Tài liệu Nghiên cứu để xác định hàm lượng tannin của cây trang(kandelia obovata sheue,liu&yong) và cây đước

Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài. Rừng ngập mặn (RNM) là một hệ sinh thái độc đáo về các nhân tố vô sinh (nhiệt độ, ánh sáng, thuỷ triều ...) và hữu sinh (thực vật, động vật, vi sinh vật). RNM có vai trò hết sức to lớn với việc phòng chống thiên tai, điều hoà khí hậu trong vùng. Theo tài liệu của Phan Nguyên Hồng (1999) [8] đã viết, Blasco (1975) nghiên cứu khí hậu và vi khí hậu rừng đó cú nhận xét: các quần xã rừng ngập mặn là một tác nhân làm cho khí hậu dịu mát hơn, giảm nhiệt độ tối đa và biên độ nhiệt đồng thời RNM cũn cú vai trò quan trọng trong việc bảo vệ môi trường. Bên cạnh vai trò to lớn về sinh thái, RNM cũn cú vai trò quan trọng về kinh tế-xã hội. RNM là nơi cung cấp cho người dân các nguồn lợi như: thuỷ hải sản vừa có giá trị kinh tế vừa là nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng, cung cấp các loại lâm sản có giá trị ví dụ: gỗ dùng làm vật liệu xây dựng hoặc là củi đun. Không chỉ có thế RNM là nguồn cung cấp thực vật làm dược liệu. Nhân dân Việt Nam và các nước có rừng ngập mặn từ lâu đã sử dụng cây ngập mặn làm thuốc nam chữa các bệnh thông thường, đặc biệt là trong hai cuộc chiến tranh Đông Dương vừa qua. Là vùng căn cứ địa kháng chiến bị địch bao vây, điều kiện khí hậu ẩm ướt, vệ sinh kộm nờn có nhiều bệnh tật. Nhưng nhờ sử dụng thuốc từ cỏc cõy trong vùng RNM nờn đó phát hiện nhiều loài cây chữa bệnh có giá trị như: cõy rỏng chữa bỏng, mụn nhọt; cui biển chữa ỉa chảy, kiết lị; sài hồ nam chữa đau đầu, giảm sốt…[8] Tuy có vai trò to lớn như vậy nhưng hiện nay RNM đang giảm sút nhanh chóng do các nguyên nhân như: phá rừng làm đầm nuôi tôm, khai thác quá mức, phá rừng lấy đất sản xuất nông nghiệp, khai thác khoáng sản, đô thị hoá, làm đường xá... Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 1 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà Diện tích RNM được công bố vào các năm 1943, 1962, 1982 và 2000. Theo số liệu năm 2000 diện tích rừng ngập mặn chỉ bằng 38% so với năm 1943. Điều này cho thấy tốc độ mất rừng ngập mặn Việt Nam là rất cao, khoảng 4.400ha/năm [4]. Với nhịp điệu phát triển không ngừng của xã hội về mọi mặt thì nhu cầu của con người về ăn, ở, mặc, giải trớ...ngày càng tăng lên. Cùng với sự phát triển đó kéo theo hàng loạt các vấn đề toàn cầu phải lo lắng như: ô nhiễm môi trường ngày càng tăng, bệnh tật phỏt triển,...gõy sức ép cho xã hội trong đó có ngành y tế. Nước ta hầu như phải nhập nguyên liệu sản xuất thuốc hoặc thuốc đã thành phẩm từ nước ngoài với giá rất cao. Trong khi đó nguồn nguyên liệu nước ta rất nhiều trong đó có tanin là nguồn nguyên liệu có giá trị to lớn trong y học như: chữa tiêu chảy, viêm ruột, chữa ngộ độc tiờu hoỏ, chữa trĩ,...và có giá trị trong một số ngành khác như: thuộc da, nhuộm vải, kỹ nghệ in, chế tạo mực,...Một trong những nguồn nguyên liệu giàu tanin có thể tiến hành khai thác đó là những cây rừng ngập mặn với diện tích lớn chủ yếu là cỏc cõy họ Đước. Nhưng khi khai thác cây ngập mặn người ta mới chỉ chú trọng đến việc lấy gỗ thân phục vụ nhu cầu chất đốt và xây dựng cũn cỏc phần khỏc thỡ bỏ phí. Hiện nay, các đề tài nghiên cứu về tanin ở các cây rừng ngập mặn là rất ít, trong khi nước ta có diện tích rừng ngập mặn khá lớn khoảng hơn 200.000ha với thành phần loài tuy không nhiều nhưng số loài cây có khả năng cung cấp tanin thì có số lượng rất lớn như: trang, đước, vẹt... Xuất phát từ lí do trên cùng với lòng say mê nghiên cứu và yêu thích khoa học và để góp phần xác định khả năng cung cấp tanin từ các cây rừng ngập mặn phục vụ cho nghiên cứu, chiết xuất được dễ dàng hơn chúng tôi chọn đề tài: “Nghiờn cứu để xác định hàm lượng tannin của cây trang (Kandelia obovata Sheue, Liu & Yong) và cây đước (Rhizophora stylosa Griff) ở một số độ tuổi khác nhau tại rừng ngập mặn huyện Giao Thuỷ, tỉnh Nam Định”. Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 2 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà 2. Mục đích nghiên cứu. - Nghiên cứu hàm lượng tanin trong các bộ phận khác nhau của cây đước vòi (R. stylosa) và cây trang (K. obovata) ở các độ tuổi khác nhau. - Nghiên cứu hàm lượng tanin để chiết xuất. - Cung cấp số liệu, cơ sở khoa học cho các ngành khác như y học, công nghệ thuộc da...khai thác tanin. 3. Nội dung nghiên cứu. - Định tính tanin trong các mẫu nguyên liệu nghiên cứu. - Xác định hàm lượng và sự biến động tanin trong một số cơ quan của cây trong các mẫu nguyên liệu nghiên cứu. Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 3 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Những nghiên cứu về tanin Từ “tanin” được dùng đầu tiên vào năm 1976 để chỉ những chất có mặt trong dịch chiết từ thực vật có khả năng kết hợp với protein của da sống động vật làm cho da biến thành da thuộc không thối và bền [2]. Năm 1879 Pronst đã chế được tanin tinh khiết và từ năm 1978 đã chiết xuất được tanin. Tanin có cấu trúc phức tạp, dựa vào cấu trúc hoá học người ta chia tanin thành 2 loại chính tanin thuỷ phân (tanin pyrogallic) và tanin không thuỷ phân được (tanin pyrocatechic). Người ta thấy nhóm tanin này phổ biến trong thiên nhiên có hoạt tính dược lý cao nên ngày càng được chú ý [5]. Chúng tôi tìm thấy một số công trình nghiên cứu về tanin chủ yếu là từ năm 1995 trở lại đõy. Cỏc công trình này chủ yếu nghiên cứu trên cây nước ngọt, đối với cây ngập mặn chúng tôi tìm được một công trình duy nhất của Hoàng Thị Oanh năm 2008. Năm 1995, Triệu Duy Điệt [5] khi nghiên cứu thành phần hoá học cây xoan trà (Choerospondias axillaceris Burttet et Hill) bằng các phản ứng định tính đã xác định trong cây xoan trà có chứa tanin catechic là hợp chất chủ yếu có tác dụng chữa bỏng, phần đơn phân tử có tác dụng làm bền vững thành mạch, thải chất phóng xạ ra khỏi cơ thể và có tác dụng chống oxy hoá mạnh. Và tác giả cũng đã xác định được hàm lượng tanin trong vỏ thân là cao nhất đạt 29,26%, trong lá thấp nhất đạt 14,65% và hàm lượng tanin trong vỏ thân ở các độ tuổi có sự khác nhau, theo tác giả cây càng già hàm lượng tanin càng cao, vỏ cây 7 tuổi hàm lượng tanin là thấp nhất đạt 17,55%, vỏ cây 20 tuổi đạt 24,5%, vỏ cây 35 tuổi là cao nhất đạt 31,54%. Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 4 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà Cũng vào năm 1995, Phùng Thị Vinh [20] khi nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng sinh học của cây chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch) đã xác định được tanin trong chố dõy là tanin catechic và định lượng được hàm lượng tanin trong cây chiếm từ 10,82% - 13,3%. Đến năm 1998, Hà Viết Quý [14] khi nghiên cứu thành phần falavonoid và tanin có trong cây Geranium thunbergii Sieb. Et zucc, đã tiến hành nghiên cứu chung toàn bộ phần trên mặt đất của cây, bằng các phản ứng định tính đã xác định được trong dịch chiết của cõy có tanin pyrogallic và cũng đã xác định được hàm lượng tanin trong cây là tương đối cao (14,30%), theo tác giả đây có thể là một trong những hợp chất chính của cây. Đến 2001, Phạm Thị Thanh [15]cũng đã xác định được trong đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour) có chứa tanin pyrogallic và xác định hàm lượng tanin trong cây theo phương pháp bột da chiếm 10,64%. Năm 2002, Vương Thị Hồng Vân [18] khi nghiên cứu chố dõy Sapa ( Ampelopsis cantoniensis Planch) cũng đã xác định được trong chố cú chứa tanin catechic giống như nghiên cứu của Phùng Thị Vinh năm 1995, đặc biệt tác giả đó xỏc dịnh và so sánh hàm lượng tanin trong cây chè dây ở Sapa và Cao Bằng, theo tác giả hàm lượng tanin trong lá chè dây thu hái ở Cao Bằng (11,71%) cao hơn ở Sapa (8,02%). Năm 2003, Nguyễn Thái An [1] nghiên cứu cây đơn lá đỏ () cũng xác định được trong cõy cú chứa tanin pyrogallic giống với kết quả của Phạm Thị Thanh 2001 và tác giả tiến hành nghiên cứu trờn cỏc mẫu thu hái ở thời gian khác nhau, bộ phận khác nhau và cách xử lý mẫu khác nhau đã đi đến kết luận: Hàm lượng tanin có trong các mẫu nghiên cứu đều khá cao từ 9% - 11%, hàm lượng này có sự thay đổi theo thời gian, đạt cao nhất vào khoảng thời gian tháng 4, 5, 6 khi cây đang trong thời kỳ ra hoa, đặc biệt vào tháng 5 hàm lượng tanin có thể đạt là 11,68%. Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 5 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà Năm 2004, Phạm Thuỳ Dương [6] lại tiếp tục nghiên cứu tanin trong chố dõy (Ampelopsis cantoniensis Planch), tỏc giả không đơn thuần tiến hành định tính và định lượng hàm lượng tanin trong cây mà đã đề ra các phương pháp chiết xuất tanin từ lá chè dây, so sánh hàm lượng chiết được tác giả đã xác định được phương pháp chiết xuất đạt hiệu quả cao. Năm 2008, Nguyễn Thuý Hằng [7] khi nghiên cứu thành phần hoá học của cây cườm rụng hoa dài (Ehretia Longiflorachamp) đã đề cập đến tanin nhưng mới chỉ mang tính chất định tính, chỉ xác định được trong cõy cú chứa tanin mà chưa phân loại được tanin và chưa xác định được hàm lượng tanin trong cây. Cũng vào năm 2008, Hoàng Thị Oanh [12] nghiên cứu nguồn nguyên liệu dùng để chiết xuất tanin ở khu vực rừng ngập mặn Giao Thuỷ, Nam Định. Tác giả đã tiến hành nghiên cứu trên ba đối tượng là cây trang (K. cadel L Durce), cây đước vòi (R. stylosa Griff) và cây vẹt dù (B. gymnorrhiza (L.) Lamk). Khi định lượng bằng phương pháp bột da đã xác định được hàm lượng tanin trong rễ, thân, cành và lá của các đối tượng nghiên cứu. Đây là công trình duy nhất tiến hành trờn cõy ngập mặn chúng tôi tỡm thấy nhưng tác giả mới chỉ định lượng trờn cỏc cõy chung chung mà chưa phân ra các độ tuổi khác nhau. Chính vì vậy chúng tôi cũng tiến hành nghiên cứu trên cây đước vòi và cây trang nhưng ở một số độ tuổi khác nhau và tiến hành định lượng bằng phương pháp khác (PP oxy hoá). 1.2. Khái niệm về tanin. Tanin là những hợp chất của polyphenol có trong thực vật, có vị chát được phát hiện dương tính với thớ nghiờm thuộc da. Định nghĩa này không bao gồm những chất phenol đơn giản hay gặp cùng tanin như acid gallic, các chất catechic, acid chlorogenic…; mặc dù những chất này ở điều kiện nhất định có thể cho kết tủa với gelatin và một phần nào được giữ trên bột da sống chuẩn. Chúng được gọi là pseudotanin. Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 6 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà Cơ chế thuộc da: do tanin có nhiều nhóm –OH phenol, tạo nhiều dây nối hydro với mạch polypeotid của protein, do đó da sống động vật biến thành da thuộc không thối và bền. Phân tử tanin càng lớn thì sự kết hợp với protein càng chặt. Phân tử lượng tanin phần lớn từ 500 – 5000. HN C O H O Dây nối hydro giữa tanin và protein [2]. 1.3. Cấu trỳc hoá học của tannin. Cấu trúc của tanin phức tạp được chia làm 2 loại: - Tanin thuỷ phân được (tanin pyrogallic). - Tanin không thuỷ phân được (tanin pyrocatechic). 1.3.1. Tanin thuỷ phân được Khi thuỷ phân bằng acid hoặc bằng enzyme tanase thì giải phóng ra phần đường là glucose, đôi khi cũng gặp những loại đường đặc biệt. Phần không phải đường là các acid, acid hay gặp là acid gallic. Các acid gallic nối với nhau băng dây nối depsid tạo thành acid digallic, acd trigallic: OH OH HO OH HOOC OH O OH CO OH COOH OH Acid gallic Acid digallic Ngoài acid gallic cũn cú cỏc acid khác như acid ellagic, acid luteolic… Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 7 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà O OH O OH HOOC HO OH HO OH HO O HO HO O C O C O Acid ellagic Acid luteolic Phần đường và phần không đường nối với nhau theo dây nối ester nên người ta gọi loại này là Pseudoglycosid. - Khi cất khô ở 180 – 2000C thì thu được pyrogalol. - Cho tủa màu xanh đen với muối sắt III. - Thường dễ tan trong nước. 1.3.2. Tanin ngưng tụ. Được hình thành từ những đơn phân cơ bản là catechin và epicatechin, đó là hai chất đồng phân của nhau. Phân tử cơ bản thuộc loại flavan có cacbon số 4 là nhóm methylen (-CH 2-) dễ ngưng tụ thành các polymer. OH OH OH HO OH O HO O OH OH OH OH Epicatechin Catechin Sự ngưng tụ thường xảy ra ở dây nối carbon – carbon, ví dụ giữa C8 của catechin và C4 của epicatechin tạo thành dimer như sau: Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 8 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà OH OH HO O OH OH OH OH HO O OH OH Epicatechin- (4β-8)-catechin - Cho tủa xanh với muối sắt III. - Khi cất khụ thỡ cho pyrocatechin. - Khó tan trong nước hơn tanin thuỷ phân. 1.4. Tính chất của tanin. 1.4.1. Tính chất vật lý: - Tanin hầu như không tan trong các dung môi kém phân cực, tan được trong cồn loãng, glycerin, ceton, tốt nhất là nước nóng. - Tanin có dạng bột vô định hình, màu vàng nhạt hay vàng nâu nhạt, mùi đặc biệt, vị chát sít. - Khi thuỷ phân tanin pyrogallic trong môi trường acid thu được acid gallic. 1.4.2. Tính chất hoá học. - Có tính acid. - Gây tủa một số muối kim loại (sắt III clorid, chì acetat…), alcaloid, albumin, gelatin. - Tạo nhiều dây nối hydro với mạch polypeotid của protein, do đó da sống động vật biến thành da thuộc bền và không thối. Có thể dựa vào kết tủa với muối sắt để xác định tanin trên vi phẫu. Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 9 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà 1.5. Tác dụng và công dụng của tanin * Trong cây: - Tanin tham gia vào quá trình trao đổi chất, các quá trình oxy hoá khử. - Là những chất đa phenol, tanin có tính kháng khuẩn nờn cú vai trò bảo vệ cho cây. * Trong y học: - Dung dịch tanin kết hợp với protein tạo thành trên màng niêm mạc nên có tác dụng làm thuốc săn da. - Tanin là thành phầ n chính có tác du ̣ng chữa bỏng, vế t thương do tính chấ t của nó khi tác du ̣ng với protein của huyế t tương ta ̣o thành tủa tanat protein. Lớp tủa này sau 10-15 phút se khô thành màng mỏng che phủ kín vế t thương, vế t bỏng, ngăn không cho dich ̣ huyế t tương thoát ra và ngăn cách vế t thương với môi trường bên ngoài, đế n khi liề n se ̣o, màng thuố c tự bong ra [5]. - Tanin còn có tác dụng kháng khuẩn nên dùng làm thuốc súc miệng khi niêm mạc miệng, họng bị viờm loột hoặc ổ loét do nằm lâu ngày; tanin có thể dùng để chữa tiêu chảy. - Tanin kết hợp tạo tủa với muối kim loại nặng và với alcaloid nờn dựng chữa ngộ độc đường tiờu hoỏ. - Tanin có tác dụng làm đụng mỏu nờn dựng đắp lên vết thương cầm máu, chữa trĩ, rò hậu môn. - Cú thể dùng tanin tinh chế pha trong nước thành dung dịch 1-2% hoặc thuốc bột, thuốc mỡ 10-20%. Khi dùng trong (uống) nờn dựng chế phẩm tanalbumin hay tanalbin; đây là dạng kết hợp tanin và albumin. Tanalbumin có màu vàng nhạt, không mùi, không vị, chứa 50% tanin, không hoà tan trong nước và trong cồn, không bị dịch vị phân huỷ; khi vào đến ruột gặp môi trường kiềm, tanin mới giải phóng, tránh được tác dụng của tanin trên niêm mạc thực quản, dạ dày, gây khó chịu và rối loạn tiờu hoỏ. Ngoài ra Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 10 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà cũn cú dạng tanatgelatin dùng như tanalbumin, tanoform (tanin + formol) dựng bôi ngoài [2]. * Trong ngành khác: - Tanin tạo màu với muối sắt (II) do đó người ta sử dụng tanin để sản xuất mực viết, dùng trong kỹ nghệ in. - Làm thuần khiết rượu bia. - Tanin dùng làm hoá chất thuộc da trong công nghệ thuộc da. - Dùng nhuộm vải sợi, lưới đỏnh cỏ…[12]. Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 11 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu. - Đối tượng nghiên cứu là cây trang Kandelia obovata Sheue, Liu & Yong và cây đước vòi Rhizophora stylosa Griff được trồng vào năm 1997 (11 tuổi), 1998 (10 tuổi) và 1999 (9 tuổi). - Đặc điểm hình thái của đối tượng nghiên cứu: 2.1.1. Đước vòi (đước chằng) Tên khoa học: Rhizophora stylosa Giff Hình 2.1: Cây đước vòi Rhizophora stylosa Griff Họ Đước: Rhizophoraceae Cây gỗ nhỏ cao2-8m Chúp lá có mũi nhọn, cuống lá dài 1,5-2cm. Lỏ cú phiến dày hình bầu dục, mặt trên màu lục đậm, mặt dưới màu lục nhạt. Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 12 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà Cụm hoa tỏn, cú 3-4 nhánh, mỗi nhỏnh cú 5-8 hoa, cuống hoa dài 34cm. Đài hoa 4 thuỳ màu vàng pha xanh lá cây, 4 cánh hoa cong vào trong có lông mịn, 8 nhị. Bầu hạ, vòi nhuỵ hình sợi, dài 4-6mm, đầu nhuỵ chẻ thành hai thuỳ. Quả có hình quả lê nhỏ khi còn non, trơn, màu nâu, trụ mầm dài 3045cm. Trụ mầm chín rộ vào tháng 7-8. Phân bố: ở cả 3 miền Bắc, Trung, Nam. Công dụng: gỗ thường được dùng làm củi, cây được trồng để chắn sóng bảo vệ đê điều. Trụ mầm và vỏ cây có thể làm thuốc chữa các bệnh đường tiờu hoỏ, ngoài ra cũn cú thể khai thác tanin để nhuộm lưới [16]. 2.1.2. Trang Tên khoa học: Kandelia obovata Sheue, Liu & Yong. Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 13 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà Họ Đước: Rhizophoraceae Hình 2.2: Cây trang Kandelia obovata Sheue, Liu & Yong. Chi Trang (Kandelia) hiện có 2 loài: K. candel (L.) Druce phân bố ở các nước Đông Nam Á, Brunei, Ấn Độ, Malaysia,…khụng chịu được lạnh và loài K.obovata Sheue, Liu & Yong chịu được lạnh về mùa đông, phân Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 14 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà bố ở Trung Quốc (Hải Nam, Phúc Kiến, Đài Loan), Nam Nhật Bản và Bắc Việt Nam. Cây gỗ nhỏ cao 4-10m, gốc rộng hình thành bạnh gốc . Lá mọc đối, hình bầu dục thuôn hay hỡnh mỏc hẹp, đầu lá thường bầu mộp nguyờn, kích thước 7-12cm x 3-5,5cm. Cụm hoa tán, cuống dài 2-4cm, 5 lá đài màu lục, hoa 5 cánh màu trắng, mỏng, xẻ thuỳ nhỏ. Bầu một buồng có 6 noón đớnh trung trụ, đầu nhuỵ 2 thuỳ. Hoa có đĩa mật là nguồn lợi nuôi ong. Quả thai sinh, trụ mầm dài 15-35cm, trụ mầm hình trụ không đều [9]. Công dụng: gỗ được dùng làm củi, cây trồng để bảo vệ đê biển, nuôi ong lấy mật. 2.2. Đặc điểm tự nhiên khu vực thu mẫu. 2.2.1. Vị trí địa lí. Giao Thuỷ là một huyện ven biển của tỉnh Nam Định. Huyện Giao Thuỷ gồm 22 xã và thị trấn, trong đó có 9 xó giỏp biển là: Giao Thiện, Giao An, Giao Lạc, Giao Xuân, Giao Hải, Bạch Long, Giao Phong, Giao Long, 9 xã này chạy dài trên 32km bờ biển thuộc 2 cửa sông: cửa Ba Lạt thuộc sông Hồng và cửa Ninh Cơ thuộc sông Ninh Cơ. Trong 9 xó giỏp biển thì 4 xã Giao Thuỷ, Giao An, Giao Lạc và Giao Xuân có hệ thống rừng ngập mặn phát triển. Xã Giao Lạc có diện tích 840,7ha, nằm giữa 20 013’-20015’ vĩ độ Bắc, 106015’-106033’ kinh độ Đông, phía bắc giáp xã Giao An, phía nam giáp xã Giao Xuân, phía đông giáp biển. Diện tích rừng ngập mặn xã Giao Lạc chiếm gần 400 ha. Do nằm giữa vùng cửa sông Hồng và cửa sông Ninh Cơ, hệ thống RNM ở đây hàng năm tiếp nhận được một lượng lớn phù sa do 2 con sông mang tới (114 Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 15 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà triệu tấn/năm), nên địa hình ở đây tương đối bằng phẳng, ít cồn cát, lớp trầm tích phù sa dày. 2.2.2. Khí hậu Xã Giao Lạc nói riêng và huyện Giao Thuỷ nói chung nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa. Mùa đông lạnh, khô hơn, mùa hè nóng và mưa nhiều. Mùa mưa kéo dài từ tháng 4 đến tháng 11. Theo số liệu của Đài khí tượng trạm thuỷ văn khu vực đồng bằng Bắc bộ năm 2007-2008, nhiệt độ trung bình tại Giao Thuỷ là 240C. Lượng mưa trung bỡmh hàng năm từ 1700-2000mm. Độ ẩm trung bình hàng năm là 85%, cao nhất vào tháng 2 và thấp nhất vào tháng 12. Độ mặn nước biển biến đổi theo mùa, theo chế độ thuỷ triều. Theo kết quả của đợt ghi độ mặn đặc trưng năm 2006-2007 tại trạm Phú Lễ, sông Ninh Cơ thì độ mặn cao nhất là 21,73‰ vào tháng 12/2006, độ mặn thấp nhất là 3,035‰ vào tháng 5. Nói chung độ mặn ổn định theo năm. (Đài khí tượng thuỷ văn khu vực đồng bằng Bắc bộ năm 2007-2008) [21]. 2.2.3. Thuỷ văn Chế độ thuỷ triều ở Giao Thuỷ là chế độ nhật triều, nghĩa là con nước lên xuống một lần trong ngày (24 giờ). Vì vậy thời gian ngập nước của cây ngập mặn kéo dài. Biên độ triều khá lớn, dao động trong khoảng 1,9-4,1m. Mức triều lớn nhất là 3,9m (tổng cục khí tượng thuỷ văn). Chế độ thuỷ triều của vùng chịu ảnh hưởng trực tiếp của lượng mưa và lưu lượng nước sông Hồng và sông Ninh Cơ vào mùa lũ từ tháng 6 đến tháng 10. Hướng của dòng chảy là hướng Đông Bắc-Tây Nam. 2.2.4. Đặc điểm rừng trồng Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 16 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà Hầu hết RNM tự nhiên ở xã Giao Lạc đã bị chặt phá từ trước năm 1900-1991. Hiện nay, RNM ở đây chủ yếu là rừng trang được trồng tại các thời kỳ khác nhau từ năm 1997 cho đến nay. Theo số liệu của hội chữ thập đỏ xã Giao Lạc, năm 1997 trồng được 165ha, năm 1998 trồng 100ha, năm 1999 và 2000 trồng được diện tích RNM lần lượt là 61ha và 21ha, đến năm 2001 trồng được 4,5ha. Như vậy, cây ngập mặn được trồng chủ yếu ở đây là cây trang (Kandelia obovata Sheue, Liu &Yong). Ngoài ra còn trồng xen lẫn bần chua (Sonneratia caseolaris) và đước vòi (Rhizophora stylosa Griff) nhưng với số lượng ít hơn. 2.3. Phương tiện nghiên cứu và hóa chất. 2.3.1. Phương tiện nghiên cứu - Tủ sấy khô phòng thí nghiệm thực vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội. - Cân “PRECISA B220A” tại bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội . - Cân “PRECISA B320C” tại bộ môn Dược liệu trường Đại hoc Dược Hà Nội. - Bếp đun cách thuỷ - Rây 355 và một số dụng cụ thí nghiệm khác tại bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội. 2.3.2. Hóa chất - Gelatin 1%, sắt III clorid (FeCl 3) 5%, chì acetat (Pb (CH3COO)2) 10%, natri acetate (CH3COONa). - Formol, acid clohydric đậm đặc (HCl), dung dịch sunfo-indigo, dung dịch kali pecmanganat (KMnO4) 0,1N. 2.4. Thời gian tiến hành. Từ tháng 10/2008 đến tháng 5/2009. Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 17 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà 2.5. Phương pháp nghiên cứu. 2.5.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu. 2.5.1.1. Phương pháp thu. Cây trang và cây đước ở ba độ tuổi: 9tuổi, 10 tuổi, 11 tuổi được chúng tôi tiến hành dóc vỏ thân trong khoảng chiều cao 1 m 3 tính từ mặt đất lên, rồi bỏ vào túi riờng cú ghi tên loài, độ tuổi. Đồng thời trờn cỏc cõy vừa dóc vỏ chúng tôi thu toàn bộ các cành mang lá cách ngọn khoảng nửa mét. Cũng đem mẫu bỏ vào cỏc tỳi riờng cú ghi tên loài, độ tuổi. Thời gian thu mẫu: tháng 10/2008. 2.5.1.2. Xử lý mẫu. Mẫu cành mang lá sau khi thu về chúng tôi tiến hành thu lá sau đó tách vỏ cành. Tất cả các mẫu lá, vỏ thân, vỏ cành thu được đem cho vào cỏc tỳi đựng riêng rẽ có đánh dấu rồi đem sấy khô tuyệt đối ở nhiệt độ khoảng 60oC- 70oC. Mẫu sau khi sấy xong được bảo quản, bọc kín trong cỏc tỳi nilong. 2.5.3. Định tính tanin trong dược liệu. Định tính tanin trong các mẫu nghiờn cứu bằng các phản ứng hoá học [3]. 2.5.3.1 Chiết tanin từ dược liệu. Lấy khoảng 1,00g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc. Dịch lọc được dùng để định tính. 2.5.3.2 Các phản ứng định tính: Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 18 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà Ống 1: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl 3 5% (TT) sẽ xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt. Ống 2: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% (TT) sẽ xuất hiện tủa bông. Ống 3: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% sẽ xuất hiện tủa bông trắng. 2.5.3.3 Phản ứng Stiasny (phân biệt tanin pyrogallic và tanin pyrocatechic). Lấy 10ml dịch lọc, thêm vào đó 2ml formol và 1ml HCl đậm đặc. Nếu không có tủa là tanin pyrogallic, nếu có tủa là tanin pyrocatechic. Nếu dược liệu có cả 2 loại tanin thì sau khi làm phản ứng Stiasny tạo tủa đem lọc qua giấy lọc để loại tủa tanin pyrocatechic, thêm vào dịch lọc Natriacetat dư rồi thêm dung dịch FeCl3 5% (TT) sẽ xuất hiện tủa xanh đen. Bảng 2.1. Các phản ứng định tính tanin. STT Phản ứng Thuốc thử 1 Phản ứng thuộc da Dung dịch gelatin 1% pha trong NaCl 0,9%. 2 3 Phản ứng tạo kết tủa với -6 Dung dịch Pb (CH3COO)2 10% muối kim loại -7 Dung dịch FeCl3 5% Stiasny Formol và acid clohydric đậm đặc. Từ kết quả phản ứng xác định sự có mặt của tanin trong các mẫu nguyên liệu nghiên cứu. 2.5.4. Định lượng tannin. Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 19 Líp K55B - Khóa luận tốt nghiệp Nội Trường ĐHSP Hà Khi căn cứ vào hàm lươ ̣ng tanin để đánh giá chấ t lươ ̣ng thuố c và muố n chiế t xuấ t đươ ̣c nhiề u tanin sử du ̣ng trong công nghê ̣ thuô ̣c da thì cầ n khảo sát, thăm dò hàm lươ ̣ng tanin có trong vỏ cây, hoă ̣c các bô ̣ phâ ̣n khác của cây, các cây có đô ̣ tuổ i khác nhau, theo các phương pháp đinh ̣ lươ ̣ng, chế biế n và bảo quản khác nhau nhằ m giúp cho viê ̣c khai thác và sử du ̣ng hơ ̣p lý. Định lượng tanin bằng phương pháp oxy hoá [3]. Nguyên tắc: chiết kiệt tanin bằng nước. Pha loãng rồi chuẩn độ bằng dung dịch KMnO4 0,1N, chỉ thị màu là dung dịch sulfo-indigo. Song song tiến hành định lượng một mẫu kiểm tra trắng, 1ml KMnO 4 0,1N tương ứng với 0,004157g tanin. Dược điển Việt Nam và Liờn Xụ quy định định lượng bằng PP này. Cách tiến hành: Cân chính xác 2g dược liệu đã tán nhỏ qua dây số 355 cho vào 1 bỡnh nún. Đổ thêm 50ml nước sôi và đun cách thuỷ, vừa đun vừa khuấy trong 30 phút. Để yên vài phút rồi lọc qua bông vào một bình định mức 250ml. Tiếp tục chiết như trên vài lần cho tới khi dịch chiết không cho phản ứng của tanin (thử với dung dịch FeCl 3). Để nguội rồi cho thêm nước vào bình định mức tới vạch. Lấy 25ml dung dịch trên vào một bỡnh nún 1000ml, thêm 750ml nước và 25ml dung dịch sunfo-indigo. Định lượng bằng dung dịch Kali pecmanganat 0,1N cho tới khi chuyển sang màu vàng. Song song tiến hành định lượng 1 mẫu kiểm tra trắng gồm 25ml dung dịch sunfo-indigo và 750ml nước. 1ml dung dịch KMnO4 0,1N tương ứng với 0,004157g tanin tinh khiết. Hàm lượng phần trăm tanin trong dược liệu được tính theo công thức: Đỗ Thị Lan Hương Sinh học 20 Líp K55B -