BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
NGUYỄN NGỌC QUANG
NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR
VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HÓA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN
TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 942 02 01
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS. TS. Chu Hoàng Hà
2. TS. BS. Nguyễn Phi Hùng
Hà Nội – 2020
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Luận án là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng nghiên cứu,
cộng tác với các nhà khoa học khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành cũng như các hội nghị trong
nước và quốc tế với sự đồng ý và cho phép của đồng tác giả; những kết quả còn lại
trong luận án chưa được tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày
tháng năm 2020
Nghiên cứu sinh
Nguyễn Ngọc Quang
Nguyễn Ngọc Quang
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà, Viện Công
nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, chỉ
bảo tận tình trong suốt quá trình tôi thực hiện luận án. Thầy không chỉ truyền thụ
cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn mà còn giúp tôi bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm
túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học. Đó là nền tảng cho quá trình thực
hiện luận án là hành trang giúp tôi tự tin vững bước trên con đường khoa học sau
này.
Trong thời gian học tập và nghiên cứu, tôi xin trân trọng cảm ơn TS. BS.
Nguyễn Phi Hùng, Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K.
Thầy đã luôn hướng dẫn, động viên, dành cho tôi nhiều lời khuyên quý báu trong
những lúc tôi gặp khó khăn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Tạ Văn Tờ, TS. Vương Diệu Linh và các
đồng nghiệp thuộc Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K đã
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen,
Viện Công Nghệ Sinh học đã luôn bên cạnh giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời
gian qua.
Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin dành cho bố mẹ, bạn bè đã luôn tin tưởng,
thông cảm, động viên, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn trong thời gian qua, giúp
tôi hoàn thành tốt luận án này.
Nghiên cứu sinh
Nguyễn Ngọc Quang
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 4
1.1. Ung thư phổi......................................................................................................... 4
1.1.1. Thực trạng ung thư phổi .................................................................................... 4
1.1.2. Phân loại ung thư phổi ...................................................................................... 6
1.1.3. Các giai đoạn ung thư phổi ............................................................................... 7
1.2. Ung thư biểu mô tuyến của phổi .......................................................................... 9
1.2.1 Đặc điểm ung thư biểu mô tuyến ....................................................................... 9
1.2.2. Các phân típ mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyến ................................ 11
1.3. Biến đổi gen EGFR trong ung thư phổi ............................................................. 13
1.3.1. Cấu trúc và chức năng gen EGFR ................................................................... 13
1.3.2. Đột biến gen EGFR trong ung thư phổi .......................................................... 15
1.3.3. Biểu hiện protein EGFR trong ung thư phổi ................................................... 17
1.4. Methyl hóa DNA trong ung thư phổi ................................................................. 17
1.4.1. Methyl hóa DNA ............................................................................................. 17
1.4.2. Methyl hóa các gen EGFR, BRCA1, MLH1, MGMT và RASSF1A trong
ung thư phổi ...................................................................................................... 20
1.5. Điều trị đích trong ung thư và ung thư phổi....................................................... 29
1.5.1. Điều trị đích trong ung thư .............................................................................. 29
1.5.2. Điều trị đích trong ung thư phổi ...................................................................... 31
1.6. Phương pháp phân tích biến đổi phân tử trong ung thư phổi ............................. 33
1.6.1. Phương pháp phân tích đột biến gen trong ung thư phổi ................................ 33
1.6.2. Phương pháp phân tích methyl hóa DNA trong ung thư phổi ........................ 35
1.7. Nghiên cứu các dấu ấn phân tử trong ung thư phổi ở Việt Nam ....................... 37
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................... 39
2.1. Vật liệu ............................................................................................................... 39
2.1.1. Mẫu nghiên cứu ............................................................................................... 39
2.1.2. Hóa chất .......................................................................................................... 39
2.2. Thiết bị chính ..................................................................................................... 42
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 43
2.3.1. Tách chiết DNA tổng số và xác định nồng độ DNA ...................................... 43
2.3.2. Xử lý bisulfite với DNA tổng số ..................................................................... 44
2.3.3. Phương pháp PCR ........................................................................................... 44
2.3.4. Phương pháp điện di ....................................................................................... 47
2.3.5. Phương pháp xác đinh đột biến gen EGFR ..................................................... 47
2.3.6. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch ......................................................... 48
2.3.7. Phương pháp tạo trình tự DNA methyl bằng enzyme M.sssI ......................... 49
2.3.8. Xử lý kết quả bằng thống kê sinh học ............................................................. 50
2.4. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................................ 50
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ ...................................................................................... 51
3.1. Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu ........................................................................ 51
3.2. Đột biến và biểu hiện gen EGFR ....................................................................... 52
3.2.1 Đột biến gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân ...................... 52
3.2.2. Biểu hiện protein EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân.............. 56
3.3. Tình trạng methyl hóa một số gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến của
phổi ................................................................................................................... 59
3.3.1. Methyl hóa gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân ................ 59
3.3.2. Methyl hóa gen BRCA1 và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân .............. 61
3.3.3. Methyl hóa gen MGMT và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân ............... 63
3.3.4. Methyl hóa gen MLH1 và sự tương quan đặc điểm bệnh nhân ...................... 65
3.3.5. Methyl hóa gen RASSF1A và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân ........... 66
3.4. Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa một
số gen liên quan đến ung thư tuyến của phổi ................................................... 68
3.4.1. Tương quan giữa đột biến, biểu hiện và methyl hóa gen EGFR..................... 68
3.4.2.
Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa
các gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A ................................................. 71
3.4.3. Tương quan về tình trạng methyl giữa các gen liên quan đến ung thư biểu
mô tuyến của phổi ............................................................................................ 74
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ...................................................................................... 76
4.1. Đặc điểm phân tử gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi..... 76
4.1.1. Đột biến vùng hoạt hóa Tyrosine Kinase gen EGFR ...................................... 76
4.1.2. Biểu hiện quá mức của protein EGFR ............................................................ 78
4.1.3. Methyl hóa vùng promoter EGFR .................................................................. 80
4.1.4. Tương quan giữa các đặc điểm phân tử gen EGFR ........................................ 81
4.2. Methyl hóa gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A ở bệnh
nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi .............................................................. 83
4.2.1. Methyl hóa vùng promoter gen BRCA1 .......................................................... 83
4.2.2. Methyl hóa vùng promoter gen MGMT .......................................................... 84
4.2.3. Methyl hóa vùng promoter gen MLH1 ........................................................... 86
4.2.4. Methyl hóa vùng promoter gen RASSF1A ...................................................... 87
4.3. Tương quan giữa những đặc điểm phân tử gen EGFR với sự methyl hóa
BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A trong ung thư biểu mô tuyến của
phổi ................................................................................................................... 88
4.3.1. Đột biến EGFR với sự methyl hóa quá mức các gen ức chế khối u ............... 88
4.3.2. Biểu hiện EGFR với sự methyl hóa các gen ức chế khối u ............................ 90
4.3.3. Sự methyl hóa đồng thời của một số gen liên quan đến ung thư biểu mô
tuyến của phổi................................................................................................... 91
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 94
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 95
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ ............................................................................... 96
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 97
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt
Tên đầy đủ
A260
Độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm
AAH
Atipical Adenomatous Hyperplasias (Tế bào phân chia quá mức
không điển hình)
ABL
Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 gene
ACS
American Cancer Society (Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ)
AIS
Adenocarcinoma in situ (Ung thư tại chỗ)
ALK
Anaplastic Lymphoma Kinase gene
ALK-EML4,
Chuyển đoạn ALK-EML4, BCR-ABL
BCR-ABL
APC
Adenomatous polyposis of the colon gene
BAC
Bronchioloalveolar Carcinoma (Ung thư biểu mô tiểu phế nang)
BCR
Breakpoint Cluster Region gene
BRCA1
Breast cancer susceptibility gene (Gen nhạy cảm với ung thư vú)
BRAF
v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B
CD74
Cluster of Differentiation 74 gene
CHFR
Checkpoint With Forkhead And Ring Finger Domains
CK5/6
Cytokeratin 5/6 protein
CK7
Cytokeratin 7 protein
COBRA
Combined Bisulfite Restriction Analysis (Phân tích kết hợp
Bisulfite và cắt giới hạn)
cs.
Cộng sự
DAB
3, 3 –diaminobenzidine
DAPK
Death‐associated protein kinase
DNA
Acid deoxyribonucleic
DNMTs
DNA methyltransferase (Enzyme methyl hóa DNA)
dNTP
Deoxynucleotide triphosphate
EDTA
Ethylene diamine tetraacetic acid
EGFR
Epidermal growth factor receptor (Yếu tố phát triển biểu mô)
ER
Estrogen receptor (thụ thể estrogen)
FDA
Food and Drug Administration (Hiệp hội thực phẩm và thuốc
Hoa Kỳ)
FFPE
Formalin fixed paraffin embedded
FISH
Fluorescence In Situ Hybridization (Lai tại chỗ huỳnh quang)
GTP
Guanosine triphosphate
GDP
Guanosine diphosphate
GSTP1
Glutathione S-transferase Pi 1 gene
H&E
Hematoxylin & Eosin
HDACs
Histone deacetylase
HRM
High Resolution Melting (Độ phân giải cao nhiệt độ nóng chảy)
HPR
Horseradish Peroxidase
IARC
International Agency for Research on cancer (Tổ chức nghiên
cứu ung thư thế giới)
IHC
Immunohistochemistry (Hóa mô miễn dịch)
MAPK
Mitogen-activated protein kinase
MDR
Multidrug resistance gene
MEK
Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 1
(MAP2K1)
MET
Mesenchymal-epithelial transition factor
MIA
Minimally Invasive Adenocarcinoma
MGMT
O-6-methylguanine-DNA methyltransferase gene
MLH1
MutL homolog 1 gene
MsssI
CpG methyltransferase
MS-PCR
Methylation Specific PCR (PCR đặc hiệu methyl)
MYC
Myelocytomatosis genes
NGS
Next Generation Sequencing (Giải trình tự thế hệ mới)
NSCLC
Non-small cell lung cancer (Ung thư phổi không tế bào nhỏ)
PI3K
Phosphoinositide 3-kinases
PTEN
Phosphatase and tensin homologue
PR
Progesterone Receptor (Thụ thể progesterone)
RASSF1A
Ras association domain family 1A gene
RARP2
The retinoic acid receptor P gene
Ras
Rat sarcoma
RB2
Retinoblastoma-like protein 2
RET
Rearranged during transfection
ROS1
c-ros oncogene 1gene
SAM
S-adenosylmethionine
SCLC
Small cell lung cancer (Ung thư phổi tế bào nhỏ)
SDC4
Syndecan 4 gene
SLC34A2
Solute Carrier Family 34 Member 2 gene
SNP
Single Nucleotide Polymorphism (Sự đa hình nucleotide)
SSCP
Single-strand conformation polymorphism (đa hình cấu trúc sợi
đơn)
TAE
Tris-acetate-EDTA
TBE
Tris-borate-EDTA
TEMED
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine
TKIs
Tyrosine Kinase Inhibitors (Các chất ức chế Tyrosine Kinase)
TIMP3
Tissue Inhibitor of Metalloproteinases 3 gene
TTF-1
Transcription Termination Factor 1 (Yếu tố kết thúc phiên mã 1)
WHO
World Heath Organization (Tổ chức Y tế thế giới)
WNT
Wingless genes
YAP
Yes-associated protein
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1
Tỷ lệ mắc và tử vong của một số loại ung thư phổ biến trên
thế giới
5
Hình 1.2
Số ca mắc ung thư mới tại Việt Nam năm 2018
5
Hình 1.3
Phân loại mô bệnh học trong ung thư phổi
7
Hình 1.4
Quá trình hình thành ung thư biểu mô tuyến
11
Hình 1.5
Một số phân típ phổ biến trong ung thư biểu mô tuyến của phổi
12
Hình 1.6
Đường truyền tín hiệu thông qua phân tử EGFR
14
Hình 1.7
Tần suất các dạng đột biến gen EGFR
15
Hình 1.8
Methyl hóa DNA ở tế bào bình thường và tế bào ung thư
19
Hình 1.9
Các vị trí methyl hóa trên gen EGFR
22
Hình 1.10
Cấu trúc gen BRCA1ở người
22
Hình 1.11
Chức năng ức chế khối u của BRCA1
23
Hình 1.12
Cấu trúc gen MLH1
24
Hình 1.13
Các phức hợp sửa chữa DNA của MLH1
24
Hình 1.14
Cấu trúc gen MGMT
26
Hình 1.15
Cơ chế sửa chữa DNA của MGMT
26
Hình 1.16
Cấu trúc của gen RASSF1A và các đồng phân
27
Hình 1.17
Chức năng ức chế khối u của RASSF1A
28
Hình 1.18
Điều trị đích trong ung thư phổi
32
Hình 1.19
Một số kỹ thuật phát hiện đột biến gen
35
Hình 1.20
Lịch sử phát hiện các kỹ thuật phân tích methyl hóa DNA
36
Hình 2.1
Phương pháp xử lý bisulfite
44
Hình 2.2
Phương pháp RT-PCR Scorpion Arms
48
Hình 2.3
Phương pháp hóa mô miễn dịch
49
Hình 2.4
Sơ đồ nghiên cứu
50
Hình 3.1
Kết quả phát hiện đột biến EGFR
53
Hình 3.2
Kết quả hóa mô miễn dịch protein EGFR
Hình 3.3
Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa
gen EGFR
Hình 3.4
Hình 4.1
63
Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl
hóa MLH1
Hình 3.7
61
Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa
gen MGMT
Hình 3.6
59
Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa
gen BRCA1
Hình 3.5
56
65
Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa
gen RASSF1A
67
Tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa và sự biểu hiện
EGFR
81
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1
Kit và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
40
Bảng 2.2
Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
41
Bảng 2.3
Điều kiện các phản ứng PCR sử dụng trong nghiên cứu
45
Bảng 2.4
Thành phần phản ứng PCR trong nghiên cứu
46
Bảng 3.1
Đặc điểm của bệnh nhân trong nghiên cứu
51
Bảng 3.2
Các đột biến gen EGFR được phát hiện trong nghiên cứu
52
Bảng 3.3
Tương quan giữa đột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân
54
Bảng 3.4
Tương quan giữa đột biến EGFR và tình trạng hút thuốc ở bệnh
nhân nam giới
55
Bảng 3.5
Mức độ biểu hiện protein EGFR
57
Bảng 3.6
Tương quan giữa mức độ biểu hiện protein EGFR với đặc điểm
bệnh nhân
58
Bảng 3.7
Tương quan giữa methyl hóa EGFR với đặc điểm bệnh nhân
60
Bảng 3.8
Tương quan giữa methyl hóa BRCA1 với đặc điểm bệnh nhân
62
Bảng 3.9
Tương quan giữa methyl hóa MGMT với đặc điểm bệnh nhân
64
Bảng 3.10
Tương quan giữa methyl hóa MHL1 với đặc điểm bệnh nhân
66
Bảng 3.11
Tương quan giữa methyl hóa RASSF1A với đặc điểm bệnh nhân
68
Bảng 3.12
Tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa và biểu hiện protein
EGFR
69
Bảng 3.13
Tỷ lệ đột biến, biểu hiện protein ở bệnh nhân methyl hóa EGFR
70
Bảng 3.14
Tương quan giữa đột biến và methyl hóa với biểu hiện EGFR
70
Bảng 3.15
Tương quan giữa đột biến EGFR với sự methyl hóa các gen
BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A
Bảng 3.16
Tương quan giữa biểu hiện protein EGFR với sự methyl hóa các
gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A
Bảng 3.17
72
73
Tương quan về tình trạng methyl các gen liên quan đến ung thư
biểu mô tuyển ở phổi
74
MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của luận án
Ung thư phổi là loại ung thư có tỷ lệ mắc và tử vong cao nhất trên thế giới
hiện nay. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới, năm 2018 có đến 2,1 triệu
trường hợp mắc mới và 1,8 triệu người chết do ung thu phổi. Trong khi đó, số ca
mắc mới và tử vong ở Việt Nam là 160 000 và 115 000 người. Ung thư phổi được
chia làm hai nhóm chính là ung thư phổi tế bào nhỏ chiếm 10 – 15 % và ung thư
phổi không tế bào nhỏ chiếm 85 – 90 %. Trong đó, ung thư biểu mô tuyến của phổi
là dạng phổ biến nhất, không chỉ gặp ở những người hút thuốc lá mà còn khá phổ
biến ở những người không hút thuốc, phụ nữ và những người trẻ tuổi. Ung thư phổi
nói chung và ung thư biểu mô tuyến của phổi nói riêng có tiên lượng và mức độ đáp
ứng điều trị rất thấp, chỉ 10 – 15 % bệnh nhân ung thư phổi có thể sống sót qua 5
năm. Tuy vậy hiệu quả điều trị sẽ được cải thiện rõ rệt nếu như bệnh nhân được
phát hiện ung thư sớm và sử dụng những phác đồ điều trị hiện đại. Một trong những
phương pháp điều trị mới đang được áp dụng phổ biến hiện nay là những thuốc điều
trị nhắm đích dựa trên những hiểu biết về những biến đổi di truyền của tế bào ung
thư. Ở ung thư phổi không tế bào nhỏ nói chung và ung thư biểu mô tuyến của phổi
nói riêng, phác đồ điều trị bằng thuốc nhắm đích TKIs (Tyrosine Kinase Inhibitors)
dựa trên những đột biến về gen EGFR (Epidermal growth factor receptor) đang
được sử dụng rộng rãi và mang lại những hiệu quả rõ rệt trong việc kéo dài thời
gian sống thêm và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân ung thư phổi. Bên
cạnh đó việc đánh giá sự biểu hiện của gen EGFR cũng góp phần quan trọng trong
việc đưa ra những tiên lượng tiến triển của bệnh cũng như định hướng liều lượng
thuốc cho bệnh nhân. Mặt khác, biểu hiện gen EGFR lại được điều khiển bởi mức
độ methyl hóa vùng promoter của gen này. Cùng với EGFR, methyl hóa các gen ức
chế khối u cũng được xem là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành và phát triển của
ung thư. Methyl hóa các gen ức chế khối u như: BRCA1, MGMT, MLH1,
RASSF1A…. đã được phát hiện trong nhiều loại ung thư trong đó có ung thư phổi.
Thêm vào đó, tình trạng methyl hóa một số gen ức chế khối u dẫn đến tiên lượng
xấu cho bệnh nhân và được xem là marker điển hình trong ung thư phổi. Đồng thời,
1
sự kết hợp thuốc điều trị nhắm đích TKIs với chất loại bỏ nhóm methyl đã mang lại
hiệu quả ban đầu cao hơn so với việc chỉ sử dụng TKIs trên những dòng tế bào ung
thư phổi điển hình.
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về đột biến gen EGFR trên bệnh nhân
ung thư phổi. Tuy nhiên, không có nhiều nghiên cứu tổng thể về những biến đổi
phân tử của gen EGFR và sự ảnh hưởng của hiện tượng methyl hóa các gen ức chế
khối u BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A lên những biến đổi này. Ở Việt Nam hiện
nay, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở mức độ xác định đột biến gen EGFR để đưa ra
phác đồ điều trị bằng TKIs. Vì vậy chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đột
biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl hóa một số gen liên
quan trên bệnh nhân ung thƣ biểu mô tuyến ở phổi” với mục tiêu:
1. Phân tích tỷ lệ đột biến và mức độ biểu hiện của gen EGFR trên bệnh nhân
ung thư biểu mô tuyển ở phổi.
2. Đánh giá được tình trạng methyl hóa một số gen bao gồm: EGFR, BRCA1,
MGMT, MLH1, RASSF1A và sự tương quan về methyl hóa giữa các gen này với đột
biến và biểu hiện protein EGFR.
Nội dung nghiên cứu
1. Sàng lọc bệnh nhân, thiết lập hồ sơ bệnh án hoàn chỉnh. Thu thập mẫu bệnh
phẩm ung thư phổi và mẫu phổi liền kề.
2. Xác định tỷ lệ đột biến và mức độ biểu hiện của gen EGFR. Phân tích sự liên
quan của các đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu với đột biến và biểu hiện gen EGFR.
3. Thiết lập và xây dựng điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR đặc hiệu methyl
nhằm xác định tình trạng methyl hóa vùng promoter các gen EGFR, BRCA1,
MGMT, MLH1 và RASSF1A và sự tương quan của hiện tượng này với các đặc điểm
bệnh nhân trong nghiên cứu.
4. Phân tích tương quan giữa đột biến và biểu hiện EGFR với tình trạng methyl
hóa các gen liên quan bao gồm: EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A.
2
Đóng góp mới của luận án
Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam xác định toàn diện các đặc điểm phân tử
của EGFR là đột biến, methyl hóa và biểu hiện protein. Đồng thời, đánh giá được
tình trạng methyl hóa 4 gen ức chế khối u quan trọng trong ung thư biểu mô tuyến
của phổi. Nghiên cứu có một số đóng góp mới và ý nghĩ thực tiễn như sau:
1.
Mô tả tỷ lệ đột biến, mức độ biểu hiện của protein EGFR và sự methyl hóa
của một số gen liên quan đến sự phát sinh ung thư, tiến triển bệnh và đáp ứng điều
trị ung thư biểu mô tuyến ở phổi.
2.
Chỉ ra được mối liên quan giữa methyl hóa gen RASSF1A với methyl hóa
các gen BRCA1 và MLH1. Sự khác nhau của methyl hóa vùng promoter gen EGFR
và BRCA1 với sự biểu hiện protein EGFR trên bề mặt tế bào ung thư biểu mô tuyến
ở phổi.
3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Ung thƣ phổi
1.1.1. Thực trạng ung thư phổi
Ung thư phổi là loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới. Theo thống kê của
Tổ chức Y tế thế giới (WHO), năm 2018 có đến 1,8 triệu người chết do ung thư
phổi trong tổng số 9,6 triệu người chết do ung thư (Hình 1.1) [35]. Đây vẫn ung thư
phổ biến nhất ở nam giới trên toàn cầu (chiếm 14,5% tổng số). Tỷ lệ mắc cao nhất
là ở Trung Âu và Đông Âu (53,3/100 000 người) và Đông Á (50,4/100 000 người).
Tỷ lệ mắc thấp nhất là ở Trung Phi và Tây Phi (2,0 và 1,7/100 000 người). Ở phụ
nữ, ung thư phổi đứng thứ ba sau ung thư vú và ung thư đại trực tràng (chiếm 8,4%
tổng số). Tỷ lệ mắc ung thư phổi ở phụ nữ thấp hơn ở nam giới và có sự khác nhau
ở các vùng địa lý khác nhau, chủ yếu phản ánh lịch sử tiếp xúc khác nhau với thuốc
lá. Do đó, tỷ lệ mắc cao nhất là ở Bắc Mỹ (33,8/100 000 người) và Bắc Âu
(23,7/100 000 người), tỷ lệ mắc tương đối cao ở khu vực Đông Á (19,2/100 000
người) và thấp nhất ở Tây Phi và Trung Phi (1,1 và 0,8/100 000 người) [35]. Hiệp
hội ung thư của Hoa Kỳ (American Cancer Society) ước tính trong năm 2017, đã có
thêm 225 500 trường hợp mới mắc ung thư phổi chiếm 13% tổng số ca ung thư
được phát hiện. Chỉ có 19% trường hợp bị phát hiện ung thư phổi có thể sống thêm
quá 5 năm. Cũng theo thống kê của Hiệp hội ung thư của Hoa Kỳ, năm 2015 có đến
155 800 người chết do căn bệnh này, chiếm 25% số trường hợp tử vong do ung thư
[102]. Số trường hợp tử vong do ung thư phổi lớn hơn tổng số trường hợp tử vong
do ba loại ung thư phổ biến khác ở Hoa Kỳ bao gồm ung thư tuyến tiền liệt, ung thư
vú và ung thư đại tràng cộng lại [102].
Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới 2018, ở Việt Nam, mỗi năm có
khoảng 160 000 trường hợp mắc mới và có tới 115 000 người tử vong do ung thư.
Việt Nam đứng ở vị trí 78/172 quốc gia, vùng lãnh thổ khảo sát với tỉ lệ tử vong
110/100 000 người (Hình 1.2). Ung thư phổi có tỉ lệ mắc đứng hàng thứ 2 ở nam
giới và đứng hàng thứ 3 ở nữ giới nhưng lại có tỷ lệ tử vong cao thứ hai ở cả nam
và nữ (sau ung thư gan). Số ca mắc mới ung thư phổi ở nam giới năm 2000 chỉ là 6
905 ca với tỉ lệ 29,3/100 000 dân, đến năm 2018 số ca mắc đã là 23 667 trường hợp
4
(14,4% tổng số ca ung thư) và tăng tỉ lệ lên 35,1/100 000 dân. Dự báo, đến năm
2020, số trường hợp mắc mới có thể lên tới 23 000 ở nam giới và hơn 34 000 ở cả
hai giới [35]. Cũng theo WHO, Việt Nam nằm ở nhóm nước có tần suất mắc ung
thư phổi cao thuộc hàng thứ hai trên thế giới, với tỉ lệ mắc ở nam giới là 25,5 –
41,5/100 000 dân và ở nữ giới là 7,3 – 13,6/100 000 dân [35].
Hình 1.1. Tỷ lệ mắc và tử vong của một số loại ung thư phổ biến trên thế giới [35].
Hình 1.2. Số ca mắc mới ung thư tại Việt Nam năm 2018 [35].
5
1.1.2. Phân loại ung thư phổi
Ung thư phổi được phân loại dựa trên kết quả xét nghiệm mô bệnh học [84].
Sự phân loại này có ý nghĩa quan trọng cho việc theo dõi, điều trị và tiên lượng
bệnh. Ung thư phổi được hình thành từ khối u ác tính phát sinh từ tế bào biểu mô,
gọi là ung thư biểu mô. Ung thư biểu mô phổi được phân loại theo kích thước và
hình thái của các tế bào ác tính quan sát dưới kính hiển vi. Để phục vụ cho mục đích
điều trị, ung thư phổi được chia ra hai loại lớn: Ung thư phổi không tế bào nhỏ
(NSCLC – Non-Small Cell Lung Cancer) và ung thư phổi tế bào nhỏ (SCLC –
Small Cell Lung Cancer) (Hình 1.3) [72].
1.1.2.1. Ung thư phổi không tế bào nhỏ
Ung thư phổi không tế bào nhỏ được chia thành các nhóm nhỏ hơn, trong đó
ba phân nhóm chính là ung thư biểu mô tuyến, ung thư biểu mô tế bào vảy và ung
thư biểu mô tế bào lớn [57].
Ung thư biểu mô tuyến (AD - Adenocarcinoma) chiếm khoảng 40% trường
hợp mắc ung thư phổi và thường bắt nguồn từ mô phổi ngoại vi [57]. Ung thư biểu
mô tuyến xảy ra phổ biến ở nữ giới và những người không hút thuốc [135]. Đây
cũng là loại ung thư phổi có thời gian sống kéo dài hơn những nhóm khác [112].
Ung thư biểu mô tế bào vảy (SCC – Squamous Cell Cancer) chiếm khoảng
25 – 30% số trường hợp ung thư phổi. Chúng thường bắt đầu xuất hiện ở tế bào vẩy,
là những tế bào phẳng nằm bên trong đường hô hấp của phổi. Ung thư biểu mô tế
bào vẩy có xu hướng được tìm thấy ở phần trung tâm của phổi, gần một đường hô
hấp chính (phế quản), thường gặp ở nam giới và có liên quan mật thiết với tiền sử
hút thuốc lá nhiều hơn so với hầu hết các loại ung thư phổi khác [65].
Ung thư biểu mô tế bào lớn (LCC – Large Cell Cancer) chiếm khoảng 10 –
15% số trường hợp mắc ung thư phổi. Sở dĩ tên gọi như vậy vì tế bào ung thư có
kích thước rất lớn, với sự dư thừa tế bào chất, nhân tế bào lớn và hạch nhân dễ thấy
[84]. Ung thư biểu mô tế bào lớn có thể xuất hiện ở bất kỳ phần nào của phổi. Nó có
xu hướng phát triển và lan truyền nhanh chóng, điều này có thể làm cho việc điều trị
trở nên khó khăn hơn. Một phân nhóm của ung thư biểu mô tế bào lớn, được gọi là
ung thư biểu mô tế bào thần kinh lớn, là một loại ung thư phát triển nhanh, rất giống
với ung thư phổi tế bào nhỏ [84].
6
Ngoài ra ung thư phổi không tế bào nhỏ còn có thêm một số phân típ khác
hiếm gặp như là carcinoid và thần kinh nội tiết [84].
Hình 1.3. Phân loại mô bệnh học trong ung thư phổi [57].
1.1.2.2. Ung thư phổi tế bào nhỏ
Đặc điểm nổi bật của ung thư phổi tế bào nhỏ là các tế bào chứa dày đặc các
hạt tiết thể dịch thần kinh đó là những túi tiết chứa hormone thần kinh nội tiết, do
đó khối u loại này có liên quan đến với hội chứng cận ung thư/nội tiết [118,
135]. Đa số trường hợp bệnh phát sinh ở đường dẫn khí lớn (phế quản chính và phế
quản thùy). Khoảng 60 – 70% trường hợp bệnh được phát hiện ở giai đoạn đã lan
rộng và không thể tiến hành xạ trị ở một phạm vi đơn lẻ [57].
1.1.3. Các giai đoạn ung thư phổi
Ung thư được phân chia theo các giai đoạn phát triển dựa vào kích thước, vị
trí của khối u nguyên phát, mức độ xâm lấn cũng như khả năng di căn. Hiện nay, hệ
thống phân loại giai đoạn ung thư phổi đang được sử dụng phổ biến nhất là hệ thống
TNM, dựa trên kích thước khối u (Tumor), số hạch lympho phát sinh (Node) và
mức độ di căn (Metastasis). Theo hệ thống phân loại này, tiến triển của ung thư
phổi có thể chia thành các giai đoạn từ 0 (STAGE 0) đến IV (STAGE IV) [3].
Giai đoạn 0 tương ứng với ung thư phổi không xâm lấn, không có hạch,
không di căn xa. Giai đoạn này, các tế bào ung thư chỉ khu trú, không hề xuất hiện
7
- Xem thêm -