nha Trang và Viện KH&CN Hải dương Hàn Quốc đã hỗ trợ kinh phí thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, hỗ trợ và động viên trong suốt thời gian qua để tôi có thể hoàn thành tốt nhiệm vụ học tập và công tác chuyên môn. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Nghiên cứu sinh Phan Thị Hoài Trinh iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan.................................................................................................................................................i Lời cảm ơn....................................................................................................................................................ii Mục lục..........................................................................................................................................................iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt.........................................................................................vii Danh mục các bảng...................................................................................................................................x Danh mục các hình...................................................................................................................................xi MỞ ĐẦU.......................................................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN..............................................................................................................4 1.1. Giới thiệu chung về hoạt tính sinh học từ vi nấm biển......................................4 1.1.1. Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học từ vi nấm biển...........4 1.1.1.1. Chất kháng sinh.........................................................................................................................4 1.1.1.2. Chất gây độc tế bào ung thư................................................................................................8 1.1.1.3. Chất chống oxy hóa...............................................................................................................10 1.1.1.4. Chất bảo vệ tế bào thần kinh.............................................................................................11 1.1.1.5. Một số chất có hoạt tính sinh học khác........................................................................12 1.1.2. Đa dạng sinh học vi nấm biển...........................................................................................12 1.1.3. Một số đặc tính sinh học của vi nấm biển....................................................................14 1.1.4. Nghiên cứu sàng lọc vi nấm biển sinh tổng hợp hoạt chất sinh học................16 1.2. Môi trường lên men và ảnh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm biển...................................................17 1.2.1. Đặc điểm của quá trình lên men sinh chất kháng sinh...........................................17 1.2.2. Môi trường lên men vi nấm sinh kháng sinh..............................................................19 1.2.2.1. Lên men rắn...............................................................................................................................19 1.2.2.2. Lên men chìm............................................................................................................................20 1.2.3. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm biển...............................................................................................................22 1.2.3.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men...................................................................................22 1.2.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối...........................................................................................24 iv 1.2.3.3. Ảnh hưởng của pH.................................................................................................................26 1.2.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ.......................................................................................................27 1.2.3.5. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ...........................................................................28 1.3. Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hóa học chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển.......................................................................................................29 1.3.1. Phân lập chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển....................................................29 1.3.2. Xác định cấu trúc hóa học chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển................31 1.4. Xu hướng nghiên cứu các hoạt chất sinh học từ vi nấm biển trên thế giới và ở Việt Nam................................................................................................................32 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................37 2.1. Vật liệu và môi trường nghiên cứu.............................................................................37 2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................................39 2.2.1. Phân lập vi nấm biển..............................................................................................................39 2.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng VSV kiểm định của các chủng vi nấm biển..........39 2.2.3. Phân tích cặn chiết của các chủng vi nấm có hoạt tính kháng sinh cao.........39 2.2.4. Xác định đặc điểm hình thái và phân loại vi nấm biển..........................................40 2.2.5. Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm biển..............................................................................................................42 2.2.6. Phân tách các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển.................................42 2.2.6.1. Phân tách các hợp chất từ chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.1.5..............43 2.2.6.2. Phân tách các hợp chất từ chủng vi nấm Aspergillus sp. 01NT.1.12.3.........43 2.2.6.3. Phân tách các hợp chất từ chủng vi nấm P. chrysogenum 045-357-2...........44 2.2.7. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển .. 44 2.2.8. Xác định hoạt tính sinh học của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển......................................................................................................................................45 2.2.8.1. Xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định.....................................................................45 2.2.8.2. Xác định hoạt tính gây độc tế bào...................................................................................45 2.2.8.3. Xác định hoạt tính chống oxy hóa...................................................................................46 2.2.8.4. Xác định hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh................................................................47 2.2.9. Xử lý số liệu nghiên cứu......................................................................................................47 2.2.10. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát trong luận án..................................................................48 v CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU................................................................................49 3.1. Phân lập và sàng lọc hoạt tính kháng VSV kiểm định của vi nấm biển .. 49 3.1.1. Số lượng chủng vi nấm biển thu nhận theo địa điểm và nguồn phân lập..........49 3.1.2. Đặc điểm hình thái của vi nấm biển...................................................................................50 3.1.3. Hoạt tính kháng VSV kiểm định của vi nấm biển.......................................................58 3.2. Phân tích cặn chiết thô và xác định đặc điểm phân loại của 08 chủng vi nấm biển tuyển chọn........................................................................................................62 3.2.1. Phân tích cặn chiết thô của 08 chủng vi nấm biển tuyển chọn..............................62 3.2.2. Xác định đặc điểm hình thái và phân loại 08 chủng vi nấm biển tuyển chọn. 64 3.3. Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của 03 chủng vi nấm biển tuyển chọn...............................................................71 3.3.1. Khảo sát thời gian lên men.....................................................................................................71 3.3.2. Khảo sát nồng độ muối biển..................................................................................................73 3.3.3. Khảo sát pH ban đầu.................................................................................................................76 3.4. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ chủng vi nấm biển tuyển chọn..........................................................................78 3.4.1. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất từ chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.1.5.....................................................................................................78 3.4.2. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất từ chủng vi nấm Aspergillus sp. 01NT.1.12.3.................................................................................................89 3.4.3. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất từ chủng vi nấm P. chrysogenum 045-357-2...................................................................................................94 3.5. Xác định hoạt tính sinh học của 14 hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ 03 chủng vi nấm biển tuyển chọn.........................................................................................97 3.5.1. Xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định......................................................................97 3.5.2. Xác định hoạt tính gây độc tế bào....................................................................................100 3.5.3. Xác định hoạt tính chống oxy hóa....................................................................................100 3.5.4. Xác định hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh..................................................................102 CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ................................................................................103 4.1. Hình thái và hoạt tính kháng VSV kiểm định của vi nấm biển miền Trung Việt Nam....................................................................................................................103 vi 4.2. Đặc tính của các chủng vi nấm biển có tiềm năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học.............................................................................................................................105 4.3. Điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm biển................................................................................................................................107 4.4. Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ 03 chủng vi nấm biển tuyển chọn . 110 4.5. Hoạt tính sinh học của 14 hợp chất thu nhận từ 03 chủng vi nấm biển tuyển chọn.................................................................................................................................115 4.5.1. Hoạt tính kháng VSV kiểm định..................................................................................115 4.5.2. Hoạt tính gây độc tế bào, chống oxy hóa và bảo vệ tế bào thần kinh......116 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................................................119 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ.......................................................................121 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................................123 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC........................................................................................................150 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ACHN A-549 ADN ATCC BGCs BGC-823 CFU CC CLSI COSY Tiếng Anh Tiếng Việt Renal carcinoma cells Adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells Acid Deoxyribonucleic American Type Culture Collection Biosynthetic gene clusters Gastric adenocarcinoma cell line Colony Forming Units Chromatography column The Clinical & Laboratory Standards Institute Correlation spectroscopy Tế bào ung thư biểu mô thận Tế bào ung thư phổi Axit deoxyribonucleic Bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ Nhóm gen sinh tổng hợp Tế bào ung thư dạ dày Đơn vị hình thành khuẩn lạc Sắc ký cột thường Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét ngiệm Phổ tương tác hai chiều đồng hạt nhân DPPH DU-145 ESI-MS 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Prostatic carcinoma cell line Electron spray ionzation mass spectroscopy 13 13 C-Nuclear magnetic resonance spectroscopy Influenza A virus subtype H1N1 Influenza A virus subtype H3N2 HeLa cell line Human colon cancer cell line Human colon cancer cell line Human leukemic cell line Heteronuclear multiple bond correlation Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 Virus cúm A H1N1 Virus cúm A H3N2 Tế bào ung thư cổ tử cung Tế bào ung thư đại tràng Tế bào ung thư đại tràng Tế bào ung thư bạch cầu Phổ tương tác đa liên kết hai chiều dị nhân 1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Sắc ký lỏng cao áp C -NMR H1N1 H3N2 HeLa HCT-15 HCT-116 HL-60 HMBC 1 H-NMR HPLC HSQC H- Nuclear magnetic resonance spectroscopy High performance liquid chromatography Heteronuclear single quantum coherence Tế bào ung thư tuyến tiền liệt Phổ khối lượng phun mù điện tử Phổ tương tác hai chiều dị hạt nhân viii Chữ viết tắt HT-29 Tiếng Anh Colorectal adenocarcinoma cell line IR Infrared spectroscopy ITS Internal transcribed spacer K-562 Human leukemic cell line LF Liquid fermentation M-CSF Macrophage colony stimulating factor MCF-7 Human breast carcinoma cell line MDA-MB- Human breast carcinoma cell line 231 MHB Mueller Hinton Broth MIC Minimum inhibitory concentration MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus MS Mass spectroscopy NCI-H23 Human lung cancer cell line NCI-H460 Human lung cancer cell line Neuro2a Neural cell line NOESY Nuclear overhauser effect spectroscopy NMR Nuclear magnetic resonance NUGC-3 Gastric adenocarcinoma cell line OSMAC One-Strain-Many-Compounds PC-3 Prostatic carcinoma cell line RAW264.7 Leukemia cell line rDNA Ribosomal DNA RI detector Refractive Index detector ROESY Rotating frame nuclear overhauser effect spectroscopy ROS Reactive oxygen species RYE Rice yeast extract medium SmF Submerged fermentation Tiếng Việt Tế bào ung thư đại trực tràng Phổ hấp phụ hồng ngoại Vùng được phiên mã nội bộ Tế bào ung thư bạch cầu Lên men lỏng Nhân tố kích thích đại thực bào Tế bào ung thư vú Tế bào ung thư biểu mô tuyến vú Môi trường canh Mueller Hinton Nồng độ ức chế tối thiểu Staphylococcus aureus kháng methicillin Phổ khối Tế bào ung thư biểu mô phổi Tế bào ung thư phổi Tế bào thần kinh Phổ NOESY Cộng hưởng từ hạt nhân Tế bào ung thư biểu mô dạ dày Một chủng – Nhiều hợp chất Tế bào ung thư tuyến tiền liệt Tế bào ung thư bạch cầu ADN ribosom Đầu dò khúc xạ Phổ ROESY Gốc oxy tự do Môi trường gạo và dịch chiết nấm men Lên men chìm ix Chữ viết tắt SSF Tiếng Anh Tiếng Việt Solid state fermentation Lên men rắn 6-hydroxydopamine Độ dịch chuyển hóa học của proton và carbon Chất gây độc tế bào thần kinh δH, δC 6-OHDA x DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các hợp chất mới có hoạt tính kháng sinh từ vi nấm biển................................5 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của một số chủng vi nấm biển điển hình........................54 Bảng 3.2. Hoạt tính kháng VSV kiểm định của một số chủng vi nấm đại diện..........58 Bảng 3.3. Số liệu thống kê hoạt tính kháng VSV kiểm định của 273 chủng vi nấm biển 60 Bảng 3.4. Đặc điểm hình thái của 08 chủng vi nấm biển tuyển chọn............................64 Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái của 08 chủng vi nấm biển tuyển chọn được quan sát dưới kính hiển vi66 Bảng 3.6. Phân loại 08 chủng vi nấm biển dựa trên phân tích trình tự gen vùng ITS/28S rDNA 69 Bảng 3.7. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất 1-14.......................98 Bảng 3.8. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất 1-14..................................99 Bảng 3.9. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hợp chất asterriquinone C1 (8)....100 Bảng 3.10. Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất 1-14.............................................101 xi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất cephalosporin C và gliotoxin.........................4 Hình 1.2. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng tạo sinh khối và sinh tổng hợp chất penicilazaphilone C (PAC) của chủng vi nấm biển Penicillium sclerotiorum M – 22 23 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất pestalone................................................................34 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát trong luận án...............................................................48 Hình 3.1. Số lượng các chủng vi nấm biển được phân lập từ Ninh Thuận, Nha Trang và Đà Nẵng 49 Hình 3.2. Thống kê hình dạng khuẩn lạc của 273 chủng vi nấm biển.............................50 Hình 3.3. Thống kê đặc điểm bề mặt khuẩn lạc của 273 chủng vi nấm biển...............51 Hình 3.4. Thống kê đặc điểm độ dày khuẩn lạc của 273 chủng vi nấm biển...............52 Hình 3.5. Thống kê đặc điểm viền khuẩn lạc của 273 chủng vi nấm biển....................52 Hình 3.6. Thống kê màu sắc bề mặt khuẩn lạc của 273 chủng vi nấm biển.................53 Hình 3.7. Hoạt tính kháng VSV kiểm định của một số chủng vi nấm biển đại diện 61 Hình 3.8. Hoạt tính kháng VSV kiểm định của 08 chủng vi nấm biển tuyển chọn 61 Hình 3.9. Phân tích cặn chiết thô của 08 chủng vi nấm tuyển chọn trên TLC...........62 1 Hình 3.10. Phổ H-NMR của cặn chiết thô từ 5 chủng vi nấm 01NT.1.1.5, 01NT.1.12.3, 045-357-2, 168ST.16.1 và 01NT.1.5.4 63 Hình 3.11. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt tính kháng VSV kiểm định và hàm lượng cặn chiết thô từ chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.1.5 (A), Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 (B), và P. chrysogenum 045-357-2 (C) 73 Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ muối biển đến hoạt tính kháng VSV kiểm định xii và hàm lượng cặn chiết thô từ chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.1.5 (A), Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 (B), và P. chrysogenum 045-357-2 (C) 75 Hình 3.13. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt tính kháng VSV kiểm định và hàm lượng cặn chiết thô từ chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.1.5 (A), Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 (B), và P. chrysogenum 045-357-2 (C) 78 Hình 3.14. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.1.5 79 Hình 3.15. Cấu trúc hóa học của hợp chất phomaligol A2 (1).........................................81 Hình 3.16. Một số tương tác trên phổ COSY và HMBC của hợp chất phomaligol A2 (1) 81 Hình 3.17. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất wasabidienone E (2)82 Hình 3.18. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất aspertetranone D (3)83 Hình 3.19. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất mactanamide (4) 84 Hình 3.20. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất cycloechinulin (5) 85 Hình 3.21. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất asteltoxin (6) 86 Hình 3.22. Cấu trúc hóa học của hợp chất ochraceopone F (7)..........................................87 Hình 3.23. Một số tương tác trên phổ COSY, HMBC và ROESY của hợp chất ochraceopone F (7) 88 Hình 3.24. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất asterriquinone C1 (8) 89 Hình 3.25. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ chủng vi nấm Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 90 xiii Hình 3.26. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất dihydroaspirone (9) ............................................................................... 91 Hình 3.27. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất aspilactonol F (10) ................................................................................. 91 Hình 3.28. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất 6β,7α,14-trihydroxyconfertifoline (11) ................................................. 92 Hình 3.29. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất 6β,9α,14-trihydroxycinnamolide (12) ................................................... 93 Hình 3.30. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ chủng vi nấm P. chrysogenum 045357-2 ...................................................................................................... 94 Hình 3.31. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất andrastin A (13) ..................................................................................... 96 Hình 3.32. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất citreohybridonol (14) ............................................................................. 96 Hình 3.33. Hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh Neuro2a của hợp chất mactanamide ở nồng độ 1 µM và 10 µM .................................................................. 102 1 MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với công cuộc phát triển kinh tế xã hội thì việc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng luôn là mối quan tâm đặc biệt của mọi quốc gia trên thế giới. Mặc dù nền y học của con người đã đạt đến trình độ tiến bộ nhất định nhưng các bệnh truyền nhiễm và bệnh nan y vẫn đang diễn biến khá phức tạp và là mối đe doạ lớn đối với sức khoẻ cộng đồng. Tình trạng dịch bệnh xảy ra phổ biến ở các nước đang phát triển do sự thiếu thuốc và sự xuất hiện lan rộng của các chủng vi sinh vật gây bệnh kháng kháng sinh [1]. Vì vậy, việc nghiên cứu phát hiện các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học, đặc biệt là các hợp chất có nguồn gốc từ vi sinh vật biển đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trong nước và trên thế giới [2]. Các nhà khoa học đã chứng minh vi sinh vật biển có vai trò rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất và phát triển của các sinh vật trong đại dương. Chính sự đa dạng của hệ sinh thái biển cùng sự khắc nghiệt của môi trường sống đã tạo nên các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ vi sinh vật biển đa dạng về cấu trúc cũng như các hoạt tính sinh học [3]. Do đó, trong những năm gần đây, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã tập trung nghiên cứu và thu nhận các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật biển với mục đích phát triển chúng thành các nguồn dược liệu mới. Một số lượng lớn các công trình nghiên cứu cũng đã công nhận vi nấm biển là nguồn tiềm năng cung cấp các hợp chất với cấu trúc mới và hoạt tính sinh học có giá trị trong y học bao gồm hoạt tính kháng sinh, kháng viêm, kháng ung thư và chống oxy hoá [4]. Cụ thể, giữa năm 2000 và 2005, khoảng 100 hợp chất từ vi nấm biển được mô tả [5], đến giữa năm 2006 và 2010, có tổng số 690 hợp chất tự nhiên phân lập từ vi nấm biển được công bố [6]. Những hợp chất mới này được tạo ra chủ yếu từ các loài nấm thuộc chi Penicillium, Aspergillus và một số loài nấm thuộc các chi ít phổ biến hơn như Acremonium, Emericella, Epicoccum, Exophiala, Paraphaeospaeria, Phomosis và Halarosellinia [7]. Hệ sinh thái biển ở vùng nhiệt đới được các nhà khoa học đánh giá là rất đa dạng, đặc biệt là hệ sinh thái rạn san hô ở vùng ven biển. Trong đó, Việt Nam được biết đến là một quốc gia có chiều dài bờ biển hơn 3.200 km và sở hữu một nguồn tài 2 nguyên sinh vật phong phú và đa dạng. Đây chính là cơ sở cho các nghiên cứu điều tra về đa dạng sinh học cũng như tiềm năng các hoạt chất sinh học từ nguồn vi nấm biển. Với mục tiêu tìm kiếm các chủng vi nấm biển có khả năng sinh các chất chuyển hoá thứ cấp có hoạt tính sinh học nhằm phát hiện nguồn dược liệu mới đóng góp một phần vào việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số hợp chất từ vi nấm biển phân lập tại miền Trung Việt Nam”. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài: Mục tiêu nghiên cứu: Thu nhận các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm biển phân lập ở vùng biển miền Trung và xác định một số hoạt tính sinh học (kháng sinh, gây độc tế bào, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào thần kinh) của các hợp chất sạch thu được. Nội dung nghiên cứu: 1. Phân lập, đánh giá hoạt tính kháng sinh và tuyển chọn các chủng vi nấm biển cho nghiên cứu tiếp theo. 2. Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thô của chủng vi nấm biển tuyển chọn. 3. Phân tách, tinh sạch và xác định cấu trúc của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ cặn chiết lên men chủng vi nấm tuyển chọn. 4. Xác định hoạt tính sinh học của các hợp chất chuyển hóa thứ cấp tinh sạch được thu nhận trong nghiên cứu. Những đóng góp mới của luận án: - Luận án là nghiên cứu mới có hệ thống về phân lập và đánh giá hoạt tính kháng sinh của các chủng vi nấm phân lập từ vùng biển miền Trung Việt Nam. - Tinh sạch và đánh giá được hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào ung thư, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào thần kinh của 14 hợp chất chuyển hóa thứ cấp thu nhận được từ 3 chủng vi nấm biển Aspergillus flocculosus 01NT.1.1.5, Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 và Penicillium chrysogenum 045-357-2, gồm: phomaligol A2 (1), wasabidienone E (2), aspertetranone D (3), mactanamide (4), cycloechinulin (5), 3 asteltoxin (6), ochraceopone F (7), asterriquinone C1 (8), dihydroaspyrone (9) và aspilactonol F (10), 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (11), 6β,9α,14- trihydroxycinnamolide (12), andrastin A (13) và citreohybridonol (14). - Xác định được 4 hợp chất mới gồm phomaligol A2 (1), ochraceopone F (7), 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (11), và 6β,9α,14-trihydroxycinnamolide (12). 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về hoạt tính sinh học từ vi nấm biển 1.1.1. Các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học từ vi nấm biển 1.1.1.1. Chất kháng sinh Vào thập niên 50 của thế kỷ trước, nhóm nghiên cứu của Abraham đã phát hiện được hợp chất cephalosporin C có hoạt tính kháng sinh cao từ loài vi nấm Cephalosporium spp. (ngày nay là Acremonium spp.) có nguồn gốc từ vùng biển Sardinia, Ý (Hình 1.1) [8, 9]. Hợp chất này chính là đại diện cho kháng sinh tự nhiên thuộc nhóm β-lactam lần đầu tiên được phân lập từ vi nấm biển. Khám phá này đã nhanh chóng giúp cho các nhà khoa học mở ra định hướng nghiên cứu mới về các chất kháng sinh có nguồn gốc từ môi trường biển, đặc biệt là từ vi nấm biển. Đến cuối những năm 1970, hợp chất gliotoxin mới được phát hiện từ chủng vi nấm Aspergillus sp. MO-10 phân lập ở vùng biển Seto (Hình 1.1). Đây là một loại kháng sinh diketopiperazine lần đầu tiên thu được từ một loại vi nấm có nguồn gốc từ trầm tích biển sâu [10]. Từ đó, một số lượng lớn các sản phẩm tự nhiên mới từ vi nấm biển đã được phân lập và mô tả, chủ yếu là từ các chi Penicillium, Aspergillus, Fusarium và Cladosporium [11]. Phần lớn các chất kháng sinh (khoảng 50%) thuộc nhóm polypeptide, tiếp theo là các nhóm alkaloid, terpene và peptide chiếm 14 – 20% [12]. Cephalosporin C Gliotoxin Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của chất kháng sinh cephalosporin C [8] và gliotoxin [10] Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi nấm biển đóng một vai trò quan trọng trong việc tạo ra các kháng sinh mới chống lại các vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là các vi khuẩn kháng kháng sinh đang bùng phát hiện nay [13]. Chính quá trình thích nghi với điều kiện sống khắc nghiệt của môi trường biển như độ mặn cao, dinh dưỡng thấp, 5 áp suất cao, biến đổi nhiệt độ đồng thời cạnh tranh với vi khuẩn, virus và các loại nấm khác đã tạo điều kiện để các vi sinh vật biển sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học mới, ưu việt so với vi sinh vật trên cạn [14]. Các công bố cũng cho thấy có từ 38% đến 59% các hợp chất chiết xuất từ vi nấm biển thể hiện hoạt tính kháng sinh [15, 16]. Các hợp chất tự nhiên từ vi nấm biển rất đa dạng về lớp cấu trúc và kết hợp với một loạt các nhóm thế dẫn đến hoạt tính sinh học vô cùng phong phú. Dưới đây là một số hợp chất kháng sinh mới từ các chủng vi nấm biển được công bố từ năm 2011 đến nay (Bảng 1.1). Bảng 1.1. Các chất kháng sinh mới được phân lập từ vi nấm biển Hợp chất Chủng vi nấm kháng sinh mới biển Các hợp chất indol-alkaloid β-aflatrem Aspergillus flavus OUCMDZ-2205 Cristatumin A và D Eurotium cristatum EN-220 Neoechinulin A Aspergillus sp. Diaporthalasin Diaporthaceae sp. PSU-SP2/4 Stachyin B Stachybotrys sp. MF347 Các hợp chất pyridine và pyridinone Trichodin A Trichoderma sp. MF106 5,6-dihydro-3-hydroxy5-methylcyclopenta pyridin-7-one Curvulamine Wallemia sebi PXP-89 Curvularia sp. IFB-Z10 Hoạt tính kháng sinh Nguồn tham khảo S. aureus (MIC 20,5 µM) [17] E. coli và S. aureus (MIC, 64 μg/mL) Vibrio spp. (MIC 0,1 μg/mL) S. aureus và S. aureus kháng methicillin (MRSA) (MIC 2,0 μg/mL) B. subtilis và S. epidermidis (IC50; 1,42 và 1,02 μM) [18] B. subtilis và S. epidermidis (IC50 lần lượt 27,05 và 24,28 µM) và Candida albicans (IC50, 25,38 μM) E. aerogenes (MIC 76,7 µM) [22] Veillonella parvula, Streptococcus sp. Bacteroides vulgatus và Peptostreptococcus sp. (MIC 0,37 μM) Các hợp chất Piperazine/Diketopiperazine và Pyrimidine/Pyrimidinone Terremides B Aspergillus E. aerogenes (MIC 33,5 terreus PT06-2 μM) [19] [20] [21] [23] [24] [25]