Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Më ®Çu
1. Lý do chän ®Ò tµi
Xoan ta (Melia azedarach L.) lµ c©y th©n gç, sím rông l¸, thuéc hä xoan
(Meliaceae), cã nguån gèc ë Ên ®é, miÒn nam Trung Quèc vµ Australia.
Xoan ta ®−îc ph©n bè ë nhiÒu n−íc nh− ViÖt Nam, Lµo, Campuchia.
Riªng ë ViÖt Nam tõ B¾c vµo Nam hÇu nh− tØnh nµo còng thÊy sù hiÖn diÖn cña
c©y xoan ta, chóng mäc tù nhiªn hoÆc ®−îc trång thµnh rõng [18].
Xoan ta lµ mét trong nh÷ng c©y trång quan träng trong chiÕn l−îc ph¸t
triÓn l©m nghiÖp, ®−îc trång ë 6 trong sè 9 vïng sinh th¸i l©m nghiÖp, trong ®ã
cã c¸c vïng: vïng §ång b»ng s«ng hång, vïng Trung du, vïng T©y b¾c, vïng
Nam trung bé, vïng T©y nguyªn, vïng §«ng nam bé [18].
Xoan ta ®øng ®Çu trong danh môc c¸c c©y trång ®−îc −u tiªn ph¸t triÓn theo
quyÕt ®Þnh sè 16/2005/ Q§BNN ngµy 15/03/2005 cña bé tr−ëng bé N«ng nghiÖp
vµ Ph¸t triÓn N«ng th«n [26].
Xoan ta lµ loµi c©y gç lín cã thÓ cao ®Õn 30m, ®−êng kÝnh gÇn 100cm. Gç
xoan cã lâi mµu hång hay n©u nh¹t, d¸c x¸m tr¾ng, gç nhÑ, v©n thí ®Ñp, nÕu
®−îc ng©m tÈm th× ®©y lµ lo¹i gç kh¸ bÒn vµ khã bÞ mèi mät, cho nªn gç xoan
th−êng ®−îc dïng ®Ó x©y dùng, trang trÝ néi thÊt, ®iªu kh¾c [18].
V× lµ mét loµi c©y mang nhiÒu gi¸ trÞ kinh tÕ nªn hiÖn nay c©y xoan ®ang
khuyÕn khÝch trång vµ ngµy cµng më réng diÖn tÝch. §Ó ®¸p øng nhu cÇu s¶n
xuÊt th× cÇn ®−a ra c¸c gièng míi cã ®Æc ®iÓm nh− kh¸ng bÖnh, chèng chÞu c¸c
®iÒu kiÖn bÊt lîi cña m«i tr−êng, cã chÊt l−îng gç tèt, sinh tr−ëng ph¸t triÓn
nhanh. C«ng nghÖ chuyÓn gen ®· dÇn trë thµnh nh©n tè mang tÝnh ch×a kho¸ ®Ó
gi¶i quyÕt c¸c vÊn ®Ò trªn. Tuy nhiªn, ®Ó thùc hiÖn ®−îc viÖc chuyÓn gen th× ph¶i
cã mét hÖ thèng t¸i sinh c©y hoµn chØnh. Víi môc ®Ých t¹o ra c©y xoan ta cã chÊt
l−îng gç tèt, kh¶ n¨ng sinh tr−ëng, ph¸t triÓn nhanh nhê chuyÓn gen th× tr−íc
tiªn cÇn ph¶i thiÕt lËp ®−îc hÖ thèng t¸i sinh xoan ta invitro ®¹t hiÖu suÊt cao. V×
vËy chóng t«i tiÕn hµnh ®Ò tµi: “Nghiªn cøu hÖ thèng t¸i sinh xoan ta (Melia
azedarach L.) phôc vô chuyÓn gen”.
2. Môc ®Ých nghiªn cøu
DiÖpThÞ Lan
1
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
T¹o ra hÖ thèng t¸i sinh c©y xoan ta invitro hoµn chØnh phôc vô chuyÓn
gen b»ng c¸ch t¹o ®a chåi tõ th©n mÇm, l¸ mÇm.
3. Néi dung nghiªn cøu
ChuÈn bÞ c¸c m«i tr−êng nu«i cÊy kh¸c nhau ®Ó ®¸nh gi¸:
Kh¶ n¨ng c¶m øng t¹o côm chåi tõ l¸ mÇm
Kh¶ n¨ng c¶m øng t¹o côm chåi tõ th©n mÇm
Kh¶ n¨ng kÝch thÝch kÐo dµi chåi
Kh¶ n¨ng t¹o rÔ vµ ra c©y
Sau ®ã t×m ra m«i tr−êng thÝch hîp nhÊt cho sù t¸i sinh cña c©y
4. ý nghÜa khoa häc vµ thùc tiÔn cña ®Ò tµi
§©y lµ h−íng nghiªn cøu míi øng dông c«ng nghÖ gen vµo c¶i tiÕn gièng
xoan ta. ViÖc x©y dùng hÖ thèng t¸i sinh c©y xoan ta hoµn chØnh lµ b−íc ®ét ph¸
quan träng trong quy tr×nh chän t¹o gièng míi cung cÊp cho c¸c ®¬n vÞ trång
rõng, nh»m ph¸t triÓn rõng nguyªn liÖu cã n¨ng suÊt cao phÈm chÊt gç tèt.
Néi dung
DiÖpThÞ Lan
2
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Ch−¬ng 1. Tæng quan tµi liÖu
1.1. C¸c ®Æc ®iÓm tù nhiªn cña c©y xoan ta
Lµ c©y th©n gç ph©n bè ë nhiÒu n−íc trªn thÕ giíi nh− ViÖt Nam, Trung
Quèc, Lµo ... ë ViÖt Nam chóng mäc tù nhiªn hoÆc ®−îc trång thµnh rõng [19].
Xoan ta lµ lo¹i c©y th−êng rông l¸ vµo mïa ®«ng, th©n th¼ng, t¸n l¸ th−a,
vá mµu n©u x¸m. Hoa nhá, ®Òu, l−ìng tÝnh, cã mïi th¬m h¾c víi 5 c¸nh hoa cã
mµu tÝm nh¹t hoÆc tÝm hoa cµ, mäc thµnh côm (h×nh 1).
H×nh 1: ¶nh cµnh xoan mang hoa ®ang në [23]
Qu¶ h¹ch cã mµu vµng nh¹t khi chÝn, treo trªn c©y suèt mïa ®«ng vµ cã
nh©n mµu tr¾ng (h×nh 2) [21].
DiÖpThÞ Lan
3
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
H×nh 2: ¶nh cµnh xoan mang qu¶ [23]
L¸ dµi ®Õn 50 cm mäc so le, cuèng l¸ víi 2 hoÆc 3 lÇn l¸ phøc mäc ®èi, l¸
chÐt mÐp cã r¨ng c−a [21].
HÖ rÔ ngang kh¸ ph¸t triÓn, th−êng ¨n n«ng vµ lan réng, rÔ cäc ¨n s©u.
Xoan th−êng ph©n cµnh sím, kh¶ n¨ng ®©m chåi nhanh nªn cã thÓ lîi dông t¸i
sinh chåi ®−îc [23].
`
Xoan lµ c©y nguyªn s¶n ë c¸c vïng nhiÖt ®íi ¸ vµ nhiÖt ®íi ch©u ¸. Xoan
−a s¸ng, sinh tr−ëng nhanh, sau khi trång tõ 6-8 n¨m cã thÓ thu ho¹ch ®−îc.
Xoan −a khÝ hËu nãng Èm cã 2 mïa: mïa m−a vµ mïa kh«, l−îng m−a hµng n¨m
tõ 1000 mm trë lªn, nh÷ng vïng cã thÓ chÞu ®−îc h¹n víi l−îng m−a hµng n¨m lµ
500 mm [23].
Xoan sinh tr−ëng trªn nhiÒu lo¹i ®Êt kh¸c nhau nh−ng thÝch hîp nhÊt lµ
®Êt pha c¸t, ®Êt phï sa ven s«ng cã ®é ph× cao vµ s©u Èm.
Xoan cã thÓ chÞu ®−îc muèi, l−îng muèi trong ®Êt tõ 0,4-0,5%, ®Êt chua
cã ®é PH 5-6, h¬i kiÒm. Nh÷ng n¬i ®Êt b¹c mµu, kh« h¹n hoÆc óng n−íc ®Òu
kh«ng thÝch hîp víi xoan [23].
Xoan cã kh¶ n¨ng t¸i sinh (mäc l¹i tõ gèc cò ®· thu ho¹ch) tõ 3-4 lÇn [18].
DiÖpThÞ Lan
4
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
C©y trång 3 - 4 n¨m ®· b¾t ®Çu cho qu¶. Chän nh÷ng c©y mÑ tõ 10 - 20
tuæi mäc tõ h¹t, cã th©n th¼ng, ph©n cµnh cao, t¸n l¸ ®Òu, Ýt cµnh ngang, kh«ng
s©u bÖnh ®Ó thu h¸i h¹t lµm gièng [23].
Khi gieo ng©m h¹t trong n−íc Êm kho¶ng 450C trong 8h. NhiÖt ®é thÝch
hîp cho sù n¶y mÇm lµ 16-220C, l−îng m−a trung b×nh tõ 1700-2000 mm [19],
[20].
Xoan lµ c©y th−êng ph©n cµnh sím, v× vËy ®Ó thóc ®Èy c©y sinh tr−ëng,
ph¸t triÓn nhanh vÒ ®−êng kÝnh, chiÒu cao vµ t¹o ra ®o¹n th©n sö dông dµi, cÇn
tiÕn hµnh ch¨m sãc nh−: lµm cá, xíi ®Êt, vun gèc kÕt hîp víi bãn ph©n ®Çy ®ñ
cho c©y ®ång thêi thùc hiÖn tØa cµnh nh©n t¹o ngay tõ khi c©y 1,5 - 3 tuæi. Sau
tuæi nµy kh«ng nªn tØa th−a n÷a v× lóc nµy cµnh ®· lín viÖc tØa th−a dÔ lµm c©y bÞ
rçng ruét [23].
Xoan ®©m chåi rÊt m¹nh, c¶ chåi th©n vµ chåi rÔ do vËy cã thÓ t¹o c©y
chåi sau khi khai th¸c. Kinh nghiÖm nh©n d©n cho biÕt gç c©y mäc tõ chåi
th−êng th¼ng, ch¾c h¬n mäc tõ h¹t nhÊt lµ nh÷ng c©y mäc tõ chåi rÔ [23].
1.2. ý nghÜa kinh tÕ cña c©y xoan
Gç xoan thuéc nhãm gç V, cã lâi mµu hång hay n©u nh¹t, d¸c x¸m tr¾ng,
gç nhÑ mÒm tØ träng 0,565, lùc kÐo ngang thí 22kg/cm2, nÐn däc thí 339kg/cm2
[18].
Gç xoan nhÑ nh−ng kh¸ bÒn Ýt bÞ mèi mät, mÒm rÊt dÔ bµo nh½n, c−a xÎ
tr¹m træ, nh−ng cã nh−îc ®iÓm lµ dÔ nøt. NÕu ®−îc ng©m n−íc tõ 5 - 6 th¸ng th×
trë nªn rÊt bÒn vµ khã bÞ mèi mät cho nªn gç xoan th−êng ®−îc dïng trong x©y
dùng nhµ cöa, ®ãng ®å gia dông, trang trÝ néi thÊt vµ dïng trong ®iªu kh¾c [23].
Than vµ cñi xoan cung cÊp mét l−îng nhiÖt lín. Ngoµi ra l¸, rÔ xoan cßn
dïng lµm ph©n xanh, thuèc s¸t trïng, h¹t cã thÓ Ðp dÇu ch÷a mét sè bÖnh, trång
xoan ®Ó che bãng vµ phßng hé …[18].
Víi ®Æc ®iÓm sinh ho¸ nh− trªn còng nh− cã gi¸ trÞ vÒ nhiÒu mÆt nªn xoan
lµ loµi c©y trång l©m nghiÖp cã nhiÒu tiÒm n¨ng ph¸t triÓn réng r·i.
1.3. T×nh h×nh trång xoan ë n−íc ta
Theo quyÕt ®Þnh cña Bé n«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n ViÖt Nam sè
16/2005/Q§- BNN ngµy 15/03/2005
DiÖpThÞ Lan
5
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Danh môc c¸c loµi c©y chñ yÕu cho trång rõng s¶n xuÊt theo 9 vïng sinh
th¸i l©m nghiÖp.Trong ®ã c¸c vïng trång xoan nh−: vïng T©y b¾c gåm c¸c tØnh
Lai Ch©u, §iÖn Biªn, S¬n La, Hßa B×nh; vïng Trung du (TD) gåm 6 tØnh: Lào
Cai, Yªn B¸i, Hà Giang, Tuyªn Quang, Phó Thä, VÜnh Phóc; vïng ®ång b»ng
s«ng H«ng (§BSH) gåm 10 tØnh: H¶i Phßng, H¶i D−¬ng, B¾c Ninh, H−ng Yªn,
Hµ Néi, Hµ T©y, Th¸i B×nh, Nam §Þnh, Hµ Nam, Ninh B×nh; vïng B¾c Trung Bé
(BTB) gåm 6 tØnh: Thanh Hãa, NghÖ An, Hµ TÜnh, Qu¶ng B×nh, Qu¶ng TrÞ, Thõa
Thiªn HuÕ; vïng Nam Trung Bé (NTB) gåm 7 tØnh: Qu¶ng Nam, Qu¶ng Ng·i,
B×nh §Þnh, Phó Yªn, Kh¸nh Hßa, Ninh ThuËn, B×nh ThuËn; vïng T©y Nguyªn
(TN) gåm 5 tØnh: L©m §ång, §¾k N«ng, §¾c L¾c, Gia Lai, Kon Tum; vïng
§«ng Nam Bé gåm 6 tØnh: Bµ RÞa - Vòng Tµu, §ång Nai, B×nh D−¬ng, B×nh
Ph−íc, T©y Ninh, Tp Hå ChÝ Minh; vïng T©y Nam Bé (TNB) gåm 12 tØnh: Long
An, BÕn Tre, §ång Th¸p, Sãc Tr¨ng, VÜnh Long, CÇn Th¬,TiÒn Giang, B¹c Liªu,
Cµ Mau, Kiªn Giang, An Giang, Trµ Vinh [26].
1.4. C¸c ph−¬ng ph¸p kü thuËt øng dông trong c¶i tiÕn di truyÒn gièng xoan
1.4.1. C¸c kü thuËt truyÒn thèng
Ph−¬ng ph¸p truyÒn thèng nh− gieo h¹t, hom rÔ nh−ng kh¶ n¨ng cung cÊp
víi sè l−îng lín, ®óng mïa vô trång gÆp nhiÒu khã kh¨n. MÆt kh¸c do ph−¬ng
ph¸p nh©n gièng b»ng h¹t cã nhiÒu nh−îc ®iÓm nh−:
Thêi gian b¶o qu¶n ng¾n kho¶ng 6 - 7 th¸ng
C©y sinh tr−ëng vµ ph¸t triÓn kh«ng ®ång ®Òu do cã sù ph©n li trong di
truyÒn
Kh¶ n¨ng kh¸ng s©u bÖnh cña c©y thÊp [18].
1.4.2. Kü thuËt nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt
Ta thÊy c©y xoan cã nhiÒu tiÒm n¨ng ph¸t triÓn réng kh¾p c¸c tØnh. Khi
diÖn tÝch trång xoan t¨ng ®ång nghÜa víi viÖc t¨ng nguån gièng. §Ó kh¾c phôc
nh−îc ®iÓm cña nh©n gièng b»ng h¹t vµ hom rÔ nªn trong thêi gian qua trung
t©m øng dông tiÕn bé khoa häc vµ c«ng nghÖ ®· øng dông thµnh c«ng kü thuËt
nh©n gièng v« tÝnh c©y xoan b»ng ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy m« tÕ bµo nh»m gi¶i
quyÕt nh÷ng khã kh¨n trªn [18].
DiÖpThÞ Lan
6
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
TÝnh −u viÖt cña c©y xoan cÊy m« lµ: ®¶m b¶o ®Æc tÝnh di truyÒn, Ýt tho¸i
ho¸, c©y cã kh¶ n¨ng sinh tr−ëng vµ ph¸t triÓn nhanh, cã ®é ®ång ®Òu cao, ®¶m
b¶o l−îng lín c©y trång ®óng thêi vô [18].
Cã thÓ nãi ®©y lµ mét b−íc ®ét ph¸ quan träng nh»m gi¶i quyÕt khã kh¨n
vÒ nhiÒu mÆt, ®ång thêi s¶n xuÊt cung øng gièng cho c¸c ®¬n vÞ trång rõng kü
thuËt, ph¸t triÓn rõng nguyªn liÖu, ®¶m b¶o chÊt l−îng, n©ng cao n¨ng suÊt c©y
trång [18].
1.5. C¬ së kÜ thuËt cña nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt
1.5.1. TÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo
Nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt lµ ph¹m trï kh¸i niÖm chung cho tÊt c¶ c¸c
lo¹i nu«i cÊy c¸c nguyªn liÖu (tÕ bµo, m«, ph«i...) thùc vËt hoµn toµn s¹ch c¸c vi
sinh vËt trªn m«i tr−êng dinh d−ìng nh©n t¹o trong ®iÒu kiÖn v« trïng [1].
C«ng nghÖ nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt lµ mét trong nh÷ng c«ng nghÖ
quan träng cña c«ng nghÖ sinh häc, lµ nÒn t¶ng ®Ó nghiªn cøu vµ øng dông c¸c
c«ng nghÖ kh¸c trong lÜnh vùc c«ng nghÖ sinh häc thùc vËt [1].
C«ng nghÖ nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt ®−îc tiÕn hµnh ë n−íc ta tõ nh÷ng
n¨m 1960 t¹i miÒn Nam vµ nh÷ng n¨m 1970 t¹i miÒn B¾c. Tuy nhiªn chØ tõ cuèi
nh÷ng n¨m 1980 trë l¹i ®©y c«ng nghÖ m« tÕ bµo míi ph¸t triÓn m¹nh mÏ vµ
nhanh chãng, nhiÒu phßng thÝ nghiÖm, nghiªn cøu ®· ®−îc x©y dùng vµ triÓn
khai ë hÇu kh¾p c¸c tØnh thµnh trong c¶ n−íc [ 22].
C¬ së nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt lµ tÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo, ®iÒu nµy
lÇn ®Çu tiªn ®−îc haberlandt (1902) ®Ò cËp, «ng cho r»ng: mçi tÕ bµo bÊt kú cña
c¬ thÓ ®a bµo ®Òu tiÒm tµng kh¶ n¨ng ph¸t triÓn thµnh mét c¸ thÓ hoµn chØnh.
Theo quan ®iÓm cña sinh häc hiÖn ®¹i th× mçi tÕ bµo riªng rÏ ®· ph©n ho¸
®Òu mang toµn bé th«ng tin di truyÒn cña toµn bé c¬ thÓ. Trong ®iÒu kiÖn thÝch
hîp, mçi tÕ bµo ®Òu cã thÓ ph¸t triÓn thµnh mét c¬ thÓ hoµn chØnh, ®ã lµ tÝnh toµn
n¨ng cña tÕ bµo. TÝnh toµn n¨ng lµ c¬ së cña ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy m«, tÕ bµo
thùc vËt, trªn c¬ së ®ã ng−êi ta ®· t¹o ®−îc mét c¬ thÓ thùc vËt hoµn chØnh tõ mét
tÕ bµo riªng rÏ [1].
HiÖn nay, ng−êi ta ®· thùc hiÖn ®−îc kh¶ n¨ng t¹o ra ®−îc mét c¬ thÓ thùc
vËt hoµn chØnh tõ mét tÕ bµo riªng rÏ [1].
DiÖpThÞ Lan
7
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
1.5.2. Sù ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n hãa cña tÕ bµo
C¬ thÓ thùc vËt tr−ëng thµnh lµ mét tæng thÓ thèng nhÊt bao gåm nhiÒu c¬
quan kh¸c nhau, cã chøc n¨ng kh¸c nhau vµ ®−îc h×nh thµnh tõ nhiÒu lo¹i tÕ bµo
kh¸c nhau. Tuy nhiªn, tÊt c¶ c¸c lo¹i tÕ bµo ®Òu b¾t nguån tõ tÕ bµo hîp tö ban
®Çu. TÕ bµo hîp tö lóc ®Çu ph©n chia thµnh khèi tÕ bµo ch−a chuyªn hãa. C¸c tÕ
bµo ch−a chuyªn hãa nµy tiÕp tôc ph©n chia thµnh c¸c tÕ bµo chuyªn ho¸ ®Æc
tr−ng cho c¸c m«, c¬ quan cã chøc n¨ng kh¸c nhau. §ã lµ hiÖn t−îng ph©n ho¸ tÕ
bµo. Tuy nhiªn, c¸c tÕ bµo chuyªn hãa thµnh c¸c tÕ bµo chuyªn biÖt l¹i kh«ng
mÊt sù hoµn toµn biÕn ®æi cña m×nh. Trong nh÷ng ®iÒu kiÖn thÝch hîp nhÊt ®Þnh
chóng cã thÓ trë thµnh d¹ng tÕ bµo nh− tÕ bµo ban ®Çu, nghÜa lµ ë d¹ng tÕ bµo
ch−a chuyªn ho¸. HiÖn t−îng nµy gäi lµ hiÖn t−îng ph¶n ph©n hãa tÕ bµo [1].
Sù ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n hãa tÕ bµo lµ mét qu¸ tr×nh ho¹t hãa, øc chÕ
ho¹t ®éng cña c¸c gen. Trong mét giai ®o¹n ph¸t triÓn nhÊt ®Þnh cña c©y, mét sè
gen nµo ®ã ®ang ë tr¹ng th¸i øc chÕ kh«ng ho¹t ®éng ®−îc ho¹t hãa ®Ó cho ra
mét tÝnh tr¹ng biÓu hiÖn míi. Ng−îc l¹i mét sè gen l¹i bÞ øc chÕ ®×nh chØ ho¹t
®éng. Qu¸ tr×nh ho¹t hãa, øc chÕ diÔn ra theo mét ch−¬ng tr×nh ®· ®−îc lËp s½n
trong cÊu tróc gen cña tÕ bµo, gióp cho sù sinh tr−ëng, ph¸t triÓn cña c¬ thÓ tÕ
bµo thùc vËt ®−îc hµi hßa. Sù ho¹t ®éng hµi hoµ cña tÕ bµo vµ m« c¬ quan cßn
phô thuéc vµo tÕ bµo n»m trong khèi m«, c¬ quan cña c¬ thÓ. Khi t¸ch riªng tõng
tÕ bµo, hoÆc lµm gi¶m kÝch th−íc khèi m« sÏ t¹o ®iÒu kiÖn cho viÖc ho¹t hãa c¸c
gen cña tÕ bµo [1].
KÜ thuËt nu«i cÊy m«, tÕ bµo thùc chÊt lµ ®iÒu khiÓn ph¸t triÓn sù ph¸t sinh
h×nh th¸i cña tÕ bµo thùc vËt mét c¸ch cã ®Þnh h−íng dùa vµo sù ph©n hãa vµ
ph¶n ph©n hãa cña tÕ bµo thùc vËt. §Ó ®iÒu khiÓn sù ph¸t sinh h×nh th¸i cña tÕ
bµo, ng−êi ta bæ sung vµo m«i tr−êng nu«i cÊy hai nhãm ®iÒu hoµ sinh tr−ëng
thùc vËt lµ auxin vµ cytokinin. Tû lÖ hµm l−îng cña 2 nhãm chÊt ®iÒu hoµ sinh
tr−ëng nµy trong m«i tr−êng nu«i cÊy m« kh¸c nhau sÏ ®Þnh h−íng cho sù ph¸t
sinh h×nh th¸i (ph¸t sinh chåi, rÔ hoÆc m« sÑo) cña m« nu«i cÊy kh¸c nhau.
Trong m«i tr−êng nu«i cÊy, tû lÖ nång ®é auxin/cytokinin (®¹i diÖn lµ IAA/KIN)
lµ thÊp th× nu«i cÊy ph¸t sinh theo h−íng t¹o chåi, tû lÖ nµy cao th× m« nu«i cÊy
DiÖpThÞ Lan
8
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
sÏ t¹o ra m« sÑo. M« sÑo lµ d¹ng tÕ bµo ch−a ph©n ho¸ ph©n chia liªn tôc vµ cã
kh¶ n¨ng h×nh thµnh ph«i, chåi vµ c©y hoµn chØnh [1].
1.6. Nu«i cÊy m« xoan
1.6.1. L−îc sö nu«i cÊy m« xoan
Nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt ®· ®−îc tiÕn hµnh trªn nhiÒu ®èi lo¹i c©y nh−:
l¹c, ®Ëu t−¬ng, cµ chua, hoa loa kÌn, xoan... vµ ®· ®¹t ®−îc nh÷ng kÕt qu¶ nhÊt
®Þnh ®Ó phôc vô cho nhiÒu môc ®Ých cña con ng−êi vÝ dô nh− phôc vô cho chuyÓn
gen, nh©n gièng ®Ó b¶o tån c¸c gièng quý... [3], [4], [5], [7], [8].
N«ng V¨n H¶i, Lª Xu©n §¾c, Hµ Hång H¶i, §µo ThÞ Thu Hµ, NguyÔn
Thanh Danh, Lª ThÞ Xu©n, Lª TrÇn B×nh ®· x©y dùng ®−îc thµnh c«ng quy tr×nh
nh©n nhanh invitro c©y Mµng tang ®Ó b¶o tån gièng quý [4].
NguyÔn ThÞ Ph−¬ng Th¶o, NguyÔn Quang Th¹ch, Hoµng ThÞ Mai ®·
nghiªn cøu nh©n nhanh gièng hoa loa kÌn b»ng kü thuËt nu«i cÊy invitro nh»m
t¹o ra nhiÒu gièng cung øng cho c¸c nhµ s¶n xuÊt [8].
§èi víi ®èi t−îng lµ ®Ëu t−¬ng NguyÔn ThÞ Nh−, §ç TiÕn Ph¸t, Lª ThÞ
Muéi, §inh ThÞ Phßng ®· nghiªn cøu ®−îc hÖ thèng t¸i sinh c©y qua ph«i soma
®èi víi gièng §T12. HiÖu suÊt t¸i sinh ®¹t 39% vµ sè ph«i trung b×nh lµ 7,5. §©y
lµ b−íc ®Çu ®Ó cã thÓ nghiªn cøu viÖc chuyÓn gen nh»m n©ng cao n¨ng suÊt vµ
chÊt l−îng cña c¸c s¶n phÈm tõ ®Ëu t−¬ng[5].
Ngoµi ra ng−êi ta cßn nghiªn cøu quy tr×nh t¸i sinh c©y l¹c, c©y cµ chua
phôc vô chuyÓn gen [3], [7].
Xoan lµ mét ®èi t−îng c©y l©m nghiÖp quan träng vµ ®· ®−îc nghiªn cøu
nhiÒu. Cho ®Õn nay ®· cã nhiÒu c«ng tr×nh cña nhiÒu nhµ khoa häc nghiªn cøu vÒ
t¸i sinh xoan phôc vô chuyÓn gen nh−: Ahmad vµ céng sù 1990, Thakur vµ céng
sù 1998, Vila vµ céng sù 2003-2005, míi ®©y nhÊt lµ Sharry vµ céng sù 2006
[10], [13], [15], [16].
N¨m 1998 Thakur vµ céng sù ®· nghiªn cøu t¹o côm chåi tõ l¸ mÇm vµ
®¹t tØ lÖ t¹o ®a chåi lµ 74% trong 7-9 tuÇn nu«i cÊy [15].
N¨m 2005 Vila vµ céng sù ®· nghiªn cøu t¸i sinh chåi tõ rÔ xoan ta víi
viÖc sö dông 0,44 μM BAP cho tØ lÖ t¹o côm chåi lµ 66,8% kh«ng cã chÊt ®iÒu
hoµ sinh tr−ëng tØ lÖ t¹o côm chåi lµ 40,3% [16].
DiÖpThÞ Lan
9
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
N¨m 2006 Sharry vµ Teixeira dasilva sö dông BAP kÕt hîp víi NAA trong
viÖc c¶m øng t¹o chåi vµ ®· t¹o ®−îc 160-200 chåi/g mÉu cÊy [16].
ë ViÖt Nam, theo b¸o c¸o n¨m 2007 cña Hå V¨n Gi¶ng tr−êng §¹i häc
L©m nghiÖp ®· tuyÓn chän ®−îc 15 c©y tréi cã s¶n l−îng gç cao lÊy mÉu nu«i
cÊy m«. §ang x¸c ®Þnh chØ tiªu chÊt l−îng cã liªn quan ®Õn s¶n l−îng vµ chÊt
l−îng gç. §· t¹o ®−îc mÉu s¹ch invitro xoan ta, b−íc ®Çu ®· x¸c ®Þnh ®−îc lo¹i
vËt liÖu nu«i cÊy t¹o ph«i soma vµ côm chåi, ®· t¸i sinh ®−îc ph«i soma vµ côm
chåi. HiÖn ®ang tiÕn hµnh nghiªn cøu tiÕp ®Ó hoµn thiÖn quy tr×nh kÜ thuËt t¸i
sinh c©y xoan ta th«ng qua ph«i soma vµ ®a chåi [25].
N¨m 2007 theo b¸o c¸o cña §oµn ThÞ Mai ViÖn khoa häc L©m nghiÖp
ViÖt Nam ®· tiÕn hµnh c¸c thÝ nghiÖm nh©n gièng sinh d−ìng b»ng nu«i cÊy m«
cho 36 dßng, b−íc ®Çu ®· t×m ra ®−îc m«i tr−êng thÝch hîp cho tõng dßng, hÖ sè
nh©n chåi ®¹t tõ 5,5 – 9,2 chåi/ côm chåi [24].
Nghiªn cøu ra rÔ chåi xoan ta Sharry vµ Teixeira dasilva (2006), sö dông
IBA ë nång ®é thÊp 0,049μM tØ lÖ chåi ra rÔ chØ ®¹t 17% nh−ng khi sö dông
NAA ë nång ®é thÊp 0,054μM th× tØ lÖ ra rÔ thu ®−îc 100% sau 6 tuÇn nu«i cÊy
[13].
1.6.2. ¶nh h−ëng cña c¸c thµnh phÇn m«i tr−êng ®Õn nu«i cÊy m« xoan
Thµnh phÇn v« c¬ bao gåm c¸c muèi kho¸ng (c¶ ®a l−îng vµ vi l−îng)
®−îc ®−a vµo m«i tr−êng nu«i cÊy. Nhu cÇu vÒ muèi kho¸ng cña tÕ bµo vµ m«
thùc vËt t¸ch rêi lµ kh«ng kh¸c nhiÒu so víi yªu cÇu cña c©y ®−îc trång trong
®iÒu kiÖn tù nhiªn. Trong thµnh phÇn muèi kho¸ng ®a l−îng c¸c nguyªn tè ph¶i
cung cÊp lµ nit¬, kali, photpho…[2].
Nit¬ v« c¬ ®−îc ®−a vµo m«i tr−êng ë 2 d¹ng lµ nitrat (NO3-) vµ amon
( NH4+ ). §a sè c¸c m«i tr−êng cã chøa d¹ng nitrat nhiÒu h¬n amon. Theo
Narayanas Wamy (1994) hµm l−îng nitrat trong nhiÒu m«i tr−êng kho¶ng 25μM
cßn cña amon tõ 2 - 20 μM [2].
Trong m«i tr−êng MS amon ®−îc cung cÊp ë d¹ng muèi NH4NO3,, cßn
m«i tr−êng B5 cña Gramborg cã amon ë d¹ng muèi (NH4)2SO4 - c¸c gèc nitrat
®−îc ®−a vµo m«i tr−êng d−íi d¹ng muèi nitrat canxi, nitrat kali hoÆc nitrat
amon. Khi m«i tr−êng chØ chøa nit¬ ë d¹ng dÔ g©y kiÒm ho¸ m«i tr−êng v× thÕ
DiÖpThÞ Lan
10
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Yªu cÇu vÒ muèi kho¸ng vi l−îng cña m« thùc vËt trong nu«i cÊy kh¸
phøc t¹p vµ Ýt ®−îc nghiªn cøu. Tuy nhiªn trong nhiÒu lo¹i m«i tr−êng c¬ b¶n ®·
®−îc x©y dùng, c¸c t¸c gi¶ ®Òu cung cÊp cho m«i tr−êng hÇu hÕt c¸c nguyªn tè vi
l−îng cÇn thiÕt nh»m môc ®Ých ®Ó thóc ®Èy sù sinh tr−ëng vµ ph¸t triÓn cña mÉu
nu«i cÊy [2].
S¾t ®−îc ®−a vµo m«i tr−êng d¹ng muèi FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3. Nh−ng
chóng sÏ bÞ kÕt tña vµ mÉu nu«i cÊy rÊt khã hÊp thô c¸c lo¹i muèi nµy do ®ã ph¶i
cho thªm vµo m«i tr−êng nu«i cÊy Na2EDTA (sodium ethyline diamine tetra
acetate) ®Ó t¹o muèi phøc Na2FeEDTA (d¹ng selat) cã ch−a Na, Fe vµ ®−îc m«
nu«i cÊy hÊp thô dÔ dµng [2].
Ngoµi ra c¸c thµnh phÇn h÷u c¬ còng cã ¶nh h−ëng tíi nu«i cÊy m«.
Nguån cacbon cung cÊp cho mÉu nu«i cÊy chÝnh lµ ®−êng sucrose,
maltose...®−îc sö dông trong m«i tr−êng. Bªn c¹nh vai trß lµ nguån n¨ng l−îng,
vËt chÊt c¬ b¶n, ®−êng cßn t¹o ra mét ¸p lùc thÈm thÊu gióp cho m« cã sù c©n
b»ng cÇn thiÕt víi m«i tr−êng nu«i cÊy [2].
C¸c t¸c nh©n t¹o g el: quyÕt ®Þnh tr¹ng th¸i vËt lý cña m«i tr−êng nu«i cÊy.
C¸c m«i tr−êng chøa ®ñ hµm l−îng chÊt t¹o gel lµm cho chóng ®«ng l¹i ë nhiÖt
®é b×nh th−êng (25 - 30oC) [2].
ChÊt gel ®−îc sö dông phæ biÕn lµ agar (thạch) gåm mét sè polysaccharide
®−îc lÊy tõ rong biÓn. C¸c polysaccharide kÕt hîp víi c¸c ph©n tö n−íc t¹o thµnh
polymer vµ ®«ng l¹i thµnh gel ë nhiÖt ®é 450C. Hµm l−îng agar sö dông kho¶ng
0,5 - 10% tuú theo chÊt l−îng cña chóng vµ lo¹i m«i tr−êng ®−îc sö dông. NÕu
nhiÒu qu¸ g©y h¹n chÕ kh¶ n¨ng trao ®æi chÊt gi÷a c¬ thÓ víi m«i tr−êng [2].
Mét sè tr−êng hîp ng−êi ta cßn bæ sung Adenin nång ®é 40 - 80mg/lit.
1.6.3. ¶nh h−ëng cña c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng ®Õn nu«i cÊy m« xoan
DiÖpThÞ Lan
11
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
C¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng cã vai trß quan träng trong kÜ thuËt nu«i cÊy
m« thùc vËt. B»ng c¸ch cung cÊp c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng ë mét møc thÝch
hîp ng−êi nghiªn cøu cã thÓ ®iÒu khiÓn ®−îc chiÒu h−íng ph¸t sinh h×nh th¸i
cña mÉu nu«i cÊy. Auxin vµ cytokinin lµ 2 chÊt ®−îc sö dông phæ biÕn nhÊt.
Ngoµi ra ng−êi ta cßn sö dông gibberellin [6].
HiÖu qu¶ t¸c ®éng cña chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng phô thuéc vµo nång ®é sö
dông, ho¹t tÝnh vèn cã cña chóng vµ mÉu nu«i cÊy.
Auxin cã hiÖu qu¶ kÝch thÝch sù sinh tr−ëng cña tÕ bµo, cïng víi cytokinin
lµm t¨ng ph©n bµo, h¹n chÕ −u thÕ ®Ønh, kÝch thÝch sù h×nh thµnh rÔ vµ tham gia
vµo c¶m øng ph«i v« tÝnh [6].
C¸c lo¹i Auxin th−êng sö dông trong nu«i cÊy lµ:
IAA - Indole acetic acid
IBA - Indole butyric acid
NOA - Naphthoxy acetic acid
NAA - Naphthalene acetic acid
2,4D - 2,4 dichlorophenoxy acetic cid
IAA Ýt ®−îc sö dông do kÐm bÒn víi nhiÖt vµ ¸nh s¸ng, nh÷ng tr−êng hîp cã bæ
sung IAA vµo m«i tr−êng nghiªn cøu th× ph¶i dïng ë nång ®é cao 1,0 - 30mg/l
(Dodds anh Roberts 1990) [2].
Theo Thakur vµ céng sù (2004), Vila vµ céng sù (2005) víi viÖc sö dông
m«i tr−êng MS bæ sung thªm IBA ë nång ®é cao vµo giai ®o¹n tiÒn c¶m øng sÏ
t¨ng c−êng kh¶ n¨ng ra rÔ chåi xoan ta invitro [15], [16], [17].
C¸c auxin kh¸c cã hµm l−îng sö dông tõ 0,1 - 2,0 mg/lit - chóng cã hiÖu
qu¶ sinh lý ë nång ®é thÊp. Tuú lo¹i auxin hµm l−îng sö dông vµ ®èi t−îng nu«i
cÊy mµ t¸c ®éng sinh lý cña auxin lµ kÝch thÝch sinh tr−ëng cña m«, ho¹t ho¸ sù
h×nh thµnh rÔ hay thóc ®Èy sù ph©n chia m¹nh mÏ cña tÕ bµo dÉn ®Õn h×nh thµnh
m« sÑo (callus) [2].
Cytokinin kÝch thÝch sù ph©n chia tÕ bµo, sù h×nh thµnh vµ sinh tr−ëng cña
chåi invitro. C¸c cytokinin cã biÓu hiÖn øc chÕ sù t¹o rÔ vµ sù sinh tr−ëng cña m«
sÑo nh−ng cã ¶nh h−ëng d−¬ng tÝnh râ rÖt ®Õn ph¸t sinh ph«i v« tÝnh cña mÉu
nu«i cÊy [6].
DiÖpThÞ Lan
12
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
C¸c lo¹i cytokinin th−êng dïng lµ: Kinetin (KIN), zeatin, 6Bentyl amino
purin (6BAP), Isopentenyl adenin (Zip) [2].
Kinetin ®−îc nhµ khoa häc Skoog ph¸t hiÖn ngÉu nhiªn trong khi chiÕt
xuÊt axit nucleic, kinetin thùc chÊt lµ mét dÉn xuÊt cña baz¬ nit¬ adenin.
BAP lµ cytokinin ®−îc tæng hîp nh©n t¹o cã ho¹t tÝnh m¹nh h¬n kinetin
[6].
Theo b¸o c¸o cña Joarder vµ céng sù (1993) BAP thùc chÊt lµ ®iÒu hoµ
sinh tr−ëng rÊt tèt cho viÖc ph¸t sinh chåi c©y neem [17].
BAP ®−îc sö dông ë nång ®é 0,44 μM ®· cho tØ lÖ t¹o côm chåi tõ l¸ mÇm
lµ 66,8%, BAP tèt h¬n c¸c cytokinin kh¸c trong viÖc c¶m øng ph¸t sinh chåi ë
c©y gç [14], [16].
BAP ë nång ®é 4,44 μM kÝch thÝch c¶m øng t¹o ph«i soma ®¹t tØ lÖ cao
nhÊt.
Hµm l−îng sö dông c¸c lo¹i cytokinin dao ®éng tõ 0,1 - 2,0 mg/lit. ë
nh÷ng nång ®é cao h¬n cytokinin kÝch thÝch râ rÖt sù h×nh thµnh chåi bÊt ®Þnh
®ång thêi øc chÕ m¹nh sù t¹o thµnh rÔ cña chåi nu«i cÊy. Trong c¸c lo¹i
cytokinin nãi trªn th× KIN vµ BAP lµ 2 lo¹i ®−îc sö dông réng r·i h¬n c¶ [2].
Trong nu«i cÊy cã lo¹i mÉu chØ cÇn auxin hoÆc cytokinin hoÆc kh«ng cÇn
c¶ 2, ®a sè c¸c tr−êng hîp sö dông phèi hîp c¶ auxin vµ cytokinin ë nh÷ng
tr−êng hîp tû lÖ kh¸c nhau [2].
T¸c ®éng phèi hîp cña auxin vµ cytokinin cã t¸c dông quyÕt ®Þnh ®èi víi
sù ph¸t triÓn vµ ph¸t sinh h×nh th¸i cña m«, tÕ bµo. Nh÷ng nghiªn cøu cña Skoog
cho thÊy tû lÖ auxin/cytokinin cao th× thÝch hîp cho sù h×nh thµnh rÔ, tû lÖ thÊp
sÏ kÝch thÝch qu¸ tr×nh ph¸t sinh chåi. NÕu tû lÖ nµy ë møc ®é c©n b»ng th× thuËn
lîi cho ph¸t triÓn m« sÑo. Das (1958) vµ Nitsel (1968) kh¼ng ®Þnh r»ng chØ khi
t¸c ®éng ®ång thêi cña auxin vµ cytokinin th× míi kÝch thÝch m¹nh mÏ sù tæng
hîp ADN, liªn quan ®Õn qu¸ tr×nh ph©n chia tÕ bµo [9].
1.6.4. ¶nh h−ëng cña c¸c ®iÒu kiÖn nu«i cÊy
C¸c mÉu nu«i cÊy th−êng ®−îc ®Æt trong phßng nu«i æn ®Þnh vÒ ¸nh s¸ng
vµ nhiÖt ®é. TÊt c¶ c¸c tÕ bµo m« nu«i cÊy ®Òu cÇn ¸nh s¸ng trõ mét sè tr−êng
hîp nu«i cÊy t¹o m« sÑo, nh−ng trong qu¸ tr×nh t¸i sinh vµ nh©n gièng cña chóng
DiÖpThÞ Lan
13
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
1.6.5. ¶nh h−ëng cña pH
PH cña ®a sè m«i tr−êng nu«i cÊy ®Òu ®−îc ®iÒu chØnh trong ph¹m vi tõ
5,5 - 6.0. PH d−íi 5,5 lµm cho agar khã chuyÓn sang tr¹ng th¸i gel cßn pH > 6,0
agar cã thÓ rÊt cøng. NÕu trong thµnh phÇn m«i tr−êng nu«i d−ìng cã GA3 th×
ph¶i ®iÒu chØnh gi¸ trÞ pH cña ph¹m vi nãi trªn. V× pH qu¸ kiÒm hoÆc qu¸ acid,
GA3 sÏ chuyÓn sang d¹ng kh«ng cã ho¹t tÝnh (Vanbrapt and piert 1971). Trong
qu¸ tr×nh nu«i cÊy, pH cña m«i tr−êng cã thÓ gi¶m xuèng do mét sè mÉu thùc vËt
s¶n sinh ra c¸c axit h÷u c¬ [2].
DiÖpThÞ Lan
14
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Ch−¬ng 2:
VËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu
2.1. VËt liÖu nghiªn cøu
2.1.1. VËt liÖu thùc vËt
Qu¶ xoan ta thu h¸i vµ chän läc tõ nh÷ng c©y tréi ®−îc trung t©m gièng vµ
c«ng nghÖ sinh häc, viÖn sinh th¸i rõng vµ m«i tr−êng, §¹i häc l©m nghiÖp cung
cÊp. Sau ®ã lo¹i bá phÇn thÞt qu¶ b»ng c¬ giíi vµ t¸ch lÊy h¹t lµm vËt liÖu nu«i
cÊy.
2.1.2. Dông cô vµ ho¸ chÊt thÝ nghiÖm
C¸c ®iÒu kiÖn m¸y mãc vµ ho¸ chÊt ®−îc phßng C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt
- ViÖn c«ng nghÖ sinh häc cung cÊp.
M«i tr−êng nu«i cÊy, m«i tr−êng c¬ b¶n MS ®−îc sö dông trong nghiªn
cøu gåm c¸c muèi ®a l−îng vµ vi l−îng theo Murashige vµ Skoog
Dông cô: nåi khö trïng, tñ cÊy, b×nh tam gi¸c, pipet, lß vi sãng, tñ sÊy,
m¸y chuÈn pH....
Ho¸ chÊt: m«i tr−êng MS, m«i tr−êng B5 theo Gamborg, sucrose, 8gam
agar/lit, pH = 5,8 ( b¶ng 1).
DiÖpThÞ Lan
15
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
B¶ng 1: Thµnh phÇn m«i tr−êng MS (theo Murashige vµ Skoog)
STT
Thµnh phÇn
Nång ®é
Muèi kho¸ng
1
NH4N03
1650 mg/lit
2
KN03
1900 mg/lit
3
CaCl2.2H20
440 mg/lit
4
MgS04.7H20
370 mg/lit
5
KH2P04
170 mg/lit
6
H3B03
6,2 mg/lit
7
MnS04.4H20
22,3 mg/lit
8
ZnS04.7H20
8,6 mg/lit
9
KI
0.83 mg/lit
10
Na2Mo04.2H20
0,25 mg/lit
11
CuS04.5H20
0,025 mg/lit
12
CoCl2.6H20
0,025 mg/lit
13
Na2EDTA
37,3 mg/lit
14
FeS04.7H20
27,8 mg/lit
C¸c chÊt h÷u c¬ vµ vitamin
15
Myo - Inositol
100 mg/lit
16
Nicotinic acid
0,5 mg/lit
17
Vitamin B1
0,5 mg/lit
18
Vitamin B6
0,1 mg/lit
19
Glycine
2,0 mg/lit
20
sucrose
30 g/lit
21
Agar
8 g/lit
pH
5,6
B
B
DiÖpThÞ Lan
16
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
2.2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu
Khö trïng m«i tr−êng vµ dông cô nu«i cÊy ë nhiÖt ®é 1210C, ¸p suÊt 1,5
atm trong 15 phót. Nu«i cÊy trong ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é 25 ± 20C c−êng ®é ¸nh s¸ng
3000 lux víi thêi gian chiÕu s¸ng 16h/ngµy.
T¸i sinh côm chåi b»ng nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt gåm c¸c b−íc theo s¬ ®å
[27].
C©y gièng trong v−ên gièng
®Çu dßng
Khö trïng
M«i tr−êng MS c¨n b¶n
Chåi con trong èng nghiÖm
CÊy chuyÓn
M«i tr−êng nh©n chåi
Côm chåi
M«i tr−êng nh©n chåi
M«i tr−êng v−¬n th©n
C©y con chuÈn bÞ ra rÔ
M«i tr−êng ra rÔ
C©y con hoµn chØnh
Nhµ huÊn luyÖn
DiÖpThÞ Lan
¦¬m c©y trong v−ên −¬m
17
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Chóng t«i tiÕn hµnh t¸i sinh côm chåi tõ l¸ mÇm, th©n mÇm theo c¸c b−íc
nh− sau:
V« trïng mÉu
T¹o côm chåi
KÐo dµi chåi
KÐo dµi rÔ vµ hoµn thiÖn c©y con invitro
§−a c©y ra nhµ l−íi
2.2.1. Khö trïng mÉu vµ chuÈn bÞ nguyªn liÖu t¹o chåi
H¹t ®−îc s¸t khuÈn bÒ mÆt b»ng ethanol trong 3 phót.
Khö trïng b»ng javen 60% trong 30 phót (l¾c m¹nh).
Lo¹i bá javen vµ röa s¹ch b»ng n−íc cÊt v« trïng 5 lÇn.
H¹t sau khi khö trïng ®−îc nu«i cÊy trªn m«i tr−êng dinh d−ìng MS bæ
sung thªm sucrose víi mËt ®é 15 h¹t/b×nh tam gi¸c 250 ml.
2.2.2. C¶m øng t¹o côm chåi
Sau 3 tuÇn nu«i cÊy h¹t n¶y mÇm, ph©n l¸ mÇm ®−îc c¾t bá viÒn l¸ vµ c¾t
®«i, phÇn th©n mÇm c¾t thµnh nh÷ng ®o¹n nhá cã kÝch th−íc 4 -5 mm cÊy lªn
m«i tr−êng MS bæ sung thªm vitamin B5 (Gamborg vµ céng sù 1968) vµ 3%
sucrose + 0,44 - 13,32 μM, 6BAP+ + 0,46 μM KIN nu«i cÊy trong 4 tuÇn.
2.2.3. KÝch thÝch kÐo dµi chåi
C¸c chåi ®−îc t¸i sinh ra tõ côm chåi vµ cÊy chuyÓn sang m«i tr−êng kÝch
thÝch kÐo dµi chåi MS bæ sung thªm vitamin B5 + 3% sucrose + 0,44 - 2,22 μM
BAP + 0,3 μM GA3 nu«i cÊy trong 4 tuÇn.
2.2.4. Kh¶ n¨ng t¹o rÔ vµ ra c©y hoµn thiÖn c©y con invitro
C¸c chåi ®¹t chiÒu dµi 20 – 30 mm ®Çu tiªn ®−îc cÊy lªn m«i tr−êng tiÒn
c¶m øng t¹o rÔ MS bæ sung thªm 2% sucrose + 12,30 mM IAB nu«i cÊy trong 4
ngµy vµ sau ®ã cÊy sang m«i tr−êng MS cã bæ sung thªm 1% sucrose, kh«ng bæ
sung chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng. Nu«i tiÕp trong 4 tuÇn ®Ó kÐo dµi rÔ.
2.2.5. §−a c©y ra nhµ l−íi
C©y m« hoµn chØnh ®−îc ®−a ra nhµ l−íi, trång trªn gi¸ thÓ trÊu hun
100%, trÊu hun pha c¸t tØ lÖ 1:1, c¸t 100% trong vßng 2 tuÇn ®Çu ¸nh s¸ng trùc
x¹. TÊt c¶ m«i tr−êng nu«i cÊy ®Òu ®−îc chuÈn ®é pH = 5,8 vµ bæ sung thªm agar
DiÖpThÞ Lan
18
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
2.2.5. Ph−¬ng ph¸p xö lÝ sè liÖu thùc nghiÖm
Sè liÖu ®−îc xö lÝ ®¸nh gi¸ theo ph−¬ng ph¸p to¸n thèng kª trªn m¸y tÝnh
nhê phÇn mÒm Excel - 2003 víi c¸c th«ng sè trung b×nh sè häc, ®é lÖch chuÈn,
hÖ sè biÕn ®éng, sai sè cña trung b×nh sè häc, sai sè cña hiÖu c¸c trung b×nh sè
häc, tiªu chuÈn ®é tin cña hiÖu.
Trung b×nh sè häc:
1
n
=
X
n
∑
X
(X
−
i= 0
i
δ y
δ x
δ
=
C V
=
m
m
d
td =
δ
=
X
)
2
n − 1
* 1 0 0
X
δ
n
=
m
d
m
2
1
+ m
2
2
d
DiÖpThÞ Lan
19
Líp K31A
Tr−êng §HSP Hμ Néi 2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Ch−¬ng 3:
KÕt qu¶ vµ th¶o luËn
3.1. Kh¶ n¨ng c¶m øng côm chåi tõ l¸ mÇm
Nghiªn cøu sù ¶nh h−ëng cña chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng BAP vµ KIN,
NAA lªn kh¶ n¨ng c¶m øng t¹o côm chåi tõ l¸ mÇm c©y xoan ta, kÕt qu¶ thu
®−îc ghi ë b¶ng 2 nh− sau:
B¶ng 2: ¶nh h−ëng cña c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng ®Õn kh¶ n¨ng c¶m
øng t¹o côm chåi tõ m¶nh l¸ mÇm sau 4 tuÇn nu«i cÊy.
PhÇn tr¨m
BAP
KIN
NAA
M¶nh
(μM)
(μM)
(μM)
cÊy t¹o chåi
-
-
-
0/92
0
0
0,44
-
-
0/97
0
0
2,22
-
-
5/89
5,6
1,5 ± 0,2
4,44
-
-
81/90
90,0
6,8 ± 0,1
6,66
-
-
86/90
91,5
6,2 ± 0,4
90/96
93,8
5,8 ± 0,3
8,88
m¶nh cÊy
C håi/m¶nh cÊy
t¹o chåi
11,10
-
-
72/85
84,7
5,5 ± 0,2
13,32
-
-
61/76
80,3
5,0 ± 0,1
2,22
0,46
-
7/97
7,2
1,7 ± 0,3
4,44
0,46
-
84/86
97,7
7,0 ± 0,8
6,66
0,46
-
95/97
98,0
7,3 ± 0,8
8,88
0,46
-
85/92
92,4
6,0 ± 0,9
4,44
-
2,68
9/71
12,7
1,2 ± 0,0
6,66
-
2,68
9/74
12,2
1,0 ± 0,0
8,88
-
2,68
31/92
37,0
2,5 ± 0,5
11,10
-
2,68
26/97
26,8
2,2 ± 0,2
Ghi chó: (-) kh«ng cã chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng
DiÖpThÞ Lan
20
Líp K31A
- Xem thêm -