Tài liệu Nghiên cứu hệ protease trùn quế (perionyx excavatus) trong quá trình tự phân và khả năng ứng dụng

  • Số trang: 39 |
  • Loại file: DOCX |
  • Lượt xem: 887 |
  • Lượt tải: 0
dangvantuan

Tham gia: 02/08/2015

Mô tả:

3 CHƯƠNG 1. TỒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Trùn quế 1.1.1 Đặc tính sinh lý học: Trùn quế thuộc: Ngành: Giun đốt (Annelida). Ngành phụ: Có đai sinh dục (Clillata). Lóp: Giun ít tơ (Oligochaeta). Họ: Megascolecidae. Tên khoa học: Perionyx excavatus. Hình 1.1: Trùn quế (Perionyx excavatus) Trùn quế có kích thuớc tuơng đối nhỏ, con truởng thành dài khoảng 1 0 - 1 5 cm, thân hơi dẹt, màu từ đỏ đến mận chín, có ánh kim, nhạt dần về phía bụng, hai đầu hơi nhọn. Trùn quế có hình thon dài nối với nhau bởi nhiều đốt, ữên mỗi đốt có một vành tơ. Trùn quế hô hấp qua da, chủng có khả năng hấp thu 02 và thải C02 trong môi truờng nuớc nên có khả năng tồn tại trong nuớc một thời gian vài tháng. Trùn quế là sinh vật luống tính, đai và các lỗ sinh dục lệch về phía đầu cơ thể, có thể giao phối chéo với nhau để hình thành kén. Sau 14 - 21 ngày mỗi kén nở cho 2 - 1 0 trùn con màu ữắng, sau 5-7 ngày có màu hồng và đỏ dần. về thành phần hóa học của trùn quế gồm nuớc chiếm khoảng 80 - 85%, chất khô khoảng 15 - 20%. Hàm luợng các chất khô (tính trên trọng luợng chất khô) nhu sau: protein: 68 70%, lipid: 7 - 8%, chất đuờng: 12 -14 %, tro: 11 -12% [47]. Trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, ấm áp, yên tĩnh. Chúng sợ ánh sáng, nhiệt độ cao, tiếng động, hóa chất bảo vệ thực vật, muối, vôi. Nhiệt độ thích họp từ 20 - 30°c, ẩm độ 75- 80%, 4 pH 7,0 - 7,5. Ở nhiệt độ khoảng 30°c và độ ẩm thích họp trùn quế sinh truởng và sinh sản rất nhanh. Thức ăn của trùn là các loại phân gia súc, gia cầm, rác đang phân hủy... trong đó phân bò tuơi và phân ữâu tuơi là món ăn thích họp nhất. Mỗi ngày trùn quế tiêu thụ luợng thức ăn tuơng đuơng với trọng luợng cơ thể của nó [48]. 1.1.2 Các nghiên cứu ứng dụng về trùn đất nóỉ chung và trùn quế nói riêng Trong y học cổ truyền Việt Nam, trùn đất đuợc dùng trong một số bài thuốc chữa sốt rét, sốt nóng, suy nhuợc cơ thể, cao huyết áp, tai biến mạch máu não [33]. Trùn quế còn chứa enzyme có thể thủy phân đặc hiệu fibrin với hoạt tính xúc tác rất cao, có triển vọng khai thác làm thuốc điều trị những căn bệnh đột quỵ, tim mạch [35]. Hiện nay các tỉnh phía Nam và đồng bằng sông Cửu Long đã bắt đầu nuôi trùn quế với quy mô lớn, nguồn thức ăn chủ yếu lấy từ phân bò, ữâu [48]. Một số nghiên cứu sử dụng trùn đất làm thức ăn bổ sung cho gà góp phần nâng cao hiệu suất nuôi gà thả vuờn cho các hộ nông dân [2], hoặc sử dụng trùn quế để sản xuất chế phẩm sinh học dùng trong nông nghiệp[14]. Ngoài ra, nông dân các tỉnh miền Tây sử dụng thêm nguồn thức ăn trục tiếp từ trùn quế giàu đạm để bổ sung thêm khẩu phần dinh duỡng cho các loại tôm cá vừa qua giai đoạn ấu trùng, hoặc khôi phục sức khỏe vật nuôi sau dịch bệnh. Ở các nuớc Châu Á nhu Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc đã nghiên cứu thành công enzyme thủy phân fibrin từ các loài trùn đất Lumbricus rubeỉỉus [55], [80] và Eisenia fétida [102]. Trình tụ nucleotide của gen mã hóa lumbrokinase có hoạt tính thủy phân fibrin cao cũng đuợc nghiên cứu nhằm tiến tới việc chủ động sinh tổng họp enzyme này bằng con đuờng tái tổ họp [57], [103]. Trên thế giới đã có hai sản phẩm thuốc chữa bệnh tim mạch từ trùn đất là Lumbrokinase và Boluoke. Một huớng nghiên cứu khác về sự ổn định và ứng dụng các serine protease của loài trùn Lumbrỉcus rubeỉỉus. Kết quả cho thấy các enzyme này ổn định trong dung dịch đệm TrisHCl 100 mM ữong thời gian 5 năm ở nhiệt độ phòng và có khả năng chịu đựng các dung môi hữu cơ tốt, kể cả toluen và n-hexane. Chúng có thể thủy phân nhiều cơ chất protein khác nhau như elastin, hemoglobin, fibrin, casein, collagen, albumin và keratin và đặc biệt là thủy phân chính protein của loài trùn đất này và tạo ra dung dịch đạm có thành phần 5 tương tự nước tương và ứng dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật [45]. Ở Úc, nghiên cứu sử dụng đạm từ thịt trùn thay thế thịt cá cho việc nuôi loại tôm hùm nhỏ, kết quả hoàn toàn không làm giảm tỉ lệ tăng trưởng của tôm [69]. Ở Trung Quốc một số nghiên cứu ứng dụng trùn làm thức ăn cho gà con hoặc dùng trong y học [105]. Ở Nigeria đã nghiên cứu sử dụng 25% protein trùn đất thay thế vào thức ăn nuôi cá hồi nhỏ Heterobranchus ỉongựìlis đạt kết quả tốt cả về môi trường nước và tốc độ sinh trưởng của cá [99]. Hiện nay, nhiều nghiên cứu về thức ăn cho trùn đất như bổ sung protein, acid béo nhằm thu được hiệu suất tạo sinh khối và phân ữùn cao là một trong những nghiên cứu nằm ữong dự án lớn RIRDC của Chính phủ úc [64]. Từ việc khảo sát, tập hợp các tài liệu nghiên cứu ứng dụng của trùn đất nói chung và trùn quế nói riêng ở trong và ngoài nước cho thấy hiện nay các tỉnh Đông Nam Bộ và Đồng Bằng sông Cửu Long trùn quế đang được nuôi rộng rãi tại các vùng chăn nuôi bò với một sản lượng lớn nhưng gặp khó khăn trong quá trình bảo quản và vận chuyển nên khả năng tiêu thụ chúng còn hạn chế. Nhằm làm tăng thêm giá trị sử dụng trùn quế cần khai thác thêm một sổ ứng dụng khác nữa một khi đã tìm hiểu rõ hơn về hệ enzyme trong loài trùn đất này. 1. 2 Hệ protease và các nghiên cứu ứng dụng Protease là nhóm enzyme được ứng dụng một cách rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản xuất xà phòng. Người ta có thể thu nhận protease từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật, động vật và vi sinh vật. Trong chế biến thực phẩm : sử dụng nhiều nhất để cải tiến công nghệ sản xuất nước mắm hoặc nước tương từ các chế phẩm cá, bánh dầu đậu nành bằng việc bổ sung protease từ giai đoạn thô sơ dùng dịch chiết mủ đu đủ xanh, vỏ dứa, ruột cá, ruột lợn đến giai đoạn cao hơn dùng chế phẩm enzyme thêm vào quá trình thủy phân như chế phẩm bromelain [7], [20], [54], papain [11], [94], [96], ficin [49], chế phẩm protease từ nấm mốc A.oryzae [10], [40], vi khuẩn Bacillus subtilis S5 [3], [36] hoặc nấm sợi [37] và cả các chế phẩm protease từ đầu tôm [5], [8]. Những kết quả nghiên cứu cho thấy khi bổ sung thêm protease vào cá thi hàm luợng đạm amin tăng cao, quá trình thủy phân nhanh hơn nên rút ngắn được thời gian 6 chế biến nước mắm. Một lĩnh vực khác nghiên cứu sản xuất bột đạm cao cấp cho trẻ em và người lớn tuổi già từ bột đậu nành sử dụng chế phẩm prozima có chứa bromelain để cải biến kích thước phân tử protein và xử lý các protein ức chế tiêu hóa có sẵn ữong nguyên liệu [6], hoặc sử dụng các protease thương mại Alcalase, Novozym, Flavourzyme thủy phân bột đậu nành tách béo nhằm làm tăng hàm lượng amino acid tự do đạt hiệu suất thủy phân cao và rút ngắn thời gian thủy phân làm giảm thiểu sự hoạt động vi sinh vật [70]. Ngoài ra enzyme protease còn được sử dụng trong các lĩnh vực chế biến thực phẩm khác như làm phomat [32], làm mềm thịt,... Trong y học : một số protease như trypsin, a-chymotrypsin dùng sản xuất thuốc chữa bệnh kém tiêu hóa, tiêu mủ các ổ viêm, làm thông đường hô hấp rất thông dụng trên thị trường dược phẩm. Nghiên cứu chế phẩm protease có tên gọi “prozimabo” trong điều ữị bỏng giúp giả mạc rụng nhanh, vết bỏng nhanh khỏi [5]. Đặc biệt hiện nay protease được ứng dụng ữong điều trị bệnh tim mạch, chúng rất đa dạng và có nguồn gốc khác nhau: từ động vật [56], [62], [63], [81], [82], [112], thực vật [58], [74], đến vi sinh vật [51], [75], [60], [114], [107], chúng thuộc nhóm serine protease có khả năng thủy phân fibrin, fibrinogen. Trong nông nghiệp: protease được bổ sung vào thức ăn cho động vật nuôi nhằm tăng khả năng tiêu hóa, chúng được xử lý trực tiếp vào thức ăn trước khi sử dụng hoặc xử lý sơ bộ thức ăn. Hiện nay, các chế phẩm vi sinh chứa hỗn họp protease và các enzyme thủy phân khác cũng được sử dụng cho ngành nuôi ữồng thủy sản làm tăng hệ số tiêu hóa, làm giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường nước nuôi [13, [17], [21]. Ngoài ra protease còn ứng dụng rộng rãi trong một số ngành khác như công nghiệp thuộc da để làm mềm da, tăng cường khả năng tách lông ra khỏi da nhưng không ảnh hưởng đến chất lượng da [83]. Trong công nghệ sản xuất xà phòng làm tăng khả năng tẩy vết bẩn có thành phần là protein [95], [97]. 7 Từ các ứng dụng của nhỏm protease ở trên cho thấy việc nghiên cứu ứng dụng hệ protease trùn quế vào lành vực y học và sản xuất bột đạm chất lượng cao dùng nuôi ấu trùng tôm sú phục vụ cho nuôi trồng thủy sản ỉà cần thiết nhằm làm tăng giá trị thương phẩm một khi trùn quế đã được đưa vào nuôi công nghiệp. 1.2.1 Phân ỉoạỉ về protease Protease là nhóm enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide của protein: R, H H + V .G ++ HĩlM. X l li Rĩ H ,,N.. R* Peptide X . .C., Carboxy! Cữmptìttéíl t Aminũ Cátnpũtièht Theo Harrtley (1960) việc phân loại nhóm enzyme protease được thay đổi qua các thời kỳ (trích dẫn bởi Barrett, 2001) [32]. Theo Grassmann và Dyckerhoff (1928) protease phân chia thành proteinase và peptidase. Theo Bergmann và Ross (1936) gọi chung việc thủy phân liên kết peptide nên sử dụng danh từ peptidase và được chia thành 2 nhóm là endopeptidase và exopeptidase. Dựa trên việc phân tích nghĩa rộng và nghĩa hẹp của từ “peptidase” nên để tránh nhầm lẫn theo yêu cầu của IUBMB protease được coi là peptidase nhưng chia làm hai loại là endopeptidase (proteinase) và exopeptidase. Năm 1960, Hartley đã phân loại enzyme thủy phân protein theo 4 nhóm dựa theo tên hóa học các amino acid tham gia vào tâm vị trí xúc tác [32]: Aspartic peptidase là những protease chứa nhóm carboxyl (-COOH) ữong trung tâm hoạt động, tác động lên liên kết peptide tạo phức hợp trung gian bằng liên kết không cộng hóa trị giữa enzyme và cơ chất. Các nhóm carboxyl này thuộc mạch bên R của aspartic, glutamic hoặc có thể là nhóm carboxyl đầu c của chuỗi polypeptide. Aspartic peptidase thường hoạt động trong vùng pH acid và bị ức chế đặc hiệu bởi pepstatin. Cysteine peptidase: các enzyme thuộc nhóm này có nhóm thiol (-SH) của cysteine trong trung tâm hoạt động, tác động lên nhóm -CO của liên kết peptide tạo phức hợp trung gian thiolacylenzyme. Các cysteine peptidase thường hoạt động mạnh ở vùng pH trung tính, chúng chi hoạt động khi nhóm thiol ở trạng thái không bị bao vây. Do đó các chất như cysteine, acid 8 ascorbic thường có tác dụng làm bền và hoạt hóa enzyme này. 9 Cystatin, leupeptin là các chất ức chế thuận nghịch và E64 chất ức chế không thuận nghịch cho nhóm cysteine peptidase rất thông dụng hiện nay. Kim loại peptidase là những protease trong trung tâm hoạt động có chứa các ion kim loại trục tiếp tham gia phản ứng, chúng tác động lên liên kết peptide tạo phức họp trung gian bằng liên kết không cộng hóa trị giống nhu nhóm aspartic peptidase. Nhóm kim loại peptidase hoạt động mạnh nhất ở vùng pH trung tính và bị giảm hoạt tính duới tác dụng của EDTA. Serine peptidase: là những protease có nhóm hydroxyl (-OH) của serin trong trung tâm hoạt động. Các peptidase serine này thuờng hoạt động ở vùng pH khá rộng từ trung tính đến kiềm, nhóm -OH của serine tác động lên nhóm -CO của liên kết peptide tạo họp chất trung gian acyl-enzyme. Các enzyme thuộc nhóm này thông dụng nhất là trypsin và chymotrypsin. Chúng bị ức chế bất thuận nghịch dưới tác dụng diisopropylphosphofluoridate (DFP), phenylmethanesulfonyl flouride (PMSF), coumarin và một số chất ức chế thuận nghịch như antitrypsin ở đậu nành (SBTI), aprotinin, chymostatin. Trong các nhóm proteaza được phân loại, ứng dụng rộng rãi ở nhiều lãnh vực nhất là nhóm serine protease do chúng có khả năng thích ứng ữong khoảng pH khá rộng từ trung tính đến kiềm mạnh đã làm tăng khả năng ứng dụng nhóm enzyme này so với các nhóm protease khác [67]. Đặc biệt được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thuộc da và chất tẩy rửa. Hiện nay nhóm serine protease đã được phát hiện và nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau [67], [78], [80] với các tên thông dụng ở bảng 1.1: Bảng 1.1: Một sổ serine protease thông dụng hiện nay Enzyme Vị trí cắt Trypsin Chymotrypsin Elastase Plasmin Thrombin V8-protease (GluC) Lys-C Subtilisin Carboxypeptidase Arg, Lys Tyr,Trp,Phe Gly, Ala, Val Arg, Lys Arg Aps, Glu Lys Tyr, Phe, Leu Đầu c các amin Nguồn Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loài khác Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loài khác Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loài khác Máu Máu Staphylococcus aureus V8 Lysobacter enzymogenes Các chủng Bacilli khác nhau Hệ thống tiêu hóa ở động vật 1 0 Sau đây là cơ chế hoạt động của nhỏm serin proteaza vì chủng liên quan đển nghiên cứu cơ bản và các ứng đụng của đề tài trên đối tượng trùn quế. 1,2.2 Cơ chế phản ứng của nhóm serine peptidase Serine protease có chung nhóm phân ỉoạỉ EC 3.4.21 ỉà một trong số các enzyme được nghiên cứu khá rộng rãi ngoài khả năng thủy phân protein trong quá trình tiêu hóa của động vật phổ biến nhất là trypsin, Chymotrypsin và elastase. Serine protease còn tham gia vào nhiều hiện tượng sinh lý trong cơ thể như phá cục máu nghẽn và họat hóa các bổ thể [62]. Trung tâm hoạt động của nhóm enzyme này chứa các amino acid aspartic, histidin và serine trong đó serine gỉữ vai trò trực tiếp gắn với cơ chất theo cơ chế được trình bày hình 1.2. Híst7 (3) 0 H2O H1 •-* — c H V / A*Piõỉ 1 r~\ ị H —- N ^ —H mmm 0 —^ y H — N—c— s1H «V o Acyf^nzynm fntannedfrrte Hình 1.2: Sơ đồ các bước xúc tác cơ bản của nhóm serine protease 1 1 Cơ chế theo hình 2.1 gồm 3 phản ứng: Phản ứng 1: nhóm -OH của serine trong trung tâm hoạt động enzyme kết họp với nhóm c=0 của liên kết peptide trong chuỗi polypeptide tạo phức hợp chuyển tiếp tứ diện (itetrahedral complex). Phản ứng 2: ở trạng thái phức họp chuyển tiếp tứ diện thường kém bền nên chuyển điện tích lên o tạo nhóm c=0 mới làm đứt liên kết peptide giải phóng mạch polypeptide đầu N và hình thành họp chất trung gian acyl-enzyme mới. Phản ứng 3: với sự có mặt của nước sẽ giải phóng mạch polypeptide đầu c còn lại và khôi phục trung tâm hoạt động của serine protease. Như vậy ngoài cơ chế chung các enzyme thuộc nhóm này có tính chất cắt riêng biệt là do trong phân tử protein có một “túi “ (pocket) luôn được định vị gần trung tâm hoạt động nhóm serine (Hình 1.3). Hình dạng và sự tích điện của túi khác nhau sẽ cho các vị trí cắt chuyên biệt của từng serine protease khác nhau [80] Hình 1.3: Hình dạng và gốc amino acid ở các túi khác nhau của serine protease 1 2 Chymotrypsin YỚi túi chỉ chứa các nhánh amino acid kỵ nước cồng kềnh YÌ vậy nhóm này chỉ thích họp với các mạch bên R của phenylalanin, tryptophan, tyrosine của chuỗi polypeptide. Trypsin với túi chứa aspartic ở vị trí trong cùng nên chỉ thích họp với các mạch bên R của amino acid tích điện dương như arginine, lysine. Elastase với túi chứa hai phân tử valin nên chỉ chứa đủ các amino acid của mạch bên R như glycine, alanine và valine Plasmin thuộc nhóm serine protease (EC 3.4.21.7) là enzyme quan trọng có mặt trong máu để thủy phân các cục máu nghẽn fibrin, hoạt động giống trypsin có khả năng thủy phân liên kết peptide có mạch bên R của arginine và lysine trong chuỗi polypeptide. Ngoài việc thủy phân ííbrin, plasmin còn thủy phân cả những protein trong các hệ thống khác như hoạt hóa collagenase, một vài chất điều hòa của hệ thống bổ thể và làm yếu vách tế bào của nang Graafian dẫn đến sự rụng trứng. 1.2.3 ứng dụng nhóm serỉne protease trong quá trình thủy phân íibrỉn 1.2.3.1 Khái quát về phân tử fibrinogen, fibrin Fibrinogen và Fibrin điều khiển sự cân bằng trong việc cầm máu của cơ thể. Chúng đóng vai trò quan ữọng ữong việc duy trĩ độ nhớt của máu ở điều kiện bĩnh thường và cầm máu khi cơ thể bị tổn thương [98]. a. Cẩu trúc phân tử fibrinogen Cấu trúc phân tử íĩbrinogen đã được mô tả vào năm ■»■ỉ í. Hình 1.4: Mô hình phân tử ílbrỉnogen 1959 bởi Hall và Stayter trích dẫn bởi Fuss c. và ctv. (2001) [65], nó là phân tử có chiều dài 47,5±2,5nm có 3 nút nhỏ theo hình 1.4. Hai nút ngoài gọi là các domain tận cùng (cuối) với đường kính khoảng 6,5nm và một domain trung tâm khoảng 5nm, chủng nối với nhau bằng một sợi nhỏ hơn với chiều dày 1,5nm có cấu trúc xoắn cuộn. 1 3 Cuối những năm 1970 cấu trúc phân tử fibrinogen đã đuợc xác định rõ ràng hơn, chúng có khối luợng phân tử 340.000Da [78]. Phân tử fibrinogen gồm một domain trung tâm và hai domain nhánh. Mỗi domain nhánh đều chứa ba chuỗi polypeptide có tên là Aa, Bị3 và y tuơng ứng YỚi 610, 461 và 411 gốc amino acid (Hình 1.5). Hình 1.5: cấu trúc phân tử fibrinogen (Mander, 1982) Domain trung tâm là nơi liên kết hai domain nhánh bằng cách tập họp 3 gốc amine tự do của mỗi domain nhánh. Đầu amine của mạch Aa, Bị3 có hai đoạn peptide A và B, khi chúng bị tách ra khỏi domain trung tâm sẽ có sự chuyển đổi fibrinogen thành monomer fibrin. Đoạn đầu của domain nhánh (gần domain trung tâm) có 3 trong số 11 liên kết disulfide, đoạn cuối domain nhánh sẽ chứa 8 liên kết disulfide còn lại, đuợc định vị giữa hai mạch Ad, BỊ3 và nối liền giữa domain trung tâm và các cuộn xoắn của domain nhánh. Những cuộn xoắn này bao gồm các mạch đơn của 3 chuỗi Aa,B|3 và y siêu cuộn lại nhu xoắn d. Các liên kết disulfide trong mỗi cuộn xoắn chịu ữách nhiệm cho cấu trúc siêu xoắn và cho việc nối domain trung tâm và các domain nhánh duới dạng các vòng 1 4 disulfide. Việc định hướng các gốc amino acid ữong cấu trúc phân tử fibrinogen luôn luôn là: bên ữong cuộn xoắn chứa các gốc kỵ nước và bên ngoài là các gốc phân cực Các domain nhánh có khối lượng phân tử 67.200Da, hầu hết cấu trúc chủ yếu trong các domain này được hiển thị bằng các nếp gấp ngẫu nhiên của các mạch y và ß tương ứng được gọi là thùy (lobe) Y và ß. Ngoài ra, các domain nhánh còn có bốn cụm carbohydrate, mỗi cụm khoảng 2.500Da, hai cụm định vị trên mạch ß ở mỗi domain nhánh và hai cụm nằm trên mạch y ở mỗi nhánh gần domain trung tâm. Phần phụ phân cực Aa là vị ữí để tạo các liên kết chéo trong phân tử fibrin và chúng nằm gần đầu cuối carboxyl của mạch y. b. Sự polymer hóa fibrinogen tạo fibrin Sự polymer hóa fibrinogen được thực hiện khi có mặt của thrombin. Thrombin có nhiệm vụ tạo thành sợi fibrin không hòa tan từ fibrinogen. Đầu tiên là thành lập các monomer fibrin, bằng việc cắt hai đoạn peptide A và B từ đầu cuối amin của mạch Aa và Bß bởi thrombin [65], [66]. Việc loại bỏ đoạn peptide của fibrinogen dẫn đến sự polymer hóa tự phát các monomer fibrin thành fibrin, vì khi loại bỏ peptide A lộ ra một điểm polymer hóa đầu amin của mạch a với trình tự của Gly-Pro-Arg. Vị trí này sẽ tương tác với một vị trí tương thích trên thùy y của domain nhánh. Trên hai cạnh đối nhau của phân tử, peptide B cũng lộ ra đầu amine của của mạch ß với trình tự của GlyHis-Arg, vị ữí này sẽ tương tác với một vị ữí bổ sung thùy ß của domain nhánh. Phản ứng khởi đầu này tạo một dimer, từ đó có thể kết họp với các monomer fibrin khác tạo thành một protofibril. Dimer f. A ¿Ọ * Fibrinoeen Monomer Hình 1.6: Tiến trình polymer hóa fibrinogen tạo Ü fibrin 1 5 Các liên kết chéo của protofibril bắt đầu chuyển hóa yếu tố cảm ứng thrombin (yếu tố XIII) tạo thành enzyme transglutaminase gọi là yếu tố xnia có khả năng liên kết các mạch bên của lysine và glutamine bằng các liên kết peptide giữa các mạch protofibril, khoảng 6 liên kết có thể gắn kết các monomer fibrin kề nhau. Ban đầu liên kết chéo nhanh chóng cuộn các mạch y thành hai phân tử fibrin thẳng hàng theo kiểu đối dịên và song song YỚi nhau (hình 1.6). Sau đó, là các mạch a liên kết lại tạo nên một kiểu liên kết chéo phức tạp tương ứng với sự tạo thành các sợi fibrin dày có độ đàn hồi lớn và bị phân giải bởi plasmin. c. Sự phân giải fibrinogen và fibrin Trong cơ thể, sự thủy phân sợi fibrin không chỉ cần thiết ữong việc làm lành vết thương mà còn giới hạn khả năng lan rộng sự vón cục máu. Giữ vai trò quan trọng trong chức năng cầm máu là sự hoạt hóa plasminogen thành plasmin và sự tương tác của chúng với fibrinogen và fibrin. Plasminogen tồn tại dưới hai dạng là Glu-plasminogen và Lyschưa bị phân cắt có đầu amine chứa acid glutamic vì vậy được gọi là Gluplasminogen. Khi có mặt của plasmin, Gluplasminogen bị cắt ở vị trí Lys76-Lys77 tạo thành Lys-plasminogen [110] và loại này có ái lực cao đối với fibrin hơn Glu- MảnhX plasminogen [53]. Cả hai dạng của plasminogen này có thể bị phân cắt ở liên kết peptide Arg560-Val561 bởi uPA (chất hoạt hóa plasminogen urokinase) hoặc tPA (chất Mảnh Y hoạt hóa plasminogen của mô) tạo thành plasmin [101]. Cả hai dạng plasminogen đều có hai vị trí gắn với monomer fibrin, một có ái lực cao và một Mảnh D Mảnh E Hình 1.7 : Mô hình phân giải fibrinogen bởi plasmin (Mander, 1982) 1 6 plasminogen. Dạng Glu-plasminogen khi 1 7 có ái lực thấp. Bằng việc tương tác với fibrin, phía có ái lực thấp hoạt hóa plasminogen gấp 5 lần so với phía có ái lực cao. Fibrin và fibrinogen đều bị phân giải bởi plasmin, là enzyme thuộc nhóm serine protease chuyên thủy phân liên kết peptide có mạch bên arginyl và lysyl trong cấu trúc cuộn xoắn. Tiến trì nil phân giải fibrinogen theo thứ tự được mô tả ở hĩnh 1.7. Theo Mander sản phẩm trung gian là các mảnh X và Y. Mảnh X là kết quả từ việc loại bỏ phần phụ phân cực Aa khỏi fibrinogen, mảnh Y là kết qủa từ việc cắt cuộn xoắn giữa đoạn của domain trung tâm và domain nhánh tạo ra mảnh D và Y. Việc cắt xa hơn nữa mảnh Y lại tiếp tục tạo ra mảnh D và E. Những bước phân giải này cũng tương tự cho fibrin không có các liên kết chéo. Cũng có thể dự đóan nếu có liên kết chéo thì sản phẩm của sự thủy phân fibrin sẽ có sự khác biệt. Khi có các liên kết chéo thì sự phân giải fibrin sẽ chậm lại và tạo các dẫn suất khác nhau rất phức tạp ữong suốt quá trinh hòa tan cục máu đông. 1.2.3.2 Vai trò của enzyme thủy phân fibrin trong điều trị tìm mạch Như đã đề cập về hoạt động của hệ thống fibrinogen và fibrin trong cơ chế cầm máu. Ở các mô bình thường, luôn có sự cân bằng động giữa hai quá ữình này. Trong hầu hết các bệnh về tim mạch như tràn máu não, nhồi máu cơ tim, tắc động mạch phổi người ta đều thấy nguyên nhân gây tắc nghẽn mạch là do các cục máu đông lưu giữ trong mạch. Nhưng nếu quá trình thủy phân fibrin tăng bởi nguyên nhân bệnh lý sẽ dẫn đến hậu quả chảy máu quá mức. Trong thực tế, việc xử lý bệnh nghẽn mạch đều dựa vào việc sử dụng các chất kháng đông hóa học như heparin và coumadin để kìm hãm sự tạo thành các cục máu fibrin. Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra cách tiếp cận tốt nhất để điều trị chứng nghẽn mạch là tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch một enzyme có khả năng chuyển hóa plasminogen thành plasmin, nói cách khác là các chất hoạt hóa plasminogen. Hiện nay các enzyme thường được sử dụng trong điều ữị này là streptokinase (từ vi khuẩn Streptococcus haemolytỉcus), urokinase (từ nước tiểu của người) và tPA tái tổ họp. Việc sử dụng các enzyme này tương đối hiệu quả, nhưng nó vẫn chưa thể giải quyết được hết các vấn đề nảy sinh trong quá trình điều trị bệnh nghẽn mạch. Việc điều trị bằng Streptokinase có tác dụng phụ là gây sốt cho bệnh nhân, có xu hướng tăng chảy máu, tạo 1 8 kháng nguyên và khó có thể xác định liều lượng thích họp [61]. tPA tái tổ họp và urokinase tuy không có vấn đề miễn dịch như đối với sữeptokinase nhưng giá thành lại rất đắt. Do các tồn tại ữên và nhu cầu chữa bệnh nghẽn mạch là rất lớn nên các nhà nghiên cứu đã tìm kiếm những tác nhân tự nhiên có thể phân giải trực tiếp cục máu đông gây nghẽn mạch, có tác dụng thủy phân fibrin như plasmin có ữong cơ thể. Họ cho rằng enzyme thủy phân trực tiếp fibrin có thể khắc phục được những vấn đề còn tồn tại đối với các loại thuốc đã sử dụng. Do đó việc dò tìm các enzyme thủy phân trực tiếp fibrin làm thuốc chữa bệnh tim mạch đã tỏ ra có nhiều triển vọng và ngày càng mở rộng trên nhiều đối tượng khác nhau từ nước tiểu ở người, động vật, thực vật cho đến vi sinh vật. 1.233 Các nghiên cứu về enzyme thủy phân fibrin Enzyme thủy phân fibrin có nguồn gốc từ động vật: Loài trùn đất Lumbricus rubellus đã được phát hiện tại Nhật [81], [82], có khả năng thủy phân mạnh fibrin và sau đó được tinh sạch gồm 6 isozyme đều có khả năng đó và được đặt tên là Lumbrokinase. Tiếp theo là các nghiên cứu ữên lọai trùn này ở Hàn Quốc [46], [47] cũng đã tinh sạch, khảo sát các đặc điểm, giải ữình tự nucleotide và nhân dòng gen mã hóa lumbrokinase có hoạt tính thủy phân fibrin cao. Năm 1997, Yang J.S đã tách chiết enzyme thủy phân fibrin được hoạt hóa bởi SDS có nguồn gốc từ loài trùn đất Eisenia fetida [112]. Bằng các kỹ thuật sắc ký trên gel DEAE sepharose, sephadex G-75 và phenyl sepharose đã tinh sạch được loại enzyme có khối lượng phân tử 45kDa gồm hai tiểu đơn vị, tiểu đơn vị lớn 26kDa và tiểu đơn vị nhỏ 18kDa gắn kết với nhau bằng các liên kết tương tác kỵ nước. Enzyme thủy phân fibrin được tách chiết từ sâu bướm Lonomia achelous ở Venezuela bởi Coll-Sangrona. E và ctv (1998) [52] có hoạt tính khoảng 100 đơn vị urokinase/mL. Enzyme này có khả năng phân hủy các cục máu đông với tốc độ chậm hơn so với sự thủy phân của plasmin. Các vị trí cắt của enzyme này ữên phân tử fibrinogen khác với các vị trí cắt của plasmin. Dametto và ctv, năm 2000 đã tinh sạch được enzyme giống trypsin có khả năng thủy phân fibrin từ một giống ruồi Haematobia irrtans. Bằng cột sắc ký ái lực chuyên biệt SBTI-sepharose đã tách được enzyme có khối lượng phân tử 25,5 kDa hoạt động ở pH tối ưu bằng 9 và thủy phân được cơ chất tổng họp H-D Ile-Pro-Arg-p-nitroanilide đặc trưng cho enzyme giống trypsin và có thể thủy phân cả fibrinogen và fibrin với hoạt tính rất cao 1 9 [93]. Enzyme thủy phân fibrin từ vi sinh vật: Năm 1987, Sumi sau nhiều năm nghiên cứu về enzyme phân giải cục máu nghẽn và tim kiếm tác nhân tự nhiên có thể hòa tan cục nghẽn liên quan đến nhồi máu cơ tim đã phát hiện ra nattokinase cũng là một enzyme có khả năng thủy phân fibrin mạnh. Nattokinase được chiết tách và tinh sạch từ đậu nành lên men có tên gọi Natto, là một lọai thực phẩm truyền thống của Nhật Bản. Quá trình lên men được bổ sung vi khuẩn Bacillus natío vào dịch đậu nành đã được nấu chín và chính lọai vi khuẩn này sản sinh enzyme nattokinase [114]. Tiếp theo là hàng loạt các nghiên cứu trên đối tượng vi sinh vật ở Hàn quốc, Kim W.K và ctv (1996) đã tinh sạch enzyme thủy phân fibrin từ Bacillus sp CK 11-4 được chiết tách từ nước sốt đậu nành lên men [75]. Một nghiên cứu khác của Kim H.K và ctv cũng tinh sạch và khảo sát các đặc điểm thủy phân fibrin từ Bacillus sp KA38 có nguồn gốc từ cá muối lên men [73]. Douchi là loại thực phẩm lên men từ đậu nành Trung Quốc cũng được Wang và ctv (2006) đã chiết tách và xác định các tính chất một enzyme thủy phân mạnh fibrin và fibrinogen từ chủng Bacillus subtilis DC33 có khối lượng phân tử khoảng 30kDa, với hoạt tính 418 IU cho mỗi ml môi trường nuôi cấy LB [117]. Một enzyme thủy phân fibrin có tính chất giống chymotrypsin thuộc nhóm protease kim loại, bị kìm hãm bởi EDTA và EGTA cũng được phát hiện bởi Park và ctv năm 2007, tinh sạch từ môi trường lên men nấm Flammulina velutỉpes [90]. Enzyme thủy phân fibrin có nguồn gốc từ thực vật: Việc nghiên cứu các enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin cao không chỉ dừng lại ở các đối tượng động vật và vi sinh vật mà còn khai thác cả ữên thực vật. Choi và Sa (2001) đã tách chiết và khảo sát đặc tính của enzyme thủy phân fibrin từ loài bèo tấm Spirodela polyzhira là loại enzyme có hai sợi polypeptide với khối lượng phân tử 145kDa và 70kDa. Với khả năng thủy phân được không những cơ chất fibrinogen, fibrin mà còn có hoạt tính kháng thrombin. Vi vậy có thể sử dụng ữong điều trị lâm sàng đối với bệnh nghẽn mạch [53]. Kim J.S và ctv (2006) đã tinh sạch enzyme protease trung tính từ loại nấm ăn chữa bệnh Cordyceps militarỉs (Hàn Quốc) YỚi khối lượng phân tử 52 kDa có khả năng thủy phân nhanh mạch a, mạch y-y của fibrin và thủy phân mạch Ị3 fibrin nhưng chậm hơn [14]. 2 0 Như vậy với vai trò quan trọng của nhóm enzyme thủy phân fibrin trong điều trị bệnh tim mạch nên việc tinh sạch và khảo sát các đặc tỉnh hóa học của nó trên các đổi tượng khác nhau là điều cần thiết. Qua đó đã chứng minh được việc sử dụng các loài trùn đất trong các bài thuốc dân tộc ở phương Đông nói chung và Việt Nam nói riêng để ngăn ngừa và điều trị bệnh tim mạch là hoàn toàn có cơ sở khoa học. 1.2.4 ứng dụng protease trong quá trình tự phân protein 1.2.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến qúa trình tự phân Quá trình tự phân của trùn quế thực chất là quá trình thủy phân protein trùn quế dưới tác động của hệ enzyme protease nội sinh. Vì vậy các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tự phân cũng chính là các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng có enzyme xúc tác. Thông thường các yếu tố này bao gồm pH, nhiệt độ, nồng độ enzyme và cơ chất, lượng nước bổ sung, thời gian thủy phân và diện tích tiếp xúc. ❖ Ảnh hưởng của pH lên quả trình tự phân pH ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzyme do liên quan đến sự tương tác giữa enzyme và cơ chất. Phản ứng xúc tác phụ thuộc vào điện tích phân bố trên cả enzyme lẫn cơ chất, cụ thể là trung tâm hoạt động của phân tử enzyme. Mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một pH xác định, gọi là pH tối ưu. pH tối ưu cho hoạt động của nhiều enzyme vào khoảng 7. pH quá cao hay quá thấp có thể làm enzyme bị biến tính. pH tối ưu của mỗi enzyme có thể thay đổi trong một khoảng nhất định tùy theo tính chất và nồng độ cơ chất, nhiệt độ và bản chất của các loại dung dịch đệm [4]. ❖ Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình tự phân Bản chất của enzyme là protein do đó nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến vận tốc phản ứng. Nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng tăng nhưng đến mức nào đó thì tốc độ phản ứng giảm xuống do enzyme bị biến tính. Đa số enzyme có nhiệt độ tối ưu khoảng 40 - 50°c. Ở nhiệt độ ữên 70°c phần lớn các enzyme đều mất hoạt tính. Nhiệt độ tối ưu của các enzyme khác nhau thì không giống nhau, chúng tùy thuộc vào nguồn gốc sản sinh ra chúng. Phần lớn nhiệt độ tối ưu của enzyme từ vi sinh vật, thực vật cao hon động vật [24]. Nhiệt độ tối ưu của mỗi enzyme không cố định mà thay đổi theo thời gian thủy phân, nồng độ enzyme, cơ chất phản ứng và dạng tồn tại của enzyme [4]. 2 1 ❖ Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và cơ chất trong quá trình tự phân Trong trường họp cơ chất đầy đủ, nồng độ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc độ phản ứng [18]. Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme cao quá sẽ không có hiệu quả kinh tế, ngược lại nếu cơ chất quá nhiều sẽ ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzyme. Vi vậy cần nghiên cứu chọn nồng độ enzyme phù họp với lượng cơ chất nhất định. Trong quá trình tự phân đôi lúc sản phẩm sinh ra cũng có thể ức chế hoạt động của enzyme, làm cho phản ứng xảy ra chậm và ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm [109]. ❖ Ảnh hưởng của lượng nước bồ sung trong quá trình tự phân Trong phản ứng thủy phân protein bằng enzyme, nước không những là môi trường để khuếch tán enzyme và cơ chất mà còn là tác nhân tham gia phản ứng. Lượng nước cho vào nếu ít quá thì tác dụng thủy phân của enzyme kém nhưng nếu nhiều quá thì sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật hoạt động làm ảnh hưởng đến chất lượng của dịch đạm thủy phân. Đối với quá trinh tự phân trùn quế để sản xuất bột đạm amine thì lượng nước bổ sung ngoài ảnh hưởng đến việc tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất còn ảnh hưởng đến quá trình sấy khô sản phẩm, vi vậy cần nghiên cứu để chọn được tỷ lệ nước bổ sung thích họp là cần thiết. ❖ Ảnh hưởng của thời gian tự phân Theo một số nghiên cứu thì mức độ thủy phân tăng vọt trong thời gian đầu của phản ứng, sau đó tốc độ phản ứng chậm lại. Thời gian thủy phân dài hơn, cần sử dụng lượng enzyme lớn hơn thì mức độ thủy phân mới có thể cao hơn. Thời gian thủy phân nhanh hay chậm còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kích thước nguyên liệu, cấu trúc, loại protein... ❖ Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc Diện tích tiếp xúc cũng là một yếu tố quan họng ảnh hưởng đến quá trình thủy phân. Để tạo điều kiện tốt hơn cho quá trình thủy phân cần tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, muốn vậy cần làm nhỏ kích thước cơ chất trước khi thủy phân. Như vậy có nhiều yểu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân trùn quế bằng phương pháp sử dụng protease nội sinh, vì vậy cần phải phổi hợp hài hòa giữa các yếu tổ giúp qúa trình tự phân đạt hiệu suất cao nhất nhằm tạo bột đạm đạt chất lượng cao về hàm lượng đạm amine và cả độ an toàn về mặt vỉ sinh thực phẩm. 1.2.4.2 Các phương pháp đánh giá hiệu suất quá trình thủy phân protein 2 2 Trong quá trình thủy phân protein thông số theo dõi phản ứng là hiệu suất thủy phân. Hiệu suất thủy phân đuợc xác định là % của luợng nitơ đạm amine tạo ra trong dịch thủy phân trên luợng nitơ của đạm tổng số [79]. MNX100 Trong đó: Hiệu suất thủy phân (N%) =------- ------MN tổng số N : hiệu suất thủy phân (%) Mn: luợng nitơ đạm amine dịch thủy phân MN tổng số : lượng nitơ đạm tổng số Một vài phuơng pháp thông dụng để theo dõi hiệu suất thủy phân là pH-stat, chuẩn độ formol, đo độ nhớt, xác định hàm lượng nitơ hòa tan hoặc xác định hàm lượng nhóm amine bằng phuơng pháp Trinitro-benzene sulfonic acid (TNBS) hoặc phuơng pháp orthophthaldialdehyde. Mỗi phuơng pháp đều có những uu và nhuợc điểm khác nhau, những phuơng pháp xác định nhanh có thể cho độ chính xác không cao. Sau đậy là bảng tóm tắt nguyên tắc các phuơng pháp xác định hiệu suất thủy phân protein thông dụng. Bảng 1.2 Nguyên tắc các phương pháp xác định hiệu suất thủy phân Phương pháp pH-stat Đo độ nhớt Chuẩn độ formol TNBS OPA Nguyên tắc Giữ pH không đổi suốt tiến trình thủy phân, số lượng base sử dụng tỉ lệ với lượng amine tạo ra Theo dõi sự thay đổi độ nhớt bằng máy đo độ nhớt Chuẩn độ nhóm amine với formadehyde 2,4,6-Trinitro-benzene sulfonic acid phản ứng với nhóm amine tạo họp chất có màu Ortho -phthaldialdehyde phản ứng với nhóm amine bậc 1 tạo họp chất hấp thụ ở bước sóng 340nm Tham khảo [86] [86] [79] [88] [87] 1.3 Kỹ thuật thu nhận, tỉnh sạch và phân tích protein hiện đại Protein là họp chất hữu cơ cao phân tử, do tế bào sống tổng họp nên và hoạt động tốt trong môi trường cơ thể chính nó. Trong thực tế để ứng dụng protein có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả, chẳng hạn đối với protein là enzyme do chúng không những xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong hệ thống sống mà sau khi tách khỏi nó vẫn có thể hoạt động cho các phản ứng ở ngoài tế bào. Vi thế việc tinh sạch protein nhằm hiểu rõ hơn về tính chất lý hóa học của nó như khối lượng phân tử protein, nhiệt độ và pH tối ưu, độ bền pH, nhiệt độ theo thời gian, các tác dụng sinh lý ữên invitro là điều không thể thiếu trong các nghiên cứu cơ
- Xem thêm -