Tài liệu Nghiên cứu định lượng curcuminoids trong chế phẩm nacumax bằng hplc

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ VÂN ANH MSV: 1301020 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CURCUMINOIDS TRONG CHẾ PHẨM NACUMAX BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ VÂN ANH MSV: 1301020 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CURCUMINOIDS TRONG CHẾ PHẨM NACUMAX BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Lê Thị Kim Vân 2. ThS. Tống Thị Thanh Vượng Nơi thực hiện: 1. Viện Dược liệu 2. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Kim Vân – Khoa Bào chế và chế biến – Viện Dược liệu, người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những ngày đầu làm nghiên cứu tới khi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Tống Thị Thanh Vượng – GV Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất đã quan tâm, đóng góp ý kiến và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị trong khoa Bào chế và chế biến – Viện Dược liệu đã tạo điều kiện, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu tại khoa. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường cùng toàn thể quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập tại trường. Cuối cùng, với tất cả tình yêu thương, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn động viên, chia sẻ, khuyến khích tôi trong suốt thời gian học tập tại trường Đại học Dược Hà Nội. Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2018 Phạm Thị Vân Anh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về curcuminoids ...............................................................................2 1.1.1. Nguồn gốc ...................................................................................................2 1.1.2. Công thức hóa học ......................................................................................2 1.1.3. Tính chất ......................................................................................................2 1.1.4. Tác dụng dược lý .........................................................................................6 1.1.5. Một số nghiên cứu định lượng curcuminoids..............................................8 1.1.6. Tiêu chuẩn curcuminoids trong dược điển ...............................................11 1.2. Chế phẩm nacumax ..........................................................................................12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu .............................................................14 2.1.1. Đối tượng ..................................................................................................14 2.1.2. Phương tiện nghiên cứu ............................................................................14 2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................14 2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ..........................................................................14 2.2.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu ....................................................................14 2.2.3. Thẩm định phương pháp sắc ký đã xây dựng............................................15 2.2.4. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng curcuminoids trong chế phẩm Nacurmax .....................................................................................................15 2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................15 2.3.1. Khảo sát điều kiện phân tích curcuminoids bằng HPLC ..........................15 2.3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu ....................................................................15 2.3.3. Thẩm định phương pháp ...........................................................................16 2.3.4. Áp dụng phương pháp phân tích định tính, định lượng curcuminoids trong chế phẩm narcumax ...............................................................................................18 2.4. Xử lý số liệu .....................................................................................................18 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Xây dựng điều kiện phân tích curcuminoids bằng HPLC ...............................19 3.1.1. Khảo sát lựa chọn cột sắc ký.....................................................................19 3.1.2. Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện ....................................................19 3.1.3. Khảo sát lựa chọn pha động và tốc độ dòng.............................................20 3.1.4. Khảo sát lựa chọn thể tích tiêm.................................................................22 3.2. Chuẩn bị mẫu ...................................................................................................23 3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn ........................................................................23 3.2.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu ....................................................................23 3.2.3. Chuẩn bị mẫu trắng ..................................................................................25 3.3. Thẩm định phương pháp định lượng curcuminoids bằng HPLC.....................25 3.3.1. Độ phù hợp của hệ thống ..........................................................................25 3.3.2. Tính chọn lọc .............................................................................................25 3.3.3. Độ tuyến tính và khoảng nồng độ .............................................................26 3.3.4. Độ chính xác .............................................................................................28 3.3.5. Độ đúng .....................................................................................................29 3.3.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .......................30 3.4. Áp dụng định tính, định lượng curcuminoids trong hỗn dịch Nacumax .........31 3.5. Bàn luận ...........................................................................................................32 3.5.1. Phương pháp xử lý mẫu ............................................................................32 3.5.2. Điều kiện sắc ký HPLC .............................................................................32 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận ............................................................................................................34 4.2. Kiến nghị ..........................................................................................................35 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril BDMC Bisdemethoxycurcumin BHT Butylated hydroxyl toluene Cur Curcumin DMC Demethoxycurcumin ED50 Liều đáp ứng ở 50% cá thể (Effective dose 50) HLGTN Hàm lượng ghi trên nhãn HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantification) MeOH Methanol ppm Một phần triệu (parts per million) PTFE Polytetrafluoroethylene RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation) STT Số thứ tự TB Trung bình TLTK Tài liệu tham khảo v/v Thể tích/thể tích (volume/volume) w/w/w Khối lượng/khối lượng/khối lượng (weight/weight/weight) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Cấu trúc hóa học của Curcuminoids ...............................................................2 Bảng 1.2. Tính chất vật lý đặc trưng của curcuminoids ..................................................3 Bảng 3.1. Các hệ đẳng dòng và gradient khảo sát .........................................................21 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát lựa chọn pha động .............................................................21 Bảng 3.3. Cách pha các hỗn hợp dung dịch chuẩn ........................................................23 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi chiết mẫu ....................................................24 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu ............................................................24 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ phù hợp của hệ thống. ..................................................25 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ tuyến tính ......................................................................27 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp ..........................................29 Bảng 3.9. Kết quả xác định độ thu hồi ..........................................................................30 Bảng 3.10. Kết quả giá trị LOD, LOQ của các curcuminoids ......................................31 Bảng 3.11. Kết quả định lượng curcuminoids trong chế phẩm Nacumax ....................31 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Curcuminoids ..............................................................2 Hình 1.2. (A) Curcumin, (B) Demethoxycurcumin, (C) Bisdemethoxycurcumin ..........2 Hình 1. 3. Phổ UV – VIS trong ethanol của Cur, DMC, BDMC [1] ..............................3 Hình 1.4. Dạng hỗ biến ceto – enol của curcuminoids trong dung dịch .........................3 Hình 1.5. Phản ứng amin hóa của curcumin ...................................................................4 Hình 1.6. Các dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch..........................................5 Hình 1.7. Sự phân hủy của Curcumin trong môi trường kiềm ........................................5 Hình 3.1. Sắc ký đồ của curcuminoids khi dùng cột HiQ sil C18HS (250 x 4,6 mm, 5µm) ..............................................................................................................................19 Hình 3.2. Sắc ký đồ của curcuminoids khi dùng cột TKSgel ODS – 80Ts (150 x 4,6 mm, 5µm) ......................................................................................................................19 Hình 3.3. Sắc ký đồ của curcuminoids khi dùng cột Ascentis C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) .......................................................................................................................................19 Hình 3.4. Phổ hấp thụ của Cur, DMC và BDMC ..........................................................20 Hình 3.5. Sắc ký đồ của curcuminoids ở hệ 1 ...............................................................21 Hình 3.6. Sắc ký đồ của curcuminoids ở hệ 2 ...............................................................21 Hình 3.7. Sắc ký đồ của curcuminoids ở hệ 3 ...............................................................21 Hình 3.8. Sắc ký đồ của curcuminoids ở hệ 4 ...............................................................21 Hình 3.9. Sắc ký đồ của curcuminoids ở hệ 5 ...............................................................21 Hình 3.10. Sắc ký đồ của mẫu trắng ..............................................................................26 Hình 3.11. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn ............................................................................26 Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của Cur ...........................................................................................................................27 Hình 3. 13 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của DMC........................................................................................................................27 Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của BDMC. ....................................................................................................................28 Hình 3.15. Sắc ký đồ của mẫu thử .................................................................................32 ĐẶT VẤN ĐỀ Nghệ là một loại gia vị màu vàng thường được dùng ở nhiều nước châu Á, không chỉ cho chăm sóc sức khỏe mà còn cho việc bảo quản thực phẩm và làm thuốc nhuộm màu vàng cho hàng dệt may. Qua nhiều thế kỉ, các nhà nghiên cứu đã chứng minh được rằng các chất màu curcuminoids là hoạt chất chính tạo ra các tác dụng sinh học của củ nghệ. Các curcuminoids đã được chứng minh là có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư,…và có khả năng chống lại các bệnh như bệnh loét dạ dày – tá tràng, tiểu đường, dị ứng, viêm khớp, bệnh Alzheimer,… Tuy nhiên, sinh khả dụng của các curcuminoids thấp do hấp thu kém, chuyển hóa nhanh và thải trừ nhanh chóng khỏi hệ thống tuần hoàn. Do đó, hiệu quả trên lâm sàng của các curcuminoids bị hạn chế. Để cải thiện sinh khả dụng của curcuminoids, có nhiều phương pháp đã được nghiên cứu, trong đó có biện pháp bào chế curcuminoids dưới dạng hệ tiểu phân nano nhằm làm tăng độ tan và độ hòa tan của curcuminoids từ đó làm tăng sinh khả dụng đường uống của curcuminoids một cách hiệu quả. Ở Việt Nam, hiện nay có nhiều sản phẩm chứa nano curcuminoids trên thị trường. Khoa Bào chế và chế biến – Viện Dược liệu đã nghiên cứu và bào chế tạo ra sản phẩm có chứa nano curcuminoids dạng hỗn dịch trong nước là Nacumax. Nhằm góp phần xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho sản phẩm này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu định lượng curcuminoids trong chế phẩm Nacumax bằng HPLC” với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng phương pháp định lượng curcuminoids trong hỗn dịch Nacumax bằng HPLC. 2. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng curcuminoids trong hỗn dịch Nacumax. 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về curcuminoids 1.1.1. Nguồn gốc Curcuminoids thuộc nhóm diarylheptanoids, là những chất màu, chất hoạt động chính được tìm thấy trong rễ cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.), họ Gừng (Zingiberaceae) [21]. Curcuminoids là dẫn chất nhóm phenolic, gồm curcumin (Cur) chiếm khoảng 60 – 80%, demethoxycurcumin (DMC) chiếm khoảng 15–30%, và bisdemethoxycurcumin (BDMC) chiếm khoảng 2 – 6% [16], [8], [30]. 1.1.2. Công thức hóa học Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Curcuminoids Bảng 1.1. Cấu trúc hóa học của Curcuminoids Curcumin OCH3 OCH3 (1E,6E) – 1,7 – bis (4 – hydroxy – 3– methoxyphenyl) – 1,6 – heptadiene – 3,5 – dione R1 R2 Tên khoa học Demethoxycurcumin OCH3 H Bisdemethoxycurcumin H H (1E, 6E) – 1 – (4 – Hydroxy – 3 – methoxyphenyl) – 7 – (4 – hydroxyphenyl) – 1,6 – heptadiene – 3,5 – dione (1E,6E) – 1,7 – Bis (4 – hydroxyphenyl) hepta – 1,6 – diene – 3,5 – dione Tên khác Diferuloylmethan phydroxycinnamoylferuloylmethane; Monodemethoxycurcumin CTPT C21H20O6 C20H18O5 p,pdihydroxydicinnamoylmethane; didemethoxycurcumin; bis(4hydroxycinnamoyl)methane C19H16O4 1.1.3. Tính chất 1.1.3.1. Tính chất vật lý Hình 1.2. (A) Curcumin, (B) Demethoxycurcumin, (C) Bisdemethoxycurcumin 2 Bảng 1.2. Tính chất vật lý đặc trưng của curcuminoids Curcumin Demethoxycurcumin Bisdemethoxycurcumin Hình dạng [1] Tinh thể hình kim Màu vàng tươi Tinh thể hình kim Màu đỏ cam Tinh thể hình kim Màu vàng cam Tnc (℃) [1] 179,5 – 183,5 168,5-170,2 213,2-215,5 Khối lượng phân tử (g/mol) [19], [8] 368 338 308 λmax UV – VIS trong ethanol (nm) [1] 426 422 418 Tan trong dầu, thực tế không tan trong nước ở pH acid và trung tính, Độ tan tan trong kiềm. Tan trong aceton, 2-butanone, ethyl acetate, methanol, ethanol, acid acetic băng, dichloroethan, propylene glycol... [16], [31], [22]. Hình 1. 3. Phổ UV – VIS trong ethanol của Cur, DMC, BDMC [1] 1.1.3.2. Tính chất hóa học ➢ Hiện tượng hỗ biến Trong dung dịch, các curcuminoids tồn tại ở dạng cân bằng hỗ biến giữa dạng diceton và ceto – enol được ổn định bởi liên kết hydro nội phân tử [16], [18], [31]. Hình 1.4. Dạng hỗ biến ceto – enol của curcuminoids trong dung dịch ➢ Tính chất của nhóm polyphenol [6] ✓ Tan trong dung dịch kiềm. 3 ✓ Tác dụng với các tác nhân oxy hóa: Nhóm –OH hoạt hóa nhân thơm, làm nhân thơm nhạy cảm đối với các tác nhân oxy hóa, nên Cur rất dễ bị oxy hóa. ✓ Tác dụng với dung dịch muối kim loại tạo phức chất có màu: Với Fe3+ tạo phức màu xanh đen; với thiếc (Sn), kẽm (Zn), đồng (Cu), canxi (Ca), magnesi (Mg) tạo hợp chất có màu từ vàng cam đến nâu đen [22]. ✓ Cur có thể liên kết với một số kim loại nặng như cadmium và chì, do đó làm giảm độc tính của các kim loại nặng [9]. ➢ Tính chất của nhóm diceton [6] Trong môi trường acid acetic, Cur dễ phản ứng với các hợp chất có cấu trúc kiềm (Y – NH2) như hydroxylamine (Y = – OH), hoặc phenylhydrazin (Y = C6H5 – NH –) tạo sản phẩm lần lượt là 3,5 – bis (3 – methoxy – 4 – hydroxylstiryl) Isoxazol và 3,5bis (3 – methoxy – 4 – hydroxylstiryl) – 1 – phenylpirazol. Các sản phẩm này đều có hoạt tính kháng nấm và chống oxy hóa tốt. Hình 1.5. Phản ứng amin hóa của curcumin ➢ Ảnh hưởng của pH tới dạng tồn tại của curcuminoids trong môi trường nước [16]. ✓ Ở pH < 1, dung dịch nước của Cur có màu đỏ biểu thị dạng proton (H4A+). ✓ Ở dải pH 1-7, phần lớn các Cur ở dạng trung tính (H3A). Độ tan trong nước rất thấp trong khoảng pH này và dung dịch có màu vàng. ✓ Ở pH > 7,5, màu chuyển sang đỏ, tồn tại ở 3 dạng H2A–, HA2–, A3– tương ứng với các giá trị pKa lần lượt là 6,8; 8,5; 9,0. 1.1.3.3. Độ ổn định ✓ Curcuminoids tương đối ổn định ở pH acid nhưng nhanh chóng bị phân hủy ở pH > 7. Ở pH 7 – 10, curcuminoids bị phân hủy thành acid ferulic, feruloylmethane và sản phẩm ngưng tụ, sau đó feruloylmethane bị phân hủy thành valinin và aceton [16]. 4 ✓ Curcuminoids dễ bị oxy hóa dưới tác dụng của ánh sáng. Các sản phẩm phân hủy chính là acid vanilic, vanillin, ferulic aldehyde và acid ferulic. Tuy nhiên, thành phần và sự phong phú của các sản phẩm phân hủy khác nhau tùy theo trạng thái vật lý của hợp chất và các điều kiện môi trường [16], [22]. Hình 1.6. Các dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch Hình 1.7. Sự phân hủy của Curcumin trong môi trường kiềm 5 1.1.4. Tác dụng dược lý Trong y học cổ truyền, nghệ đã được sử dụng để trị nhiều bệnh như đau bụng, dạ dày viêm loét, ung nhọt, viêm tấy… Thành phần chính tạo ra các tác dụng dược lý của nghệ đã được xác định là các chất màu curcuminoids. Các curcuminoids (đặc biệt là Cur) đã được chứng minh là có nhiều tác dụng sinh học như chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư, kháng khuẩn, chống virus, chống nấm… [9], [14], [19] , [24], [27]. ➢ Tác dụng chống oxy hóa Từ các nghiên cứu cho thấy, các curcuminoids có tác dụng chống oxy hóa mạnh, tương đương với vitamin C, E [9], [19]. Hoạt tính chống oxy hóa của các curcuminoids đã được đánh giá bằng một số mô hình in vitro. Khả năng chống oxy hóa của các curcuminoids giảm dần theo thứ tự Cur > DMC > BDMC. Ở nồng độ 50 ppm, Cur, DMC, BDMC được tìm thấy có tác dụng chống oxy hóa lần lượt tương đương với 3099 ± 66, 2833 ± 25 và 2677 ± 30 µmol/g vitamin C [19]. Khi đánh giá khả năng chống oxy hóa của các curcuminoids bằng phương pháp peroxy hóa acid linoleic, so với chất chống oxy hóa butylated hydroxyl toluene (BHT), ở nồng độ 100 ppm, hoạt động chống oxy hóa được thấy là cao nhất với Cur, sau đó đến DMC và BDMC [19]. ➢ Tác dụng chống viêm Cur có tác dụng chống viêm trong cả trường hợp viêm cấp tính và viêm mạn tính. Cur có tác dụng giống như phenylbutazone hay các cortisone trong trường hợp viêm cấp và có tác dụng bằng một nửa phenylbutazone trong trường hợp viêm mạn [9], [28]. Trong một nghiên cứu cho thấy, Cur cũng như cortisone hay phenylbutazone có tác dụng ức chế phù nề ở chuột cống ở mức liều từ 20 đến 80 mg/kg. Mức liều Cur có tác dụng ức chế phù nề 50% (ED50) là 48 mg/kg trong khi liều của cortisone và phenylbutazone là 45 và 48 mg/kg tương ứng [28]. Ngoài ra, một số nghiên cứu khác cũng cho thấy cả 3 curcuminoids tự nhiên đều có tác dụng chống viêm tốt [26]. Ở mức liều 50,0 mg/kg, BDMC cho tác dụng ức chế 86,86% phù phổi chuột nhắt ở 240 phút, còn Cur và DMC có tác dụng ức chế 72,4% và 65,1% tương ứng [26]. 6 ➢ Tác dụng chống ung thư Trong một vài nghiên cứu cho thấy rằng Cur có tác dụng ngăn ngừa ung thư phụ thuộc liều trên một vài hệ thống thử nghiệm khối u ở động vật bao gồm ung thư đại tràng, tá tràng, dạ dày, thực quản và ung thư miệng [24]. Các nghiên cứu trên động vật (chuột cống và chuột nhắt), cũng như các nghiên cứu in vitro sử dụng dòng tế bào người đã chứng minh khả năng của Cur ức chế chất sinh ung thư ở 3 giai đoạn: sự tăng sinh khối u, sự hình thành mạch và sự phát triển khối u [9]. Các curcuminoids (Cur, DMC, BDMC) cũng được nghiên cứu so sánh về hoạt động gây độc tế bào, giảm khối u và hoạt động chống oxy hóa. Các dữ liệu cho thấy, BDMC là tác nhân gây độc tế bào hiệu quả hơn và có thể ức chế đáng kể khối u cổ chướng ở chuột nhắt [24]. ➢ Tác dụng kháng khuẩn, kháng virus. Cur có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương trong ống nghiệm nhưng tác dụng yếu hơn nhiều so với các kháng sinh thông thường [20]. Một khám phá thú vị là nồng độ Cur thấp rất độc đối với Salmonella khi có ánh sáng. Tác dụng gây độc này được cho là do các chất trung gian không ổn định, có thể là các gốc tự do hình thành trong quá trình chiếu xạ [20]. Một số thử nghiệm in vitro và in vivo đã chứng minh được hoạt tính kháng virus của Cur chống lại virus herpes typ 2. Trong một thử nghiệm in vivo, 15 μl Cur (100 mg/ml) đã được đưa vào âm đạo ở chuột bị gây mê, sau đó tiêm phòng bằng virus. Trong số những con chuột được điều trị bằng Cur chỉ có 33,3 % phát triển nhiễm bệnh so với 75 % ở nhóm đối chứng [20]. ➢ Tác dụng bảo vệ gan Các nghiên cứu trước đây đã xác nhận rằng Cur và các chất tương tự có tác dụng bảo vệ gan mạnh mẽ chống lại tổn thương oxy hóa gây ra bởi một số chất gây độc gan [27]. Sử dụng Cur (30 mg/kg, đường uống) có thể làm giảm tổn thương gan gây ra ở chuột bằng cách làm giảm peroxid hóa lipid [20]. Ngoài ra, curcumin ức chế sự tổng hợp collagen và kích hoạt tế bào stellate gan in vitro và in vivo, do đó có thể giúp ngăn ngừa xơ gan [20]. ➢ Tác dụng trên đường tiêu hóa Nghệ đã được chứng minh có thể ức chế hình thành loét dạ dày tá tràng gây ra bởi stress, rượu, indomethacin, reserpine… và làm tăng đáng kể chất nhày ở dạ dày chuột 7 [9]. Trong một nghiên cứu xác định hiệu quả của nghệ ở 25 bệnh nhân bị loét dạ dày tá tràng chẩn đoán thông qua nội soi, liều uống bột nghệ (600 mg, 5 lần một ngày với cứ 500 mg bột nghệ chứa 8,25 mg curcuminoids) đã xóa loét ở 48 % bệnh nhân sau 4 tuần, 72 % bệnh nhân sau 8 tuần và 76 % bệnh nhân sau 12 tuần điều trị [20]. Trong một nghiên cứu khác, Cur đã được tìm thấy có khả năng bảo vệ đến 82 % chống lại sự phát triển của loét dạ dày do indomethacin gây ra. Cur ngăn chặn sự suy giảm glutathion, peroxyd hóa lipid và quá trình oxy hóa protein trong loét dạ dày cấp tính indomethacin gây ra ở chuột [20]. 1.1.5. Một số nghiên cứu định lượng curcuminoids Có nhiều nghiên cứu về các phương pháp kiểm soát hàm lượng curcuminoids trong các sản phẩm đã được thực hiện. ✓ Một nghiên cứu xác định hàm lượng curcuminoids trong bột nghệ được tiến hành trên hệ thống HPLC với cột Vydac, RP-18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), pha pha động ACN : acid trifluroacetic 0,1% (50 : 50, v/v), bước sóng phát hiện 420 nm, tốc độ dòng 1,5 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl. Curcuminoids trong mẫu thử được chiết bằng phương pháp soxhlet với dung môi chiết là hexan, hexan sau đó được thu hồi, cắn được tái hòa tan trong MeOH [17]. Phương pháp này cho phép xác định đồng thời Cur, DMC và BDMC trong khoảng nồng độ 100 – 600 ng/ml với độ phân giải Rs > 2, độ nhạy, độ chọn lọc, độ chính xác cao. Thời gian lưu của Cur, DMC và BDMC lần lượt là 9,0; 8,12 và 7,2 phút. Phương pháp đã xác định được LOD của Cur, DMC, BDMC là 27,99 ; 31,91; 21,81 ng/ml và LOQ của Cur, DMC, BDMC là 84,84; 96,72; 66,10 ng/ml. ✓ Cũng trên mẫu bột nghệ, trong một nghiên cứu khác curcuminoids được định lượng trên hệ thống HPLC với cột Water µ-Bondapack C18 (300 x 4,6 mm), bước sóng phát hiện 425 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, với gradient như sau: Thời gian (phút) MeOH Acid acetic 2% ACN 0 – 15 5% 50 → 30% 45 → 65% 15 – 20 5% 30 → 50% 65 → 45% Curcuminoids trong mẫu thử cũng được chiết bằng phương pháp soxhlet với dung môi là hexan, sau đó dung môi hexan được thu hồi, cắn được tái hòa tan lại bằng MeOH [11]. 8 Phương pháp cho phép xác định đồng thời Cur, DMC và BDMC trong khoảng nồng độ 0,0625 – 2,0 µg/ml. Thời gian lưu của Cur, DMC và BDMC lần lượt là 6,93 ± 0,092; 6,51 ± 0,065 và 6,11 ± 0,079 phút. LOQ của các curcuminoids được xác định là 0,05 µg/ml. ✓ Nghiên cứu định lượng curcuminoids trong các mẫu cao chiết nghệ trên hệ thống HPLC với cột Alltect Alltima C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), pha động ACN:Acid acetic 2% (40 : 60, v/v), bước sóng phát hiện 425 nm, tốc độ dòng 2 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, nhiệt độ cột 33oC. Curcuminoids trong mẫu thử được chiết bằng phương pháp siêu âm với dung môi ACN [30]. Phương pháp cho phép xác nhận đồng thời Cur, DMC và BDMC trong khoảng nồng độ 10 – 60; 4 – 24 và 0,5 – 3,0 µg/ml với thời gian lưu lần lượt là 13,6; 12,1 và 10,8 phút. LOD và LOQ được xác định là 0,90 và 2,73 µg/ml cho Cur; 0,84 và 2,53 µg/ml cho DMC; 0,08 và 0,23 µg/ml cho BDMC. Phương pháp được áp dụng định lượng với 5 mẫu cao chiết cho kết quả lượng curcuminoids thu được trong khoảng 81,90 – 99,86%. ✓ Một nghiên cứu khác xác định hàm lượng curcuminoids trong bột nghệ và mẫu cao chiết nghệ được thực hiện trên hệ thống HPLC với cột Luna C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), pha động ACN: acid formic 0,1% (50 : 50), bước sóng phát hiện 425 nm, tốc độ dòng 0,8 ml/phút, thể tích tiêm 10 µl, nhiệt độ cột 40oC. Curcuminoids trong mẫu thử được chiết bằng phương pháp siêu âm với dung môi MeOH [21]. Kết quả thu được thời gian lưu của Cur, DMC và BDMC lần lượt là 7,37; 8,24 và 9,18 phút. Giá trị LOD của Cur, DMC, BDMC xác định được là 7,40; 9,24; 6,48 ng/ml và giá trị LOQ tương ứng của 3 chất là 24,7; 30,8; 21,61 ng/ml. Áp dụng phương pháp vào định lượng 6 mẫu cao chiết nghệ cho kết quả định lượng curcuminoids trong mỗi mẫu dao động trong khoảng 85,55 – 99,30 % và với các mẫu bột nghệ thu được lượng curcuminoids là 41,76 ± 0,140 mg/g. ✓ Một nghiên cứu định lượng curcuminoids trong mẫu chiết Curcuma longa và nhũ tương chứa curcuminoids được tiến hành trên hệ thống HPLC với cột Agilent Eclipse Plus C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), pha động ACN: MeOH: H2O (40 : 20 : 40) (pH 3,0), bước sóng 370 nm, tốc độ dòng 1,5 ml/phút, thể tích tiêm 25 µl. Curcuminoids được chiết từ mẫu chiết Curcuma longa bằng máy rung với dung môi MeOH. Còn mẫu nhũ tương được đun cách thủy đến tan và pha loãng với MeOH [12]. 9 Phương pháp này cho kết quả sắc ký tách rời cả 3 chất Cur, DMC và BDMC với thời gian lưu là 6,667; 6,112 và 5,621 phút. Giá trị LOD và LOQ của Cur được xác định lần lượt là 0,305 µg/ml và 2 µg/ml. Áp dụng vào định lượng các mẫu thử cho kết quả hàm lượng Cur trong mẫu chiết Curcuma longa là 100,20% và trong mẫu nhũ tương là 99,45%. ✓ Nghiên cứu định lượng curcuminoids trong viên nang Hepapro chứa curcuminoids được thực hiện trên hệ thống HPLC với cột Waters X - bridge C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), bước sóng 288 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, nhiệt độ cột 30oC, với hệ pha động như sau: Thời gian (phút) 0.05M KH2PO4 pH 2,3 MeOH ACN 0–3 65 35 – 3 – 12 65 → 55 35 → 45 – 12 – 15 55 → 50 45 → 50 – 15 – 24 50 50 – 24 – 24,1 50 → 55 50 → 0 0 → 45 24,1 – 35 55 – 45 35 – 35,1 55 → 65 0 → 35 45 → 0 35,1 - 38 65 35 – Mẫu chế phẩm được hòa tan trong dung môi MeOH bằng phương pháp siêu âm. Phương pháp cho kết quả tách được cả 3 curcuminoids với thời gian lưu là 36,71; 35,77 và 34,94 phút tương ứng với Cur , DMC và BDMC. Giá trị LOD và LOQ của Cur là 0,0035 và 0,0118 mg/ml. Kết quả định lượng của Cur trong mẫu viên nang Hepapro là 100,78 ± 0,603 % [23]. ✓ Một nghiên cứu định lượng curcuminoids trong chế phẩm sol – gel chứa nano curcuminoids được tiến hành trên hệ thống HPLC Agilent Technologies 1260 Infinitive với cột Inertsil C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm), bước sóng phát hiện 418 nm, pha động ACN: dung dịch acid acetic 4% (50:50), thể tích tiêm 10 µl, tốc độ dòng 1,7 ml/phút. Mẫu chế phẩm được hòa tan trong MeOH bằng phương pháp siêu âm. [5] Phương pháp cho kết quả tách được cả 3 curcuminoids với thời gian lưu lần lượt là 8,747; 7,886 và 7,107 phút tương ứng với Cur, DMC và BDMC. Kết quả định lượng curcuminoids trong mẫu phân tích là 6,30 ± 0,067 %. 10 1.1.6. Tiêu chuẩn curcuminoids trong dược điển a. Dược điển Hồng Kông [15] + Đối tượng: Rễ củ khô của Curcuma longa L. + Chuẩn bị mẫu: Cân khoảng 0,5 g mẫu bột cho vào bình định mức 50 ml, chiết với 30 ml ethanol 75% bằng phương pháp siêu âm trong 30 phút. Lọc và chuyển dịch lọc sang bình cầu đáy tròn 150 ml. Chiết lặp lại thêm 1 lần nữa. Rửa phần cặn với 5 ml ethanol 75%. Làm bay hơi dung môi đến khô ở áp suất thấp trong thiết bị cô quay. Hòa tan phần cặn trong ethanol 75%. Chuyển dịch sang bình định mức 20 ml và thêm ethanol 75% vừa đủ đến vạch. Lọc qua màng lọc PTFE 0,45 µm trước khi khai triển HPLC. + Điều kiện sắc ký: ✓ Cột: ODS silica gel (250 x 4,6 mm, 5 µm). ✓ Pha động: ACN : acid formic 0,2% Thời gian (phút) ACN (%, v/v) Acid formic 0,2% (%, v/v) 0–5 40 60 5 – 20 40 → 47 60 → 53 20 – 45 47 53 45 – 60 47 →85 53 → 15 ✓ Bước sóng phát hiện: 335 nm. ✓ Tốc độ dòng: 1ml/phút. ✓ Thể tích tiêm: 10 µl. ➢ Yêu cầu: Rễ củ khô của Curcuma longa L. chứa không ít hơn 0,052% tổng lượng BDMC, DMC và Cur tính theo dược liệu khô. b. Dược điển Mỹ USP 38 [29] + Đối tượng: mẫu nghệ, bột nghệ, bột cao chiết nghệ và các sản phẩm chứa curcuminoids. + Chuẩn bị mẫu ✓ Với mẫu nghệ: Nghiền thành bột khoảng 5,0 g nghệ. Cân chính xác khoảng 0,5 g bột nghệ đã nghiền cho vào bình định mức 50 ml, thêm 30 ml aceton và siêu âm trong 30 phút. Thêm aceton vừa đủ đến vạch, lắc kỹ và ly tâm. Lấy 5 ml dịch cho vào bình định mức 50 ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc kỹ. 11