Tài liệu Nghiên cứu điều kiện tách và tinh sạch peptide có hoạt tính chống oxy hóa từ sản phẩm đậu nành thủy phân

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -------------------------- NGÔ MINH NGỌC NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TÁCH VÀ TINH SẠCH PEPTIDE CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TỪ SẢN PHẨM ĐẬU NÀNH THỦY PHÂN CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Quản Lê Hà Hà Nội – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề được sử dụng. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho luận văn này đã được cảm ơn và thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc. Học viên Ngô Minh Ngọc LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi đã nhận được sự chỉ bảo, hướng dẫn và động viên của Ban lãnh đạo, các thầy cô giáo, các cán bộ phòng thí nghiệm trong Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo, các thầy cô giáo đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi làm việc trong thời gian vừa qua. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới Phó giáo sư – Tiến sĩ Quản Lê Hà – người đã trực tiếp hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên và tạo điều kiện cho tôi trong thời gian thực hiện luận văn. Hà Nội ngày 27 tháng 09 năm 2017 Học viên Ngô Minh Ngọc MỤC LỤC MỤC LỤC ..................................................................................................................1 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT..........................................3 DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................4 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ............................................................5 MỞ ĐẦU ....................................................................................................................6 CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN ...................................................................................8 1.1. Các chất chống oxy hóa ....................................................................................8 1.1.1. Khái niệm hoạt tính chống oxy hóa ............................................................8 1.1.2. Các chất có hoạt tính chống oxy hóa trong tự nhiên .................................9 1.1.3. Các peptide có hoạt tính chống oxy hóa ..................................................10 1.2. Đậu nành và các sản phẩm đậu nành thủy phân .............................................12 1.2.1. Thành phần của đậu nành và bã đậu nành ..............................................12 1.2.2. Quá trình thủy phân .................................................................................14 1.3. Điều kiện tách và tinh sạch các peptide có hoạt tính chống oxy hóa .............16 1.3.1. Các nghiên cứu về điều kiện tách các peptide có hoạt tính chống oxy hóa ..16 1.3.2. Các nghiên cứu về tinh sạch peptide có hoạt tính chống oxy hóa ...........18 CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................24 2.1. Vật liệu ............................................................................................................24 2.1.1. Nguyên liệu ...............................................................................................24 2.1.2. Thiết bị ......................................................................................................25 2.1.3. Hóa chất ...................................................................................................21 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................21 2.2.1. Phương pháp thủy phân bã đậu ...............................................................21 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu điều kiện tách chiết các peptide có hoạt tính chống oxy hóa .....................................................................................................22 2.2.3. Phương pháp tách các phân đoạn peptide có hoạt tính chống oxy hóa ..23 2.2.4. Các phương pháp phân tích .....................................................................25 1 CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................30 3.1. Lựa chọn mẫu .................................................................................................30 3.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tách chiết peptide ...................................31 3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian chiết tới hoạt tính chống oxy hóa ....................31 3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tới hoạt tính chống oxy hóa ......................33 3.2.3. Ảnh hưởng của chế độ khuấy tới hoạt tính chống oxy hóa ......................35 3.2.4. So sánh hiệu quả thu hồi peptide có hoạt tính chống oxy hóa .................36 3.3. Kết quả tinh sạch peptide có hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết peptide từ bã đậu thủy phân bằng neutrase.........................................................................38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................42 I. Kết luận ..............................................................................................................42 II. Kiến nghị ...........................................................................................................42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................43 PHỤ LỤC 2 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Da: Dalton kDa: kilo Dalton ROS: Reactive oxygen species MWCO: microweight cut-off TLTK: Tài liệu tham khảo BHA: butylated hydroxyanisole BHT: butylated hydroxytoluen OD: Optical Density (Mật độ quang) MeOH: methanol MW: khối lượng phân tử DPPH: 2,2 diphenyl -1-picrylhydrazyl 3 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của đậu nành tính theo chất khô ........................12 Bảng 1.2. Thành phần của bã đậu tính theo chất khô ...............................................13 Bảng 1.3. Nguồn gốc, phương pháp tinh sạch, kích thước, thành phần axit amin và hoạt tính chống oxy hóa của một số phân đoạn peptide có hoạt tính chống oxy hóa .......................................................................................................20 Bảng 2.1. Mật độ quang OD tại các nồng độ L-Glutathion ......................................25 Bảng 2.2. Mật độ quang OD và hoạt tính chống oxy hóa của BHA .........................29 Bảng 3.1 Sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết ban đầu sau khi tinh sạch ............................................................................................................40 4 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1. Cấu tạo của 5 axit amin thường có trong các peptide có hoạt tính chống oxy hóa. ....................................................................................................16 Hình 2.1. Các bước tinh sạch peptide có hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp lọc màng...................................................................................................24 Hình 2.2. Đường chuẩn L-Glutathion .......................................................................26 Hình 2.3. Cấu tạo phân tử DPPH ..............................................................................26 Hình 2.4. Cơ chế phản ứng giữa DPPH với chất cho H+ ..........................................27 Hình 3.1. Hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu bã đậu thủy phân bằng các tác nhân khác nhau (%DPPH) ................................................................................30 Hình 3.2.1 Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết thu được tại các mốc thời gian khác nhau (%DPPH) ................................................................................31 Hình 3.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết thu được ở các điề u kiê ̣n nhiệt độ khác nhau(%DPPH) ............................................................................33 Hình 3.3. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết thu được phu ̣ thuô ̣c vào điề u kiê ̣n khuấy trô ̣n (%DPPH) ...............................................................................35 Hình 3.4. Hoạt tính chống oxy hóa của dich ̣ chiế t phu ̣ thuô ̣c vào điều kiện tách chiết khác nhau(%DPPH) .................................................................................36 Hình 3.5. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết tại điều kiện tách chiết thích hợp và điều kiện tách chiết bình thường (%DPPH) .......................................37 Hình 3.6. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết peptide có kích thước khác nhau(%DPPH) .........................................................................................38 Hình 3.7 Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết peptide có kích thước >10 kDa, 3kDa, 1 kDa(%DPPH) .............................................................................39 Hình 3.8. Hình ảnh mẫu phản ứng với DPPH của một số phân đoạn peptide ..........41 5 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, vấn đề an toàn sức khỏe và an toàn thực phẩm đang được quan tâm nhiều tại Việt Nam, trong đó được quan tâm nhiều là các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học giúp con người cải thiện sức khỏe khi được sử dụng như thực phẩm chức năng hay thay thế các hợp chất tổng hợp khác không có lợi cho sức khỏe trong bảo quản và chế biến thực phẩm. Trong số các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học, chất chống oxy hóa có vai trò quan trọng vì vừa có thể bảo vệ sức khỏe con người vừa bảo quản thực phẩm. Trong khi có những báo cáo về sự nguy hại khi sử dụng các chất chống oxy hóa tổng hợp thì việc sử dụng các chất chống oxy hóa tự nhiên là giải pháp hiệu quả và an toàn. Các peptide có hoạt tính chống oxy hóa chính là một trong số các chất chống oxy hóa tự nhiên được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu. Có nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng tách sản phẩm peptide có hoạt tính sinh học từ protein đậu nành hay đậu nành thủy phân là hoàn toàn khả thi. Bã đậu là phụ phẩm được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi trực tiếp, sẵn có và rẻ tiền. Tuy vậy bã đậu có hàm lượng các axit amin như cystein, methionine, valine, tyrosine, threonine, histidine và glycine không kém trong đậu nành. Đây là những axit amin có trong cấu trúc của các peptide có hoạt tính chống oxy hóa. Chính vì vậy việc nghiên cứu tách chiết và tinh sạch các peptide có hoạt tính sinh học từ dịch bã đậu thủy phân là rất có ý nghĩa và giá trị ứng dụng thực tiễn cao. Đây cũng là lý do chính để chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu điều kiện tách và tinh sạch peptide có hoạt tính chống oxy hóa từ sản phẩm đậu nành thủy phân”. Peptide có hoạt tính chống oxy hóa tách chiết từ sản phẩm đậu nành thủy phân đã được một số nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu từ những năm 90 của thế kỷ 20. Tuy nhiên vấn đề này còn khá mới mẻ ở nước ta. Vậy nên mục đích nghiên cứu của đề tài là: - Nghiên cứu đưa ra điều kiện tách chiết tối thích đối với đối tượng là dịch sản phẩm đậu nành thủy phân sao cho hoạt tính chống oxy hóa trong dịch chiết thu 6 được là cao nhất; từ đó tiếp tục nghiên cứu tinh sạch dịch chiết sao cho sản phẩm thu về là thuần khiết nhất và có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất. Để thực hiện được mục đích trên, các nội dung chính cần thực hiện trong đề tài gồm: - Lựa chọn được mẫu dịch thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất để sử dụng cho việc nghiên cứu các điều kiện tách và tinh sạch peptide; - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tách chiết peptide như: thời gian chiết, nhiệt độ , chế độ khuấy; - Nghiên cứu các phương pháp tinh sạch peptide và áp dụng để tinh sạch peptide, xác định được phân đoạn nào có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất. 7 CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1. Các chất chống oxy hóa 1.1.1. Khái niệm hoạt tính chống oxy hóa Trong quá trình trao đổi chất của cơ thể, các gốc oxy hoạt động (ROS) hoặc các gốc tự do được sản xuất tự nhiên bởi các phản ứng oxy hóa thông qua hô hấp. Dưới các yếu tố bất lợi như ô nhiễm môi trường và thực phẩm, các tia cực tím hay tia phóng xạ, các chất độc hại, stress đã khiến lượng ROS tăng lên quá mức, ngoài tầm kiểm soát của cơ thể. Các ROS này do có năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA dẫn đến gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể. Chúng thường gây ra nhiều bệnh mạn tính không lây như bệnh tiểu đường, xơ vữa động mạch, viêm khớp và ung thư [5, 26]. Ngoài ra, quá trình peroxy hóa chất béo gây ra bởi ROS là một trong những nguyên nhân chính gây giảm chất lượng lipid trong thức ăn hoặc các loại mỹ phẩm [36]. Chất chống oxy hoá được định nghĩa là một chất có thể làm giảm đáng kể hoặc làm chậm các tác động bất lợi của các loại phản ứng gây ra bởi các gốc tự do hay các gốc oxy hoạt động đối với các hoạt động sinh học bình thường của con người, và trong các hệ thống sinh học thực phẩm. [19]. Các chất chống oxy hoá là các hợp chất hoặc hệ thống làm chậm sự oxy hóa bằng cách ức chế sự hình thành các gốc tự do hoặc bằng cách làm gián đoạn hoạt tính của gốc tự do bằng một (nhiều) cơ chế: (1) loại bỏ những thứ khởi động phản ứng peroxit, (2) giữ các ion kim loại (4) phá vỡ phản ứng oxy hóa tự động theo dây chuyền hoặc (5) làm giảm nồng độ oxy trong nước. Có hai loại chất chống oxy hoá: chất chống oxy hoá chính có tác dụng dừng các phản ứng dây chuyền tạo ra các gốc tự do (khử các gốc tự do); và các chất chống oxy hóa thứ cấp có tác dụng loại bỏ các phản ứng oxy hóa bằng cách ngăn sự hình thành các chất oxy hóa hoạt động (các chất chống oxy hoá bảo vệ) [19]. 8 Hoạt tính chống oxy hóa được hiểu là khả năng chống oxy hoá của chất đó, được sử dụng để đánh giá hiệu quả của chất chống oxy hoá tự nhiên thông qua hai cơ chế hóa học chính. Quét sạch các gốc tự do là vai trò chính của chất chống oxy hoá, điều này có thể thực hiện được bằng cách ngăn chặn sự di chuyển electron (electron migration - EM) và sự chuyển giao nguyên tử hydro (hydrogen atom transfer - HAT) [39, 48]. Hoạt tính chống oxy hóa chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như môi trường oxy hóa và trạng thái vật lý của chất có khả năng oxy hóa[19]. Các chất chống oxy hoá hiệu quả nhất là những chất làm gián đoạn phản ứng chuỗi gốc tự do. Thường chứa vòng thơm hoặc vòng phenol. Những chất chống oxy hoá này hiến H cho các gốc tự do. Có nhiều phương pháp để xác định hoạt tính chống oxy hóa. Trong tài liệu [39, 48], có bốn phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa thường được sử dụng cho các phản ứng dựa trên HAT: Phương pháp Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC); Phương pháp Total Radical Trapping Antioxidant Parameter (TRAP); Phương pháp Crocin Bleaching Assay (CBA) và phương pháp Lipid Peroxidation Assay (LPA). Đối với phản ứng oxy hóa dựa trên EM, một số phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá thường được sử dụng như Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC); 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) và Coper II Reduction Capacity (CRC). 1.1.2. Các chất có hoạt tính chống oxy hóa trong tự nhiên Trong tự nhiên, các chất chống oxy hoá này bao gồm flavonoid, axit phenolic, carotenoid và tocopherol có thể ức chế quá trình oxy hóa, loại bỏ các gốc tự do, và hoạt động như chất khử [20, 34]. Các chất phenolic chống oxy hoá chủ yếu có thể được chia thành 4 nhóm chung: axit phenolic (gallic, protochatechuic, caffeic, rosmarinic acids), phenolic diterpenes (carnosol và carnosic acid), flavonoid (quercetin và catechin; ), và dầu dễ bay hơi (eugenol, carvacrol, thymol, và men-thol)[42] . Các axit phenol thường hoạt động như các chất chống oxy hoá bằng cách bẫy các gốc tự do; Flavonoids có thể quét các gốc tự do và loại bỏ các kim loại khá tốt[17]. 9 Những hợp chất này nằm trong một số loại quả (táo và cherry), họ dâu tây (dâu tây, quả mâm xôi, dâu tây đen), trong lá (chè), các loại hạt (nho, lúa, đậu nành và cacao) và vỏ của nhiều cây[12, 7, 3]. Một số gia vị và thảo mộc có chứa các hợp chất này. Chất chiết xuất của nhiều thành phần thuộc họ Lamiaceae như húng quế, hương thảo, đinh hương có hàm lượng phenol cao [9]. Trong số một số loại thảo mộc và gia vị (hương thảo, cây húng quế, kinh giới, quế, rau mùi và bạc hà) có tỉ lệ cao nhất các hợp chất phenolic đơn giản (96%) [29]. Các loại gia vị như gừng, nghệ, tiêu đen, tỏi cũng chứa nhiều hợp chất chống oxy hóa. 1.1.3. Các peptide có hoạt tính chống oxy hóa Peptide là sản phẩm của sự liên kết axit amin hoặc thủy phân protein. Các peptide có kích thước và trọng lượng phân tử nhỏ hơn nguồn protein tự nhiên của chúng. Các peptide thu được từ quá trình thủy phân protein khá đa dạng. Chúng có độ dài, thành phần axit amin, và chức năng khác nhau. Các peptide có hoạt tính sinh học được định nghĩa là các đoạn protein cụ thể có ảnh hưởng tích cực đến các chức năng hoặc các điều kiện của cơ thể và có thể ảnh hưởng đến sức khoẻ. Hoạt động của peptide dựa trên thành phần và trình tự axit amin vốn có của chúng. Kích cỡ của các trình tự peptide hoạt động có thể thay đổi từ 2 đến 20 axit amin, và nhiều peptide có thể có hoạt tính sinh học. Những protein và các peptide có hoạt tính sinh học này được sinh ra trong cơ thể, trong ống nghiệm, và trong quá trình chế biến thực phẩm. Các peptide hoạt tính đã được tìm thấy trong quá trình thuỷ phân protein bằng enzyme và các sản phẩm sữa lên men, nhưng chúng cũng có thể được tạo thành trong quá trình tiêu hóa các protein của dạ dày-ruột [25]. Các peptide có hoạt tính sinh học bao gồm các peptide có hoạt tính chống oxy hóa, các peptide chống viêm, các peptide hạ huyết áp, các peptide chống đột quỵ… 10 Đã có những nghiên cứu về các peptide có hoạt tính chống oxy hóa có trong sản phẩm thủy phân đậu nành [15] hay các peptide có hoạt tính chống oxy hóa có trong sản phẩm thủy phân nhau thai cừu. Một số nghiên cứu đã được thực hiện để xác định các chất chống oxy hoá peptide tiềm năng trong gelatin da cá. Ngoài ra, một số dịch thủy phân protein từ nguồn động vật và thực vật cũng đã được tìm thấy có hoạt động chống oxy hoá [46] . Các peptide có hoạt tính chống oxy hoá đã được nghiên cứu rộng rãi, ứng dụng trong điều trị các bệnh thoái hóa mãn tính không truyền nhiễm và trong bảo quản thực phẩm. Mối quan hệ cấu trúc-hoạt động của các peptide thu được từ các protein khác nhau đã được nghiên cứu. Các đặc tính khác nhau của cấu trúc hóa học như trọng lượng phân tử nhỏ, thành phần các axit amin (His, Trp, Phe, Pro, Gly, lys, Ile và Val) với tính kỵ nước, vòng indole / imidazole / pyrrolidin …tất cả đều có ảnh hưởng đến hoạt động chống oxy hoá của peptide. Trong số đó, thành phần và chuỗi axit amin có tác động nhiều nhất đến hoạt động chống oxy hoá. Các peptide có hoạt tính chống oxy hoá có kích thước dao động từ 400 đến 650 Da, chiếm 70% trong số 42 peptide có hoạt tính chống oxy hóa đã được xác định. Các peptide được chiết tách từ phần bã trong sản xuất dầu oliu bằng alcalase có trọng lượng nhỏ có khả năng chống oxy hoá cao hơn đáng kể so với các phân đoạn có trọng lượng phân tử cao hơn [14]. Hơn nữa, trong các phân đoạn peptide của dịch thủy phân đậu pinto thu được bằng cách sử dụng siêu lọc màng với MWCO lần lượt là 100, 50, 30, 10 và 3 kDa, phân đoạn peptit <3 kDa có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất [30]. Các peptides dưới 1000 Da thể hiện hoạt tính chống oxy hoá dài tốt nhất [10]. Ngoài ra, phân đoạn peptide thu được từ dịch thủy phân protein lòng trắng trứng bằng enzyme alcalase với MW <1 kDa có khả năng chống oxy hóa mạnh nhất so với các phân đoạn peptide khác [22]. 11 1.2. Đậu nành và các sản phẩm đậu nành thủy phân 1.2.1. Thành phần của đậu nành và bã đậu nành Đậu nành lần đầu tiên được phát hiện ở Đông Nam Á trước năm 1100 trước Công nguyên. Kể từ đó, đậu nành đã được dần dần lan rộng trên toàn cầu, chủ yếu là thông qua việc thuộc địa của Anh. Các sản phẩm từ đậu nành, bao gồm nước tương, đã trở nên phổ biến ở Châu Âu và Mỹ. Vào đầu những năm 1900, người ta nhận ra rằng đậu nành là một nguồn protein và dầu có giá trị, và chất lượng đất đai đã ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng dinh dưỡng của đậu nành [32]. Trồng đậu tương đã được quảng bá trên khắp thế giới do giá trị dinh dưỡng của nó. Đậu nành khô có hàm lượng protein cao hơn (~ 40%) so với ngũ cốc (8-15%) và đậu (2030%). Từ năm 2000 đến năm 2005, 225,6 triệu tấn đậu nành đã được sản xuất trên toàn thế giới, trong đó Hoa Kỳ (41,3%), Brazil (23,7%) và Argentina (16,1%) đóng góp trên 80% sản lượng toàn cầu [13]. Canada chiếm 1,3% sản lượng đậu tương toàn cầu. Thành phần dinh dưỡng của đậu nành được cung cấp trong Bảng 1.1 [13] Thông thường, đậu nành có trọng lượng 16 - 19 g / 100 hạt [13]. Mặc dù đậu nành có hàm lượng protein cao (~ 40%), chúng chủ yếu được trồng để sản xuất dầu (~ 20% trên cơ sở khô). Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của đậu nành tính theo chất khô Thành phần dinh dưỡng Tỷ lệ (% khối lượng) Ví dụ Chất béo 18 – 21 Protein 36 – 40 Glycinin, β-conglycinin Đường hòa tan 10 – 11 Gluco, saccaro Đường không hòa tan 21 – 25 Xenlulo, pectin Khoáng chất 5 Sắt, phốt pho, ma giê 12 Protein đậu nành được xem là nguồn protein chất lượng cao, vì chúng chứa tất cả 9 axit amin thiết yếu với số lượng đủ để con người và động vật cần dinh dưỡng hợp lý [43]. Nhiều lợi ích sức khoẻ quan trọng từ việc tiêu thụ protein đậu nành, đặc biệt là phòng ngừa ung thư, và điều trị bệnh béo phì và đái tháo đường đã được báo cáo [28]. Việc sử dụng protein đậu nành trong thực phẩm có tính hấp dẫn về mặt kinh tế, vì đậu nành không đắt. Đặc điểm của protein đậu nành Protein của đậu nành có ba chức năng gồm các protein tham gia vào quá trình trao đổi chất, protein cấu trúc, và các protein dự trữ. Đa số protein đậu nành là các protein dự trữ, như glycinin (~ 40%), β - conglycinin (~ 28%), và γ- conglycinin (~ 3%). Các hỗn hợp protein đậu nành, khi được ly tâm, được tách ra thành nhiều phân đoạn protein bao gồm 2S (α - conglycinin), 7S (β - và γ - conglycinin), 11S (glycinin), 9S và 15S globulins [16]. Bã đậu (Okara) là một sản phẩm phụ của quá trình chế biến đậu phụ, sữa đậu nành hoặc sản xuất protein đậu nành. Bã đậu chỉ được coi là chất thải công nghiệp với giá trị thấp trên thị trường vì tuổi thọ ngắn. Tuy nhiên trong thực tế, bã đậu thường có chứa protein lên đến 25,4-28,4% (tính theo chất khô) với chất lượng dinh dưỡng cao, có thể thấy nó là một nguồn protein thực vật tiềm năng cho con người với chi phí thấp [33]. Thành phần của bã đậu tự nhiên đã được xác định và thể hiện ở Bảng 1.2[38]. Bảng 1.2. Thành phần của bã đậu tính theo chất khô Thành phần dinh dưỡng Tỷ lệ (% khối lượng) Chất xơ 12,2 Protein 25,52 Chất béo 12 Cacbonhydrate 32,6 Chất tro 3,96 13 1.2.2. Quá trình thủy phân Peptide đậu nành có thể được sản xuất bằng cách thủy phân protein. Thủy phân protein là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất để sản xuất các peptide có hoạt tính sinh học. Thủy phân bằng axit ít tốn kém và tương đối đơn giản, nhưng khó kiểm soát hơn, và có khả năng biến tính axit amin. Ngược lại, quá trình thủy phân enzyme ít khắc nghiệt hơn và không gây biến tính axit amin tuy nhiên tốn kém hơn. Phương pháp thủy phân enzyme vẫn là phương pháp chủ yếu để chuẩn bị các peptide hoạt tính sinh học từ protein; Lên men là một cách khác để thủy phân protein nhưng được coi là ít hiệu quả hơn. Các enzyme đường tiêu hóa, như pepsin và hỗn hợp pancreatin, thường được sử dụng trong sản xuất các peptide hoạt tính sinh học [44]. Nhiều enzyme khác và sự kết hợp của chúng, như Alcalase và Flavourzyme, có thể được sử dụng để sản xuất các peptide từ protein. Trong nghiên cứu của Kristinsson (2007) đã ước lượng mức độ thủy phân (DH) của collagen bằng các protease thương mại khác nhau (neutrase, alcalase, papain và acid protease). Người ta phát hiện ra rằng enzyme trung tính cho DH cao hơn các enzyme khác. Do đó, hoạt tính chống oxy hoá được tập trung nghiên cứu trên các peptide thu được từ sự thủy phân bằng neutrase [37]. Neutrase là loại metallo endoprotease được thu nhận từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens; trong khi Alcalase là loại endoprotease được thu nhận từ vi khuẩn Bacillus licheniformis; Flavourzyme là chế phẩm enzyme kết hợp cả hai loại edoprotease và exopeptidase, được thu nhận từ nấm mốc Aspergillus oryzae. Các vị trí cắt trên peptide của alcalase thường ưu tiên ở: glutamate, methionine, leucine, tyrosine, lysine, và glutamine [1]. Chế độ thủy phân bởi alcalase là 30oC- 65oC, pH = 7-9, thời gian từ 90 phút tới 6 giờ. Flavourzyme bao gồm endo-và exopeptidases [4]. Dịch thủy phân được tạo bởi flavourzyme có vị ít đắng hơn so với các protease khác, do đó chúng được ứng dụng nhiều hơn trong thực phẩm. Các vị trí và cơ chế tách chiết bởi enzyme 14 flavourzyme chưa được nghiên cứu rộng rãi. Chế độ thủy phân bởi flavourzyme là 30oC- 55oC, pH = 6-7, thời gian từ 90 phút tới 6 giờ. Còn đối với neutrase, chế độ thủy phân là 30oC- 55oC, pH = 5,5-7,5, thời gian từ 90 phút tới 6 giờ. Đã có một số nghiên cứu về sử dụng các chủng vi sinh vật để thủy phân protein đậu nành thành các peptide có hoạt tính chống oxy hóa. Issoufou Amadou (2010) đã sử dụng chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum Lp 6 để thủy phân đậu nành. Chế độ thủy phân là 37oC trong 72 giờ [2]. Một nghiên cứu khác của Mona M. Rashad (2011) đã sử dụng nấm men Candida albicans, Pichia pinus, Saccharomyces cerevisiae để lên thủy phân bã đậu. Chế độ thủy phân là 30oC trong 72 giờ [27]. Mai.M.M. Naeem (2015) đã sử dụng chủng nấm mốc Aspergillus oryzae để thủy phân bã đậu. Chế độ thủy phân là 30oC trong 10 ngày [24]. Các sản phẩm đậu nành có chứa một lượng hợp chất phenolic đã được chứng minh là có khả năng chống oxy hoá. Ngày nay, các sản phẩm đậu nành lên men được phổ biến rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới như một món ăn địa phương, ví dụ như Tua-nao (Thailand), Natto (Nhật Bản), Tempe (Indonesia) và Kinema (Ấn Độ) [27]. Một trong những peptide có khả năng chống oxy hoá được xác định trong dịch thủy phân protein đậu nành là chuỗi peptide leucine - leucine - proline histidine - histidine (leu - leu - pro - his - his) [8]. Dựa trên peptide này, rất nhiều chất chống oxy hoá peptide được tổng hợp. Chen và cộng sự (1998) đã phát hiện ra rằng pro-his-me như một peptide cá thể, có khả năng chống oxy hoá cao nhất. Hơn nữa, sự tồn tại của một dư lượng leucine hoặc proline tại đầu N của một peptide chứa nó đã tăng cường khả năng chống oxy hoá và tính kỵ nước của các peptide. Histidine và các axit amin vòng thơm khác góp phần khả năng chống oxy hoá, do cấu trúc vòng của chúng [8, 31]. 15 Hình 1.1. Cấu tạo của 5 axit amin thường có trong các peptide có hoạt tính chống oxy hóa. 1.3. Điều kiện tách và tinh sạch các peptide có hoạt tính chống oxy hóa 1.3.1. Các nghiên cứu về điều kiện tách các peptide có hoạt tính chống oxy hóa Trong nghiên cứu của Mai.M.M. Naeem (2015) về sử dụng chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Trichodema harzium để thủy phân bã đậu thành các peptide có hoạt tính chống oxy hóa, dịch thủy phân được tách bằng nước và dung môi (methanol, ethanol, aceton, diethyl ether). Các bước tách chiết bằng nước được thực hiện như sau: 1g bã đậu lên men được bổ sung 20ml nước cất, hỗn dịch được đồng hóa bằng máy trong 2 phút, sau đó đun sôi 15 phút để bất hoạt enzyme, giữ ở 60oC trong 1 giờ với tốc độ khuấy 150 vòng/phút. Sau đó ly tâm ở chế độ 3000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch, lọc qua giấy lọc Whatman No 1 và bảo quản dịch. Với phương pháp chiết bằng dung môi: bã đậu lên men được sấy khô ở 60oC trong 24 giờ, sau đó bổ sung dung môi với tỷ lệ 1:5(khối lượng/thể tích), giữ ở 55oC 16 trong 3 giờ với tốc độ khuấy 100 vòng/phút. Lọc qua giấy lọc Whatman No1 thu dịch lọc và sấy khô. Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết bằng nước cao nhất so với các dịch chiết bằng dung môi. Tỷ lệ quét gốc DPPH (%) của các dịch chiết bằng nước, methanol, ethanol, aceton, diethyl ether (2mg/ml) khi thủy phân bằng A.oryzae lần lượt là 92,8%, 84,2%, 88,4%, 81,4%, 75,7%. [24]. Trong nghiên cứu của W. Samruan (2012) về hoạt tính chống oxy hóa của đậu nành và dịch chiết từ đậu nành lên men từ Bacillus subtilis SB-MYP-1, đã sử dụng 2g dịch thủy phân dạng đông khô hòa tan với 10ml nước cất hoặc methanol, trộn bằng vontex trong 1 phút, ly tâm với tốc độ 3200 vòng/phút trong 30 phút, phần bã được rửa lại với 10ml nước cất hoặc methanol. Hai phần dịch thủy phân được trộn đều và cô đặc. Với mẫu tách bằng nước được sấy đông khô, còn mẫu tách bằng dung môi được bay hơi và sấy khô bằng dòng khí nitơ tại nhiệt độ phòng. Kết quả cho thấy dịch chiết bằng nước có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn dịch chiết bằng methanol. Giá trị IC50 (mg/ml) của dịch chiết bằng nước và dịch chiết bằng methanol của mẫu đậu nành thủy phân lần lượt là 14,277 và 29,468 [40]. Trong nghiên cứu của Ferial M. Abu-Salem về các peptide có hoạt tính chống oxy hóa thu nhận từ dịch thủy phân đậu nành bằng enzyme papain, cách thu dịch chiết được thực hiện theo các bước: đun cách thủy dịch thủy phân ở nhiệt độ sôi trong 3 phút để bất hoạt enzyme, sau đó ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 20 phút thu lấy dịch trong là dịch chiết các peptide [15]. Trong nghiên cứu của Mona M. Rashad 2011 về các peptide có hoạt tính chống oxy hóa thu nhận từ dịch thủy phân bã đậu bằng các chủng nấm men Candida albicans NRRL Y-12, Candida guilliermondii NRRL Y-2075, Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12632, dịch chiết được thu nhận bằng cách: Bã đậu sau khi lên men được sấy khô ở 60oC và nghiền thành bột, bột được trộn với methanol theo tỷ lệ 1:5 (khối lượng/thể tích) tại 55oC trong 2 giờ trong bể ổn 17