Tài liệu Nghiên cứu định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.

MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................... 2 1.1. Tổng quan về carbamazepin (CBZ) .................................................................. 2 1.1.1. Công thức cấu tạo và đặc điểm hóa lý ............................................................ 2 1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng ............................................................................ 2 1.1.3. Dược động học .............................................................................................. 3 1.1.4. Chỉ định và chống chỉ định ............................................................................ 4 1.1.5. Một số chế phẩm trên thị trường .................................................................... 4 1.1.6. Một số phương pháp định lượng CBZ trong dịch sinh học bằng HPLC.......... 5 1.2. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao...................................... 8 1.2.1. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao ........................................................ 8 1.2.2. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC ............................................................... 8 1.2.3. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký .................................................. 9 1.2.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký ...................................... 11 1.2.5. Phương pháp định lượng bằng HPLC .......................................................... 14 1.3. Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học ................................... 15 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................................................... 19 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị .................................................................................. 19 2.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 20 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 21 2.3.1. Chuẩn bị mẫu trong nghiên cứu ................................................................... 21 2.3.2. Xây dựng phương pháp phân tích ................................................................ 22 2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích ............................................................... 23 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................... 27 3.1. Xây dựng phương pháp định lượng CBZ trong huyết tương ........................... 27 3.1.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và nội chuẩn ..................................... 27 3.1.2. Khảo sát và tìm điều kiện xử lý mẫu có CBZ ............................................... 31 3.1.3. Qui trình phân tích CBZ trong huyết tương .................................................. 33 3.2. Thẩm định phương pháp phân tích .................................................................. 33 3.2.1. Tính chọn lọc-đặc hiệu................................................................................. 33 3.2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính .............................................................. 35 3.2.3. Giới hạn định lượng dưới ............................................................................. 36 3.2.4. Độ đúng – độ lặp lại trong ngày và khác ngày.............................................. 37 3.2.5. Tỷ lệ thu hồi của phương pháp ..................................................................... 38 3.2.6. Độ ổn định của mẫu huyết tương ................................................................. 41 3.3. Bàn luận ......................................................................................................... 41 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CBZ : Carbamazepin CBZ-E : Carbamazepine 10, 11- epoxide CV : Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation) HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ cao (High Quality Control Sample) HT : Huyết tương IS : Nội chuẩn (Internal Standard) LLOQ : Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit Of Quantification) LQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ thấp (Lower Quality Control Sample) MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol MQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ trung bình (Middle Quality Control Sample) P.A : Tinh khiết phân tích (pure analysis) QC : Mẫu kiểm soát chất lượng (Quality Control Sample) SKĐ : Sắc ký đồ SPE : Chiết pha rắn (Solid-phase extration) US-FDA : Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (The United States Food and Drug Administration) UV-VIS : Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet - Visible) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 1.1 Các chế phẩm carbamazepin trên thị trường 5 1.2 Một số nghiên cứu định lượng carbamazepin trong dịch sinh học 6 2.1 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 19 2.2 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu 20 2.3 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 20 2.4 Các mẫu huyết tương trắng trong nghiên cứu 20 2.5 Chuẩn bị đường chuẩn 22 2.6 Chuẩn bị mẫu kiểm tra 22 2.7 Chuẩn bị mẫu kiểm tra xác định độ đúng 24 3.1 Kết quả xác định ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời gian lưu của carbamazepin và nội chuẩn 35 3.2 Kết quả thẩm định đường chuẩn 35 3.3 Kết quả thẩm định giới hạn định lượng dưới 36 3.4 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại trong ngày 37 3.5 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại giữa các ngày 38 3.6 Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi nội chuẩn 39 3.7 Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi carbamazepin 40 3.8 Kết quả thẩm định độ ổn định dung dịch chuẩn nội trong thời gian ngắn 41 3.9 Kết quả thẩm định độ ổn định dung dịch chuẩn carbamazepin gốc dài ngày 41 3.10 Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông–rã 42 3.11 Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn 43 3.12 Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương ở thời gian dài ở nồng độ thấp 44 3.13 Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu huyết tương ở thời gian dài ở nồng độ cao 44 3.14 Kết quả thẩm định độ ổn định của mẫu sau xử lý 45 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình Nội dung Trang 1.1 Cấu trúc cột LC-DB 12 1.2 Cấu trúc cột có gốc isopropyl 13 3.1 Phổ hấp thụ UV – VIS của carbamazepin 27 3.2 Sắc ký đồ khảo sát trimetazidin làm nội chuẩn 28 3.3 Sắc ký đồ khảo sát olanzapin làm nội chuẩn 28 3.4 Sắc ký đồ khảo sát acid fenofibric làm nội chuẩn 28 3.5 Sắc ký đồ khảo sát propylparaben làm nội chuẩn 28 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 Sắc ký đồ của carbamazepin và nội chuẩn trong pha động MeOH : đệm phosphat pH 7,0 (60:40) và tốc độ dòng 1,0 mL/phút Sắc ký đồ của carbamazepin và nội chuẩn trong pha động MeOH : đệm phosphat pH 7,0 (58:42) và tốc độ dòng 1,0 mL/phút Sắc ký đồ của carbamazepin và nội chuẩn trong pha động MeOH : đệm phosphat pH 7,0 (58:42) và tốc độ dòng 1,3ml/phút Sắc ký đồ mẫu chuẩn carbamazepin và nội chuẩn với quy trình xử lý mẫu được chọn Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng thẩm định độ chọn lọc Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn carbamazepin (nồng độ 0,1µg/mL) và nội chuẩn 30 30 30 32 34 34 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh động kinh được định nghĩa là sự rối loạn từng cơn chức năng của thần kinh trung ương do sự phóng điện đột ngột, quá mức, đồng thời của các neuron. Bệnh xuất hiện ở tất cả mọi nơi trên thế giới và có thể ở mọi lứa tuổi. Trong số các bệnh nhân động kinh, khoảng 50% trẻ em có vấn đề khó khăn về nhận thức, 6% bệnh nhân có bất thường về vận động, 6% rối loạn tâm thần nặng, 1/15 bệnh nhân phụ thuộc vào người khác cho các công việc hằng ngày vì lý do bệnh động kinh và mức độ tàn phế liên quan đến nó. Trên thế giới người mắc bệnh động kinh chiếm khoảng 0,5% dân số và tại Việt Nam khoảng 2% dân số bị động kinh trong đó gần 60% số bệnh nhân là trẻ em [1], [20], [26]. Carbamazepin là một dẫn xuất của iminostiben, được xem là một trong những thuốc cơ bản hàng đầu để điều trị bệnh động kinh, đặc biệt là động kinh cục bộ và động kinh thể co cứng giật rung. Tuy nhiên khoảng điều trị của carbamazepin hẹp, cơ chế tác dụng phức tạp, nhiều tương tác, tương kỵ và có nhiều trường hợp bệnh nhân ngộ độc thuốc. Hơn nữa trong thực tế điều trị, tính cá thể thường thể hiện rất rõ và phức tạp. Do đó việc nghiên cứu về sinh khả dụng, dược động học, dược lâm sàng của các chế phẩm carbamazepin, đặc biệt kiểm soát nồng độ carbamazepin trong huyết tương bệnh nhân để điều chỉnh liều cho phù hợp với từng cá thể là hết sức cần thiết. Tại Việt Nam, năm 2010, Bộ Y Tế đã quy định các thuốc chứa hoạt chất carbamazepin phải có báo cáo, số liệu đánh giá tương đương sinh học invivo mới được cấp phép đăng ký và lưu hành trên thị trường Việt Nam [7]. Với mong muốn xây dựng phương pháp xác định nồng độ carbamazepin trong huyết tương nhằm phục vụ cho công tác điều trị và đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm chứa hoạt chất carbamazepin, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với 2 mục tiêu: 1. Khảo sát, xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA. 2. Thẩm định phương pháp xây dựng theo qui định của US-FDA. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ CARBAMAZEPIN (CBZ) 1.1.1. Công thức cấu tạo và đặc điểm hóa lý 1.1.1.1. Công thức cấu tạo - Công thức phân tử: C15H12N2O. - M=236,27g/mol. - Tên khoa học: 5H-Dibenz[b,f]azepine-5-carboxamide [10], [21]. 1.1.1.2. Đặc điểm hóa lý - Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng. - Rất khó tan trong nước và ether, hơi tan trong aceton và ethanol (96%), dễ tan trong dicloromethan, methylen clorid, chloroform. - Nhiệt độ nóng chảy: 189-193°C [3], [5], [10], [14]. 1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng Carbamazepin là một hợp chất iminostilben - nhóm cấu trúc dibenzazepine, là một trong những thuốc cơ bản trong điều trị động kinh cục bộ và động kinh co cứng-giật rung. CBZ làm ổn định tình trạng quá kích thích tại màng thần kinh, kìm hãm sự phóng lặp lại các xung thần kinh, giảm sự dẫn truyền synap của các xung kích thích. Sự ức chế cảm ứng điện dòng Na+ có thể là cơ chế hoạt động chính của CBZ, nhờ đó CBZ có thể ức chế sự chuyển vận catecholamin, quá trình giải phóng glutamate [2], [4], [23]. Tác dụng chống co giật của CBZ đặc biệt hiệu quả ở các bệnh nhân động kinh cục bộ phức hợp tuy nhiên không hiệu quả trong động kinh cơn vắng. CBZ làm tăng 3 ngưỡng động kinh, làm giảm nguy cơ co cứng và giảm các triệu chứng cai nghiện rượu. CBZ có tác dụng hướng tâm thần, nâng cao tâm trạng ở một số bệnh nhân trầm cảm bị động kinh và điều trị phối hợp với các thuốc chống loạn thần trong giai đoạn cấp tính của bệnh tâm thần phân liệt. CBZ cũng có tác dụng điều trị bệnh rối loạn lưỡng cực, đặc biệt trong trường hợp bệnh nhân không đáp ứng điều trị với cả lithium và valproat. Ngoài ra, CBZ còn có tác dụng giảm đau do thần kinh như đau dây thần kinh sinh ba, giảm triệu chứng đau mãn tính phát sinh từ các hội chứng thần kinh ngoại vi khác [2], [4], [9]. 1.1.3. Dược động học Sau khi uống, CBZ hầu như được hấp thu hoàn toàn, tuy chậm và thất thường. Thời gian cần để đạt tới nồng độ đỉnh trong máu sau khi uống CBZ dạng viên nén, hỗn dịch, viên nén giải phóng kéo dài, viên nang giải phóng kéo dài lần lượt là: 4,5h; 1,5h; 3-12h và 4,1-7,7 giờ. Thuốc phân phối nhanh vào mô, rộng khắp cơ thể, phát hiện có trong dịch não tủy, não, dịch tá tràng, mật, nước bọt, cả nhau thai và sữa mẹ. Tỷ lệ liên kết với protein huyết tương: 75-78%, nồng độ thuốc trong dịch não tủy tương đương trong huyết tương. Thể tích phân bố là: 0,88  0,06 lít/kg ở người lớn và 1,2  0,2 lít/kg ở trẻ em. Cơ chế chuyển hóa của CBZ không hoàn toàn sáng tỏ, theo nghiên cứu thì con đường chuyển hóa chính là quá trình oxy hóa bởi CYP3A, chủ yếu tạo thành carbamazepin-epoxid (CBZ-E) là một chất chuyển hóa có hoạt tính. Ở người lớn, CBZ-E có trong máu với nồng độ từ 10 - 15% nồng độ của hợp chất mẹ, ở trẻ em là 20%. CBZ-E có thể gây độc thần kinh, đặc biệt khi dùng thuốc đồng thời với phenytoin hoặc phenobarbital và việc tăng tỷ lệ epoxid có thể giải thích độc tính thần kinh của CBZ ở nồng độ điều trị trong huyết thanh. 4 Thải trừ: CBZ-E tiếp tục chuyển hóa thành hợp chất bất hoạt và đào thải vào nước tiểu. Chỉ có 3% CBZ bài tiết không thay đổi trong nước tiểu ở dạng không chuyển hóa, ở phân tỷ lệ này là 15%. Thời gian bán thải: - CBZ: Liều ban đầu :25 giờ đến 65 giờ. Liều lặp lại (sau 3-5 tuần) : 12 giờ đến 17giờ (do quá trình tự cảm ứng của CBZ trong 3-5 tuần đầu). - CBZ-E: 6,1 giờ [2], [9], [23]. 1.1.4. Chỉ định và chống chỉ định 1.1.4.1. Chỉ định: - Bệnh động kinh: Ðộng kinh cục bộ có triệu chứng phức tạp (động kinh tâm thần vận động và động kinh thùy thái dương), động kinh lớn (co giật cứng toàn bộ). Các kiểu động kinh hỗn hợp gồm các loại trên, hoặc các loại động kinh cục bộ hoặc toàn bộ khác. - Ðau do nguyên nhân thần kinh: Giảm đau do dây thần kinh sinh ba và giảm đau dây thần kinh lưỡi hầu, đau trong zona, giang mai thần kinh…. - Dự phòng bệnh hưng - trầm cảm (không đáp ứng với liệu pháp thông thường). - Ðiều trị hội chứng cai rượu. 1.1.4.2. Chống chỉ định - Loạn chuyển hóa porphyrin cấp tính. - Quá mẫn với CBZ hoặc dị ứng với các thuốc có cấu trúc liên quan như các thuốc chống trầm cảm ba vòng. - Block nhĩ - thất. - Người có tiền sử loạn tạo máu và suy tủy. - Người mang thai, đặc biệt trong 3 tháng đầu [2], [4]. 1.1.5. Một số chế phẩm trên thị trường Các chế phẩm CBZ trên thị trường chủ yếu dùng ở dạng viên nén hàm lượng 200mg. Ngoài ra còn có các dạng viên nén nhai, viên nén giải phóng kiểm soát, viên nang giải phóng chậm, hỗn dịch uống với hàm lượng 100, 200 hoặc 300 mg cho phù hợp với nhu cầu người sử dụng. Một số chế phẩm chứa CBZ trên thị trường được trình bày cụ thể tại bảng 1.1 sau: 5 Bảng 1.1. Một số chế phẩm CBZ trên thị trường [24], [25]. STT 1 Dạng bào chế Viên nén Tên biệt dược 200mg Novartis Carbadac 200mg Cadila Heathcare Calzepin 200mg Hovid Sdn. Bhd Carbamazepin-200 200mg Carbamazepin 200mg phóng kiểm 5 Viên nang giải phóng chậm Hỗn dịch uống Sishui Xier Kang Pharmaceutical.Co.Ltd Carbatol 200 200mg Torrent Pharm.Ltd Tegretol 100mg Novartis Tergetol-CR soát 4 phẩm ECO Flamingo Pharm.Ltd Viên nén giải 3 Công ty CP dược 200mg tablet BP 200mg Viên nén nhai Nhà sản xuất Tegretol Carbamazepin 2 Hàm lượng Carbatol Carbamazepin suspension 100mg 200mg 200mg 300mg Novartis Shire US 100mg/5ml Alpharma 1.1.6. Một số phương pháp định lượng CBZ trong dịch sinh học bằng HPLC Hiện nay, định lượng CBZ nguyên liệu có thể sử dụng phương pháp đo quang hoặc phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Định lượng CBZ trong dịch sinh học có thể sử dụng nhiều phương pháp khác như HPLC, điện di mao quản, phóng xạ miễn dịch [12], [13]. Tuy nhiên, phương pháp định lượng bằng HPLC vẫn 6 được nhiều nghiên cứu sử dụng nhất do có nhiều ưu điểm. Một số phương pháp định lượng CBZ trong huyết tương bằng HPLC được trình bày ở bảng 1.2 Bảng 1.2. Một số nghiên cứu định lượng CBZ trong dịch sinh học. TT/ Tài Mẫu liệu 1 [15] Huyết tương người Điều kiện sắc ký Xử lý IS mẫu Chiết 5 (p- lỏng-lỏng metylphenyl) -5- bằng phenylhydantoin chlorofom Cột Pha động Detector Acetonitril: µ-Bondapark nước = 37:63 C18 (v/v) (30cm×4mm) Tốc độ dòng: UV, λ 254 nm 1,5ml/phút Acetonitril : 2 [18] Huyết tương BakerbondChiết pha rắn (SPE) phenobarbital người BDC C18 (250mm x 4.6 mm) 10mM đệm phosphat pH UV, 7,0 = 30 :70 λ 210 nm (v/v) Tốc độ dòng: 1,5mL/phút Tủa 3 [17] Huyết protein tương bằng thỏ methanol (MeOH) µ-Bondapark propylparaben C18 (150mm×4,6 mm) MeOH: nước=50:50 UV, (v/v) λ 285nm Tốc độ dòng: 1ml/phút Nhận xét: Phương pháp 1: Phương pháp cho độ nhạy cao và thời gian chạy sắc ký là 8 phút, thuận lợi cho quá trình phân tích. Tuy nhiên dung môi chiết chỉ sử dụng cloroform – khó bay hơi nên có nhược điểm thời gian cô dài, dễ tạo nhũ tương gây khó khăn cho quá trình chiết. Ngoài ra chất chuẩn nội 5 (p-metylphenyl) -5phenylhydantoin của phương pháp không phổ biến, một chất hiện tại phòng thí nghiệm chúng tôi chưa có nên khó có thể áp dụng phương pháp vào nghiên cứu. 7 Phương pháp 2: Phương pháp cho độ chính xác cao (92,09% - 108,5%), khoảng nồng độ tuyến tính từ 0.2-25 µg/mL, thời gian chạy sắc ký ngắn (khoảng 8 phút). Tuy nhiên sử dụng quy trình xử lí mẫu bằng SPE tương đối phức tạp và chi phí cao. Trong điều kiện phòng thí nghiệm ở nước ta hiện nay, việc áp dụng phương pháp này gặp nhiều khó khăn do không đủ kinh phí mua cột chiết và trang thiết bị chiết pha rắn. Vì vậy phương pháp này khó có thể áp dụng ngay ở nước ta hiện nay. Phương pháp 3: Xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein trong dung môi MeOH đơn giản, dễ thực hiện. Tuy nhiên, nền mẫu phức tạp, mẫu chưa sạch, pic của chuẩn không tách được hoàn toàn pic tạp trên sắc ký đồ và thời gian lưu của chuẩn nội khoảng 11,4 phút gây kéo dài thời gian phân tích, không thuận lợi cho quá trình phân tích nhiều mẫu trong ngày. Dựa trên sự tham khảo các tài liệu đã được công bố và dựa vào tính chất lý hóa của CBZ, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng CBZ trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với detector UV-VIS có sử dụng chất nội chuẩn phù hợp đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ chính xác cao của phương pháp phân tích trong dịch sinh học, dễ thực hiện với điều kiện hiện có tại các phòng kiểm nghiệm của Việt Nam. We used a Model Conn. 06856) high-pressure liquid 601 (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, 8 1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.2.1. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao. Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế: hấp phụ, phân tán, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hóa học trên bề mặt [6], [8]. 1.2.2. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC  Hệ thống bơm Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được điều chỉnh được áp suất (thường 0-400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn định, phù hợp với quá trình sắc ký.  Bình chứa dung môi và hệ thống xử lí dung môi Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ. Dung môi cần được lọc loại các hạt (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45µm) và đuổi khí hòa tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí).  Bộ phận tiêm mẫu Để đưa mẫu phân tích vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ thống tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay) hay microsyringe tiêm trong hệ tiêm mẫu tự động.  Cột sắc ký Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký vì ở cột xảy ra quá trình phân tách các chất. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao tới vài trăm bar. Trong cột nhồi pha tĩnh của hệ sắc ký. Cột có nhiều cỡ khác nhau, tùy theo mức độ và mục đích quá trình sắc ký. Nói chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 10-25cm, đường kính 2-5mm.  Bộ phận phát hiện (Detector) 9 Là bộ phận phát hiện chất phân tích. Tùy theo bản chất của các chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp, thường có các loại sau: Detector hấp thụ UVVIS, detector phổ phát xạ nguyên tử, detector huỳnh quang [6], [8]. 1.2.3. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký 1.2.3.1. Thời gian lưu tR & Thể tích lưu VR  Thời gian lưu (tR) Thời gian lưu (tR) của một chất là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detertor và cho pic trên sắc ký đồ tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh của pic. Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ, nó là hằng số đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi. Trong một phép phân tích còn có thời gian lưu hiệu chỉnh hay thời gian lưu thực (tR’), được tính bằng công thức sau: tR’ = tR – tM. Với: tM là thời gian lưu của 1 chất không bị lưu giữ bởi pha tĩnh. Nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém, còn nếu tR quá lớn thì pic bị loãng, thời gian phân tích kéo dài.  Thể tích lưu (VR) Thể tích lưu (VR) là thể tích dung môi đi qua cột cần để di chuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc ký đồ. VR= tR×Fc Với: Fc là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian. Trên thực tế, thể tích lưu là lượng tổng cộng pha động tính từ lúc tiêm mẫu đến khi ra khỏi hệ thống [6], [8]. 1.2.3.2. Hệ số phân bố K Hệ số phân bố (K) là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó qua cột. K= Trong đó: CS và CM là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh và pha động 10 Hệ số phân bố K phụ thuộc vào: bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ. Trị số K càng lớn thì sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm [6]. 1.2.3.3. Hệ số dung lượng k’ Hệ số dung lượng k’ cho biết khả năng phân bố của chất phân tích trong hai pha và được tính theo sức chứa của cột: k’ = k x = = ′ = Hệ số dung lượng k’ phụ thuộc: bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc điểm cột, thể tích pha động và pha tĩnh. Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho: 1≤ k ’≤8 [6], [8]. 1.2.3.4. Hệ số chọn lọc α Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B, người ta dùng hệ số chọn lọc α : α = ′ = ′ = ( ) ( ) Qui ước : Chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên α>1 Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 [6], [8]. 1.2.3.5. Hệ số đối xứng của pic F F= Trong đó: W: chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao của pic a: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic [6], [8]. 1.2.3.6. Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột: = 16[ ] ℎ = 5,54[ ] Trong đó: W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic. W là chiều rộng của pic đo ở đáy pic [6], [8]. 11 1.2.3.7. Độ phân giải Rscủa cột Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B) Rs = .( ( ) ( ) ) hoặc , .( ( ) ( ) ) / / Trong đó: t(R)A; t(R)B : thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (A và B). WA; WB : độ rộng pic đo ở các đáy pic. W1/2A; W1/2B : độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic. Yêu cầu: RS> 1; giá trị tối ưu Rs = 1,5 [6], [8]. 1.2.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 1.2.4.1. Lựa chọn pha tĩnh cho HPLC Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách của một hỗn hợp nhiều chất. Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động sắc ký được chia thành 2 loại: - Sắc ký pha thuận: pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, chất phân tích thường là các chất phân cực hoặc là các chất có thể phân cực. - Sắc ký pha đảo: pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất phân tích thường là các chất có thể phân cực hoặc ít phân cực. Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền Silica (SiO2), nền oxyd nhôm (Al2O3), nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên mạch carbon. Trong sắc ký hấp phụ pha đảo: pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu việt được sử dụng nhiều nhất. Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc Siloxan: 12 - R là các nhóm phân cực (ưa nước): nhóm OH hoặc các alkylamin –CH2NH2, alkyl nitril – CH2 – CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha thuận để phân tích các chất ít hoặc không phân cực [16]. - Với R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế bằng cách alkyl hóa các nhóm OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkylR của mạch carbon (C2;C8;C18) hay các gốc carbon vòng phenyl. Do các nhóm OH thân nước được thay thế bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực. Silica đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion [6]. Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn những nhóm –OH gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy theo môi trường pH phân tích. Trong môi trường quá acid, pH < 2 thì có sự phân ly các nhóm ether ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không thể tương tác với cột. Trong môi trường Base (pH>7), các nhóm –OH trong cột sẽ tương tác với chất tan có tính base. Tương tác này khác với kiểu tương tác của chất tan với nhóm –SiC18, dẫn đến hiện tượng cùng một chất nhưng sẽ có những đỉnh ra khác nhau hay là hiện tượng kéo đuôi. Kết quả giảm đi độ chính xác. Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các hợp chất như trimethylclorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexametyldisizan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH này. Cấu trúc pha liên kết được trình bày ở hình 1.1 Hình 1.1: Cấu trúc cột LC-DB 13 Có một cách khác để loại trừ bớt sự ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần tương tác với nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che chắn đi những nhóm –OH, được trình bày ở hình 1.2. Hình 1.2 : Cấu trúc cột có gốc Isopropyl Ngoài ra, trong một số trường hợp còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của dây C18 làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh (Cột EPS–Expended Polar Selectivity) [16]. 1.2.4.2. Lựa chọn pha động cho HPLC Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp. Trong sắc ký pha đảo, pha động là dung môi phân cực như: nước, methanol, acetonitril … hoặc hỗn hợp của chúng. Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ. Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký như: độ chọn lọc α, thời gian lưu tR, độ phân giải Rs, độ rộng của đáy pic… nên việc phân tích, lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng.  Yêu cầu của 1 pha động - Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian. - Hòa tan chất cần phân tích. - Có độ tinh khiết cao. - Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký. - Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường.  Các yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả - Bản chất của dung môi để pha pha động. 14 - Thành phần các chất trong pha động. - pH của pha động. - Tốc độ dòng của pha động.  Chọn đệm – pH: Trong sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính chất acid hoặc base thường phải sử dụng đệm ở pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký. Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc ký.  Tốc độ dòng của pha động: Sau khi có pha tĩnh, pha động, pH thích hợp, để tăng hiệu lực tách của quá trình phải chọn tốc độ pha động phù hợp, đảm bảo việc tách các chất phân tích được tốt nhất mà đạt hiệu quả cao về thời gian và kinh tế [16]. 1.2.4.3. Lựa chọn Detector Khi pha động rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ ghi nhận bởi detector chuyển thành tín hiệu và được ghi trên sắc ký đồ. Detector phổ biến nhất là Detector UVVIS. Tùy theo chất cần phân tích mà người ta đặt các bước sóng phát hiện khác nhau [16]. 1.2.5. Phương pháp định lượng bằng HPLC 1.2.5.1. Cách đánh giá pic - Đánh giá diện tích pic: để tính diện tích pic có thể dùng tích phân kế hoặc dùng máy tính đã cài đặt sẵn chương trình. - Đánh giá chiều cao của pic với điều kiện các chỉ số k’ là hằng định. Đo chiều cao của pic chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thử từ thấp đến trung bình. 1.2.5.2. Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. Có 4 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký: phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn, phương pháp chuẩn hóa diện tích. 15 Hiện nay, phương pháp chuẩn nội được sử dụng nhiều nhất để định lượng thuốc trong huyết tương. Phương pháp chuẩn nội khắc phục được những nhược điểm của phương pháp chuẩn ngoại, giúp hạn chế tối đa những sai số có thể gây ra do máy móc, kỹ thuật nhất là với những qui trình xử lý mẫu phức tạp và các mẫu có hàm lượng chất cần định lượng thấp.  Nguyên tắc phương pháp chuẩn nội: thêm cả vào mẫu chuẩn và mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết (chất chuẩn nội) rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện.  Nguyên tắc lựa chọn chất nội chuẩn: - Trong cùng điều kiện sắc ký, chất IS phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử. - Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử. - Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử. - Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử. - Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm. Trong phương pháp chuẩn nội có 2 phương pháp là: - Chuẩn hóa 1 điểm. - Chuẩn hóa nhiều điểm. Chuẩn bị một dãy chuẩn ít nhất là 5 mẫu có nồng độ chất chuẩn khác nhau nhưng tất cả cùng chứa một lượng chuẩn nội bằng nhau. Tiến hành chạy sắc ký các mẫu, ta xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa tỷ số diện tích (hay chiều cao) pic của chất chuẩn với chuẩn nội (SS / SIS) so với tỷ số nồng độ chất chuẩn với chuẩn nội (CS / CIS). Dựa vào đường chuẩn để tìm ra nồng độ chất thử [6], [8]. 1.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC 1.3.1. Khái niệm Thẩm định một phương pháp phân tích sinh học là quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế, nhằm