Tài liệu Nghiên cứu hoá học theo định hướng hoạt tính sinh học các cây thuốc dân tộc việt nam nhằm tạo ra những sản phẩm có giá trị cao phục vụ cuộc sống

VHHCHCTN BKH&CN BKH&CN VHHCHCTN BKH&CN VHHCHCTN Bé khoa häc vµ c«ng nghÖ B¸o c¸o tæng kÕt NhiÖm vô Hîp t¸c quèc tÕ theo nghÞ ®Þnh th− viÖt nam-hµn quèc (2003-2006) “nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc c¸c c©y thuèc d©n téc viÖt nam nh»m t¹o ra nh÷ng s¶n phÈm cã gi¸ trÞ cao phôc vô cuéc sèng” C¬ quan chñ tr×: ViÖn Ho¸ häc c¸c Hîp chÊt thiªn nhiªn ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam Chñ nhiÖm ®Ò tµi: PGS. TS Hoµng Thanh H−¬ng GS. TS Ch©u V¨n Minh 6392 20/5/2007 Hµ Néi - 2007 Môc lôc Th«ng tin tãm t¾t vÒ ®Ò tµi Më ®Çu PhÇn 1:Tæng quan, ®èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu Ch−¬ng I: YÕu tè sao chÐp nh©n NF-κB vµ c¸c xu h−íng míi trong nghiªn cøu ®iÒu trÞ c¸c bÖnh viªm vµ ung th− I.1. YÕu tè sao chÐp nh©n NF-κB I.1.1. YÕu tè nh©n NF-κB-mét yÕu tè phiªn m· mÊu chèt trong c¸c bÖnh viªm m·n tÝnh I.1.2. YÕu tè nh©n NF-κB I.2. C¸c xu h−íng míi trong nghiªn cøu ®iÒu trÞ c¸c bÖnh viªm vµ ung th− I.2.1. Vai trß cña NF-κB trong c¸c bÖnh viªm I.2.2. ¶nh h−ëng cña c¸c glucococticoit tíi NF-κB I.2.3. Nh÷ng vÊn ®Ò liªn quan ®Õn ®iÒu trÞ bÖnh I.2.4. Sö dông c¸c chÊt øc chÕ NF-κB trong c¸c liÖu ph¸p ch÷a bÖnh Ch−¬ng II: môc tiªu, §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu II.1. Môc tiªu, ®èi t−îng nghiªn cøu cña ®Ò tµi II.1.1. Môc tiªu nghiªn cøu cña ®Ò tµi II.1.2. §èi t−îng nghiªn cøu II.2. C¸c ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu II.2.1. Ph−¬ng ph¸p thu thËp mÉu, gi¸m ®Þnh tªn ph©n loµi II.2.2. Ph−¬ng ph¸p xö lý mÉu, t¹o dÞch chiÕt phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh sinh häc vµ nghiªn cøu ho¸ häc II.2.3. C¸c ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh sinh häc II.2.3.1. Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh kh¸ng NF-kB II.2.3.2. Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh kh¸ng MAO II.2.3.3. Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo II.2.3.4. Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh kh¸ng Cyclooxygenases (COX) II.2.4. Ph−¬ng ph¸p t¸ch chiÕt, x¸c ®Þnh cÊu tróc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc II.2.5. Ph−¬ng ph¸p x©y dùng c¬ së d÷ liÖu thùc vËt PhÇn 2: KÕt qu¶ nghiªn cøu Ch−¬ng III : KÕt qu¶ thu thËp mÉu vµ x©y dùng c¬ së d÷ liÖu III.1. KÕt qu¶ thu thËp mÉu III.2. KÕt qu¶ x©y dùng c¬ së d÷ liÖu Chu¬ng IV. kÕt qu¶ sµng läc vµ ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh NF-κB IV.1. Quy tr×nh ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh kh¸ng NF-κB IV.2.KÕt qu¶ sµng läc ho¹t tÝnh kh¸ng NF-κB i 1 3 5 5 5 5 5 8 8 9 10 11 13 13 13 13 13 13 13 15 15 15 17 19 19 20 22 22 22 34 38 38 41 Ch−¬ng V: KÕt qu¶ nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc V.1 Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y ngò gia b× h−¬ng (Acanthopanax trifoliatus (L).Merr) V.2. Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y tr¹ch t¶ (Alisma plantago-aquatica) V.3. Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y muèi hoa tr¾ng (Rhus chinensis) V.4. Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y mãc diÒu (Caesalpinia decapetala) V.5. Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y cïm côm r¨ng (Ehretia dentata Courch) V.6. Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y cá lµo (Chromolaena odorata) V.7. Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y bïm bôp (Mallotus apelta) V.8.Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc cña c©y sau sau (Liquidambar formosana Hance) PhÇn 3: KÕt luËn Danh môc c¸c c«ng tr×nh ®∙ c«ng bè Tµi liÖu tham kh¶o ii 48 48 144 184 207 240 270 305 399 405 410 411 Th«ng tin tãm t¾t vÒ ®Ò tµi 1. Tªn ®Ò tµi: “Nghiªn cøu ho¸ häc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh sinh häc c¸c c©y thuèc d©n téc ViÖt Nam nh»m t¹o ra nh÷ng s¶n phÈm cã gi¸ trÞ cao phôc vô cuéc sèng”. “A Cooperation on the Conservation of indigenous Biodiversity in Viet Nam & Their Utilization for the Development of High-value Biotech Product” 2. Thêi gian thùc hiÖn: 01/2003 – 12/.2006 3. C¬ quan thùc hiÖn: PhÝa ViÖt Nam: ViÖn Ho¸ häc c¸c Hîp chÊt thiªn nhiªn §Þa chØ: 18 Hoµng Quèc ViÖt, CÇu GiÊy, Hµ Néi §iÖn tho¹i: 84-4-8363375; Fax: 84-4-7564390;Email: [email protected] PhÝa Hµn Quèc: Korea Research Institute for Bioscience and Biotechnology (Kribb), Taejon, Korea. College of Pharmacy, Chungnam National University (CNU), Taejon, Korea. 4. C¬ quan chñ qu¶n: ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam 18-Hoµng Quèc ViÖt, CÇu GiÊy, Hµ Néi 5. Chñ nhiÖm §Ò tµi: PhÝa ViÖt Nam: PGS.TS Hoµng Thanh H−¬ng GS. TS. Ch©u V¨n Minh ViÖn Ho¸ häc c¸c Hîp chÊt thiªn nhiªn ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam Tel: 84.4.8363375; Fax: 84.4.7564390; Email: [email protected] PhÝa Hµn Quèc: 1. Dr Jung Joon Lee Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology (KRIBB). Tel: 042-860-4360; Fax: 042-860-4595; Email: jjlee@mail. kribb.re.kr 2. Prof. Dr. Young Ho Kim College of harmacy, Chungnam National University, Taejon, Korea 6. Môc tiªu cña ®Ò tµi: 1. Sµng läc, ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh kh¸ng ung th− theo c¬ chÕ øc chÕ NF-κB mét sè c©y thuèc ViÖt Nam. 2. TËp trung nghiªn cøu ho¸ häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc mét sè ®èi t−îng thùc vËt cã triÓn väng ®−îc lùa chän th«ng qua sµng läc nh»m t¸ch chiÕt, x¸c ®Þnh cÊu tróc c¸c chÊt cã ho¹t tÝnh, ®Þnh h−íng sö dông cã hiÖu qu¶ nguån tµi nguyªn thiªn nhiªn cña ViÖt Nam. 1 3. §µo t¹o c¸n bé th«ng qua dù ¸n (TiÕn sü, thùc tËp sinh) ®Ó t¨ng c−êng n¨ng lùc nghiªn cøu. 7. Danh s¸ch c¸n bé tham gia chÝnh STT Hä vµ tªn Häc hµm, häc vÞ C¬ quan c«ng t¸c 1 Lª Mai H−¬ng TS ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 2 Phan V¨n KiÖm TS ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 3 Ph¹m Quèc Long TS ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 4 TrÇn B¹ch D−¬ng TS ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 5 Vò M¹nh Hïng TS Häc viÖn Qu©n Y 6 NguyÔn ThÞ Ph−¬ng Chi TS ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 7 NguyÔn H. Toµn Phan NCS ViÖn sinh häc NhiÖt ®íi 8 Lª ThÞ Ph−¬ng Quúnh TS ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 9 L−u V¨n ChÝnh TS ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 10 Lª Minh Hµ TS ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 11 NguyÔn H¶i §¨ng Th.S ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 12 NguyÔn Hoµi Nam NCS ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 13 NguyÔn TiÕn §¹t NCS ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 14 NguyÔn Xu©n C−êng Th.S ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 15 NguyÔn Ph−¬ng Th¶o CN ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 16 Hoµng Lª TuÊn Anh NCS ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 17 NguyÔn H÷u Tïng KS ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 18 TrÇn Hång Quang CN ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 19 Hµ ViÖt B¶o NCS ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 20 NguyÔn ThÞ Hång V©n NCS ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 21 Ph¹m H¶i YÕn Th.S ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 22 NguyÔn Xu©n NhiÖm Th.S ViÖn Ho¸ häc c¸c hîp chÊt thiªn nhiªn 2 Më ®Çu YÕu tè nh©n kappa B (Nuclear Factor kappa B, viÕt t¾t lµ NF-κB) lÇn ®Çu tiªn ®−îc t×m ra vµo n¨m 1986 bëi c¸c nhµ khoa häc Mü Sen vµ Baltimore ph¸t hiÖn ra ®Çu n¨m 1986 vµ ®−îc nhËn d¹ng lµ mét chÊt ®iÒu tiÕt sù biÓu hiÖn cña gen chuçi nhÑ kappa trong c¸c lympho bµo B ë chuét. Nh÷ng nghiªn cøu tiÕp theo ®· chØ ra r»ng NF-κB cßn cã mÆt ë nhiÒu tÕ bµo kh¸c nhau trong c¬ thÓ. Ngay sau khi ph¸t hiÖn ra, c¸c nhµ khoa häc trªn thÕ giíi ®· tËp trung nghiªn cøu vÒ c¬ chÕ g©y bÖnh cña NF-κB khi chóng bÞ ho¹t ho¸ vµ ®· chØ ra r»ng chÝnh NFκB, mét yÕu tè phiªn m· cã ë kh¾p n¬i cã tÇm quan träng ®Æc biÖt trong c¸c ®¸p øng miÔn dÞch vµ viªm. NF-κB bÞ ho¹t ho¸ ®· t¸c ®éng ®Õn c¸c gen dÝch ë vïng khëi ®Çu cña sù phiªn m·. ChÝnh v× vËy NF-κB nhanh chãng trë thµnh ®èi t−îng nghiªn cøu lý t−ëng trong c¸c nghiªn cøu thö nghiÖm ®Ó t×m ra c¸c hîp chÊt ch÷a trÞ ung th− vµ c¸c bÖnh viªm m·n tÝnh . Trong khu«n khæ ch−¬ng tr×nh hîp t¸c nghiªn cøu khoa häc vµ c«ng nghÖ theo NghÞ ®Þnh th− gi÷a ViÖn Ho¸ häc c¸c Hîp chÊt thiªn nhiªn víi Tr−êng §¹i häc Tæng hîp Chung Nam vµ ViÖn Sinh häc vµ C«ng nghÖ Sinh häc Hµn quèc (2003-2006), chóng t«i ®· tiÕn hµnh sµng läc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh kh¸ng NF-κB cña 512 mÉu thùc vËt ViÖt Nam. KÕt qu¶ sµng läc ®· ph¸t hiÖn ra 49 loµi thùc vËt cã ho¹t tÝnh kh¸ng NF-κB ®¸ng quan t©m ®Ó nghiªn cøu s©u vÒ mÆt ho¸ häc, nh»m t×m kiÕm nh÷ng ho¹t chÊt sinh häc tõ nguån tµi nguyªn thiªn nhiªn phong phó cña ViÖt Nam phôc vô cuéc sèng. Trong ®Ò tµi nµy, chóng t«i tr×nh bµy kÕt qu¶ gÇn ®©y vÒ nghiªn cøu ho¸ häc, ho¹t tÝnh kh¸ng NF-κB vµ mét sè ho¹t tÝnh sinh häc kh¸c cña 8 loµi thùc vËt ViÖt Nam, bao gåm: 1. C©y Ngò gia b× h−¬ng (Acanthopanax trifoliatus) thuéc hä Nh©n s©m (Araliaceae) 2. C©y Tr¹ch t¶ (Alisma plantago-aquatica) thuéc hä Tr¹ch t¶ (Alismataceae) 3. C©y Mãc diÒu (Caesalpinia decapetala) thuéc hä §Ëu (Fabaceae). 4. C©y Muèi hoa tr¾ng (Rhus chinensis) thuéc hä §µo lén hét (Anacardiaceae). 5. C©y cïm côm r¨ng ((Ehretia dentanta) thuéc hä D©y gèi (Celastraceae) 6. C©y Cá lµo (Chromolaena odorata) thuéc hä Cóc (Asteraceae) 7. C©y Bïm bôp (Mallotus apelta) thuéc hä ThÇu dÇu (Euphorbiaceae) 8. C©y Sau sau (Liquidambar formosana Hance) thuéc hä Sau sau (Altingiaceae) §©y lµ nh÷ng ®èi t−îng thùc vËt ®· ®−îc lùa chän th«ng qua ch−¬ng tr×nh sµng läc theo ®Þnh h−íng ho¹t tÝnh kh¸ng NF-κB trong khu«n khæ ®Ò tµi hîp t¸c quèc tÕ theo NghÞ ®Þnh th− ViÖt Nam-Hµn Quèc (2003-2006). 3 PhÇn I: tæng quan, ®èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu Ch−¬ng 1. yÕu tè sao chÐp nh©n nf-κB vµ c¸c xu h−íng míi trong nghiªn cøu ®iÒu trÞ c¸c bÖnh viªm vµ ung th− I.1. YÕu tè sao chÐp nh©n NF-kB I.1.1.YÕu tè nh©n-κB – mét yÕu tè phiªn m∙ mÊu chèt trong c¸c bÖnh viªm m∙n tÝnh. Trong c¸c bÖnh viªm m·n tÝnh nh− hen, viªm khíp d¹ng thÊp, bÖnh viªm ruét, bÖnh vÈy nÕn, mét sè cytokin tËp hîp c¸c tÕ bµo miÔn dÞch vµ tÕ bµo bÞ viªm ®−îc ho¹t ho¸ ®Õn vÞ trÝ tæn th−¬ng, do ®ã lµm nÆng thªm vµ lµm dai d¼ng tr¹ng th¸i viªm. C¸c tÕ bµo ®−îc ho¹t ho¸ ®ã s¶n xuÊt ra nhiÒu chÊt trung gian kh¸c cña qu¸ tr×nh viªm [1]. Nguyªn nh©n g©y ra c¸c bÖnh nµy vÉn lµ ®iÒu bÝ Èn, song ®· biÕt qu¸ tr×nh bÖnh lµ kÕt qu¶ cña sù t¸c ®éng qua l¹i cña c¸c yÕu tè di truyÒn vµ c¸c yÕu tè m«i tr−êng. C¸c gen nh− c¸c gen quyÕt ®Þnh sù dÞ øng trong bÖnh hen vµ c¸c gen ®¸p øng l¹i c¸c kh¸ng nguyªn trong bÖnh viªm khíp d¹ng thÊp, bÖnh viªm ruét cã thÓ quyÕt ®Þnh tÝnh dÔ bÞ m¾c cña bÖnh nh©n ®èi víi bÖnh vµ quyÕt ®Þnh møc ®é nÆng nhÑ cña bÖnh, song c¸c yÕu tè m«i tr−êng, th−êng lµ kh«ng biÕt, cã thÓ quyÕt ®Þnh sù diÔn biÕn cña qu¸ tr×nh bÖnh. Mét khi ®· ®−îc x¸c lËp th× qu¸ tr×nh viªm cña bÖnh m·n tÝnh h×nh nh− b¾t ®Çu cã ®µ cña nã. Vßng luÈn quÈn nµy cã thÓ bÞ øc chÕ b»ng liÖu ph¸p glucococticoit hoÆc liÖu ph¸p gi¶m miÔn dÞch, song hiÖn nay kh«ng cã ph−¬ng ph¸p ®iÒu trÞ ch÷a khái ®èi víi bÊt kú bÖnh viªm m·n tÝnh nµo. Sù hiÓu biÕt cña chóng ta vÒ c¸c c¬ chÕ ph©n tö mµ qua ®ã c¸c tÝn hiÖu m«i tr−êng lµm thay ®æi sù biÓu hiÖn gen ®· t¨ng lªn ®¸ng kÓ. Cã c¸c yÕu tè ®Æc hiÖu di truyÒn ®iÒu tiÕt sù phiªn m· cña c¸c gen ®Ých b»ng c¸ch liªn kÕt víi c¸c phÇn tö nhËn biÕt ®Æc hiÖu, mµ c¸c phÇn tö nµy th−êng n»m ë vïng khëi ®Çu sù phiªn m· (5’) h−íng ng−îc chiÒu cña gen [2]. C¸c yÕu tè nµy th−êng lµm t¨ng tèc ®é phiªn m· cña gen, v× vËy lµm t¨ng sù t¹o thµnh ARN th«ng tin vµ protein. NhiÒu yÕu tè trong sè c¸c yÕu tè phiªn m· nµy lµ ®Æc hiÖu ®èi víi tÕ bµo vµ cã vai trß quan träng trong sù biÖt ho¸ tÕ bµo vµ sù ®iÒu hoµ c¸c qu¸ tr×nh tÕ bµo ®Æc hiÖu nh− qu¸ tr×nh t¨ng sinh. C¸c yÕu tè phiªn m· kh¸c cã ë kh¾p n¬i vµ ho¹t tÝnh cña chóng cã thÓ bÞ lµm thay ®æi bëi c¸c tÝn hiÖu m«i tr−êng. ChÝnh c¸c yÕu tè phiªn m· võa nãi nµy cã thÓ cã vai trß then chèt trong c¸c ®¸p øng miÔn dÞch vµ viªm. Mét yÕu tè phiªn m· cã ë kh¾p n¬i cã tÇm quan träng ®Æc biÖt trong c¸c ®¸p øng miÔn dÞch vµ viªm lµ yÕu tè nh©n-κB (NF-κB) [3]. I.1.2. YÕu tè nh©n NF-κB NF-κB lÇn ®Çu tiªn ®· ®−îc nhËn d¹ng lµ mét chÊt ®iÒu tiÕt sù biÓu hiÖn cña gen chuçi nhÑ kappa trong c¸c lympho bµo B ë chuét [4], song sau ®ã ®· ®−îc t×m thÊy ë nhiÒu tÕ bµo kh¸c nhau. NhiÒu protein NF-κB kh¸c nhau ®· ®−îc x¸c ®Þnh ®Æc tÝnh. D¹ng ®−îc ho¹t ho¸ cña NF-κB lµ mét dÞ ®ime, th−êng gåm 2 4 protein: mét tiÓu ®¬n vÞ p65 (còng d−îc gäi lµ relA) vµ mét tiÓu ®¬n vÞ p50. C¸c tiÓu ®¬n vÞ kh¸c nh− rel, relB, v-rel vµ p50 còng cã thÓ lµ thµnh phÇn cña NF-κB ®−îc ho¹t ho¸ vµ cã lÏ lµ c¸c d¹ng kh¸c nhau cña NF-κB cã thÓ ho¹t ho¸ c¸c tËp hîp kh¸c nhau cña c¸c gen ®Ých. Trong c¸c tÕ bµo kh«ng ®−îc kÝch thÝch, NF-κB ®−îc t×m thÊy trong bµo t−¬ng(tÕ bµo chÊt) vµ nã bÞ liªn kÕt víi IκBα vµ IκBβ mµ c¸c phÇn tö nµy ng¨n c¶n NF-κB ®i vµo nh©n tÕ bµo. Khi c¸c tÕ bµo ®ã bÞ kÝch thÝch, th× c¸c kinaza ®Æc hiÖu photphoryl ho¸ IκB lµm cho nã bÞ gi¶m ph©n nhanh chãng bëi c¸c proteasom [5] (H×nh I.1.2 a ). Sù gi¶i phãng NF-κB tõ IκB dÉn tíi sù chuyÓn NF-κB vµo nh©n tÕ bµo, t¹i ®©y nã liªn kÕt víi c¸c ®o¹n tr×nh tù ®Æc hiÖu trong c¸c vïng khëi ®Çu sù phiªn m· cña c¸c gen ®Ých. Bëi v× gen IκBα (tr−íc ®©y ®−îc gäi lµ MAD-3) cã ®o¹n (tr×nh tù) nhËn biÕt κB trong vïng khëi ®Çu sù phiªn m· cña gen ®ã, nªn NF-κB kÝch thÝch g©y ra sù tæng hîp IκBα, mµ phÇn tö nµy ®i vµo nh©n ®Ó liªn kÕt víi NF-κB ®· ®−îc ho¹t ho¸ vµ vËn chuyÓn NF-κB tíi bµo t−¬ng, nhê vËy kÕt thóc sù ho¹t ho¸ biÓu hiÖn cña gen. Sù ph©n gi¶i h−íng ®Ých cña IκBα ë chuét dÉn tíi sù ho¹t ho¸ ®−îc kÐo dµi cña NF-κB ®Ó ®¸p øng l¹i c¸c kÝch thÝch viªm vµ chuét bÞ chÕt do viªm lan réng. Tr¸i l¹i, sù tæng hîp IκBβ kh«ng bÞ kÝch thÝch ®Ó diÔn ra bëi NF-κB, cho nªn NF-κB h×nh nh− lµ ®−îc ho¹t ho¸ (®−îc liªn kÕt víi ADN) trong mét kho¶ng thêi gian dµi h¬n ë c¸c kiÓu tÕ bµo cã IκBβ chiÕm chñ yÕu [6]. H×nh I.1.2a: Sù ho¹t ho¸ NF-κB Sù ho¹t ho¸ NF-κB bao gåm sù photphoryl ho¸ vµ gi¶m ph©n ph©n gi¶i protein tiÕp sau cña protein øc chÕ IκB bëi c¸c IκB kinaza ®Æc hiÖu. NF-κB tù do (mét dÞ ®ime gåm P50 vµ p65) sau ®ã chuyÓn vµo nh©n tÕ bµo, t¹i ®©y nã liªn kÕt víi c¸c vÞ trÝ κB ë c¸c vïng khëi ®Çu sù phiªn m· cña c¸c gen qui ®Þnh c¸c protein viªm nh− c¸c cytokin, c¸c enzym vµ c¸c ph©n tö dÝnh kÕt. P lµ protein, mARN lµ ARN th«ng tin. 5 NhiÒu kÝch thÝch g©y ho¹t ho¸ NF-κB, bao gåm c¸c cytokin, c¸c phÇn tö ho¹t ho¸ protein kinaza C, c¸c virus vµ c¸c chÊt oxy ho¸ [3] (B¶ng I.1.2 a). Cã thÓ cã nhiÒu con ®−êng truyÒn tÝn hiÖu cã liªn quan, song tÊt c¶ c¸c kÝch thÝch nµy ®Òu t¸c ®éng qua trung gian c¸c protein kinaza mµ c¸c enzym nµy xóc t¸c cho sù photphoryl ho¸ (vµ nh− vËy lµm gi¶m ph©n) IκB. C¸c kinaza ®Æc hiÖu cña IκB gÇn ®©y ®· ®−îc x¸c ®Þnh ®Æc tÝnh [7]. C¸c chÊt chèng oxy ho¸ nh− pyrolidin dithiocarbamat vµ axetylxystein cã thÓ c¶n trë sù ho¹t ho¸ mét sè kinaza trong c¸c protein kinaza nµy, ®iÒu ®ã nãi lªn lµ lo¹i chÊt chøa oxy mang ho¹t tÝnh ph¶n øng cã vai trß trung gian [8]. B¶ng I.1.2 a: C¸c kÝch thÝch ho¹t ho¸ NF-κB - Virus cóm - Virus Esptein- Bar - Cytomegalovirus (virus cù bµo) - Adenovirus C¸c kÝch thÝch miÔn dÞch - Phytohemaglutinin - C¸c kh¸ng thÓ kh¸ng CD-3( nhê sù ho¹t ho¸ lympho bµo T) - Kh¸ng nguyªn C¸c kÝch thÝch kh¸c - Lipopolysaccarit Bøc x¹ tö ngo¹i C¸c Cytokin YÕu tè ho¹i tö u α Interleukin-1β Interleukin-17 C¸c chÊt ho¹t ho¸ protein kinaza C C¸c este phorbol YÕu tè ho¹t ho¸ tiÓu cÇu C¸c chÊt oxy ho¸ Hidro peoxyt - Ozon C¸c virus - Virus trong niªm m¹c mòi NF-κB ®iÒu tiÕt sù biÓu hiÖn cña nhiÒu gen tham gia vµo c¸c ®¸p øng miÔn dÞch vµ viªm. Song ®ã kh«ng ph¶i lµ yÕu tè phiªn m· duy nhÊt tham gia vµo sù ®iÒu tiÕt c¸c gen nµy vµ nã th−êng ho¹t ®éng kÕt hîp víi c¸c yÕu tè phiªn m· kh¸c nh− protein ho¹t ho¸ 1 (AP-1) vµ yÕu tè nh©n cña interleukin-6, mµ c¸c yÕu tè nµy còng tham gia vµo sù ®iÒu tiÕt c¸c gen cña qu¸ tr×nh viªm vµ c¸c gen tham gia vµo miÔn dÞch. NF-κB t¸c ®éng lªn c¸c gen qui ®Þnh c¸c cytokin, c¸c chemokin cã lîi cho qu¸ tr×nh viªm (c¸c cytokin ho¸ øng ®éng thu hót c¸c tÕ bµo viªm vµo c¸c vÞ trÝ viªm), lªn c¸c gen qui ®Þnh c¸c enzym g©y s¶n sinh c¸c chÊt trung gian cña qu¸ tr×nh viªm, lªn c¸c gen qui ®Þnh c¸c thô thÓ miÔn dÞch, còng nh− c¸c phÇn tö dÝnh kÕt cã vai trß mÊu chèt trong sù tËp hîp ban ®Çu c¸c b¹ch cÇu ®Õn c¸c vÞ trÝ viªm (B¶ng I.1.2b). B¶ng I.1.2b: C¸c protein bÞ ®iÒu tiÕt bëi NF-κB C¸c cytokin cã lîi cho qu¸ tr×nh viªm C¸c enzym viªm YÕu tè ho¹i tö u α Nit¬ monooxyt sythetaza cã thÓ bÞ Interleukin-1β c¶m øng t¹o thµnh Interleukin-2 Xyclo oxygenaza-2 cã thÓ bÞ c¶m Interleukin-6 øng t¹o thµnh YÕu tè kÝch thÝch quÇn thÓ ®¹i thùc 5- Lipoxygenaza bµo tÕ bµo h¹t Phospholipaza A2 trong dung dÞch 6 YÕu tè kÝch thÝch quÇn thÓ tÕ bµo bµo t−¬ng h¹t C¸c ph©n tö dÝnh kÕt C¸c chemokin Ph©n tö dÝnh kÕt gian bµo 1 Interleukin-8 Ph©n tö dÝnh kÕt tÕ bµo-m¹ch m¸u 2 Protein viªm ®¹i thùc bµo 1α E-selectin Protein ho¸ øng ®éng ®¹i thùc bµo C¸c thô thÓ 1. - Thô thÓ interleukin-2 (chuçi α) Gro-α, -β vµ -γ - Thô thÓ tÕ bµo T (chuçi β) Eotaxin Do vËy sù ho¹t ho¸ NF-κB dÉn tíi sù t¨ng mét c¸ch phèi hîp sù biÓu hiÖn cña nhiÒu gen mµ s¶n phÈm cña c¸c gen ®ã lµm trung gian cho c¸c ®¸p øng viªm vµ miÔn dÞch. VÝ dô, sù kÝch thÝch mét c¸ch phèi hîp sù biÓu hiÖn cña c¸c gen qui ®Þnh E-selectin, interleukin-8 vµ yÕu tè ho¹i tö u α (TNF-α), dÉn tíi sù tËp hîp vµ ho¹t ho¸ c¸c b¹ch cÇu trung tÝnh. C¸c s¶n phÈm cña c¸c gen ®−îc ®iÒu tiÕt bëi NF-κB còng g©y ho¹t ho¸ NFκB. C¶ hai cytokin cã lîi cho viªm interleukin-1β vµ TNF-α ®Òu g©y ho¹t ho¸ NF-κB vµ ®−îc ho¹t ho¸ bëi NF-κB. KiÓu chu tr×nh ®iÒu tiÕt tÝch cùc nµy cã thÓ lµm t¨ng sù duy tr× dµi l©u c¸c ®¸p øng viªm côc bé (H×nh I.1.2b). H×nh I.1.2b: NF-κB lµ mét yÕu tè ®iÒu tiÕt viªm NF-κB cã thÓ ®−îc ho¹t ho¸ bëi nhiÒu tÝn hiÖu viªm kh¸c nhau, dÉn tíi sù biÓu hiÖn phèi hîp cña c¸c gen qui ®Þnh nhiÒu cytokin, chemokin, c¸c enzym vµ c¸c tÕ bµo dÝnh kÕt. C¸c cytokin interleukin-1β vµ yÕu tè ho¹i tö u α (TNF-α ), c¶ hai yÕu tè nµy ®Òu g©y ho¹t ho¸ NF-κB vµ ®−îc lµm t¨ng lªn bëi NF- κB. mARN chØ ARN th«ng tin. 7 I. 2. C¸c xu h−íng míi trong nghiªn cøu ®iÒu trÞ c¸c bÖnh viªm vµ ung th− I. 2.1. Vai trß cña NF-κB trong c¸c bÖnh viªm NF-κB lµm t¨ng sù biÓu hiÖn cña c¸c gen qui ®Þnh nhiÒu cytokin, c¸c enzym vµ c¸c ph©n tö dÝnh kÕt trong c¸c bÖnh viªm m·n tÝnh. Mét gen nh− vËy lµ gen qui ®Þnh nit¬ monooxyt (NO) synthaza cã thÓ bÞ c¶m øng sinh ra [9], mµ sù biÓu hiÖn cña nã ®−îc t¨ng lªn ë c¸c tÕ bµo biÓu m« ®−êng h« hÊp vµ bëi c¸c ®¹i thùc bµo ë c¸c bÖnh nh©n hen, ë c¸c tÕ bµo biÓu m« ®¹i trµng cña c¸c bÖnh nh©n bÞ viªm loÐt ®¹i trµng vµ ë c¸c tÕ bµo mµng ho¹t dÞch cña c¸c khíp bÞ viªm. Sù biÓu hiÖn t¨ng lªn nµy ®−îc ph¶n ¸nh b»ng sù t¨ng l−îng nit¬ monooxyt trong h¬i thë ra cña c¸c bÖnh nh©n hen [10] vµ ë ®¹i trµng cña c¸c bÖnh nh©n bÞ viªm loÐt ®¹i trµng ho¹t ®éng [11], còng nh− bëi nång ®é nitrit (NO2-) t¨ng trong n−íc tiÓu cña bÖnh nh©n bÞ viªm khíp d¹ng thÊp. Xyclooxygenaza-2 -mét enzym kh¸c cã thÓ bÞ c¶m øng sinh ra ®−îc ®iÒu tiÕt bëi NF-κB - lµ enzym g©y ra sù s¶n xuÊt t¨ng prostagla®in vµ thromboxan trong c¸c bÖnh viªm [12]. Trong tÊt c¶ c¸c bÖnh viªm m·n tÝnh, c¸c ph©n tö dÝnh kÕt tËp hîp c¸c tÕ bµo viªm nh− c¸c b¹ch cÇu trung tÝnh, b¹ch cÇu −a eosin vµ c¸c lympho bµo T tõ hÖ tuÇn hoµn ®Õn vÞ trÝ viªm. NF-κB ®iÒu tiÕt sù biÓu hiÖn cña nhiÒu gen m· ho¸ c¸c ph©n tö dÝnh kÕt, nh− ph©n tö dÝnh kÕt gian baß 1, ph©n tö dÝnh kÕt tÕ bµo m¹ch m¸u 1 vµ E-selectin. Sù s¶n xuÊt interleukin-1β, TNF-α, interleukin-6, yÕu tè kÝch thÝch tËp hîp ®¹i thùc bµo tÕ bµo h¹t vµ nhiÒu cytokin ho¸ øng ®éng (c¸c chemokin) ®−îc lµm t¨ng lªn ë bÖnh nh©n hen, viªn khíp d¹ng thÊp, vÈy nÕn vµ viªm ruét. TÊt c¶ c¸c cytokin nµy ®Òu cã vai trß quan träng trong qu¸ tr×nh viªm. Interleukin-1β vµ TNF-α cã thÓ ¶nh h−ëng ®Õn møc ®é nÆng nhÑ cña bÖnh, cã thÓ lµ do sù ho¹t ho¸ kÐo dµi NF-κB. ViÖc ®iÒu trÞ bÖnh nh©n viªm khíp d¹ng thÊp b»ng c¸c kh¸ng thÓ kh¸ng TNF-α cã thÓ khèng chÕ ®−îc bÖnh khã ch÷a nµy. C¸c nhiÔm virus, nh− virus trong niªm m¹c mòi vµ virus cóm, g©y c¸c c¬n cÊp trÇm träng thªm cña bÖnh hen b»ng c¸ch kh¬i mµo mét ®¸p øng viªm kÐo dµi. G©y nhiÔm thùc nghiÖm virus trong niªm m¹c mòi lµm ho¹t ho¸ NF-κB vµ kÝch thÝch sù chÕ tiÕt interleukin-6 ë c¸c tÕ bµo biÓu m« cña mòi. Trong c¸c bÖnh viªm kh¸c, c¸c virus cã thÓ ho¹t ho¸ NF-κB th«ng qua c¸c c¬ chÕ cã sù s¶n sinh c¸c chÊt trung gian chøa oxy cã kh¶ n¨ng ph¶n øng hoÆc cã sù ho¹t ho¸ c¸c protein kinaza dÉn tíi sù phosphoryl ho¸ IκB. Stress oxy hãa còng cã thÓ lµm sù viªm nÆng thªm. VÝ dô, ë c¸c ®éng vËt, sù hÝt oz«n g©y ra sù viªm ®−êng h« hÊp d−íi vµ kÝch thÝch c¸c gen viªm bÞ kiÓm so¸t bëi NF-κB. Cã t−¬ng ®èi Ýt ph−¬ng ph¸p ®o trùc tiÕp sù ho¹t ho¸ NF-κB ë c¸c tÕ bµo viªm hoÆc ë c¸c m« bÞ viªm. ViÖc cho c¸c b¹ch cÇu ®¬n nh©n to trong m¸u ngo¹i biªn, c¸c tÕ bµo biÓu m« hoÆc m« phæi cña ng−êi tiÕp xóc víi c¸c cytokin cã lîi cho qu¸ tr×nh viªm, nh− interleukin-1β vµ TNF-α hoÆc víi c¸c chÊt oxy ho¸, dÉn tíi ho¹t ho¸ râ rµng NF-κB. T−¬ng tù, ë ®éng vËt, sù ho¹t ho¸ c¸c lympho bµo T 8 b»ng c¸c kh¸ng thÓ kh¸ng CD-3 dÉn tíi sù ho¹t ho¸ râ rµng NF-κB [13]. NF-κB còng cã thÓ ®−îc ho¹t ho¸ ë c¸c ®¹i thùc bµo trong ®êm, ë c¸c tÕ bµo biÓu m« vµ c¸c ®¹i thùc bµo trong bÖnh phÈm sinh thiÕt phÕ qu¶n tõ c¸c bÖnh nh©n hen còng nh− trong c¸c tÕ bµo mµng ho¹t dÞch vµ c¸c tÕ bµo néi m« ë khíp cña c¸c bÖnh nh©n viªm khíp d¹ng thÊp [14]. MÆc dï cã nhiÒu ®iÓm t−¬ng tù trong c¸c ®¸p øng viªm ë c¸c bÖnh nh©n viªm khíp, hen, viªm ruét vµ c¸c bÖnh viªm kh¸c, song vÉn cã nh÷ng kh¸c nhau quan träng ë kiÓu tÕ bµo viªm cã liªn quan vµ c¸c chÊt trung gian cña qu¸ tr×nh viªm. C¸c kh¸c nhau nµy cã thÓ liªn quan víi sù chÕ tiÕt c¸c cytokin ®Æc hiÖu, nh− interleukin-5, mµ yÕu tè nµy ë bÖnh nh©n hen th× thóc ®Èy viªm kiÓu b¹ch cÇu −a eosin. NF-κB nªn ®−îc xem lµ mét c¬ chÕ lµm t¨ng vµ kÐo dµi tr¹ng th¸i viªm, mµ cã thÓ lµm trÇm träng thªm qu¸ tr×nh viªm ®Æc hiÖu cho bÖnh, th«ng qua sù ho¹t ho¸ phèi hîp cña nhiÒu gen cã quan hÖ ®Õn viªm. Nh− vËy, sù cã mÆt chØ mét m×nh interleukin-5 sÏ dÉn tíi sù tÝch luü t−¬ng ®èi Ýt b¹ch cÇu −a eosin ë m«, nh−ng t¸c ®éng cña cytokin cã thÓ ®−îc lµm t¨ng lªn b»ng c¸ch tiªm t¹i chç chemokin eotaxin ®Æc hiÖu víi b¹ch cÇu −a eosin; sù phiªn m· c¸c gen qui ®Þnh c¶ interleukin-5 vµ eotaxin cã lÏ bÞ ¶nh h−ëng bëi NF-κB [15]. I. 2.2. ¶nh h−ëng cña c¸c glucococticoit tíi NF-κB C¬ chÕ ph©n tö ¶nh h−ëng cña c¸c glucococticoit tíi sù viªm m·n tÝnh vÉn cßn ch−a hiÓu ®−îc râ, song ngµy cµng cã nhiÒu thªm b»ng chøng lµ chóng øc chÕ t¸c dông cña c¸c yÕu tè phiªn m· nh− AP-1 vµ NF-κB. Trong bµo t−¬ng, c¸c glucococticoit ho¹t ho¸ c¸c thô thÓ glucococticoit mµ sau ®ã c¸c glucococticoit chuyÓn vËn tíi nh©n tÕ bµo, t¹i ®©y chóng liªn kÕt thµnh c¸c ®ång ®ime víi c¸c ph©n tö ®¸p øng glucococticoit ë c¸c gen ®Ých ®¸p øng l¹i steroit, dÉn tíi sù phiªn m· t¨ng. Tuy nhiªn, c¸c glucococticoit lµm gi¶m sù phiªn m· cña c¸c gen tham gia vµo qu¸ tr×nh viªm vµ c¸c gen nµy kh«ng cã c¸c phÇn tö ®¸p øng glucococticoit cã thÓ nhËn d¹ng trong c¸c vïng khëi ®Çu sù phiªn m· cña chóng, cho thÊy r»ng ph¶i cã mét c¬ chÕ kh¸c nµo ®ã dµn xÕp ¶nh h−ëng øc chÕ cña c¸c hocm«n. Cã thÓ cã sù t−¬ng t¸c protein-protein trùc tiÕp gi÷a thô thÓ glucococticoit vµ AP-1 vµ gi÷a thô thÓ nµy víi NF-κB [16]. Nh− vËy, c¸c glucococticoit ho¹t ho¸ c¸c thô thÓ glucococticoit, mµ sau ®ã chóng liªn kÕt víi NF-κB ®· ®−îc ho¹t ho¸ vµ ng¨n c¶n NF-κB liªn kÕt víi c¸c vÞ trÝ κB trªn c¸c gen cã vai trß trong qu¸ tr×nh viªm (H×nh I.2.2a). T−¬ng t¸c nµy cã thÓ x¶y ra trong bµo t−¬ng hoÆc nh©n tÕ bµo. C¸c glucococticoit còng lµm t¨ng sù phiªn m· cña gen ®èi víi IκBα, bëi vËy lµm t¨ng sù t¹o thµnh protein nµy; protein nµy liªn kÕt víi NF-κB ®· ®−îc ho¹t ho¸ trong nh©n tÕ bµo. Protein IκBα cã lÏ kÝch thÝch g©y sù ph©n ly cña NFκB tõ c¸c vÞ trÝ κB trªn c¸c gen ®Ých vµ lµm cho NF-κB chuyÓn dÞch tíi bµo t−¬ng (H×nh I.2.2a). C¬ chÕ nµy ®· ®−îc quan s¸t thÊy ë c¸c tÕ bµo T vµ c¸c b¹ch cÇu ®¬n nh©n to nh−ng nã còng cã thÓ xÈy ra ë tÊt c¶ c¸c kiÓu tÕ bµo. C¸c 9 glucococticoit lµ c¸c chÊt øc chÕ m¹nh sù ho¹t ho¸ NF-κB, ®iÒu nµy cã thÓ lý gi¶i ®a sè c¸c t¸c dông chèng viªm [17]. H×nh I.2.2a: S¬ ®å t¸c dông cña c¸c glucococticoit lªn sù ho¹t ho¸ NF-κB Sù ho¹t ho¸ NF-κB, vÝ dô nh− bëi c¸c cytokin, bÞ c¶n trë bëi c¸c glucococticoit. C¸c phøc hîp glucococticoit-thô thÓ liªn kÕt víi tiÓu ®¬n vÞ p65 cña NF-κB vµ hîp thÓ nµy ng¨n c¶n sù ho¹t ho¸ NF-κB cña c¸c gen øng víi qu¸ tr×nh viªm. Sù tæng hîp IκBα ®−îc kÝch thÝch bëi sù liªn kÕt cña c¸c phøc hîp glucococticoit-glucococticoit-thô thÓ vµo phÇn tö ®¸p øng glucococticoit trong vïng khëi ®Çu sù phiªn m· cña gen IκBα . DÊu X mµu ®á chØ qu¸ tr×nh bÞ ng¨n c¶n, vµ mARN chØ ARN th«ng tin. I. 2.3. Nh÷ng vÊn ®Ò cã liªn quan ®Õn ®iÒu trÞ bÖnh NF-κB ®−îc ho¹t ho¸ bëi nhiÒu yÕu tè (nhiÔm virus, c¸c chÊt oxy ho¸ vµ c¸c kh¸ng nguyªn) lµm t¨ng ®¸p øng viªm. Sù ho¹t ho¸ nµy vÒ phÇn nã l¹i dÉn tíi sù biÓu hiÖn phèi hîp cña nhiÒu gen m· ho¸ c¸c protein (nh− c¸c cytokin, c¸c chemokin, c¸c ph©n tö dÝnh kÕt vµ c¸c enzym) tham gia vµo sù tæng hîp chÊt trung gian vµ kÐo dµi thªm ®¸p øng viªm. V× vËy, NF-κB lµ mét ®Ých hiÓn nhiªn cho c¸c kiÓu ®iÒu trÞ chèng viªm míi. C¸c glucococticoit lµ c¸c chÊt øc chÕ h÷u hiÖu NF-κB, nh−ng chóng còng cã t¸c dông phô tíi néi tiÕt vµ chuyÓn ho¸ khi ®−îc sö dông theo kiÓu ®iÒu trÞ toµn th©n. C¸c t¸c dông phô nµy kh«ng thÓ x¶y ra ®èi víi chÊt øc chÕ NF-κB ®Æc hiÖu h¬n. C¸c chÊt chèng oxy ho¸ øc chÕ sù ho¹t ho¸ cña NF-κB lµ c¸c hîp chÊt cßn ch−a ®−îc nghiªn cøu réng r·i. Bëi v× c¸c chÊt chèng oxy ho¸ s½n cã hiÖn nay nh− c¸c vitamin C, E vµ axetylxystein lµ t−¬ng ®èi yÕu, nªn cÇn cã c¸c chÊt chèng oxy ho¸ m¹nh h¬n, cã t¸c dông l©u bÒn h¬n. Aspirin vµ natri salixilat còng øc chÕ sù ho¹t ho¸ cña NF-κB, mÆc dï chØ ë nång ®é t−¬ng ®èi cao, vµ c¸c muèi cña vµng còng øc chÕ ®−îc sù liªn kÕt NF-κB vµo ADN [18], ®iÒu nµy cho thÊy r»ng t¸c dông chèng viªm cña c¸c lo¹i thuèc nµy, Ýt nhÊt, mét phÇn cã thÓ qui cho sù øc chÕ NF-κB. 10 Mét sè chÊt øc chÕ NF-κB cã trong tù nhiªn ®· ®−îc t×m ra nh− gliotoxyn lÊy tõ Asper gillus lµ mét chÊt øc chÕ m¹nh t−¬ng ®èi ®Æc hiÖu. Cytokin chèng viªm interleukin-10 còng øc chÕ t¸c dông cña NF-κB th«ng qua t¸c dông lªn IκBα. C¸c ph¸t hiÖn b−íc ®Çu cho thÊy r»ng interleukin-10 cã t¸c dông chèng viªm ë c¸c bÖnh nh©n viªm ruét. Sù chuyÓn gen IκBα qua trung gian a®enovirus ®· ®−îc th«ng b¸o lµ øc chÕ ®−îc sù ho¹t ho¸ c¸c tÕ bµo néi m«. HiÖn nay c¸c IκB kinaza ®Æc hiÖu ®· ®−îc x¸c ®Þnh ®Æc tÝnh, nªn cã lÏ lµ cã thÓ nhËn d¹ng c¸c chÊt øc chÕ chän läc b»ng c¸c th− viÖn sµng läc c¸c hîp chÊt ho¸ häc. Cã thÓ lµ kh«ng kh«n ngoan nÕu ng¨n chÆn sù ho¹t ho¸ NF-κB trong mét thêi gian dµi, bëi v× yÕu tè nµy cã vai trß quyÕt ®Þnh trong ®¸p øng miÔn dÞch nh− vËy vµ c¸c ®¸p øng b¶o vÖ kh¸c. Sù ph¸ vì cã chñ ®Ých (hoÆc lo¹i bá) cÊu phÇn p65 cña NF-κB lµ viÖc lµm dÉn tíi tö vong bëi v× sÏ xuÊt hiÖn c¸c bÊt th−êng vÒ ph¸t triÓn kÌm theo [19], cßn nÕu thiÕu cÊu phÇn p50 sÏ dÉn tíi c¸c thiÕu hôt miÔn dÞch vµ t¨ng kh¶ n¨ng dÔ bÞ nhiÔm trïng [20]. Bëi v× NF-κB th−êng ho¹t ®éng kÕt hîp víi c¸c yÕu tè phiªn m· kh¸c nªn cã thÓ ®¹t ®−îc sù c¶n trë chän läc h¬n ë c¸c kiÓu tÕ bµo cô thÓ hoÆc c¶n trë mét tËp hîp cã giíi h¹n c¸c gen b»ng c¸ch t¹o ra c¸c hîp chÊt øc chÕ c¸c t−¬ng t¸c hiÖp ®ång cña nhiÒu yÕu tè phiªn m·. I.2.4. Sö dông c¸c chÊt øc chÕ Nf-kB trong c¸c liÖu ph¸p ch÷a bÖnh Mét sè hîp chÊt cã t¸c dông øc chÕ Nf-kB ®· ®−îc øng dông trong mét sè liÖu ph¸p trÞ bÖnh ®−îc tr×nh bµy trong b¶ng sau: Hîp chÊt Tµi liÖu tham kh¶o ABR-25757 (oxo-quinoline-3-carboxamide) 2-(1-adamantylamino)-6-methylpyridine (AdAMP) 2-(4-Amino-3-methylphenyl)-5-fluorobenzothiazole 1-b-D-Arabinofuranosyl-cytosine (ara-C)) Anthralin Azidothymidine (AZT) Baicalein Bleomycin Bryostatin-1 Bucillamine metabolite SA 981 Camptothecin Celecoxib Ciprofibrate Cisplatin Cycloprodigiosin Dacarbazine Daio-Orengedeokuto 11 Carlsten et al, 2004 Lasek et al, 2002 Brantley et al, 2005 Strum et al, 1994 Schmidt et al, 1996 Kurata, 1994 Chou et al, 2003 Ishii & Takada, 2002 Do et al, 2004 Distler et al, 2004 Piret & Piette, 1996 Kim et al, 2004 Li et al, 1996 Nie et al, 1998 Teshima et al, 2004 Lev et al, 2003 Cho et al, 2004 Daunomycin Daunorubicin Diazoxide Diclofenac 5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid Doxorubicin Epinephrine Etoposide Flavone-8-acetic acid Haloperidol Imiquimod Isochamaejasmin Kunbi-Boshin-Hangam-Tang Lithium Methamphetamine Mitoxantrone Morphine Nipradilol Norepinephrine Nystatin Oltipraz Phenobarbital Proteasome inhibitors Protocatechuic acid SN38 (metabolite of CPT-11) Tamoxifen Taxol (Paclitaxel) Vinblastine Vincristine WR1065 Das & White, 1997; Hellin et al, 1998 Wang et al, 1996 Eliseev et al, 2004 Cho et al, 2005 Ching et al, 1999 Das & White, 1997 Lymperopouos et al, 2006 Bessho et al, 1994 Ching et al, 1999 Post et al, 1998 Schon & Schon, 2006 Tian et al, 2005 Koo et al, 2001 Nemeth et al, 2001 Asanuma & Cadet, 1998 Boland et al, 2000 Yin et al, 2006 Ando et al, 2005 Minneman et al, 2000 Ogawa et al, 2005 Nho & O'Dwyer, 2004 Li et al, 1996 Dolcet et al, 2006 Zhou-Stache et al, 2002 Kishida et al, 2004 Ferlini et al, 1999 Hwang & Ding, 1995 Rosette & Karin, 1995 Das & White, 1997 Grdina et al, 2002 12 Ch−¬ng II: môc tiªu, §èi t−îng vµ Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu II.1. Môc tiªu, ®èi t−îng nghiªn cøu cña ®Ò tµi II.1.1. Môc tiªu nghiªn cøu cña ®Ò tµi - TiÕn hµnh sµng läc, ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh øc chÕ NF-κB mét sè c©y thuèc cæ truyÒn cña ViÖt Nam. Trªn c¬ së c¸c kÕt qu¶ vÒ sµng läc ho¹t tÝnh øc chÕ NF-κB lùa chän mét sè ®èi t−îng thùc vËt ®Ó tËp trung nghiªn cøu ho¸ häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc. - T¸ch chiÕt vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc c¸c chÊt cã ho¹t tÝnh tõ mét sè ®èi t−îng thùc vËt ®· ®−îc lùa chän th«ng qua sµng läc ho¹t tÝnh, nh»m ®Þnh h−íng sö dông cã hiÖu qu¶ nguån tµi nguyªn thiªn nhiªn cña ViÖt nam. - §µo t¹o c¸c c¸n bé nghiªn cøu (TiÕn sÜ, thùc tËp sinh) nh»m t¨ng c−êng n¨ng lùc nghiªn cøu cña ViÖn. II.1.2. §èi t−îng nghiªn cøu cña ®Ò tµi Trong thêi gian thùc hiÖn dù ¸n (2003-2006) ®Ò tµi ®· tiÕn hµnh thu h¸i c¸c mÉu thùc vËt thµnh nhiÒu ®ît ®Ó tiÖn cho viÖc gi¸m ®Þnh tªn khoa häc vµ ®Þnh loµi. §Ó x©y dùng c¬ së d÷ liÖu thùc vËt chóng t«i ®· thu thËp c¸c th«ng tin khoa häc cña c¸c mÉu thùc vËt vµ c¸c th«ng tin kÌm theo bao gåm: VÞ trÝ lÊy mÉu, thêi gian, m« t¶ mÉu, ¶nh chôp mÉu, tiªu b¶n mÉu…®Ó sö dông trong viÖc t¹o tiªu b¶n mÉu vµ x©y dùng file l−u tr÷ th«ng tin vÒ tõng mÉu thùc vËt. Lµm tiªu b¶n mÉu vµ l−u tr÷ tiªu b¶n mÉu ®−îc l−u tr÷ t¹i ViÖn Ho¸ häc c¸c Hîp chÊt thiªn nhiªn. H×nh ¶nh vµ c¸c th«ng tin chi tiÕt kÌm theo cña c¸c mÉu thùc vËt ®−îc tr×nh bµy trong c¬ së d÷ liÖu x©y dùng riªng cho ®Ò tµi. Qua nghiªn cøu c¸c tµi liÖu trong vµ ngoµi n−íc, ®ång thêi kÕt hîp víi kinh nghiÖm y häc cæ truyÒn trong n−íc. §Ò tµi ®· chän lùa ®−îc h¬n 512 mÉu thùc vËt ë kh¾p mäi miÒn ViÖt Nam vµ tiÕn hµnh thu h¸i theo c¸c ®ît kh¸c nhau. II.2. C¸c ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu. I.2.1. Ph−¬ng ph¸p thu thËp mÉu, gi¸m ®Þnh tªn ph©n lo¹i §Ò tµi ®· tiÕn hµnh 5 ®ît thu lÊy mÉu t¹i c¸c ®Þa ®iÓm ph©n bè thùc vËt ë c¸c tØnh phÝa B¾c ViÖt Nam vµ mét sè mÉu thùc vËt ë c¸c d¶i miÒn Trung vµ Nam ViÖt Nam. Sè mÉu thu ®−îc tËp trung ë 147 hä (512 loµi thùc vËt), c¸c ®Þa ®iÓm thu mÉu ®· ®−îc ghi l¹i trªn b¶n ®å theo c«ng nghÖ GIS. C¸c mÉu thùc vËt thu ®−îc ®−îc gi¸m ®Þnh tªn ph©n loµi theo c¸c tiªu chuÈn ph©n lo¹i thùc vËt. I.2.2. Ph−¬ng ph¸p xö lý mÉu, t¹o dÞch chiÕt phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh sinh häc vµ nghiªn cøu ho¸ häc C¸c mÉu thùc vËt thu thËp ®−îc ®Òu ®−îc xö lý s¬ bé ®Ó æn ®Þnh ho¹t chÊt. Sau ®ã tiÕn hµnh chiÕt mÉu víi MeOH, t¹o dÞch chiÕt th«. C¸c mÉu ®Òu ®−îc chiÕt theo qui tr×nh thèng nhÊt ®−îc x©y dùng trong khu«n khæ ®Ò tµi nµy. a.Xö lý mÉu thùc vËt MÉu thùc vËt sau khi thu vÒ ®−îc tiÕn hµnh b¶o qu¶n, t¹o tiªu b¶n theo quy tr×nh thèng nhÊt sau: 13 - Chôp ¶nh n¬i lÊy mÉu, chôp ¶nh mÉu. - Röa s¹ch ®Ó lo¹i t¹p bÈn. - T¹o tiªu b¶n mÉu. - LËp danh s¸ch mÉu thùc vËt: Ký hiÖu mÉu = VN + H(Korea) + sè thø tù lÊy mÉu. VÝ dô: MÉu c©y Ngò gia b× h−¬ng (Acanthopanax trifoliatus (L).Merr) thu t¹i L¹ng S¬n, mÉu sè thø tù 62 trong ®ît lÊy mÉu. §−îc ký hiÖu lµ VNH-62. C¸c tiªu b¶n mÉu ®−îc l−u gi÷ trong phßng l−u gi÷ mÉu cña ViÖn Hîp chÊt thiªn nhiªn ®Ó ®¶m b¶o mÉu kh«ng bÞ háng vµ mÊt tiªu b¶n, tiÖn cho viÖc tra cøu vµ t×m th«ng tin sau nµy. b. T¹o dÞch chiÕt phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh. Do yªu cÇu cña ph−¬ng ph¸p sµng läc ho¹t tÝnh nªn viÖc chuÈn bÞ c¸c mÉu thùc vËt ®Ó tiÕn hµnh sµng läc cÇn cã mét sù thèng nhÊt trong qu¸ tr×nh chuÈn bÞ mÉu. Qua tham kh¶o vµ nghiªn cøu c¸c quy tr×nh chiÕt mÉu ®Ó sµng läc ho¹t tÝnh sinh häc cña phÝa Hµn quèc chóng t«i ®· x©y dùng quy tr×nh chiÕt c¸c mÉu thùc vËt phôc vô cho ®Ò tµi nh− sau: B−íc 1: ChuÈn bÞ mÉu: C¸c mÉu thùc vËt ®−îc sÊy kh« hoÆc ph¬i kh«. B−íc 2: C©n l−îng mÉu thu ®−îc vµ xay mÉu (Tuú theo lo¹i mÉu thùc vËt: l¸, th©n hoÆc rÔ sö dông c¸c thiÕt bÞ xay vµ nghiÒn mÉu kh¸c nhau). B−íc 3: MÉu thùc vËt ®−îc tiÕn hµnh chiÕt 3 lÇn b»ng MeOH trªn thiÕt bÞ chiÕt siªu ©m (Ultrasonic 2010, 950W) ë nhiÖt ®é 40-50oC, thêi gian chiÕt mçi lÇn tèi thiÓu 60 phót. B−íc 4: DÞch chiÕt cña 3 lÇn chiÕt ®−îc läc qua giÊy läc (Whatman, d=240nm, No 1) gép l¹i vµ tiÕn hµnh cÊt lo¹i dung m«i d−íi ¸p suÊt gi¶m ë nhiÖt ®é d−íi 50oC thu ®−îc dÞch c« MeOH. C¸ch ®¸nh sè ký hiÖu mÉu th«: Ký hiÖu mÉu th« = Ký hiÖu mÉu+ ký hiÖu dung m«i. Trong ®ã: Dung m«i MeOH (Ký hiÖu 00); Dung m«i n-Hexan (01); Dung m«i Clorofom (Ký hiÖu 02); Dung m«i Butanol (Ký hiÖu 03)… VÝ dô: MÉu c©y Ngò gia b× h−¬ng (Acanthopanax trifoliatus (L).Merr) thu t¹i L¹ng s¬n, mÉu sè 62 trong ®ît lÊy mÉu. §−îc ký hiÖu lµ VNH-62.00. B−íc5: C©n dÞch chiÕt vµ tÝnh l−îng cÆn dÞch chiÕt phÇn tr¨m hiÖu suÊt. B−íc 6: B¶o qu¶n mÉu trong c¸c lä ®ùng cÆn dÞch chiÕt (theo tiªu chuÈn b¶o qu¶n mÉu) ®Ó phôc vô sµng läc ho¹t tÝnh vµ l−u tr÷ l©u dµi.. 14 II.2.3. C¸c ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh sinh häc II.2.3.1. Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh kh¸ng NF-kB (Nuclear Factor kappa B assay) C¸c thö nghiÖm ho¹t tÝnh kh¸ng NF-κB ®−îc tiÕn hµnh theo ph−¬ng ph¸p SEAP ASSAY trªn dßng tÕ bµo chuÈn RAW264 t¹i Phßng Nghiªn cøu ung th−, ViÖn Sinh häc vµ C«ng nghÖ sinh häc Hµn Quèc (KRIBB). II.2.3.2.Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh kh¸ng MAO (Monoamine oxidase assay) Monoamine oxidase (MAO) lµ mét enzyme mµng ty l¹p thÓ ngoµi. Monoamine oxidase xóc t¸c cho qu¸ tr×nh «xi ho¸ ®Ò amin c¸c dÉn truyÒn thÇn kinh nh− catecholamine, serotonin… vµ lµ nguyªn nh©n chÝnh g©y ra c¸c bÖnh trÇm uÊt, ham muèn tù tö. Monoamine oxidase tån t¹i d−íi hai d¹ng: MAO-A vµ MAO-B do sù kh¸c biÖt trong ph−¬ng thøc lùa chän c¸c c¬ chÊt mµ nã xóc t¸c, ®é nh¹y c¶m øc chÕ vµ trËt tù c¸c amine trong cÊu tróc ph©n tö. MAO-A ®Ò amine ho¸ chñ yÕu c¸c serotonin, norepinephrine, trong khi MAO-B l¹i «xi ho¸ β-phenylenthylamine vµ benzylamine. C¶ hai enzyme nµy ®Òu tån t¹i trong vá n·o ng−êi, ®Æc biÖt lµ vá n·o tr−íc. Cho ®Õn nay, cÊu tróc kh«ng gian 3 chiÒu cña c¸c ph©n tö MAO vÉn ch−a ®−îc lµm s¸ng tá hoµn toµn. Tõ nh÷ng n¨m 1950, thÕ hÖ ®Çu tiªn c¸c chÊt øc chÕ MAO ®· ®−îc ®−a vµo thö nghiÖm ®Ó ch÷a trÞ c¸c bÖnh trÇm c¶m rÊt tèt, tèt h¬n nh÷ng ch÷a trÇm c¶m th−êng dïng thuéc hä tricyclit. Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, ng−êi ta ®Æc biÖt chó ý ®Õn MAO bëi hai lý do: + Mét lµ, ng−êi ta ®· ph¸t hiÖn ra ®éc tè thÇn kinh 1-methyl-4-phenyl 1,2,3,6-tetrahydro-pyridine (MDTP) lµ nguyªn nh©n g©y ra c¸i chÕt cña c¸c n¬ ron thÇn kinh g©y tiÕt Dopamin vµ lµm gi¶m héi chøng Parkinson ë ng−êi. + Hai lµ, c¸c chÊt øc chÕ MAO kh«ng g©y ra t¸c ®éng phô nh− t¨ng huyÕt ¸p, rèi lo¹n nhÞp tim nh− c¸c ®iÒu trÞ thÇn kinh kh¸c. Vµi n¨m trë l¹i ®©y, c¸c nhµ khoa häc trªn thÕ giíi ®· quan t©m rÊt nhiÒu ®Õn c¸c chÊt øc chÕ MAO cã nguån gèc thiªn nhiªn biÓn do kh¶ n¨ng ch÷a trÞ bÖnh trÇm c¶m, còng nh− ®éc tè thÊp cña chóng. • Nguyªn liÖu C¸c hîp chÊt s¹ch ph©n lËp ®−îc tõ c¸c thùc vËt trong khu«n khæ ®Ò tµi - Chuét nh¾t tr¾ng (Male, ICR, 25-30 g/con) - Dung dÞch ®−êng - Dung dÞch ®Öm KH2PO4 (pH = 7.4 ) - Dung dÞch ®Öm NaH2PO4(pH = 7.4) - Dung dÞch ZnSO4 10% - Dung dÞch KOH 1N - Dung m«i dimethylsulfoside - Dung dÞch kynuramine (c¬ chÊt ) - M¸y ly t©m (Simazu 5400 vßng/phót) - M¸y ®o mËt ®é quang ( HITACHI-F 3000) 15 - Tñ gi÷ nhiÖt (Hitachin,1200C). • Ph−¬ng ph¸p tiÕn hµnh vµ ®äc kÕt qu¶ B−íc 1: ChuÈn bÞ Enzyme Monoamine oxidase MAO tõ n·o chuét tr¾ng. Chuét nh¾t tr¾ng (male, ICR, 25-30 g/con) do Trung t©m ®éng vËt thùc nghiÖm Samyook (Suwon, Korea) cung cÊp. C¸c ph©n ®o¹n ty l¹p thÓ tõ n·o chuét ®−îc ®iÒu chÕ theo ph−¬ng ph¸p cña Naoi vµ ®−îc m« t¶ theo s¬ ®å H×nh II.2.4a. 8.8 g n·o chuét trong 20 ml dung dÞch ®−êng 0.25 M 10 ml dung dÞch ®Öm 10 mM KH2PO4 (pH = 7.4 ) §ång ho¸ 1200 vßng/ phót trong vßng 5 phót 400C DÞch ®ång nhÊt Ly t©m 16000 vßng/phót trong 20 phót, 400C §ãng viªn 1,5 g T¹o huyÒn phï trong 11.5 ml dung dÞch ®Öm 10 mM NaH2PO4(pH=7.4) Enzyme H×nh II.2.4.a: S¬ ®å ®iÒu chÕ MAO th« tõ n∙o chuét B−íc 2: Thö ho¹t tÝnh kh¸ng MAO in vitro Ho¹t tÝnh kh¸ng MAO in vitro ®−îc tiÕn hµnh theo ph−¬ng ph¸p Kraml vµ Naoi cã c¶i biªn lùa chän ph¶n øng vµ m« h×nh chuyÓn ho¸ Kynuramine thµnh 4hydroxy quinoline («xy ho¸ ®Ò amine kynuramine thµnh 4-hydroxy quinoline cã ph¸t huúnh quang). C¸c mÉu cÇn thö nghiÖm ë ®©y lµ c¸c mÉu thùc vËt vµ c¸c hîp chÊt s¹ch ®· ®−îc ph©n lËp, ®−îc pha trong dung m«i dimethylsulfoside (DMSO) theo tû lÖ nång ®é 250 µg/ml. Nång ®é cña 4-hydroxy quinoline ®−îc x¸c ®Þnh b»ng mËt ®é quang vµ ®−îc ®o trªn m¸y HITACHI-F 3000 ë c¸c b−íc sãng 380 nm (ph¸t x¹) vµ 315 nm (kÝch thÝch). Hçn hîp ph¶n øng gåm 75µl dung dÞch ®Öm photphat 0.2 M (pH=7.4) 5 µl enzyme, 2 µg dung dÞch chÊt øc chÕ(c¸c mÉu thö) vµ 20 µl dung dÞch kynuramine (c¬ chÊt). L¾c nhÑ hçn hîp ph¶n øng vµ tiÕn hµnh ph¶n øng trong 30 phót ë nhiÖt ®é 37 0C. Dõng ph¶n øng b»ng c¸ch bæ sung 25 µl dung dÞch ZnSO4 10% vµ 5 µl dung dÞch KOH 1N. Sau ®ã ly t©m hçn hîp ph¶n øng ë 3000 vßng/ phót trong 5 phót, bæ sung thªm 140 µl dung dÞch NaOH 1M cho tr¹ng th¸i ph¸t huúnh quang cña 4- hydroxy quinoline æn ®Þnh. C−êng ®é huúnh quang ®−îc ®o ë b−íc sãng 380 nm (ph¸t x¹) vµ 315 nm (kÝch thÝch). C¸c b−íc tiÕn hµnh thö nghiÖm ®−îc tr×nh bµy ë h×nh II.2.4b. 16 73 ml dung dÞch ®Öm 0.2 M KHPO4 (pH=7.4) 5µl enryme MAO 2µl mÉu thö 20 µl dung dÞch kynuramine 500 µM L¾c, ®−a vµo tñ Êm 370C Gi÷ trong tñ Êm 370 C trong vßng 30 phót Thªm 25 µl ZnSO4 10% vµ 5µl d2 1N NaOH Ly t©m 3000 vßng/phót trong 5 phót. Thªm 140 µl d2 1N NaOH PhÇn dÞch trong §o nång ®é 4-hydroxy quinoline b»ng m¸y HITACHI F3000 (λph¸t x¹ =380 nm λkÝchthÝch =315 nm) H×nh II.2.4b: Thö nghiÖm ho¹t tÝnh kh¸ng MAO cña c¸c hîp chÊt s¹ch thu ®−îc B−íc 3: Xö lý sè liÖu thu ®−îc C«ng thøc tÝnh phÇn tr¨m gi¸ trÞ øc chÕ ho¹t tÝnh kh¸ng MAO Acontr -Asamp Tû lÖ øc chÕ (%) = x100% Acontr -Ablank Trong ®ã: Acontr - C−êng ®é huúnh quang mÉu kiÓm tra (kh«ng cã mÉu thö). Asamp - C−êng ®é huúnh quang mÉu thö. Ablank - C−êng ®é huúnh quang mÉu tr¾ng (kh«ng cã mÉu thö, kh«ng cã enzyme). II.2.3.3. Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo (Cytotoxic activity assay). • Nguyªn liÖu: - Dßng tÕ bµo Dßng KB (Human epidemoid carcinoma - ung th− biÓu m«) tõ phßng thÝ nghiÖm Bioassay tr−êng §¹i häc D−îc Illinois- USA. Dßng Fl (Fibril sarcoma of Uteus - Ung th− mµng tö cung). Dßng RD (Rhabdosarcoma-Ung th− mµng tim ) tõ ViÖn VSDT Trung −¬ng. - M«i tr−êng nu«i cÊy tÕ bµo: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoÆc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt). Cã bæ sung L-glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF (Penixillin-Streptomycin sulfate-Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum). 17