Tài liệu Nghiên cứu định lượng atractylenolide iii trong thân rễ bạch truật (atractylodes macrophala koidz) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao bắt cặp detector dad

  • Số trang: 37 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 5 |
  • Lượt tải: 0
tailieuonline

Tham gia: 31/07/2015

Mô tả:

VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI dP ha rm ac y, KHOA Y DƯỢC ine an TRẦN NGỌC TUÂN M ed ic NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ATRACTYLENOLIDE III TRONG THÂN RỄ BẠCH TRUẬT (Atractylodes macrophala Koidz) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO BẮT CẶP DETECTOR DAD Co py rig ht @ Sc ho ol of KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2019 KHOA Y DƯỢC ac y, Người thực hiện : TRẦN NGỌC TUÂN VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI dP ha rm NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ATRACTYLENOLIDE III TRONG THÂN RỄ BẠCH TRUẬT (Atractylodes macrophala Koidz) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO BẮT CẶP DETECTOR DAD Khóa: QH2014.Y Người hướng dẫn: ed ic TS. Hoàng Lê Sơn ine an KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Co py rig ht @ Sc ho ol of M PGS.TS. Nguyễn Thanh Hải HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN ac y, VN U Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Tiến sĩ Hoàng Lê Sơn – Khoa Bào chế Chế biến và PGS.Tiến sĩ Nguyễn Thanh Hải – Chủ nhiệm bộ môn Bào chế khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Dược Liệu là những người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. dP ha rm Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Bào chế - khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và khoa Bào chế Chế biến – Viện Dược Liệu, đã tạo điều kiện để tôi có thể thực hiện khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm, các Phòng ban khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo trong khoa đã cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt những năm học tập, sinh hoạt và rèn luyện tại khoa. ine an Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên tôi trong lúc khó khắn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này. tháng Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic Hà Nội, ngày Trần Ngọc Tuân năm 2019 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Giới hạn phát hiện (Limit Of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit Of Quantitation) HPLC Sắc ký lỏng hiệu Chromatography) DAD Máy đo quang (Diode Array Detector) RSD Độ lệch chuẩn tương đối ACN Acetonitrile USP Dược điển Hoa Kì ICH Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người an ine ed ic M of ho ol Sc @ ht rig py Co (High Performance dP ha rm cao Liquid ac y, năng VN U LOD DANH MỤC BẢNG BIỂU Số trang 1 Hóa chất thuốc thử dùng trong nghiên cứu. 2 Trang thiết bị, máy móc sủ dụng trong nghiên cứu. 16 3 Kết quả sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi pha động với các chương trình chạy đẳng dòng bằng HPLC-DAD, bước sóng phát hiện là 220nm. 4 Kết quả diện tích pic của các lần chiết mẫu Bạch truật với Ethanol 96% khi phân tích bằng HPLC-DAD. 17 5 Các thông số đánh giá HPLC đối với Atractylenolide III. 18 6 Kết quả độ tuyến tính của phương pháp HPLC định lượng Atractylenolide III với dãy nồng độ chuẩn. 20 21 7 Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống của phương pháp định lượng Atractylenolide III với mẫu chuẩn nồng độ 26µg/ml. 8 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp định lượng Atractylenolide III với mẫu Bạch truật chiết với Ethanol 96%. 22 9 Kết quả đánh giá độ thu hồi của phương pháp định lượng trong mẫu thử thêm chuẩn Atractylenolide III. 22 10 Kết quả xác định hàm lượng Atractylenolide III trong mẫu Bạch truật Việt Nam và Trung Quốc. 23 9 M ed ic ine an dP ha rm ac y, 9 of ho ol Sc @ ht rig py Co VN U Tên bảng Bảng DANH MỤC HÌNH ẢNH Tên hình Số trang VN U Hình Công thức cấu tạo một số chất chính trong cây bạch truật. 4 2 Công thức cấu tạo của Atractylenolide III. 7 3 Sắc ký đồ phân tích ở bước sóng 220nm - 254nm và bước sóng hấp thụ cực đại của Atractylenolide III. 15 4 Sắc ký đồ HPLCđánh giá độ đặc hiệu của phương pháp định lượng Atractylenolide III với mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn và mẫu chuẩn. 28 5 Sắc ký đồ HPLC của Atractylenolide III với nồng độ lần lượt là 0,065µg/ml và 0,65µg/ml. 19 6 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của dung dịch chất chuẩn Atractylenolide III. 20 7 Sắc ký đồ phân tích Atractylenolide III trong mẫu Bạch truật bằng HPLC-DAD. 24 8 Phổ hấp thụ UV của thành phần khác trong mẫu Bạch truật Việt Nam. 24 Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an dP ha rm ac y, 1 MỤC LỤC VN U MỞ ĐẦU ...............................................................................................................................1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN................................................................................................2 ac y, 1.1. Giới thiệu chung về cây bạch truật .................................................................................2 1.1.1. Tên khoa học ............................................................................................................2 dP ha rm 1.1.2. Mô tả thực vật, bộ phận dùng ..................................................................................2 1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến ....................................................................................2 1.1.4. Thành phần hóa học .................................................................................................3 1.1.5. Tác dụng dược lý .....................................................................................................5 an 1.2. Tổng quan về vị thuốc Bạch thuật ..................................................................................7 ine 1.3. Vài nét về hoạt chất Atractylenolide III ..........................................................................8 1.4. Các nghiên cứu định lượng Atractylenolide III trong cây bạch truật .............................8 ed ic CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 9 2.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................................... 9 M 2.2. Trang thiết bị, dung môi, hóa chất ............................................................................... 9 of 2.3. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................................. 10 2.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ..................................................................................... 10 ho ol 2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu ........................................................................................ 10 2.3.3. Thẩm định quy trình phân tích.............................................................................. 10 Sc 2.3.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả ................................................................ 13 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ ................................................................................................... 15 @ 3.1. Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III .............................................. 15 ht 3.1.1. Xác định bước sóng phát hiện của chất chuẩn Atractylenolide III....................... 15 rig 3.1.2. Xây dựng điều kiện sắc ký trên mẫu Bạch truật bằng HPLC-DAD ..................... 15 Co py 3.1.3. Xác định điều kiện tối ưu hóa xử lý mẫu.............................................................. 17 3.1.4. Điều kiện chạy sắc ký HPLC ................................................................................ 17 3.2. Thẩm định phương pháp phân tích .............................................................................. 18 3.2.1. Tính đặc hiệu của phương pháp ............................................................................ 18 VN U 3.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ........................................................... 19 3.2.3. Độ tuyến tính ........................................................................................................ 19 3.2.4. Độ thích hợp của hệ thống .................................................................................... 21 ac y, 3.2.5. Độ lặp lại ............................................................................................................... 21 3.2.6. Độ đúng................................................................................................................. 22 dP ha rm 3.3. Ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng dược chất trong củ Bạch truật .............. 23 CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN ................................................................................................ 25 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .............................................................................................. 26 Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an TÀI LIỆU THAM KHẢO MỞ ĐẦU VN U Bạch truật là vị thuốc từ loài Atractylodes macrocephala Koidz (Họ Compossitae), có vị trí quan trọng trong các bài cổ phương hoặc đơn độc tại Đông Á trong hơn một ngàn năm nay để điều trị một số chứng bệnh như đau dạ dày, bụng ac y, trướng đầy, ung thư, chứng loãng xương và béo phì. Khoảng hơn bảy mươi hợp chất được xác định cấu trúc hóa học trong đó đa phần thuộc về nhóm dP ha rm sesquiterpenoid, phenolic acid và polyacetylene nhưng mối liên hệ với tác dụng trên lâm sàng là chưa rõ ràng. Cả chất tinh khiết lẫn cao dịch chiết đều thể hiện tác dụng dược lý mạnh như cải thiện hệ tiêu hóa thông qua thế bào IEC-6, kháng một số dòng tế bào ung thư gồm HepG2, LOVO, CEM, và MKN-45, kích thích miễn dịch, kháng viêm, chống oxy hóa, và cải thiện khả nhớ của chuột. Với những lợi ích trên an lâm sàng và hiệu quả điều trị đã được chứng minh, cây Bạch truật bắt đầu di thực về ine Việt Nam từ những năm 1970 và giờ được trồng phổ biên tại Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Hà Nội và Lâm Đồng. Hiện tại, các nghiên cứu công bố về hàm lượng dược ed ic chất có trong Bạch truật di thực vẫn còn hạn chế. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu định lượng Atractylenolide III trong thân rễ bạch truật M (Atractylodes macrophala Koidz) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao bắt cặp - of detector DAD” với hai mục tiêu dưới đây: Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III trong thân rễ cây - ho ol Bạch truật bằng phương pháp HPLC-DAD. Ứng dụng phương pháp để định lượng hàm lượng Atractylenolide III trong Sc mẫu Bạch truật Việt Nam và Trung Quốc. @ Lựa chọn chất nghiên cứu là Atractylenolide III giữa các hoạt chất chính thể hiện tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa, chống loãng xương, cải thiện trí nhớ, và kháng ht viêm trên các mô hình dược lý được giải thích như sau. Hàm lượng Atractylenolide rig III thấp hơn so với atractylenolide I và II có thể gây khó khăn quá trình định lượng py nhưng điều này phản ảnh một thực tế tác dụng của cao dịch chiết Bạch truật lại tốt hơn đơn chất riêng biệt. Kiểm soát chất nhỏ hơn sẽ có lợi ích hơn trong trường hợp Co này. 1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN VN U 1.1. Giới thiệu chung về cây bạch truật 1.1.1. Tên khoa học. ac y, Bạch truật có tên khoa học là Atractylodes macrocephala Koidz thuộc họ Cúc (Compossitae) [1]. dP ha rm 1.1.2. Mô tả thực vật, bộ phận dùng Đặc điểm: Cây thảo, sống lâu năm, có thân rễ to, mọc dưới đất. Thân thẳng, cao 0.3-0.8m, đơn độc hoặc phân nhánh ở bộ phận trên, phần dưới thân hóa gỗ. Lá mọc cách, dài. Lá ở phần dưới của thân có cuống dài, phần trên có cuống ngắn, gốc lá rộng, bọc lấy thân. Phiến lá xẻ sâu thành 3 thùy, thùy giữa rất lớn, hình trứng tròn, an hai đầu nhọn, hai thùy bên nhỏ hơn, hình trứng mũi mác, phần gốc không đối xứng. ine Các lá ở gần ngọn thân có phiến nguyên, hình thuôn hoặc hình trứng mũi mác, mép có răng cưa. Đầu lớn, phần dưới có một lá bắc hình lá xẻ sâu, hình lông chim. Bao ed ic hình chuông, có lá bắc mỏng xếp thành 7 hàng. Lá bắc dưới nhỏ hình trứng tam giác, to dần ở phía trên. Hoa nhiều, tràng hình ống, phần dưới màu trắng, phần trên M màu đỏ tím, xẻ làm 5 thùy hình mũi mác, xoắn ra ngoài. Năm nhị hàn liền nhau (có of nhị bị thoái hóa), chỉ nhị hình sợi dẹp. Bầu thon mặt ngoài có lông nhung, màu nâu nhạt, đoạn trên có lông hình lông chim. Vòi hình chỉ màu tím nhạt đầu nhị xẻ thành ho ol 2 thùy nông hình đầu, mặt ngoài có lông ngắn. Quả bế, thuôn, dẹp, màu xám [2]. ngà [2,10]. Sc Bộ phận dùng làm thuốc: Dùng thân rễ cứng chắc, có dầu thơm nhẹ, ruột màu trắng @ 1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến Phân bố: Bạch truật trồng chủ yếu ở Trung Quốc. Đến những năm 1970, Bạch truật ht đã bắt đầu di thực và hiện nay được trồng tại Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Hà Nội và rig Lâm Đồng [2,10]. py Thu hái và sơ chế: Cây trồng bạch truật thu hái từ cuối tháng 10 đến đầu tháng 11 Co (thường từ 8-22/11). Lúc thu hoạch, chọn ngày nắng ráo, đất khô, nhổ từng cây nhẹ nhàng. Sau khi nhổ, lấy dao cất bỏ thân cây đem củ về chế biến [1,10]. 2 Chế biến: Bạch truật đã loại bỏ tạp chất, rửa sạch, ủ mềm, thái lát dày, làm khô. Sau - VN U khi sơ chế có thể tiến hành chế biến 2 loại Bạch truật sau: Thổ Bạch truật: Lấy bạch truật phiến, dùng bột mịn phục long cán sao đến khi mặt ngoài có màu đất, rây bỏ đất, cứ 100 kg bạch truật phiến dùng 20 kg - ac y, bột mịn phục long cán [1]. Bạch truật sao: Lấy cám mật chích, cho vào trong nồi nóng, khi khói bốc lên dP ha rm thì cho bạch truật phiến vào sao cho đến khi có màu vàng sém, có mùi thơm cháy, lấy ra rây bỏ cám mật chích, cứ 100 kg bạch truật phiến dùng 40 kg cám mật chích. Có thể sử dụng cám gạo thay cám mật chích [1]. 1.1.4. Thành phần hóa học an Thành phần hóa học trong cây bạch truật đã được xác định cấu trúc gồm 67 hoạt chất chính thuộc chia vào các nhóm sau: Sesquiterpenoids, triterpenoids, ine polyacetylenes, coumarins, phenylpropanoids, flavonoids, và flavonoid glycosides. Co py rig ht @ Sc ho ol of M hơn trong cây bạch truật [7]. ed ic Ngoài ra, hai nhóm steroid và benzoquinones gồm có 4 hoạt chất chiếm tỉ lệ thấp 3 VN U ac y, dP ha rm an ine ed ic M of ho ol Sc @ ht rig py Co Hình 1: Công thức hóa học một số chất chính trong cây Bạch truật. 4 1.1.5. Tác dụng dược lý VN U Cải thiện chức đường tiêu hóa: Trong thử nghiệm lâm sàng trên chuột sử dụng cao bạch truật với hàm lượng 0,035 g/kg và 0,105 g/kg cho kết quả cải thiện trọng lượng của chuột, và thúc đẩy khả năng tiêu hóa của vi khuẩn đường ruột [2,7]. ac y, Hoạt động chống khối u: Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trên người mắc ung thư, những người sử dụng cao ethanol bạch truật (1 – 4 mg/ml) trong 24 giờ cho thấy dP ha rm giảm đáng kể các tế bào ưng thư [2,7]. Tác dụng điều hòa miễn dịch: Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện ra rằng khi sử dụng bạch truật cho tác dụng điều hòa miễn dịch. Bột bạch truật dùng đường uống với liều rất cao (1g/kg) sử dụng cho heo con trong 30 ngày cho kết quả tăng sinh tế an bào lympho ngoại biên, chỉ số tăng trọng, nồng độ immunoglobulin G (IgG) trong huyết thanh, nồng độ IL-1 và IL-2, và biểu hiện mRNA PR-39. Những chỉ số này ine cho thấy rằng bạch truật có thể cải thiện sự trao đổi chất và chức năng miễn dịch ed ic của heo con [2,7]. Tác dụng chống viêm: Thử nghiệm trên những con chuột bị viêm đại tràng cấp tính M do dextran sulfate gây ra, nghiên cứu sử dụng cao chiết bạch truật (100mg/kg) đã làm giảm biểu hiện của những yếu tố viêm như COX-2, iNOS, IL-1β, TNF-α, NF- of B. Ngoài ra, những nghiên cứu sử dụng polyacetylenes (25 – 300 mg/kg) trên chuột ho ol có hiện tượng viêm gây ra bởi acetic acid hoặc dimethyl benzene thì trong 3 − 5 ngày đã được tìm thấy để ức chế đáng kể phản ứng viêm [26,7]. Sc Điều trị bệnh Alzheimer và bảo vệ hệ thần kinh: Trong một mô hình thử nghiệm có sử dụng cao chiết xuất bạch truật với ethanol (0,5 – 2 mg/kg) được xây dựng để @ tăng cường trí nhớ, giảm tần suất sai lệch và giảm cholinesterase (AChE). Tác dụng ht của cao chiết bạch truật với ethanol có thể cải thiện tình trạng suy giảm trên chuột rig già. Ngoài ra, phương pháp điều trị 3 ngày với atractylenolide III (30 µg/ml) được xây dựng để cải thiện hoạt động của tế bào và ức chế apoptosis. Những tác dụng py này cho thấy rằng atractylenolide III có hoạt tính bảo vệ thần kinh quan trọng [4,7]. Co Tác dụng chống lão hóa và chống oxy hóa: Cao bạch truật được chứng minh là có hoạt động chống lão hóa và chống oxy hóa trên mô hình chuột. Trên những con 5 chuột sử dụng D-galactose, cao chiết bạch truật ngâm với nước được sử dụng làm VN U tăng hoạt động NO synthase (NOs), tăng sản xuất NO, và giảm hàm lượng lipid peroxide (LPO) trong mô não. Các điều trị bằng polysacarides (100−200 mg/kg) cho chuột đã sử dụng D-galactose trong 6 tuần thấy rằng nồng độ MDA và ac y, lipofuscin (Lipo) cũng như hoạt động của monoamtin oxydase (MAO) giảm. Hơn nữa, điều trị này làm tăng glutathione peroxidase (GSH-Px), CAT, SOD và toàn bộ dP ha rm năng lượng hoạt động chống oxy hóa (T-AOC). Những tác dụng này cho thấy rằng polysacarides làm tăng hoạt động chống oxy hóa ở chuột già bằng cách ức chế tạo ra peroxit lipid và tăng hoạt tính enzyme chống oxy hóa [7]. Điều hòa nội tiết và tác dụng giảm co: Nghiên cứu sử dụng cao methanol bạch truật an với liều rất cao 0,5−0,8 g/kg cho chuột gây rối loạn nội tiết bởi testosterone propionate trong 8 tuần cho thấy cải thiện chu kỳ động dục, mức độ hormone kích ine thích nang trứng (FSH) và giảm sự cân bằng của toàn bộ testosterone (TT), chỉ số androgen tự do (FAI), androstenedione phụ thuộc vào liều dùng. Cao chiết này cũng ed ic tăng kiểm soát biểu hiện của aquaporin-9 (AQP-9) và giảm kiểm soát biểu hiện của thụ thể FSH (FSHR), vì vậy, cao chiết xuất bạch truật với metanol có thể điều chỉnh M tuyến sinh dục sản xuất hoóc môn và làm giảm chứng tăng huyết áp [7]. of Điều trị béo phì và tăng cường chuyển hóa năng lượng: Những nghiên cứu sử dụng ho ol cao bạch truật (100-300 mg/kg) cho chuột béo phì do chế độ ăn nhiều chất béo trong 16 tuần dẫn đến giảm trọng lượng cơ thể, nồng độ lipid gan và nồng độ cholesterol toàn phần trong huyết thanh. Phương pháp sử dụng cao chiết bạch truật Sc này dẫn đến sự tăng nồng độ insulin, và không dung nạp glucose. Những hiệu ứng @ này cho thấy rằng bạch truật có thể ngăn ngừa béo phì. Hơn nữa, sử dụng cao bạch truật (0,2 − 1,0 mg/ml) đến các tế bào C2C12 trong 24h tăng đáng kể giải phóng ht glucose, sự biểu hiện của PGC1α và palmitoyltransferase 1b chuyển hóa khoáng rig chất (CPT). Hơn nữa, cao bạch truật cũng làm giảm hàm lượng axit béo tự do py (FFA). Khi kết hợp với nhau, những tác động này cho thấy bạch truật có thể kích Co thích chức năng ty thể và chuyển hóa năng lượng trong các mô cơ [2,7]. Tác dụng chống loãng xương: Nghiên cứu thử nghiệm trên các đại thực bào chuyển hóa từ tủy xương và chuột bị tác động bởi thụ thể của phối tử NF-κB (RANKL; một 6 cytokine thiết yếu thúc đẩy biệt hóa tế bào tiền hủy xương thành tế bào hủy xương), VN U việc sử dụng cao chiết xuất bạch truật với ethanol cho thấy ức chế sự phân hóa tế bào hủy xương [7]. Hoạt tính kháng khuẩn: Cao bạch truật cũng đã được chứng minh là có hoạt động ac y, kháng khuẩn. Nghiên cứu sử cao chiết bạch truật (5-40 mg/ml) với tụ cầu vàng, E.Coli, và trực khuẩn mủ xanh trong 24 giờ cho thấy để ức chế đáng kể sự phát dP ha rm triển của các vi khuẩn này [2,7]. Tác dụng lợi niệu: Trên chuột thử nghiệm với cao chiết nước của bạch truật (1 – 10 g/ml) trong 30 phút cho thấy cao chiết có tác dụng ức chế tiểu quản thận tái hấp thu nước, tăng bài tiết Natri [4,7]. an 1.2. Tổng quan về vị thuốc Bạch thuật ine Tính vị quy kinh: Khổ, cam, ôn. Vào kinh Tỳ và Vị [1]. ed ic Công năng chủ trị: Kiện tỳ, ích khí, táo thấp, lợi thủy, cố biểu, liễm hãn, an thai. M Chủ trị: Tiêu hóa kém, bụng trướng, tiêu chảy, phù thũng, tự hãn, động thai. of Cách dùng: Ngày dùng từ 6–12g, dạng thuốc sắc hoặc bột. Bạch truật sao cám, tẩm mật ong tăng tác dụng kiện tỳ, sao cháy có tác dụng chỉ huyết [1]. ho ol Kiêng kỵ: Đau bụng do âm hư nhiệt trướng, đại tiện táo, háo khát không dùng [1]. py rig ht @ Sc 1.3. Vài nét về hoạt chất Atractylenolide III Hình 2: Công thức cấu tạo của Atractylenolide III. Co Atractylenolide III có công thức phân tử là C15H20O3. 7 Danh pháp IUPAC: (4 S,8 R,9 S)-9 -hydroxy-3,8 -dimethyl-5-methylidene VN U 4,4 ,6,7,8,9-hexahydrobenzo(1)benzofuran-2-one. Tính chất: Atractylenolide III là dạng bột màu trắng hoặc tinh thể màu trắng. - Atractylenolide III tan tốt trong nước, methanol, ethanol, và một số dung môi ac y, - hữu cơ khác. Atractylenolide III cho phổ hấp thụ cực đại ở 220nm [27]. dP ha rm - Tác dụng dược lý: Atractylenolide III có tác dụng bảo vệ thần kinh, dạ dày, chống ung thư và chống viêm. Hoạt chất Atractylenolide III cũng có tác dụng kiểm soát miễn dịch bằng cách điều chỉnh chức năng của tế bào IL-6 trong tế bào mast. an 1.4. Các nghiên cứu định lượng Atractylenolide III trong cây bạch truật ine Trong một nghiên cứu của nhóm tác giả Hao Cai và các đồng nghiệp vào năm 2012 đã định lượng hai hoạt chất trong Bạch truật là Atractynolid I và Atractynolid III ed ic với bước sóng cực đại 220nm. Máy Agilent Zorbax Eclipse XDB Cột C-18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm). Tốc độ dòng 1 ml/phút , tiêm 10µl và nhiệt độ cột là 250C. M Hệ được sử dụng trong nghiên cứu này là ACN (A) và nước (B) với tỉ lệ 0-10 phút of 30-60% A; 10-20 phút 60-65% A; 20-25 phút 65-100% A; 25-37 phút 100% A. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp xử lý mẫu với Ethanol 80%, chiết siêu âm trong ho ol 30 phút , sau đó lọc để thu được dịch chiết [7,13]. Theo dược điển Hong Kong định lượng được hoạt chất Atractylenolide III trong Sc mẫu Bạch truật bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng với điều kiện bước sóng hấp @ thụ cực đại 220nm, cột silicagen liên kết ODS (5µm, 250 x 4,6mm), tốc độ dòng 1ml/phút và với hệ dung môi Methanol :Nước = 70 :30 trong 25 phút. Mẫu được xử ht lý bằng phương pháp siêu âm với 2g bột dược liệu trong 50 ml dung môi Ethanol rig 70%, siêu âm, có thể tiến hành chiết nhiều lần với thời gian kéo dài phù hợp với Co py mục đích nghiên cứu mẫu [23]. 8 CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VN U 2.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu: thân rễ khô của Bạch truật với tên khoa học Atractylodes Liêu Ninh, Trung Quốc do Viện Dược Liệu cung cấp. 2.2. Trang thiết bị, dung môi, hóa chất dP ha rm Hóa chất – thuốc thử ac y, macrophala Koidz (họ Compossitae). Mẫu có nguồn gốc từ Hà Nội, Việt Nam và Hóa chất thuốc thử được cung cấp bởi nhà sản xuất có uy tín với độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng. an Bảng 1: Hóa chất, thuốc thử dùng trong nghiên cứu. Nguyên vật liệu ine Nguồn gốc Trung Quốc ed ic Atractylenolide III Acetonitrile Độ tinh khiết 98% Merck-Đức HPLC Trung Quốc PA Trung Quốc PA ho ol Thiết bị, dụng cụ of Ethanol M Methanol Tiêu chuẩn Thiết bị máy móc được sử dụng đảm bảo chính xác và độ tin cậy theo thông tin như Sc nhà sản xuất. Tên thiết bị, dụng cụ ht STT @ Bảng 2: Trang thiết bị, máy móc sử dụng trong nghiên cứu. Shimadzu LC – 20AD Nhật Bản 2. Shimadzu SPD – M20A Nhật Bản 3. Shimadzu SIL – 20A Nhật Bản rig 1. py Co Xuất xứ 9 4. Shimadzu CTO – 10AS Nhật Bản 5. Cột supelco 6. Máy siêu âm MRC VN U Mỹ ac y, Việt Nam 2.3. Phương pháp nghiên cứu dP ha rm 2.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký Chúng tôi tiến hành sắc ký với cột Supleco C18(5µm, 250 x 4,6mm), tốc độ dòng 1ml/phút và thể tích tiêm mẫu 20µl để khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại và hệ dung môi pha động. Khảo sát bước sóng: Tiến hành sắc ký với chất chuẩn Atractylenolide III an - bằng phương HPLC-DAD để tìm ra bước sóng hấp thụ cực đại của chất. Khảo sát hệ dung môi pha động: Phương pháp khảo sát với các hệ dung môi ine - ed ic ACN:Nước và Methanol:Nước. 2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu Dung dịch gốc: Cân chính xác khoảng 1mg chất chuẩn Atractylennolide III of - M Chuẩn bị mẫu chuẩn: trong 1ml Methanol trong bình định mức 1ml. Tiến hành pha dãy chuẩn trong bình định mức 1ml với các nồng độ 104; 52; ho ol - 32,5; 26; 19,5; 13; 6,5; 3,25; 1,675; 0,65 và 0,065µg/ml từ dung dịch mẹ. Sc Xử lý mẫu: Cân khoảng 0.2g bột dược liệu chiết với 5ml dung môi Nước, Methanol, @ và Ethanol 30; 50; 70; 90; 96% bằng phương pháp siêu âm. Sau đó định mức với bình định mức 5ml bằng dung môi. Lọc dung dịch qua màng 0,45µl trước khi tiến rig ht hành phân tích định lượng. 2.3.3. Thẩm định quy trình phân tích py Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương pháp” Co (Validation of analytical procedures: text and methodology) của ICH (International Conference on Harmonization) ban hành vào tháng 11 năm 2005, các yếu tố của 10 một quy trình phân tích định lượng cần thẩm định gồm: độ đúng, độ chính xác, tính VN U đặc hiệu, tính tuyến tính giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng [5,6,22,25]. Tính đặc hiệu Khái niệm: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác ac y, như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất.... Trong phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi dP ha rm bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác. Phương pháp xác định: Sử dụng phương pháp thêm chuẩn sau chuẩn bị mẫu, cách này thường áp dụng đối với các phương pháp sắc ký. Sau khi chuẩn bị mẫu thử và phân tích mẫu thử trên thiết bị sắc ký thu được các pic sắc ký, ta thêm chuẩn vào an mẫu đã chiết xuất và phân tích mẫu này. So sánh sắc ký đồ của hai mẫu để đánh giá ine tính đặc hiệu. Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, pic mẫu thử phải trùng với vị trí của pic chất chuẩn và sắc ed ic ký đồ của chất nền không có pic nào. M Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Khái niệm: Giới hạn phát hiện (LOD) của một quy trình phân tích là lượng thấp of nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần phải ho ol xác định chính xác hàm lượng. Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất Sc phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ chính xác phù hợp. Phương pháp xác định: Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu S/N. LOD là nồng độ mà @ tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 – 3 và LOQ lại nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị ht gần bằng 10. rig Độ tuyến tính py Khái niệm: Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại Co lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x). 11 Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax+b với hệ số tương VN U quan tuyến tính R2. Phương pháp xác định: Khảo sát ở ít nhất 5 hoặc 6 mức nồng độ khác nhau. - Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của phương pháp. Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu. dP ha rm - ac y, - Yêu cầu: Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,995 ≤ R2 ≤ 1. Độ thích hợp hệ thống an Khái niệm: Đánh giá độ thích hợp của hệ thống để đảm bảo hệ thống phù hợp để phân tích. Đánh giá sự phù hợp của hệ thống là các phép thử để chứng minh rằng hệ ine thống hoạt động đúng theo mục đích sử dụng. ed ic Phương pháp xác định: Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn nhiều lần lặp lại vào hệ thống sắc ký và xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Số lần bơm tối thiểu 5 lần M phải cho RSD nhỏ hơn 2% Nếu RSD lớn hơn 2% cần sử dụng 6 điểm. of Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời gian lưu ≤ 2%. Độ lặp lại ho ol Khái niệm: Độ lặp lại là sự ổn định trong phương pháp phân tích định lượng mẫu trong quá trình thực hiện. Sc Phương pháp xác định: Trong phân tích hàng ngày, cần thực hiện song song tối @ thiểu 2 lần nhằm tránh được các sai số ngẫu nhiên gặp phải. Đánh giá mức độ chênh lệch giữa hai lần làm với giá trị trung bình, sự chênh lệch này phải thỏa mãn theo ht yêu cầu của từng phương pháp. rig Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 2%. Co py Độ đúng 12
- Xem thêm -