ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
CHQGHN
BÁO CÁO TÔNG KÉT
KÉT QUẢ THựC HIỆN ĐÊ TÀI KH&CN
CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA
Tên đề tài: Nghiên cứu điều kiện lên men và phương pháp tách chiết chất
kháng sinh diệt nấm gây bệnh thực vật từ vi khuẩn Bacìllus
amylolique/aciens
Mã số đề tài: QG.13.12
Chủ nhiệm đề tài: TS. Trịnh Thành Trung
Hà Nội, 2016
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
CKQG8 .N
BÁO CÁO TỎNG KẾT
KÉT QUẢ THỰC HIỆN ĐÈ TÀI KH&CN
CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA
Tên đề tài: Nghiên cứu điều kiện lên men và phương pháp tách chiết chất
kháng sinh diệt nấm gây bệnh thực vật từ vi khuẩn Bacillus
am ylolique/aciens
Mã số đề tài: QG.13.12
Chủ nhiệm đề tài: TS. Trịnh Thành Trung
Hà Nộị, 2016
PHẢN I. T H Ô N G T IN CHƯNG
1.1. Tên đề tài: Nghiên cứu điều kiện lên men và phương pháp tách chiết chất kháng sinh diệt
nấm gây bệnh thực vật từ vi khuẩn B acillus am ylolique/aciens
1.2. Mã số: QG.13.12
1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài
TT
Chức danh, học vị, họ và tên
1
TS. Trịnh Thành Trung
2
Ths. Trịnh Thị Vân Anh
"ĩ
i
K.S. Hà Thị Hàng
4
CN. Nguyễn Thị Anh Đào
5
KS. Nguyễn Mạnh Hùng
Đơn vị công tác
Viện Vi sinh vật và
Công nghệ Sinh học
Viện Vi sinh vật và
Công nghệ Sinh học
Viện Vi sinh vật và
Công nghệ Sinh học
Viện Vi sinh vật và
Công nghệ Sinh học
Viện Vi sinh vật và
Công nghệ Sinh học
Vai trò thực hiện đề tài
Chủ nhiệm đề tài
Thư ký
Thành viên
Thành viên
Thành viên
1.4. Đơn vị chủ trì: Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học
1.5. Thòi gian thực hiện:
1.5.1. Theo họp đồng: 24 tháng từ tháng 06 năm 2013 đến tháng 05 năm 2015
1.5.2. Gia hạn (nếu có): 12 tháng đến tháng 05 năm 2016
1.5.3. Thực hiện thực tế:
từ tháng 06 năm 2013 đến tháng 09 năm 2016
1.6. Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):
(Ve mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quà nghiên cíni và to chức thực hiện; Nguyên nhân; Y
kiến cùa Cơ quan quàrì lý)
1.7. Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 160 triệu đồng.
PHÀN II. TỎNG QUAiN K É T QUẢ NG H IÊN c ừ u
Viết theo cấu trúc một bài báo khoa học tổng quan từ 6-15 trang (báo cáo này sẽ được đăng trên
tạp chí khoa học ĐHQGHN sau khi đề tài được nghiệm thu), nội dung gồm các phần:
1.
Đặt vấn đề
Sử dụng phân bón vô CO' và các loại thuốc hóa học phòng trừ sâu bệnh trong sàn xuất nông nghiệp
đang gày ra những tác động tiêu cực đến độ mầu mỡ cùa đất, hủy hoại môi trường sống và làm ành
hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người. Phát triển ngành nông nghiệp theo hướng xanh và bền
vững là vấn đề tất yêu của mọi quốc gia và phân bón hữu CO' sinh học đang là giải pháp ưu thê được
nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên toàn thê giới (Bhardwaj et al.,
2014). Phân bón hữu cơ sinh học không chi cung cấp các loại chất dinh duững nhàm duy trì và ổn
định độ phi nhiêu cho đất mà còn cung cấp các loại vi sinh vật có lợi cho sự phát triển của cây
trồng. Các vi sinh vật thường bồ sung vào phàn bón hữu cơ sinh học bao gồm Rhizobium (vi khuẩn
cố định nitơ sống cộng sinh), Aiospirillum (vi khuẩn cố định nitơ sống tự do), Bacillus (vi khuẩn
phân giải phosphate khó tan và sàn sinh các chất phòng trừ bệnh cây), Pseudomonas và
Trichoderma (vi khuân và nấm sợi sàn sinh các chất phòng trừ bệnh cây) (Fravel, 2005).
Chi Bacillus là một nhóm các loài vi khuẩn hiếu khí, Gram dương, hình que, phân bố rộng
rãi trong các hệ sinh thái. Bacillus có khà năng sinh nội bào tử, một dạng nghi của tế bào để giúp vi
khuẩn có thể chổng chịu và tồn tại trước các điều kiện bất lợi cúa môi trường như khô hạn và thiếu
dinh duởng. Theo hệ thống phân loại hiện nay, chi Bacilhis có khoảng gần 300 loài và các loài phụ
1
dưới ioải (Parte, 20 i 4). Trơng số đó, Bacillus velczensìs (hay còn gọi là B amỵlolique/aciens subsp.
planturum, B. methylotrophicus và B. oryzicolà) là một trong tám loài vi khuẩn thuộc nhóm B.
subtilis (Rooney et al., 2011; Dunlap et a l, 2015). Đây là những loài vi khuân an toàn, sỏ' hữu nhiều
đặc tính quý có lợi cho cây trồng như khả năng sinh các chất kháng nấm và kháng vi khuẩn gây
bệnh cây, sàn sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật, sàn sinh các enzyme thủy phân và có khả
năng tăng cường tính miễn dịch của cây chống lại sự xâm nhiễm cùa các loại vi sinh vật gây bệnh
(Chovvdhury et al., 2015; Shao et a i, 2015; Li et al., 2015). Do sở hữu các đặc tính quý, nhiều
chủng vi khuẩn B. velezensis đã được phân lập, đánh giá các đặc tính có lợi và ứng dụng trong đấu
tranh sinh học hoặc bổ sung vào các loại phân bón hữu cơ sinh học. Một số chủng như B. velezensis
FZB42 cũng đã được sàn xuất thương mại sử dụng làm chế phẩm phân sinh học và chế phẩm phòng
trừ bệnh cây (Chowdhury et al., 2015). Nhiều báo cáo đã công bố hiệu quà sử dụng các chửng B.
veleiem is trong phòng trừ và làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh cũng như mức độ nhiễm bệnh của cây do
vi khuẩn và nấm gây bệnh cây gây ra (Chen et al., 2014; Huang et al., 2014; Wu et al., 2015; Kang
et a i, 2015). Sàn lưọng bông thu hoạch cũng tăng lên 30% khi bồ sung chủng B. veleiensis FZB42
vào phàn bón (Yao et al., 2006)
Nhằm tìm kiếm các chủng vi khuẩn có tiềm nãng ứng dụng trong sàn xuất chế phẩm làm
phân hữu CO' sinh học, trong nghiên cứu này, chúng tôi trọng tâm nghiên cứu các đặc tính có lợi cho
cây trồng từ các chủng vi khuẩn B. velezensis có trong bộ sưu tầm vi khuân Bacillus thu thập tại các
vùng Cúc Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sin và Côn Đảo. Ngoài ra, chùng vi khuẩn B. velezensis
SP1901 phân lập được từ mẫu đất rừng quốc gia Hoàng Liên cũng được sử dụng.
Bacillus velezensis là một trong số tám loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus sublilis (Rooney
et al., 2009). Đây là loài vi khuẩn an toàn, sỏ' hữu nhiều đặc tính quý có lợi cho cây trồng như khả
năng sinh các chất kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây, sản sinh hormone kích thích sinh
trưởng thực vật, sản sinh các enzyme thủy phân và có khả năng tăng cường tính miễn dịch của cây
chống lại sự xâm nhiễm của các loại vi sinh vật gây bệnh (Chovvdhury et al., 2015; Shao et al.,
2015; Li et al., 2015). Do sờ hữu các đặc tính quv, vi khuẩn B. velezensis được nhiều nhà khoa học
quan tâm nghiên cứu ở mọi cấp độ từ giái mã hệ genome đến nghiên cứu các chất trao đổi, nghiên
cứu phân loại, nghiên cứu ứng dụng trong nhà kính và ngoài thực địa; nhiều chủng vi khuẩn B.
velezensis đã được phân lập, đánh giá các đặc tính có lợi và ứng dụng trong đâu tranh sinh học đê
phòng ngừa các loại dịch bệnh hại cây trồng.
B velezensis sán sinh ra nhiều loại chất trao đồi bậc hai có hoạt tính kháng nâm và kháng vi
khuẩn gây bệnh cây. Các chất trao đổi đó bao gồm lipopeptide, polyketide, dipeptide, siderophore
và protein kháng khuẩn (Arguelles-Arias et a i, 2009; Huang et al., 2014). Lipopeptide cấu tạo từ
chuỗi peptide liên kết với acid béo, được tổng hợp không cần ribosome (nonribosomally
synthesized peptide) nhờ sự có mặt của nhóm đa enzyme non-ribosomal peptide synthetases
(NRPS). Giải mã hệ gene của các chủng B. velezensis cho thấy hơn 9% hệ genome của vi khuẩn
mang các gene tham gia sinh tổng hợp lipopeptide (Chovvdhury et al., 2015). Dựa vào cấu trúc phân
tứ và đặc tính sinh học, lipopeptide sản sinh từ Bacillus và Paenibacillus được chia thành 3 nhóm
chính là lipopeptide mạch vòng mang điện tích dương, lipopeptide mạch vòng không mang điện
tích dương và lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương (Cochrance, Vederas, 2014). Surfactin,
iturin và fengycin là các lipopeptide mạch vòng không mang điện tích dương thường được tìm thây
trong dịch nuôi cấy cùa các loài B. subtilis (Stein, 2005; Ongena, Jacques, 2008). Bên cạnh đó,
nhiều chùng B. velezensis còn có khả năng sàn sinh đồng thời các polyketide là difficidin,
bacillaene và macroìactin (Argueiles-Arias et u i, 2009; Yuan et a i, 2012).
Trong quá trình tìm kiếm các chùng vi khuẩn có khả năng ứng dụng trong đấu tranh sinh
học để phòng trừ các bệnh hại cây, chúng tôi đã phân lập được chủng B. velezensis CP 1604 trong
dất nông nghiệp gần vườn Quốc gia Cúc Phương có khả năng đối kháng mạnh với nấm gây bệnh
cây là Sclerotiiim hydrophilum, Rhizoctonia soỉani, Phytophthora capsici, Fusarium oxysporum và
vi khuẩn gây bệnh bạc lá Xanthomonas oryzcie (Trung et al., 2016). Trong nghiên cứu này, chúng
2
tôi tiến hành tách chiết, tinh sạch và xác định bàn chất của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn
sinh ra từ chùng CP i 604.
2. M ục tiêu
- Tuyển chọn đưọc một chủng vi khuẩn Bacillus am ylolique/aciens sinh chất kháng nấm mạnh
nhất.
- Nghiên cứu điều kiện lên trên qui mô 5 lít.
- Tách chiết và thu hồi chất kháng nấm.
- Tinh sạch và xác định bàn chất sinh lý hóa của chất kháne nấm.
- Đánh giá độ an toàn của chất kháng nấm.
3. Phương pháp nghiên cứu
C hủng vi khuẩn nghiên cứu
Từ bộ vi khuẩn hiếu khí sinh nội bào từ phân lập tại 4 vườn Quốc gia Cúc Phương, Bạch
Mã, Chư Yang Sin và Côn Đào, chúng tôi tiến hành so sánh tính tương đồng cao nhất cùa đoạn gen
16S rRNA so với các chúng chuẩn cúa các loài trong cơ sỏ' dữ liệu Eztaxon-e ('http://eztaxone .ezbiocloud.net/). Dựa trên số liệu so sánh, chủng tôi lựa
chọn các chùng có
trình tự gen16SrRNA
tương đồng cao nhất với các loài B. velezensis, B.
am yloliquefaciens
subsp. plantarum ,B.
methylotrophicus và B. oryzicola. Từ ống lưu giữ lạnh sâu ở -70°c, các chủng vi khuẩn lựa chọn
được ria hoạt hóa trên môi trường thạch NA (Becton, Dickinson and Company, Pháp) tại 30°c. Sau
24 giờ, tế bào hoạt hóa thu được sẽ dùng cho các thí nghiệm mô tà dưới đây.
Xác định khả năn g sinh c h ấ t k h á n g nấm và c h ấ t k h á n g k h u ẩ n
Từ các tế bào đã hoạt hóa, các chùng vi khuẩn được cấy trải đều trên mặt thạch TSBA
(Becton, Dickinson and Company, Pháp) và được ủ ở 30°c.. Hoạt tính .kháng nấm và kháng khuẩn
được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán thạch. Theo đó, khoanh thạch được đục bàng ống nhựa
vô trùng ( 0 = 6 mm) và được đặt lên môi írưòng PDA (g/L: khoai tây 200 g, dextrose 20 g và thạch
15 g) đã cấy sẵn các loài nấm kiêm định gây bệnh thực vật là Fusarium oxysporum, Scleroúum
hydrophilum, Rhizoctonia solani và Phytophthora capsici hoặc đặt lên môi trường NA đã cấy vi
khuẩn kiểm định gây bệnh bạc lá lúa là Xanthom onas oryzae. Ngoài ra, phổ hoạt tính kháng nấm
cũng đưọc kiểm tra trên các chủng nấm kiểm định là Aspergillu.s oryzae, A.
nigcr và
Sacchciromyces cerevisiae. Bộ giống các chùng vi sinh vật kiểm định này đang được lưu giữ tại Bào
tàng Giống chuẩn Vi sinh vật. Viện Vi sinh vật và Công nfihệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Xác định khả năng sinh enzym e ngoại bào
Từ các tế bào đã hoạt hóa, chủng vi khuẩn đưọc cấy vào binh tam giác 250 mi chứa 100 mỉ
môi trưòng TSB (Becton, Dickinson and Company, Pháp) dịch thể. Sau 48 giờ nuôi cấy lắc 160 v/p
ờ 30°c, dịch nuôi được ly tâm ở 8.000 v/p trong 10 phút nhầm loại bỏ tế bào vi khuẩn. Khả năng
sinh enzyme ngoại bào được xác định bằng phương pháp khuếch tán thạch. Theo đó. dịch nuôi cấy
vi khuẩn đưọc nhỏ vào các giếng ( 0 = 6 mm) đã đục lỗ trong đĩa thạch chứa 0 , 1 % một trong các
loại cơ chất là tinh bột tan, CMC, xylan, chitin, casein và tributyrin. Sau 24 giờ ủ đĩa thạch chứa cơ
chất ở 37°c, hoạt tính amylase và CMCase được xác định dựa trên vòng trong-phân giải cơ chât
tinh bột tan và CM C xung quanh khoanh thạch khi nhuộm với dung dịch lugol; hoạt tính xylanase
và chitinase được quan sát khi nhuộm cơ chất xylan và chitin với dung dịch đỏ công gô; hoạt tính
protease và lipase được quan sát trực tiếp trên cơ chất casein và tributyrin.
Xác định khả năng phân giải p hosphate khó tan
Chùng vi khuẩn đã hoạt hóa đưọc cấy vào bình tam giác 100 ml chứa 25 ml môi trường dịch
thể PVK (g/L: glucose 10, C a 3 (P 0 4 ) 2 5, KCI 0,2, (NH 4 ) ; S 0 4 0,5, NaCI 0,2, M g S 0 4. 7H2Õ 0,1.
M n S 0 4. H20 0,002 và F e S 0 4. 7H20 0,002). Sau 48 giờ nuôi lắc 160 v/p ơ 30°c, dịch nuôi vi khuấn
được ly tâm ỏ' 8.000 v/p trong 10 phút để loại bo té bào. Hàm iuựrig phosphaíe vô cơ giải phóng từ
3
Ca 3 (P 0 4 ) 2 vào mỏi trường nuôi cấy được xác định bằng phương pháp xanh molybden dựa trên
đường chuẩn phosphate xây dựng từ KH 2 PO 4 (Holman et a i, 1943).
Xác định khả năng sinh chất kích thích sinh trướng IAA
Chủng vi khuẩn đã hoạt hóa được cấy vào bình tam giác 100 ml chứa 25 ml môi trường dịch
thể NA có bổ sung L-tryptophan (Merck, Đức) tới nồng độ cuối là 5 mM. Sau 48 giờ nuôi lắc 160
v/p ở 30°c, dịch nuôi vi khuẩn được ly tâm ỏ' 8,000 v/p trong 10 phút để loại bỏ tế bào. Khà năng
sinh chất kích thích sinh trưởng indole-3-acetic acid (1AA) được xác định dựa trên phản ứng tạo
mầu với thuốc thử Salkowski (Glickmann và Dessaux, 1995). Hàm lượng IAA sinh ra được xác
định dựa trên đường chuẩn xây dựng từ IAA (Merck, Đức).
Dấu vân tay rep -P C R và phân tích tính tương đồng kiểu gen
Từ các khuẩn lạc thuần khiết, ADN tổng số được tách chiết theo phưong pháp cùa Gabor et
al. (2003). Mức độ tinh sạch của ADN được kiêm tra dựa trên chỉ sô bước sóng A 2 6 0 /A 2 8 0 (xâp xi
1,8). Sau đó, 50 ng ADN cùa từng chủng vi khuẩn được đưa vào ống PCR có thể tích phàn ứng cuối
cùng [à 25 |il chứa sằn DreamTaq™ PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientiíìc, Mỹ). Phàn ứng
PCR được thực hiện với mồi ERIC và GTG 5 theo chu trình nhiệt do Freitas et al. (2008) đà mô tả.
Sàn phẩm PCR được điện di trong 2 giờ tại 65 V trên gel agarose 2% có bổ sung chất nhuộm ADN
RedSafe (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc). Hình ảnh điện di được chụp trên hệ thống soi gel
(BioRad, Mỹ). Mô hình băng ADN (hay kiều gen) tạo ra từ mỗi chùng vi khuẩn được phân tích và
được mã hóa sang hệ ma trận nhị phân 1/0. Tính tương đồng về kiểu gen được tính toán theo hệ số
Dice. Mối quan hệ về kiểu gen của các chùng đưọc thể hiện theo SO’ đồ cây sử dụng thuật toán
UPGMA. Tât cả các bước phân tích tính tương đông kiêu gen được thực hiện trên phân mêm
NTSYSpc 2 1.
P hân tích trình tự đa gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại
Phản ứng PCR khuếch đại và giải trình tự 6 đoạn gen gyrase subunit A (gyrA), RNA
polymerase subunit B (rpoB), phosphoribosylaminoimidazolecarbox-amide formyltransferase
(purH), DNA polymerase III subunit alpha ipolC), 60 kDa heat-shock protein groEL (groEL) và
16S rRNA được thực hiện với các cặp mồi theo mô tả cùa Rooney et al. (2009). Trình tự cùa 6 gen
được gửi lên ngân hàng gen với các số hiệu lần lượt là KU9048IỌ, KU9048I1, KU9Ọ4812
KU904813, KU904814 và K.U9048I0. Trình tự đa gcn của chủng vi khuân nghiên cứu có chiêu dài
5.547 bp được kết nối theo thứ tự đoạn 928 bp của gen gỵrA, đoạn 964 bp của gen rpoB, đoạn 875
bp cùa gen purH. đoạn 777 bp của gen p o ic, đoạn 835 bp của gen groEL và đoạn 1,168 bp của gen
I 6 S rRNA. Trình tự đa gen của các loài quan hệ gần gũi trong nghiên cứu của Kobo et a i (2011)
được tài về từ ngân hàng gen NCBI (http://wvv\\ .ncbi.ním.nih.íiov/'). Cây phát sinh chủng loại được
xây dựng theo phương pháp Neighbor joining sử dụng phép toán Tamura - Nei với độ lặp lại 1,000
lần trên phần mềm MEGA phiên bản 5.05.
Tách chiết chất kháng nấm và kháng khuẩn
Từ dịch nuôi cấy đã loại bỏ tế bào, chất kháng nấm và chất kháng khuẩn được tách chiết
bàng 4 phương pháp là (i) sử dụng dung môi hữu cơ, (ii) hấp phụ với hạt amberlite-XAD7, (iii)
đông khô dịch nuôi cấy kèm tách chiết bằng ethanol và (iv) tủa ở pH thấp. Các phương pháp tách
chiết được lặp lại 2 đến 3 lần theo quy trình như sau:
i.
Phương pháp tách chiết bằng dung môi hữu cơ: dịch nuôi cấy đã loại bò tế bào được lần lượt
đưa vào các dung môi có độ phân cực khác nhau là benzen, l-butanol, chlorotbrm, ethyl
acetate, hexan, 2-pentanoi vá tuiuene theo tỷ ỉệ ỉ : 1. Sau khi đảo trộn mẫu trong 10 phút,
hỗn hợp dung dịch được ly tâm ở tốc độ 8 . 0 0 0 vòng/phút trong 2 0 phút nhăm tách rõ 2 lớp
dịch nuôi cấy và dung môi. Phần dung môi phía trên được thu lại và cô quay ờ nhiệt độ
60°c. Sau đó, cặn kháng sinh thô được hoàn nguyên với nước cất và được thứ hoạt tính
kháng nấm và vi khuẩn kiểm định.
4
II.
Phương pháp hấp phụ với hạt amberlite-XAD7: hạt amber!ite-XAD7 được đưa vào dịch
nuôi cấy theo tý lệ 1 : 5 (khối lưọng/thể tích). Hỗn hợp này được khuấy nhẹ qua đêm trên
máy khuấy từ ỏ' nhiệt độ 4°c. Sau đó, hạt amberlite đơọc thu lại và rửa liên tiếp 3 lần với
nước cất, 1 lần với ethanol 30%. Hạt amberlite được khuấy nhẹ với ethanol 75% trong 4 giờ
(He et a i, 2007). Chất kháng sinh thô thôi ra trong ethanol được thu lại và cô quay ở nhiệt
độ 60°c. Sau đó, cặn kháng sinh thô được hoàn nguyên với nước cất và được thử hoạt tính
kháng nấm và vi khuẩn kiểm định.
iii.
Phương pháp đông khô: tiến hành đông khô hoàn toàn dịch nuôi cấy. Sau đó, đưa một lượng
thể tích ethanol 1 0 0 % tương đương với lượng mẫu ban đầu vào cặn đông khô và lấc ở 160
vòng/phút trong 2 giờ nhằm chiết rút chất kháng sinh thô. Phần ethanol được thu lại và cô
quay ở nhiệt độ 60°c. Sau đó, cặn kháng sinh thô được hoàn nguyên với nước cât và được
thử hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn kiểm định.
iv.
Phương pháp tủa ở pH thấp: dịch nuôi cấy được chỉnh về pH 3,0 sử dụng HCI 6 N và được ù
qua đêm ờ 4°c. Sau đó, dịch nuôi cấy được ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 10 phút. Phân
cặn tủa được thu lại và hoàn nguyên với nước cất. Hoạt tính kháng sinh thô trong cặn tủa
được thử với nấm và vi khuẩn kiểm định.
Tinh sạch chất kháng nấm và kháng khuẩn
Chất kháng nấm và chất kháng khuẩn đưọc tinh sạch bàng kỹ thuật HPLC sử dụng cột
Zorba.\ Eclipse XDB - C18 (4,6 X 250 mm, 5 |il, Agilent Technologies, USA). Phương pháp tinh
sạch HPLC được thực hiện theo mô tả cùa He et al. 2007. Theo đó, pha động sử dụng methanol và
nuớc chứa 0,05% triíluoroacetic acid. Sau khi cân bàng cột với tỷ lệ 20% methanol, 30 |il dịch
kháng sinh tách chiết theo 2 bước bàng dung môi I - butanol và hạt amberlite-XAD7 được tải lên
cột. Dung môi hệ động được thay đổi tuyến tính theo nồng độ methano! từ 20% lên 40% trong 10
phút, từ 40% lên 60% trong 5 phút và từ 60% lên 70% trong 10 phút. Tốc độ dòng cùa cả quá trình
sắc ký là 0,5 ml/phút. sắc ký-đồ được ghi nhận tại bước sóng 220 nm. Sau khi bị thôi ra khòi cột,
các phân đoạn sẳc ký (0,5 ml/phân đoạn) được thu nhận, cô quay loại bỏ dung môi và thử hoạt tính
kháng nấm và kháng khuẩn. Sau đó, các phân đoạn có hoạt tính được trộn lại vói nhau và được tinh
sạch lại một lần nữa theo chu trình sắc ký mô tà như trên. Phân đoạn có hoạt tính kháng nấm và
kháng vi khuẩn được gửi sang Trung tâm các Phương pháp Phồ ứ n g dụng - Viện Hóa Học - Viện
Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ để xác định phổ khối.
Xác định đặc tính sinh hóa lý của chất kháng nấm và kháng khuan
Khả năng bền nhiệt độ, bền pH và bền với các enzyme thủy phân của chất kháng nấm và
chất kháng khuân được thử nghiệm như sau:
i.
ii.
iii.
Khả nâng bền nhiệt: dịch tách chiết chất kháng sinh được xử lý ớ các nhiệt độ 60°c, 80°c và
100°c. Sau thòi gian xứ lý là 30 phút, 60 phút, 90 phút và 120 phút, hoạt tính kháng nấm và
kháng vi khuẩn được xác định bàng phưong pháp khuếch tán thạch như mô tà ở trên.
Khả năng bền pH: dịch tách chiết chất kháng sinh được xử lý ở các pH từ 3,0 đến 7,0 trong
đệm citrate-phosphate và pH 8,0 đến 9.0 trong đệm Tris-HCI. Sau 24 giờ ủ ở 4°c, hoạt tính
kháng nấm và kháng vi khuẩn được xác định bẳng phương pháp khuếch tán thạch như mô tà
ở trên.
Khả năng bền với các enzyme thùy phân: 5 enzyme là trypsin, a-chymotrypsin, amylase,
lipase và proteinase K được pha trong đệm phosphate 25 mM (pH 7,0) tới nồng độ cuối
cùng là 1 mg/ml. Sau đó. dịch tách chiết chất kháng sinh được lần lượt trộn đều với các
dung dịch enzyme theo tỷ lệ 1 : 1 và được ủ ở 37°c. Sau 2 giờ xử lý, hoạt tính kháng nấm và
kháng vi khuẩn đưọc xác định bằng phương pháp khuếch tán thạch như mô tà ờ trên.
T h ử nghiệm tính an toàn của chất kháng nấm và kháng khuấn
Tính an toàn của chất kháng nấm và kháng khuẩn sán sinh từ chùng B. amyloliquefaciem
subsp. plantarnm CP 1604 bước đầu được thử nghiệm trên khả náng nảy mầm của hạt thóc, hạt lạc
và hạt ngô; và thử nghiệm khá năne sinh trường của các ioại cây ìúã, cây lạc và cây ngô. Qua đó.
5
chất kháng nấm tách thô được pha loãng đến nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng nưóc cất và các
loại hạt kể trên đưọc ngâm trong 3 giò' trong dung dịch pha loãng nàv. Sau đó, hạt được đưa lên lớp
bông ẩm nhằm tạo điều kiện thuận lợi nẩy mầm ỏ- 25°c. Độ ẩm của bông được kiểm tra hàng ngày
và kích thước (cm) hạt nẩy mầm được đo lại sau 4 đến 6 ngày ù mầm. Đối chứng là các hạt ngầm
trong nước cất trước khi ù mầm.
Nhằm đánh giá tính an toàn của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn lên sự sinh trưởng của
cây non, mầm hạt cây tại các mẫu đối chứng được trồng ra đất. Sau 5 - 7 ngày khi cây đã phát triên
ồn định, chất kháng nấm tách thô được pha loãng đến nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được phun
đều lên bề mặt các lá. Đối chửng là nưó'c cất phun đều lên bề mặt lá. Màu sắc lá được quan sát hàng
ngày. Sau 5 ngày thử nghiệm, kích thước lá I và 2 được ghi lại và so sánh.
4. Tổng kết kết quả nghiên cứu
B. am ylolique/aciens subsp. plantarum phân lập tại các vùng sinh thái khác nhau
Từ tháng 11 năm 2012 đến tháng 10 năm 2013, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã tiến hành
thu thập 79 mẫu đất tại 4 vườn Quốc gia và các vùng đất canh tác nông nghiệp lân cận là Cúc
Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sin và Côn Đào. 1.441 chủng vi khuẩn hiếu khí sinh nội bào từ đã
được phân lập bàng phương pháp xử lý nhiệt [45]. Dựa trên các đặc điểm khác biệt về màu sắc, kích
thước, cấu trúc bề mặt và mép viền ngoài khuấn lạc, 252 (17,5%) chủng đã được giải trình tự gen
16S rRNA (xấp xỉ 1.500 bp). So sánh trong cơ sở dữ liệu Eztaxon-e cho thấy, 14 chùng có chi sô
tương đồng gen 16S rRNA cao nhất với chủng B. cimylolique/ciciens subsp. plantarum FZB42 là
99,93%. Gen I 6 S rRNA của 14 chùng này đều tương đồng nhau và chí sai khác 1 nucleotide ở vị trí
583 (G thay bàng A) so với chung chuẩn FZB42. Không có chùng nào có trình tự gen I 6 S rRNA
tưong đồng cao nhất với các loài B. methylotrophicuỉi và B. oryzicola.
Trong số 14 chủng B. amylolique/aciens subsp. plantarum, 3 chùng phân lập được ở Cúc
Phương, 3 chủng phân lập được ỏ- Bạch Mã, 5 chủng phân lập đ ư ọ o ở Chư Yang Sin và 3 chùng
phân lập đưọc ở Côn Đảo. 12 ( 8 6 %) chùng được phân lập trong đất canh tác nông nghiệp; chi có 2
chủng là BM 1912 và CĐH 1701 phân lập trong đất rừng. Ngoài ra, B. amylolique/aciens subsp.
plantarum SP1901 phân lập từ mẫu đất rừng Hoàng Liên cũng được nghiên cứu. Thông tin chi tiết
về 15 chủng được trình bày trong bảng 1 .
H oạt tính kháng nấm và vi khuẩn
Cùng với chùng SP 1901, 14 chủng B. amylolique/aciens subsp. plantarum trong nghiên cứu
này đều sinh chất kháng nấm gây bệnh cây là F. oxysporum, s. hydrophilum. R. solani và p. capsici
với kích thước vòng kháng nấm trung bình đối với từng loại nấm lần lượt là 4,2 mm, 10,6 mm, 7,7
mm và 7,4 mm. Các chùng B. amvlolique/aciens subsp. plantarum thử nghiệm đều sinh hoạt tính
kháng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa X. oryzae với kích thước vòng kháng trung bình là 20,8 mm.
Ngoài ra, hoạt tính kháng nấm cùa các chùng vi khuấn cũng thế hiện rất rõ ràng khi thử nghiệm với
2 loại nấm sợi và I loại nấm men thường gặp là A. oryzae, A. niger và 5. cerevisiae (Bảng 2). Điêu
đó chứng tò ràng các chung B. am yitìiiqueỳaaem subsp. planiarum phản lập trong môi trường tự
nhiên của Việt Nam sinh chất có phổ hoạt tính rộng kháng nấm và kháng khuẩn.
Bàng. Thông tin CO' bàn cùa 15 chủng B. amylolique/aciens subsp. plantarum.
STT
Tên chủng
Loại
đất
Ị
CP 1604
CP 1801
CP 1205
BM0621
BM 0824
BM 1912
CYS0I01
NN
NN
NN
NN
NN
R
NN'
2
i
4
5
6
7
Tọa độ
20.39730
20.40270
20.36010
16.09630
16.27200
15.99740
12.65070
N
N
N
N
N
N
N
105.58793
105.53779
105.67194
108.08954
108.00317
107.99320
108.09832
E
E
E
E
E
E
L
Độ tu o ng
đồng (%)
Số hiệu đoạn 16S
rDNA tham chiếu
99,93
99,93
99,93
99,93
99,93
99,93
99,93
CP000560
CP0005Ó0
CP000560
CP000560
CP000560
CP000560
CP000560
6
8
9
10
1 1
12
13
14
15
CYS 0208
CYS 0816
CYS090I
CYS09I 1
CĐH 0101
CĐH 0102
CĐH 1701
SP 1901
NN
NN
NN
NN
NN
NN
R
R
12.61560 N
12.49300 N
12.52710 N
12.52710 N
8.68555 N
8.68555 N
8.68916 N
22.28469 N
108.12942
108.28791
108.35777
108.35777
106.59250
106.59250
106.58861
103.89341
E
E
E
E
E
E
E
E
99,93
99,93
99,93
99,93
99,93
99,93
99,93
99,93
CP000560
CP000560
CP000560
CP000560
CP000560
CP000560
CP000560
CP000560
N N: nône nghiệp; R: rừng
Phân tích hệ genome của B. amylolique/ciciem subsp. plcmtanim cho thấy hơn 9% hệ
genome cùa vi khuẩn chứa các gen mã hóa các chất kháng nấm và kháng khuẩn (Chovvdhury et al.,
2015). Đa số các chất này có bản chất là peptide tổng hợp không qua ribosome như bacylicin,
lipopeptide (surfactin, ĩengycin, iturin và bacillomycin) và polyketide (difficidin, bacillaene và
macrolactin). Giống như các chủng đã công bố, 15 chủng B. amylolique/aciens subsp. plantarum
phân lập tại các vùng sinh thái khác nhau ở Việt Nam đều có khả sàn sinh chất kháng nấm và vi
khuẩn gây bệnh cây.
Trong số các loài vi khuẩn ứng dụng làm chế phẩm phòng trừ các loại bệnh hại cây trồng,
Bacillus được chú trọng nghiên cửu vì vi khuẩn có khà năng tạo nội bào tử để có thể tồn tại lâu
trong chế phẩm ở điều kiện bào quản thưòng. Nhiều chùng B. amylolique/aciens subsp.
amylolique/aciens hoặc B. amylolique/aciens đã được công bố về khà năng đối kháng với các loại
vi sinh vật gây bệnh cây trồng in vitro như chủng L-H15 đối kháng nấm F. oxyspom m [22]; chùng
S76-3 đối kháng nấm F. graminearum [20]; chùng GR53 đối kháng nấm R. solanì [32]; chùng
C N U 114001 đối kháng với 12 loại nấm gây bệnh cây là Alternaria panax, Botrytis cinerea,
Colletotrichum acutatum , c . orbiculare, Curyne.spura cassicola, F. oxysporiim, Penicillium
digitatum, p. capsici, R. sôlani, Stemphliyum lycopersici, Pyricularia grisea và Sclerotinia
sclerotioritm [30]. Nhiều chủng B. amvlolique/aciens subsp. plantarum có khả năng phòng trừ và
giảm thiểu bệnh cho cây trồng khi thử nghiệm trong nhà kính như dịch nuôi cấy và dịch tế bào của
chùng NJZJSB3 đã bào vệ iá cây cải dầu chống lại hoàn toàn sự xâm nhiễm cúa nấm Sclerotinia
sclerotiorum [48]; lạc xừ lý với chủng BZ 6 -I đã giảm được tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh do R.
solanacearum từ 84,5% xuống 12,1% [47]. Hon nữa, khi bổ sung vi khuẩn B. amyloliqite/aciens
subsp. plantarnm vào phân hữu cơ làm giảm đáng kể tỷ lệ nhiễm bệnh của cây trồng như chùng S20
làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh do vi khuẩn R. solanacearnm trên cây cà tím từ 56% xuống
còn 22% [7]; chủng HR62 làm giảm tỳ lệ nhiễm bệnh héo xanh do vi khuẩn R. solanacearum trên
cây cà chua xuống 65% [27]. Chính vì vậy, nghiên cứu tiếp theo nhằm đánh giá khá năng thúc đẩy
sự sinh trường, phát triển và tạo năng suất cho cây trồng là việc làm cần thiết nhàm tìm kiếm các
chùng B. amylolique/aciens subsp. amyloliqiie/aciens hữu ích sử dụng Irong sàn xuât chê phâm
phân bón hữu cơ sinh học phù họp với các điều kiện đất canh tác nông tại Việt Nam.
Báng 2. Hoạt tính kháng nấm và vi khuân
BM 0621
7
5
-7
5
1 1
1 1
9
9
Q
8
8
1 1
10
6
23
21
20
19
7
4
3
5
s. cerevisiae
A. r/iger
12
o
*
A. oryzae
13
p. capsici
R. solani
CP 1604
CP 1801
r'D nf"K
s hydrophilum
F. oxyspornm
Hoạt tính kháng nàin và vi khuân (D - d, mm)
Kháng nâm khác
Kháng nâm và vi khuân gây bệnh cây
7
9
6
2
5
3
5
2
7
BM 0824
BM 1912
CYS 0101
CYS 0208
CYS0816
CYS 0901
CYS091 1
CĐH0101
CĐH 0102
CĐH 1701
SP 1901
5
5
13
12
6
12
5
1 1
2
12
5
4
9
7
7
5
4
9
9
21
11
21
9
9
6
18
23
23
6
22
10
8
20
8
10
1 1
.
7
6
4
4
8
6
5
1 1
6
6
2
7
5
5
2
23
18
17
23
4
5
6
3
4
6
10
2
6
2
4
4
4
3
5
5
4
7
9
9
3
2
2
7
7
3
5
2
2
6
5
9
6
Enzym e ngoại bào
Thử nghiệm dịch nuôi cấy ngoại bào cho thấy cả 15 chủng B. amylolique/ciciens subsp.
plantarum đều sinh các enzyme ngoại bào là lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase và
chitinase. Kích thước vòng phân giải trên từng loại cơ chất là tương đương nhau và được thể hiện
chi tiết trong bảng 3.
Bảng 3. Khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào
Tên chúng
CP 1604
CP 1801
CP 1205
BM 0621
BM 0824
BM 1912
CYSOiOI
CYS 0208
CYS 0816
CYS 0901
CYS 091 1
CĐH 0101
CĐH 0102
CĐH 1701
SP 1901
Lipase
1i
11
10
11
9
10
9
9
8
9
10
8
7
7
6
*
Hoạt tính enzyme ngoại bào (D - d, mm)
Amylase
Chitinase
Protease
CMCase
17
23
23
20
23
20
17
23
24
23
17
16
23
25
18
16
23
19
16
21
23
23
15
16
17
17
22
23 „
16
21
23
19
21
23
19
16
21
23
18
16
18
23
23
20
22
15
20
23
22
22
19
15
22
20
16
21
22
19
16
18
Xylanase
20
17
17
20
17
20
16
17
20
17
17
20
18
18
19
Khá năng phân giải phosphate khó tan và sinh chất kích thích sinh trư ởng IAA
15 chùng B. amyìolique/aciens subsp. plantarum đều có khà năng phân giải phosphate khó
tan Ca 3 (P 0 4)2. Mức độ giái phóng phosphate vô cơ vào trong môi trường nuôi cấy giao động từ
19,64 - 74,21 |xg/ml. Bên cạnh đó, một số chủng cũng có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng
thực vật IAA khá rõ ràng như chủng CDH 0101 (3,28 (ig/ml) và SP 1901 (1,98 |ig/ml): một số
chung sinh hàm lượng IAA rất thấp như CP 1604 và CYS 0101 (Bàng 4).
Bảng 4. Khá năng phân giải phosphate khó tan và sinh chất kích thích sinh trưởng IAA
Tên chung
CP 1604
CP 1801
CP 1205
BM 0621
HU 0824
BM 1912
Lượng phosphate hòa tan (Ịig/m!
GTTB ± KBT)
49,67 ±0,61
53,12 ± ! ,96
53,25 ±2,19
54,45 ± 5,13
63,24 ±0,53
61,21 ±2,99
Lượng IAA sinh ra
GTTB ± KBT)
ũ,(59 ± 0,09
1,41 ±0,05
1,40 ±0,04
1,18 ± 0,07
1,07 ±0,08
i ,44 i 0,04
(ng/ml;
CYS0101
CYS 0208
CYS 0816
CYS0901
CYS091 1
CDH 0101
CDH0102
CDH 1701
SP 1901
19,64 ±2,43
65,84 ± 1,85
64,79 ± 1,12
63,03 ± 1,34
74,21 ± 0,74
66,82 ± 1,91
61,13 ± 1,37
67,32 ± 0,73
60,85 ± 2,62
0,64 ±0,12
1,38 ±0,04
1,30 ±0,11
1,55 ± 0,08
1,33 ±0,11
3,28 dt 0,09
0 , 8 8 ± 0,06
0,89 ± 0,03
1,98 ± 0,10
Từ kết quả trên cho thấy, bên cạnh khả năng sinh các chất kháng nấm và chất kháng vi
khuẩn gây bệnh hại cây, các B. amylolique/aciens subsp. pỉanlarum chùng này đều có khả nãng
phân giãi phosphate khó tan và một sô chúng như CĐH 0101 và SP 10901 có khá năng sinh chât
kích thích sinh trưởng !AA khá rõ ràng trong môi trường nuôi cấy (Bàng 3.4). Các đặc tinh có lợi
cho cây trồng như này cũng đã được công bố trên một số chủng B. amylolique/aciens subsp.
plantarum [28, 35]. Ngoài ra, tất ca các chùng B. velezensis đều sinh các enzyme thủy phân ngoại
bào là lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase và chitinase. Đây là những đặc tính quan trọng
nhăm thúc đây quá trình phân hủy các chât hữu cơ và là cơ sở đê lựa chọn các chủng vi khuân này
ứng dụng trong sản xuất chế phẩm ủ phân compost hoặc bổ sung chủng vói phân bón hữu cơ nhàm
thúc đẩy sự phát triển của cây trồng.
Phân tích đa dạng kiểu gen của các chủng B. am ylolique/aciens subsp. plantarum
Phân tích dấu vân tay re p -P C R
: .
i
í§|§|f|pỊ|ỈỊ'
D íc e
ii
CCXÍĨ1C1*L1JÍ
Hình 1. Sơ đồ cây về mối tương đồng kiểu gen xây dựng bàng kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sừ
dụng mồi ERIC cùa các chủng B. amylolique/ucỉens subsp. plantarum phân lập tại các vùng sinh
thái khác nhau của Việt Nam.
Nhẩm phân tích tính đa dạng về mặt di truyền cùa các chung vi khuẩn B. amylolique/aciens subsp.
plantarum phân íặp tại các vùng sinh thái khác nhau của Việt Nam, kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR
sử dụng 2 loại mồi ERIC và GTGs đã được thực hiện. Đối với mồi ERIC, phản ứng PCR đã tạo ra
11 loại băng ADN nằm trong khoảng kích thước từ 500 - 5.000 bp. số lượng băng ADN tạo ra cho
từne chùng giao động từ 6 đến 8 . Phương pháp phân tích tính tương đồng đã xác định được 8 loại
kiểu ?en với 3 nhóm chủng có cùng mô hình băng ADN là chúng CP 1604, CP 1801 và SP 1901;
chủng BM 0621 và CYS 0208; và chùng BM 0824, CYS 0101, CL)H OiOi, CDH 0102 và CDH
9
1701. Năm chủng còn lại gồm CYS 0816, CYS 0901, BM 1912, CYS 091 I và CPI205 sở hữu
riêng một loại kiểu gen khác nhau (Hlnh 1). Tucmg tự, đối với mồi GTG5, phản ứng PCR đã tạo ra
15 loại băng ADN nàm trong khoảng kích thước từ 500 - 5.000 bp. số lượng băng ADN tạo ra cho
từng chùng giao động từ 5 đến 8 . Phưong pháp phân tích tính tương đồng đã xác định được 13 loại
kiểu gen. Trong đó, chủng CDH 0101 và CDH 0102 được xếp vào cùng 1 nhóm (Hình 2).
Phân tích trìn h tự đa gen
Để kiểm chứng lại khả năng phân tách cùa 2 loại mồi ER[C và GTG 5 trong kỹ thuật dấu vân tay rep
- PCR, trình tự đa gen của chùng CP 1604 được phân tích và so sánh với chủng SP 1901. Trình tự
ADN 5.547 bp kết nối từ 6 gen gyrA, rpoB, pnrH, po ic, groEL và 16S rRNA của hai chủng này sai
khác nhau 83 nucleotide với số lượng sai khác lần lượt cho từng gen ià 25, 8 , 20, 17, 12 và 1
nucleotide. Trên cây phát sinh chùng loại, chúng SP 1901 và CP 1604 nàm tách biệt ở 2 nhóm B.
velezensis khác nhau (Hình 3). Điều đó chứng tỏ một phần là kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sử
dụng mồi G T G 5 cho kết quả phân tách tốt hơn và chính xác hon so với mồi ERIC khi phàn tích đa
dạng di truyền trẽn loài B. cimyloỉìque/aciens subsp. plantarum.
0
0
0 ố-i
L>c?vxciBotĩr
0 92
* ' I.
Hình 2. Sơ đồ cây về mối tưong đồng kiều gen xây dựng bằng kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sử
dụng mồi G T G 5 cùa các chủng B. amyloliquefaciens subsp. plcmtarum phân lập tại các vùng sinh
thái khác nhau cùa Việt Nam.
B. amylolique/aciens subsp. plantarum là một trong số 8 loài vi khuẩn thuộc nhóm B
subtilis [40]. Đây là loài được đề xuất đặt tên đầu tiên vào năm 2005 với tên gọi B. velezensis sau
khi phát hiện về khả năng sinh các chất hoạt động bề mặt và iipopeptide kháng khuẩn [41]. Nãm
2010, Madhaiyan và cộng sự đã mô tà loài B. methylotrophicus phân lập từ đất vùng rễ lúa ở Hàn
Quốc. Bên cạnh khả năng sử dụng methanol. triethylamine và ethanol như nguồn carbon, loài vi
khuẩn này còn có khá năng sinh các chất như IAA và ACC deaminase kích thích cây trồng phát
triển [35]. Năm 201 1, Boriss và cộng sự đã phát hiện ra một nhóm chúng vi khuẩn gần gũi với
chùng B. amyloliqiie/aciem FZB42 có khá năng sống nội cộne sinh trong rề Arabidopais trong khi
đó nhóm chùng vi khuẩn gần gũi với chửng B. amyloliqite/acien.s DSM 7 không có khá nãng này.
Dựa trên kêt quả lai DNA, B. amyloiiqueỊaclem đưực tách i‘ă thành 2 loài phụ !à B.
amvloliíịIIefaciens subsp. plantantm và B amvlolique/acien.s subsp. amylolique/aciens [4]. Gân đây,
Chung và cộng sự đã mô tá một loài B. oryzicola sống nội cộng sinh trong rễ lúa có khả năng kích
thích thực vật phát triển, sinh chất kháng nấm và vi khuẩn gây bệnh cây và có khả năng tăng cường
hệ miễn dịch cùa thực vật N01. Do sò' hữu nhiều đặc tính có lọi quan trọng cho cây trồng, các loài
10
vi khuân kè trên đà nhận dưọc nhiều quan tâm của các nhà nghiên cứu; hơn 30 chủng phân iập từ
cáo vùng sinh thái khác nhau đã được giải trình tự toàn bộ genome để tìm hiểu về mối tương tác
giữa vi khuẩn và vật chù sống nội cộng sinh [13]. Song song với đó, hệ thống phân loại cùa các loài
vi khuẩn kể trên cũng được kiểm chứng lại. So sánh in silico toàn bộ hệ genome cho thấy cà bốn
loài vi khuẩn kể trên đều có hệ số tương đồng ADN - ADN lớn hơn 84% (khác với chỉ số lai ADN ADN thực nghiệm trước đây). Chính vì vậy, B. methylotrophicus, B. amylolique/aciens subsp.
aniylolique/aciens và B. oryzicola được chi định lại về tên loài được đặt ban đầu là B. velezensis
[13].
100 B acillus veleiensis NRR L B-23189
B acillus veíeiensis NRR L B-23190
0.02
BaciHus veleien sis N R R L BD-621
Bacillus vele:ensis FZB42
B acillus veleiensis Mito-5-13
Bcicillus veleien sis Mito-7-4
100
99
B acillus ve!e:ensis T ik usei-14 - 1
SP 1901
100 178
B acillus veleien sis N R R L BD-557
Q
!f
1 0
ị-
Ụ
100
Bacillus veleien sìs Hitachioom iya-8-2
C P 1604
- B acillus veleien sis N RR L BD-545
93ị'oo - B acillus ve!ezensis N R R L B - 4 1 5 8 0
B acillus vele:ensis N R R L B-4257
00
BaciHus vele:ensis NRRL BD-569
100 B acillus velerensis NRRL BD-568
B acillus am ylolique/aciens NRR L BD-601
100
B acillus am vlolìque/aciens DSM 7
100
B acil/us cim \'loliquefaciens N R R L B-14393
100
Bcicillus atrophaeus N R R l NRS-213
BaciHus m ojcivensis N RR L B - 14698
100
BaciHus val/ism ortis N R R L B - 14890
100
93
BaciHus sublilis subsp. su b lilis N R R L NRS -744
100
B acillus lequilensis N R R L B-41771
94
I--------- BaciHus subtilis subsp. inaquosorum NR.RL B-23052
100
—
B acillus su b ú lis subsp. sp i:i:e n ii N R R L B-23049
Bcicillus licheniform is DSM 13
Bacillus sonorensis N RR L B-23154
100
Lĩ
!! .
O C IL I I I I I ò
... 7. . XỊDOf Kinc o m
ụ u iìiịiu S ín K K L
B acillus ce re u í A T C C 14579
Hinh 3. Mối quan hệ giữa chúng SP 1901 và CP 1604 trên cây phát sinh chủng loại và các loài vi
khuân thuộc nhóm Bacillus subtilis xây dựng dựa trên đoạn ADN 5.547 bp kết nối từ 6 gen gyrA ,
rpoB ,parH , p o ic, groEL và I 6 S rRNA.
Tổ họp kết quà cùa kỹ thuật rep - PCR sư dụng 2 loại mồi ERiC và GTG;, cho thấy có 14
loại kiều gen trong số 15 chủng tí. amylolique/aciens subsp. plantarum nghiên cứu. Chi có duy nhất
2 chủng CĐH 0101 và CĐH 0102 phân lập từ I mẫu đất có kiểu gen tương đồng nhau. Kết quả rep
- PCR được kiểm chuẩn bằng kỹ thuật giải trình tự đa gen khi 2 chùng SP 1901 và CĐH 1604 phân
tách rõ ràng trên cây phát sinh chùng loại. Điều đó chứng tò có sự đa dạng rất cao về mặt di truyền
của các chủng B. velezensis phân lập ở các vùng sinh thái khác nhau ở Việt Nam.
Tối ưu điều kiện lên men
Với 6 môi trường nhân giống được sử dụng trong nghiên cứu (TSB, 1/5 TSB, NA, 1/5 NA,
LB, 1/5 LB), chùng CPỈ604 sinh trường tốt nhất trên môi trường TSB với giá trị ODéoonm sau 24
giờ nuôi lắc đạt 2 ,2 ; đồng thòi đây cũng là môi trường cho hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm tốt
nhất (D-d lần lượt là 30 mm và 9 mm), trong khi đó với môi trường 1/5 TSB chùng vi khuẩn này
sinh trưởng kém hơn rõ rệt (ODóoonm = 1,4; hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm D-d tương ứng là
20 mm và 5 mm). Tương tự, trên môi trường LB và NA, chung vi khuẩn sinh trưởng và sinh chất
kháne khuẩn và kháng nấm cao hơn đáng kể so với môi trường tương ứng 1/5 LB và 1/5 NA; tuy
nhiên tất cà các chi số trên đều nhỏ hơn trên môi trường TSB. Do vậy chúng tôi chọn môi trường
TSB cho những nghiên cứu về sau.
Nhiệt độ được xem là một yếu tố quan trọng anh hưởng đến khá năng sinh trưởng cũng như
kha năng sinh các chất có hoạt tính sinh học cùa vi sinh vật. Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa
chọn dải nhiệt độ từ 20°c đến 40°c để khảo sát ảnh hướng cùa nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng và
hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cùa chủng CP1604. Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiệt độ 35°c
thích hợp nhất cho sinh trưởng của chủng C PI604 với giá trị OD 6 0 0 nm= 2 . 5 ; tuy nhiên hoạt tính
kháng khuẩn và kháng nấm lại thể hiện tốt nhất ờ nhiệt độ 30°c, giá trị D-d tương ứng là 29 mm và
9 mm. Với mục đích tối ưu điều kiện lên men thu chất kháng khuẩn và kháng nấm, nhiệt độ 30°c
được lựa chọn để cho nghiên cứu tiếp theo.
Trong lên men, tốc độ khuấy có ảnh hưởng nhất định đến sinh trưởng cũng như hoạt tính
sinh học của chủng vi sinh vật. Trong nghiên cứu này, chủng ẾPI604 sinh trưởng tốt nhât
(OD 6 0 0 nm= 2 , 8 ) khi được nuôi khuấy ò' tốc độ 150 vòng/phút, đây cũng là điều kiện thích hợp cho
khà năng sinh chất kháng khuẩn và kháng nấm (D-d tương ứng 34 mm và 12 mm).
Tốc độ thông khí là một yếu tố ảnh hưởng then chốt đến sinh trưởng cùa vi sinh vật hiếu khí
nói chung và nhóm vi khuẩn Bacillus nói riêng. Với bốn tỉ lệ thông khí 50, 75, 100 và 125% được
nghiên cứu, kết quá thí nghiệm cho thấy chủng CP1604 sinh trường tốt nhất ở ti lệ thông khí 75%
(ODộ0 0 mn= 3 .0), ti lệ thông khí này cũng thích hợp nhất với khả năng sinh chất có hoạt tính kháng
khuẩn và kháng nấm cùa chung vi khuẩn nghiên cứu (D-d tương ứng là 37 mm và 15 mm).
Trong nghiên cứu về ánh hưởng của thòi gian đến sinh trướng và khả năng sinh chất kháng
khuẩn và kháng nấm. tại thời điểm sau 48 giò' lên men, chúng vi khuẩn nghiên cứu đạt giá trị
ODôoonm cực đại (2.9); tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn lại cao nhất sau 36 giờ nuôi (D-d=34 mm),
hoạt tính kháng nấm cao nhất ở cả giờ nuôi 36 và 48 (D-d= 14 mm).
Như vậy, trong nghiên cứu này, điều kiện lên men thích họp cho chủng CPI604 là môi trường TSB,
nhiệt độ 30°c, tốc độ khuấy 150 vòng/phút, tốc độ thông khí là 75%, thời gian lên men 36 giờ.
12
1
CìZ0L.
Õ
35*c
N h iệ t đ ộ n u ò i cấ y
M ò i tr ư ờ n g n uô i cấ y
(b)
(a)
3.0
X
ỉ.S Ĩ3
;.of
p
3
Hi
1'.Ị
ĩ
(phút)
Fusarium
Xcinthomonas
oxysporum
oryzae
30
8
25
60
8
25
90
8
25
120
8
25
30
8
24
60
8
2 0
90
8
2 0
120
8
2 0
30
8
2 0
60
8
15
90
8
10
120
8
7
8
25
60°c
80°c
10 0
°c
Đối chứng
Bảng 7. K.hà nãng bền pH cùa chất kháng nấm và chất kháng khuẩn
Hoạt tính đối kháng (D - d, mm)
Giá trị pH xử lý
Fusarium
oxysporum
Xanthomonas
oryzae
pH 3,0
3
2 0
pH 4,0
5
24
pH 5,0
6
25
pH 6,0
7
25
pH 7,0
8
25
pH 8,0
8
25
pH 9,0
8
T?
Lủ
Đối chứng
8
25
Bảng 8 . Khả năng bền với các enzyme thủy phân
Hoạt tính đối kháng (D - d, mm)
Enzyme
Amylase
Chymotrypsin
. . . .
Fusarium
oxysporum
Xanthomonas
oryzae
8
25
'-Ì r
8
—
......
Lipase
- ........... ............................... .
8
25
Protease
8
25
Trypsin
8
25
Đối chứng
8
25
B. amylolique/aciens subsp. plantarum (hay còn gọi là B. velezensis, B. methylotrophicus
hoặc B. oryzicola) là một loài vi khuẩn sở hữu nhiều đặc tính quý có lợi cho cây trông, đặc biệt là
khả nãng sinh các chất kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây [13]. Do đó, nhiều chùng B.
am yloliquefaciem subsp. plantarum phân lập từ các vùng sinh thái khác nhau đã được ứng dụng
trong đấu tranh sinh học để phòng trừ bệnh cây. Nhiều chất có hoạt tính sinh học từ loài B.
velezensis đã đưọc nghiên cứu nhăm làm rõ bàn chât câu trúc hóa học cũng như cơ chê tân công của
chất kháng sinh đến các vị trí đích cùa vi sinh vật gây bệnh. Từ bộ sưu tầm chùng B.
amyloliqite/aciens subsp. plantarum phân lập ở các vùng sinh thái khác nhau tại Việt Nam, chủng
CP 1604 chứng minh có khả năng sinh chất kháng nấm và kháng khuân mạnh kháng lại các ioại
nấm hại cây tà F. oxysporum , s. hydrophilum, R. solani, p. ccipsici và vi khuẩn gây bệnh bạc lá X.
oryzae. Chất hoạt tính này đều có thể tách chiết vói hiệu quá tương đương bằng các phương pháp
hấp phụ trong hạt amberlite-XAD7, chiết trong ethanol từ dịch đông khô, tủa ở pH thấp hoặc chiết
băng các dung môi hữu CO' là 1 - butanol và 2 - pentanol. Kêt quà tinh sạch băng HPLC cho thây
chất kháng nấm và chất kháng khuẩn là hai chất khác nhau được thôi ra ở hai thời điêm khác nhau.
Phân tích khối phổ cho thấy, bên cạnh các mảnh phổ khối được quan sát thấy trên bàn phổ ion
dưong, mảnh có khối lượng phân tử giống iturin A (M + H* = 1043) được tìm thấy trong phân đoạn
chất có hoạt tính kháng nấm. Tương tự mành có khối lượng phân tử giống macrolactin A (M - H T =
401) được phát hiện thấy trên bàn phổ ion ầm của phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn. Điều đó
chứng tỏ chủng CP 1604 sản sinh đông thòi 2 chất kháng nâm và kháng khuân trong dịch nuôi cây
và sự hiệp đồng của 2 chất này giúp cho dịch nuôi cấy của chủng CP 1604 có hoạt tính kháng nấm
và vi khuẩn phổ rộng.
Hình 6 . Hoạt tính của
nhau. Hoạt tính kháng
phút (2), khi xử lý ở
trong 90 phút (5) và
trong 30 phút (!), 60
chất kháng nấm và chất kháng khuán khi xư lý nhiệt ờ các nhiệt độ khác
nấm F. oxysporum (A) khi xử lý ở nhiệt độ 60°c trong 90 phút (1) và 120
nhiệt độ 80°c trong 90 phút (3) và 120 phút (4), khi xử lý ở nhiệt độ100°c
120 phút ( 6 ). Hoạt tính kháng khuẩn X. uryxae (B) khi xử lý ở nhiệt độ 100°c
phút (2), 90 nhút í 3ì và n o nhút Í4Ì. ĐC là đối chứng.
ĐAI HỌC QUỐC GIA HA NỘI
I
TRUNG TAM- t h ô n g tin thư v iể_ n_ j:
I_ũĐũAmnỉẤậ__ j
17
Lipopeptide là các chầt kháng sinh chính sản sinh từ vi khuẩn Bacillus và các chi có quan hệ
gần gũi như Paenibacillus và Brevibacillus. c hất kháng sinh này được cấu tạo từ 2 thành phần
chính là chuỗi peptide mạch thẳng hoặc vòng liên kết với phần mạch acid béo tại vị trí đầu N cùa
peptide. Trong số các lipopeptide đã công bố, iturin là được xếp vào nhỏm không mang điện tích
dương, có 7 amino acid khép vòng bởi một liên kết amide giữa đầu N của phân tử p - amino acid
béo và đầu c của amino acid cuối [11]. Iturin thường được tách chiết từ các loài vi khuẩn thuộc
nhóm B. subtilis, trong đó có B. amyloliqiie/aciens subsp. plantarum [37]. Dựa trên sự khác nhau về
thành phần cấu tạo chuỗi amino acid và cấu trúc của phân từ acid béo, lớp iturin được chia ra làm
nhiều loại với các tên gọi khác nhau là iturin, mixirin, subtulene, mycosubtilin, mojavensin và
bacillomycin. Kháng sinh lớp iturin có hoạt tính kháng nấm mạnh nhưng không có hoạt tính kháng
khuẩn, iturin tấn công vào thành phần sterol trong màng tế bào nấm, làm tăng tính thấm của ion
kali, phá vỡ màng tế bào, làm thoát hoặc bất hoạt các thành phần trong tế bào tế bào nấm, dẫn đến
tiêu diệt tế bào nấm [11, 20]. Theo các công bố trước đây, iturin A có phô hoạt tính kháng nâm
rộng, kháng lại các loại nấm như Fusarium, Rhizoctonia, Penicillium, Aspergillus và Pyricularia
[19, 42]. Iturin A sản sinh từ chùng CP 1604 cùng có phổ hoạt tính khang nấm mạnh kháng lại F.
oxysporurn, Sclerotium hydrophilum, Rhizoctonia soìani, Phytophthorứ capsici, Aspergillus oryzae,
Aspergillus rtiger và Saccharomyces cerevisiae.
Bên cạnh lipupeptide, polyketide cũng là một trong những chất trao đổi chính thường đưọ'c
tim thấy trong dịch nuôi cấy cùa vi khuẩn Bacillus. Polyketide thường có hoạt tính kháng khuẩn,
kháng virus và kháng tế bào ung thư [43]. Phân tích ADN của chủng B. amylolique/ciciens subsp.
plantarum FZB42 cho thấy hệ genome có 3 nhóm gene l à p k s \,p k s 2 v à p k sì quy định tổng họp các
polyketide lần lưọt là bacilỉaene, macrolactin và difficidin [6 , 43]. Macrolactin là một iactone dạng
vòng có 24 phân tử carbon liên kết với 1 hydrocarbon tại vị trí carbon số 7. Đây là chất được phát
hiện lần đầu tiên vào năm 1989 trong dịch nuôi cấy của một loài vi khuẩn biển và đến nay có
khoảng gần 20 loại macrolãctin đã được công bố [5, 21]. Trong số đó, macrolatin A có hoạt tính
kháng vi khuẩn mạnh nhất, đặc biệt là khả năng đối kháng với một số loại vi khuẩn kháng thuốc
kháng sinh như Siaphylococcus aureus kháng methicillin và Enterococcus kháng vancomycin [31,
39]. Macrolactin A đã đưọc phát hiện trong dịch nuôi cấy của một số chùng B. amylolique/acỉens
subsp. planlarnm như chùng GAI [ỉ] và ESB-2 [24]. Macrolactin A sàn sinh từ các chủng B.
amvlolique/aciens subsp. planiarum như HR62 và NJN - 6 đã được chứng minh có hoạt tính kháng
lại các loại vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstoma solanacearnm [27, 49]. Macrolactin A sàn sinh từ
chùng CP 1604 cũng chửng minh có hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh bạc lá X. oryzae. Hơn nữa,
dịch nuôi cấy của chủng CP 1604 cũng có hoạt tính kháng vi khuẩn kháng thuốc s. aureus và E.
/aecalis.
Lipopeptiđe từ vi khuẩn Bacillus là các chất trao đổi bậc 2 được sàn sinh theo con đường
sinh tổng peptide không cần ribosome (nonribosomally synthesized peptide) nhò' sự có mặt của
nhóm đa enzyme non-ribosomal peptide synthetases (NR.PS). Chất kháng sinh này chứa hồn họp
các amino acid dạng D và dạng L, giúp cho chất kháng sinh bền vói các enzyme thủy phân [11].
Điều đó hoàn toàn đúng với chất kháng nấm và chất kháng khuẩn sinh ra tư chùng B
amylolique/aciens subsp. plantarum CP 1604. Cà hai chất đều bền với một loạt các protease như
trypsin, a-chymotrvpsin, và proteinase K. Ngoài ra, hai chất này vẫn duy trì hoạt tính khi xử lý ở
pH bazơ. Iturin A bền nhiệt độ hơn so với macrolactin A.
Tliử nghiệm tính an toàn của chất klìáng nấm và chất kháng khuẩn
Bước đầu thử nghiệm tính an toàn cùa chất kháng nấm và chất kháng khuân, chúng tôi tiến
hành đánh giá sơ bộ ành hưởng của các chất này tới sự sinh trưởng và phát triển của một số loại cây
trồng. Qua đó. chất kháng nấm và kháng khuẩn thô được tách chiết bằng 1 - butanol kết họp với hạt
amberlite - XAD7 từ dịch nuôi cấy của chùng CP 1604 được pha tới nồng độ ức chế tối thiểu nấm
F. oxysporum và được đưa vào thư nghiệm.
18
- Xem thêm -
.PDF 
73 
296 
129 
