Tài liệu Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa của cây phong quỳ sa pa anemone chapaensis gagnep., họ hoàng liên (ranunculaceae)

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN ................................................................... ………….3 1.1.TỔNG QUAN VỀ DƢỢC LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................ 3 1.1.1.Tổng quan về chi Anemone ................................................................................ 3 1.1.1.1. Thực vật học ......................................................................................... 3 1.1.1.2. Thành phần hóa học ............................................................................. 3 1.1.1.3. Tác dụng sinh học................................................................................. 6 1.1.2.Tổng quan về cây Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.) ............... 7 1.1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố .............................................................. 7 1.1.2.2. Thành phần hóa học và tác dụng sinh học ........................................... 8 1.1.2.3. Công dụng ............................................................................................ 8 1.2. TỔNG QUAN VỀ VIÊM, GỐC TỰ DO, CHẤT CHỐNG OXI HÓA…….…..8 1.2.1. Viêm .................................................................................................................. 9 1.2.1.1. Khái niệm ............................................................................................. 9 1.2.1.2. Nguyên nhân ......................................................................................... 9 1.2.2. Gốc tự do, chất chống oxi hóa ........................................................................ 10 1.2.2.1. Nguồn gốc của gốc tự do .................................................................... 10 1.2.2.2. Stress oxi hóa, tác hại của stress oxi hóa ........................................... 10 1.2.2.3. Chất chống oxi hóa............................................................................. 11 CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...12 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .......................................................................... 12 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................................ 12 2.2.1. Hóa chất và dung môi ..................................................................................... 12 2.2.2. Thiết bị, máy móc, dụng cụ............................................................................. 13 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................... 14 2.3.1. Nghiên cứu thực vật học ................................................................................. 14 2.3.1.1. Nghiên cứu về hình thái...................................................................... 14 2.3.1.2. Nghiên cứu về đặc điểm vi học ........................................................... 14 2.3.2. Nghiên cứu chiết xuất và sàng lọc tác dụng của các phân đoạn dịch chiết lá Phong quỳ Sa Pa........................................................................................................ 14 2.3.2.1. Chiết xuất cắn toàn phần và phân đoạn ............................................. 14 2.3.2.2. Sàng lọc tác dụng dọn gốc tự do DPPH (1,1- Diphenyl-2picrylhydrazyl)các phân đoạn dịch chiết .............................................................. 15 2.3.2.3. Sàng lọc tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase invitro các phân đoạn dịch chiết ...................................................................................................... 16 2.3.3. Nghiên cứu về thành phần hóa học lá Phong quỳ Sa Pa ................................. 18 2.3.3.1. Phân lập các hợp chất ........................................................................ 18 2.3.3.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập........................................... 19 2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU .............................................................................................. 19 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 20 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THỰC VẬT .......................................................... 20 3.1.1. Đặc điểm hình thái và định tên khoa học loài nghiên cứu .............................. 20 3.1.2. Đặc điểm vi phẫu của loài Anemone chapaensis Gagnep............................... 22 3.1.3. Đặc điểm bột của loài Anemone chapaensis Gagnep. .................................... 25 3.2. KẾT QUẢ CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT LÁ PHONG QUỲ SA PA .………………………………………...28 3.2.1.Chiết xuất lá Phong quỳ Sa Pa. ........................................................................ 28 3.2.2. Kết quả sàng lọc tác dụng dọn gốc tự do DPPH các phân đoạn dịch chiết .... 31 3.2.3. Kết quả sàng lọc tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro các phân đoạn dịch chiết .......................................................................................................... 32 3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ LÁ PHONG QUỲ SA PA ................................................................................. 32 3.3.1.Định tính cắn ethyl acetat bằng sắc kí lớp mỏng. ............................................ 32 3.3.2.Phân lập một số hợp chất trong lá Phong quỳ Sa Pa........................................ 34 3.3.2.1.Phân lập .............................................................................................. 34 3.3.2.2.Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập ................................................... 37 3.3.3.Nhận dạng các chất phân lập............................................................................ 39 3.3.3.1.Hợp chất PQLE1 ................................................................................. 39 3.3.3.2. Hợp chất PQLE2 ................................................................................ 42 3.3.3.3 Hợp chất PQLE4 ................................................................................. 45 3.3.3.4. Hợp chất PQLE6 ................................................................................ 46 CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 49 4.1. VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT ........................................................................... 49 4.1.1. Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học của loài nghiên cứu .............. 49 4.1.1. Đặc điểm vi học của loài nghiên cứu .............................................................. 51 4.2. VỀ CHIẾT XUẤT VÀ SÀNG LỌC TÁC DỤNG CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT LÁ PHONG QUỲ SA PA ........................................................................... 51 4.2.1. Về chiết xuất ................................................................................................... 51 4.2.2. Về tác dụng dọn gốc tự do DPPH ……………………..................................52 4.2.3. Về tác dụng ức chế XO in vitro ...................................................................... 52 4.3. VỀ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT ................. 53 KẾT LUẬN ............................................................................................................. 57 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BuOH n-Butanol 13 Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance C-NMR DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ESI-MS Eletrospray Ionization Mass Spectroscopy EtOAc Ethyl acetat GF254 Gypsum fluorescent 254nm 1 Proton Nuclear Magnetic Resonance H-NMR HSQC Hetoronuclear Single Quantum Coherence IC50 Half (50%) maximal Inhibitory Concentration MeOH Methanol MS Mass Spectroscopy PQL Cắn toàn phần lá Phong quỳ PQLB Cắn phân đoạn n-butanol lá Phong quỳ PQLE Cắn phân đoạn ethyl acetat lá Phong quỳ PQLH Cắn phân đoạn n-hexan lá Phong quỳ PQLW Cắn nƣớc lá Phong quỳ Rf Retardation Factor RP18 Reversed Phase 18 SKLM Sắc ký lớp mỏng TT Thuốc thử UV-VIS Ultra Violet - Visible UV254nm Ultra Violet 254nm UV365nm Ultra Violet 365nm XO Xanthin oxidase DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 3.1. Khối lƣợng các cắn phân đoạn từ dịch chiết ethanol lá Phong quỳ Sa Pa 31 2 Bảng 3.2. Khả năng dọn gốc tự do DPPH của các phân đoạn dịch chiết lá Phong quỳ Sa Pa 31 3 Bảng 3.3. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro của các phân đoạn dịch chiết lá Phong quỳ Sa Pa 32 4 Bảng 3.4. Kết quả SKLM của 4 chất với 3 hệ dung môi 39 5 Bảng 3.5. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất PQLE1 40 6 Bảng 3.6. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất PQLE2 43 7 Bảng 3.7. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất PQLE4 46 8 Bảng 3.8. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất PQLE6 47 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1. Một số Flavonoid phân lập từ chi Anemone 5 2 Hình 1.2. Một số saponin phân lập từ rễ cây Anemone rivularis 5 3 Hình 1.3. Một số Saponin phân lập từ rễ cây Anemone tomentosa 6 4 Hình 1.4. Phong quỳ Sa Pa Anemone chapaensis Gagnep 8 5 Hình 2.1. Sơ đồ chiết phân đoạn và sàng lọc tác dụng 15 6 Hình 3.1. Hình ảnh cây Phong quỳ Sa Pa 21 7 Hình 3.2. Một số bộ phận của cây Phong quỳ Sa Pa 21 8 Hình 3.3. Vi phẫu gân lá Phong quỳ Sa Pa 22 9 Hình 3.4. Vi phẫu phiến lá Phong quỳ Sa Pa 23 10 Hình 3.5. Vi phẫu cuống lá Phong quỳ Sa Pa 23 11 Hình 3.6. Vi phẫu thân cây Phong quỳ Sa Pa 24 12 Hình 3.7. Vi phẫu rễ cây Phong quỳ Sa Pa 25 13 Hình 3.8. Một số đặc điểm bột thân, lá Phong quỳ Sa Pa 26 14 Hình 3.9. Một số đặc điểm bột hoa, quả Phong quỳ Sa Pa 27 15 Hình 3.10. Một số đặc điểm bột rễ Phong quỳ Sa Pa 28 16 Hình 3.11. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá Phong quỳ Sa Pa 30 17 Hình 3.12. Sắc ký đồ cắn ethyl acetat (hệ I) ở các điều kiện quan sát 33 18 Hình 3.13. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat. 36 19 Hình 3.14. Sắc ký đồ của PQLE1, PQLE2, cắn EtOAc, PQLE6, PQLE4 hệ I 37 20 Hình 3.15. Sắc ký đồ của PQLE1, PQLE2, cắn EtOAc, PQLE6, PQLE4 hệ II 38 21 Hình 3.16. Sắc ký đồ của PQLE1, PQLE2, cắn EtOAc, PQLE6, PQLE4 hệ III 38 22 Hình 3.17. Sản phẩm PQLE1 phân lập đƣợc 39 23 Hình 3.18. Công thức cấu tạo của hợp chất PQLE1 42 24 Hình 3.19. Sản phẩm PQLE2 phân lập đƣợc 42 25 Hình 3.20. Công thức cấu tạo của hợp chất PQLE2 45 26 Hình 3.21. Sản phẩm PQLE4 phân lập đƣợc 45 27 Hình 3.22. Công thức cấu tạo của hợp chất PQLE4 46 28 Hình 3.23. Sản phẩm PQLE6 phân lập đƣợc 47 29 Hình 3.24. Công thức cấu tạo của hợp chất PQLE6 48 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là nƣớc có khí hậu nhiệt đới, quanh năm nóng ẩm nên có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng, với hàng nghìn loài cây đƣợc sử dụng làm thuốc theo kinh nghiệm của dân gian. Đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên quý giá, cung cấp nguyên liệu cho nền y học dân gian, ngoài ra còn cung cấp thực phẩm, gia vị, hƣơng liệu, mỹ phẩm. Ngày nay, những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học đƣợc phân lập từ cây cỏ đã đƣợc ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp cũng nhƣ nông nghiệp, chúng đƣợc dùng để sản xuất thực phẩm chức năng, thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm. Vì vậy, nguồn cây thuốc dân gian cũng nhƣ vốn sử dụng phong phú của đồng bào các dân tộc vẫn là kho tàng quý giá để khám phá, tìm kiếm nhiều loại thuốc mới có hiệu lực trong phòng và chữa bệnh. Xu hƣớng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ các loài thực vật làm dƣợc phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút đƣợc sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ƣu điểm của chúng là sẵn có, rẻ tiền, độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể. Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.) là một loài mọc hoang ở Sa Pa, đƣợc nhà thực vật Pháp Gagnepain mô tả lần đầu tiên năm 1929 [81]. Trong dân gian, chi Phong quỳ đƣợc ngƣời dân dùng rễ để điều trị viêm họng, viêm túi mật, đau dạ dày, đau răng, phong thấp đau nhức. Tuy nhiên, những nghiên cứu về Phong quỳ Sa Pa ở cả Việt Nam và thế giới còn rất ít, mới chỉ có nghiên cứu mô tả sơ lƣợc về hình thái thực vật [78], chƣa có tài liệu nào nghiên cứu chi tiết về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây. Nhằm mục đích tìm hiểu về đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Phong quỳ Sa Pa, một cây đặc hữu của địa phƣơng, để có thêm tri thức và nâng cao giá trị sử dụng cây thuốc, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học theo định hƣớng tác dụng chống oxy hóa của cây Phong quỳ Sa Pa Anemone chapaensis Gagnep., Họ Hoàng liên (Ranunculaceae)” với các mục tiêu: 1 1. Mô tả đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học và mô tả đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu. 2. Chiết xuất và sàng lọc tác dụng dọn gốc tự do DPPH và ức chế xanthin oxidase in vitro của các phân đoạn dịch chiết lá Phong quỳ Sa Pa. 3. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 1-2 chất trong lá Phong quỳ Sa Pa. 2 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ DƢỢC LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1.1. Tổng quan về chi Anemone 1.1.1.1. Thực vật học - Vị trí phân loại Chi Anemone thuộc họ Hoàng Liên (Ranunculaceae), bộ Hoàng Liên (Ranunculales), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) [2], [4]. - Đặc điểm thực vật Cây thảo, sống nhiều năm, gốc thành củ, có thân rễ hoặc mọc thành bụi. Lá mọc so le, bị chia cắt sâu nhiều hay ít. Hoa đều, đơn độc hay thƣờng thành tán có một bao chung gồm 3 lá chét. Đài dạng cánh, có màu trắng, vàng, đỏ hoặc lam, 5-10 phiến; tràng không có; nhị nhiều, lá noãn có vòi nhụy. Quả bế, đơn hạt, rời, tập hợp thành đầu [4]. - Phân bố Chi Anemone phân bố chủ yếu ở vùng có khí hậu ôn đới, mát mẻ nhƣ miền bắc Ấn Độ, Nepal, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Bắc Mỹ… [25], [68]. Theo các công bố trên thế giới, hiện nay chi Anemone có khoảng 120-150 loài [5], [59], [81], trong đó có khoảng 50 loài đƣợc tìm thấy từ Trung Quốc [68]. Ở Việt Nam, Anemone đƣợc gọi là chi Phong quỳ, mọc khá phổ biến ở vùng núi phía Bắc nhƣ: Yên Bái, Lai Châu, Hà Giang và vùng núi cao miền trung [1], [2], [4]. Theo các tài liệu thì Việt Nam có 05 loài là A. japonica, A. rivularis, A. chapaensis, A. polilanei, A. sumatrana, trong đó có 02 loài đƣợc biết nhiều là A. japonica và A. rivularis [1], [2], [4], [8]. 1.1.1.2. Thành phần hóa học Một số nghiên cứu đã cho biết thành phần hóa học chính trong các loài thuộc chi Anemone là saponin và flavonoid, trong rễ và lá của các loài nhƣ A. tomentosa, A. taipaiensis, A. rivullaris, A. anhuiensis, A. flaccida, A. raddeana, A. hupehensis, A. coronaria… [15], [19], [21], [27], [28], [45], [67], [72], [74], [75], [77]. Ngoài ra trong các loài Anemone còn chứa diterpenoid glycosid, coumarin, một số acid béo 3 đƣợc tìm thấy trong hạt [9] và acid béo, acid béo đã khử 5 trong mô lá của Anemone leveillei L. [51]. a. Các flavonoid quercetin-3-O-β-D-galactopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside quercetin-7-O-β-D-glucopyranoside Astragalin quercetin-7-O-α-L-rhamnopyranoside 4 quercetin-3-O-β-D-galactopyranoside-7-O-α-L-rhamnopyranoside Hình 1.1. Một số Flavonoid phân lập từ chi Anemone b. Các saponin Cho đến nay, đã có khoảng 60 saponin trong chi Anemone đƣợc nhận biết và xác định cấu trúc thuộc saponin triterpenoid, trong đó chủ yếu là dẫn xuất của 2 aglycone oleane và hederagenin. Các saponin này đƣợc phân lập từ bộ phận thân rễ của các loài trong chi Anemone. 1 2 3 45 5 6 7 8 9 10 R1 S1 S1 S1 Rha I Rha I S1 Rha I S1 S1 H R2 Glc I Glc I S2 Glc I S2 H Glc I Glc I H H R3 CHO CHO CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CHO R4 H H H OH OH H H H H H R5 Glc II S3 Glc II S3 S3 H H H S3 S3 CH2OH CH2OH Hình 1.2. Một số saponin phân lập từ rễ cây Anemone rivularis 5 R1 R2 R3 R1 R2 R3 1 Glc Rib OH 2 Glc Rib OH 4 H Rib OH 3 H Gal H 6 H Rib H 5 N Rib OH 7 H H H Hình 1.3. Một số Saponin phân lập từ rễ cây Anemone tomentosa (1) Tomentoside A (2) Tomentoside B (3) Tomentoside C (4) Huzhangoside D (5) Clematiganoside A (6) Huzhangoside B (7) Bederasaponin B 1.1.1.3. Tác dụng sinh học và công dụng Các nghiên cứu về dƣợc lý học đã chứng minh các saponin nhóm triterpenoid, thành phần chính trong rễ của chi này có hoạt tính sinh học tiềm năng, bao gồm kháng u, kháng khuẩn, chống oxi hóa, ngăn chặn côn trùng… [15], [66], [77], trong đó tác dụng gây độc tế bào của A. taipaiensis và A. rivullaris đã đƣợc báo cáo [69], [72]. 6 Hơn 10 loài trong chi này đã đƣợc ngƣời dân Trung Quốc sử dụng nhƣ thuốc dân gian. Ví dụ: thân rễ của A. raddeana đƣợc ghi trong dƣợc điển Trung Quốc để điều trị bệnh thấp khớp và đau thần kinh [48]; A. rivularis đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc dân gian để điều trị bệnh viêm gan, viêm cơ, đau khớp, phù nề… [68]; rễ của A. tomentosa đƣợc ngƣời dân Trung Quốc sử dụng nhƣ thuốc y học cổ truyền để điều trị bệnh lỵ, sốt rét, suy dinh dƣỡng trẻ con. Trong dân gian, theo kinh nghiệm sử dụng thuốc y học cổ truyền của một số nƣớc Châu Á thì A. japonica dùng chữa bệnh về tim (phối hợp với thuốc khác), A. rivullaris để điều trị viêm họng, sƣng amydal, viêm gan, viêm túi mật, đau dạ dày, lỵ, thiên đầu thống, bế kinh, đái ra máu, rắn cắn, đau răng, phong thấp đau nhức, đòn ngã và giải độc ô đầu [4]. 1.1.2. Tổng quan về cây Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.) Đến nay mới thấy các tài liệu mô tả về hình thái thực vật của Phong quỳ Sa Pa A. chapaensis Gagnep., chƣa có tài liệu nào nghiên cứu chi tiết về đặc điểm thực vật (vi phẫu, soi bột), thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây. 1.1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố a) Đặc điểm thực vật Phong quỳ Sa Pa A. chapaensis Gagnep. đƣợc nhà thực vật Pháp mô tả lần đầu tiên vào năm 1929 [81]. Theo các tài liệu trƣớc đây mô tả cây Phong quỳ Sa Pa là cây thảo, thân 2-4cm mang lá chụm ở đất. Lá có cuống dài 10-15cm, mềm, có lông rải rác; phiến hình tim có 3 thùy, không lông, bìa có răng tròn. Trục mang hoa cao hơn 20cm; lá hoa 6-7, dài 2-3,5cm; lá đài 5, đầu tà hay lõm, cao 2-4cm; tiểu nhụy nhiều; tâm bì không lông, không vòi nhụy. Quả bế không cọng, không lông, dẹp dẹp, dài 4-5mm [4], [78], [81]. 7 Hình 1.4. Phong quỳ Sa Pa Anemone chapaensis Gagnep. (Hình ảnh từ internet: http://vietnamplants.blogspot.com/) b) Phân bố Mới ghi nhận thấy loài Anemone chapaensis có gặp ở Sa Pa, thƣờng mọc ở sƣờn dốc với độ cao từ 1500m trở lên [4], [8], [81]. 1.1.2.2. Thành phần hóa học và tác dụng sinh học Cho đến nay chƣa có nghiên cứu nào của Việt Nam và trên thế giới công bố về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis). 1.1.2.3. Công dụng Thân rễ và rễ Phong quỳ Sa Pa đƣợc ngƣời dân địa phƣơng sử dụng để điều trị viêm họng, viêm túi mật, đau dạ dày, đau răng, phong thấp đau nhức. Tuy nhiên cho đến nay chƣa tìm thấy nghiên cứu nào ở cả Việt Nam và thế giới công bố về tác dụng sinh học của Phong quỳ Sa Pa chứng minh cho các công dụng này. 1.2. Tổng quan về viêm, gốc tự do và chất chống oxi hóa Các gốc tự do đã đƣợc chứng minh là có liên quan đến hiện tƣợng viêm (viêm khớp, viêm mạch, viêm cầu thận, lupus ban đỏ, hội chứng hô hấp ở ngƣời lớn), nhiều bệnh lý liên quan đến viêm mạn tính nhƣ: ung thƣ, rối loạn thần kinh (bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson, bệnh teo cơ), nghiện rƣợu, các bệnh liên quan đến hút thuốc và nhiều bệnh khác [38], [62]. Các gốc tự do có thể cho một electron hoặc nhận một electron từ phân tử khác, do đó nó có thể xem nhƣ một chất oxi hóa 8 hoặc một chất khử [14]. Hai nhóm chất oxi hóa sinh học chính là nhóm oxi hoạt động (ROS) và nhóm nitơ hoạt động (RNS). Xanthine dehydrogenase (XDH) hay xanthine oxidase (XO) là một phức hợp metallo-flavoprotein tạo ra các gốc tự do. Enzyme XO xúc tác quá trình oxi hoá hypoxanthine thành xanthine và oxi hoá xanthine thành acid uric. Các hợp chất phenol, đặc biệt là flavonoid có hoạt tính ức chế mạnh đối với enzyme XO và tiềm năng chống oxy hóa cao. Trong nhóm flavonoid đáng chú ý là các hợp chất flavonol glycosid và cụ thể hơn là kaempferol và quercetin glycosid [16]. Sự ức chế hoạt động enzyme XO đƣợc xem nhƣ là một cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất polyphenol. Nhiều nghiên cứu về enzyme XO chứng minh rằng, hoạt động của enzyme XO là nguyên nhân dẫn tới sự tạo ra nhiều gốc tự do [17], [63]. Nên việc bổ sung các chất ức chế enzyme XO vừa có tác dụng ức chế sự tạo thành acid uric ngăn ngừa bệnh gout, cũng vừa có tác dụng ngăn chặn lại stress oxy hóa là nguyên nhân gây viêm trong cơ thể. 1.2.1. Viêm 1.2.1.1. Khái niệm Viêm là hiện tƣợng sƣng, nóng, đỏ, đau của đã đƣợc đề cập tới trong y học cổ đại và những khái niệm ban đầu về viêm cũng đƣợc hình thành từ rất sớm song lại rất khác nhau. Viêm là phản ứng bảo vệ của cơ thể chống lại yếu tố gây bệnh, là một quá trình bệnh lý phức tạp bao gồm nhiều hiện tƣợng: tổn thƣơng tổ chức, rối loạn chuyển hóa, rối loạn tuần hoàn, bạch cầu đến ổ viêm và thực bào, tế bào tăng sinh [3]. 1.2.1.2. Nguyên nhân [3] Nguyên nhân bên ngoài: Nguyên nhân bên ngoài thƣờng gặp nhất và phức tạp nhất bao gồm: - Vi sinh vật: vi khuẩn và các độc tố của chúng, virus, ký sinh trùng và côn trùng. Đây là nguyên nhân gây viêm thƣờng gặp nhất. - Tác nhân cơ học: chấn thƣơng. - Vật lý: nhiệt độ (nóng, lạnh), điện, bức xạ ion hóa. - Hóa học: các acid, các kiềm, các muối kim loại nặng. 9 Nguyên nhân bên trong - Hoại tử tổ chức: tắc mạch, xuất huyết, rối loạn thần kinh dinh dƣỡng. - Lắng đọng các phức hợp miễn dịch (có hoạt hóa bổ thể) (phức hợp kháng nguyênkháng thể). 1.2.2. Gốc tự do, chất chống oxi hóa 1.2.2.1. Nguồn gốc của gốc tự do Gốc tự do có thể đƣợc định nghĩa là bất kỳ tiểu phân hóa học nào có khả năng tồn tại độc lập có chứa một electron chƣa ghép cặp trong obitan nguyên tử. Electron độc thân này quy định đặc tính chung của gốc tự do. Gốc tự do không ổn định và có khả năng phản ứng cao. Một số nguồn ngoại sinh gốc tự do là: khói thuốc lá, ô nhiễm môi trƣờng, sự bức xạ, một số loại thuốc, thuốc trừ sâu, dung môi công nghiệp, ozon. Một số nguồn nội sinh của gốc tự do là: hoạt động của ti thể, hoạt động xanthin oxidase, hoạt động của peroxisom, quá trình viêm, quá trình thực bào, con đƣờng arachidonat, tập thể dục quá sức, thiếu máu cục bộ, chấn thƣơng tái tƣới máu [13]. 1.2.2.2. Stress oxi hóa, tác hại của stress oxi hóa Stress oxi hóa là thuật ngữ dùng để mô tả tình trạng mất cân bằng nghiêm trọng giữa sự phát sinh gốc tự do và chất chống oxi hóa bảo vệ trong cơ thể, có thể gây hại trên một phạm vi rộng cho các loại phân tử bao gồm cả lipid, protein và acid nucleic. Stress oxi hóa ngắn hạn có thể xảy ra trong các mô bị thƣơng do chấn thƣơng, nhiễm trùng, tổn thƣơng do nhiệt, nhiễm độc tố và tập thể dục quá mức. Những mô bị thƣơng này tăng sản xuất các enzym sinh gốc (ví dụ: xanthin oxidase, lipoxygenase, cyclooxygenase) làm kích hoạt các đại thực bào, giải phóng ion sắt, ion đồng hoặc làm gián đoạn chuỗi vận chuyển điện tử của phản ứng phosphoryl hóa và làm sản xuất dƣ thừa ROS. Việc khởi phát và tiến triển của bệnh ung thƣ, cũng nhƣ các tác dụng phụ của xạ trị và hóa trị cũng có liên quan đến sự mất cân bằng giữa ROS và hệ thống bảo vệ chống oxy hóa. ROS cũng có liên quan trong sự cảm ứng và các biến chứng của bệnh đái tháo đƣờng, bệnh về mắt ở ngƣời già, và các bệnh thoái hóa thần kinh nhƣ bệnh Parkinson [53]. 10 Ảnh hƣởng của stress oxi hóa đã đƣợc công nhận trong nhiều tiến trình bệnh lý bao gồm cả xơ vữa động mạch, tình trạng viêm, ung thƣ và quá trình lão hóa. Việc sản xuất quá mức và không kiểm soát của ROS (kết quả của stress oxi hóa), đặc biệt ROS có nguồn gốc ti thể kích thích trực tiếp lên điều chỉnh của các cytokin viêm liên quan với các tình trạng bệnh lý khác nhau trong các bệnh liên quan đến viêm ở ngƣời [38]. Viêm xảy ra nhƣ là kết quả của stress oxy hóa. Đáp ứng với tình trạng giải phóng quá nhiều gốc tự do (thƣờng có nguồn gốc từ ti thể) sẽ dẫn đến một loạt của các bệnh lý của viêm, khởi động một chu trình đáp ứng tế bào phức tạp bắt đầu và kích hoạt một vài phân tử tín hiệu. Một trong những phân tử trung gian truyền tín hiệu quan trọng là yếu tố sao chép nhân (NF-κB), yếu tố này điều chỉnh quá trình sản xuất các chất trung gian gây viêm hạ nguồn nhƣ: NO synthase cảm ứng (iNOS), interleukin-1β (IL-1β), yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α) và cyclooxygenase-2 (COX-2). NF-κB đóng vai trò quan trọng trong phản ứng viêm và chết tế bào, miễn dịch và đáp ứng stress cũng nhƣ điều hòa biểu hiện của các gen khác nhau [52]. Sản sinh ROS quá mức có khả năng oxi hóa gây thay đổi và tổn thƣơng các phân tử sinh học nhƣ: lipid, carbohydrat, protein và ADN thông qua các cơ chế khác nhau, kết quả là có thể làm mất chức năng của các phân tử sinh học này vĩnh viễn. 1.2.2.3. Chất chống oxy hóa Chất chống oxy hóa là một phân tử ổn định có khả năng cho hoặc nhận của gốc tự do một electron để trung hòa gốc tự do này, do đó làm giảm khả năng gây nguy hại của nó. Những chất chống oxy hóa làm chậm hoặc ngăn chặn sự phá hủy tế bào chủ yếu là thông qua khả năng dọn gốc tự do của chúng. Những chất chống oxy hóa trọng lƣợng phân tử thấp có thể tƣơng tác một cách an toàn với các gốc tự do và chấm dứt chuỗi phản ứng trƣớc khi các phân tử quan trọng bị phá hủy [24]. 11 CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Nghiên cứu thực vật đƣợc tiến hành trên toàn cây Phong quỳ Sa Pa khi cây có đủ hoa, quả đƣợc thu hái ở đèo Hoàng Liên (Ô Qui Hồ, ở độ cao 1500 đến 1800m), thuộc huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai. Mẫu tiêu bản khô gồm có cành, lá, hoa số 01 thu hái ngày 11/9/2013 và mẫu tiêu bản số 02 thu hái ngày 24/5/2015 tại đèo Hoàng Liên, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai đƣợc lƣu giữ tại phòng Bách thảo thực vật, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và Khoa Hóa phân tích-Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu. Mẫu dƣợc liệu đƣợc lƣu giữ tại Khoa Hóa phân tích-Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu. Nghiên cứu chiết xuất, sàng lọc tác dụng sinh học của các phân đoạn dịch chiết và phân lập một số hợp chất đƣợc tiến hành với bộ phận trên mặt đất (trong luận văn gọi tắt là lá ví phần lớn phần trên mặt đất là lá và cuống lá) của cây Phong quỳ Sa Pa đƣợc thu hái ở đèo Hoàng Liên (Ô Qui Hồ, ở độ cao 1500 đến 1800m), thuộc huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai. 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1. Hóa chất và dung môi - Các dung môi công nghiệp dùng để chiết: ethanol 96%, n-hexan, ethyl acetat, n-butanol, nƣớc cất. - Các dung môi tinh khiết (PA) dùng trong sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột. - Các chất tẩy – nhuộm tiêu bản: Nƣớc Javen, Cloral hydrat, đỏ son phèn, xanh methylen… - Acid acetic, HCl (Merk). - DPPH, Allopurinol, xanthin oxidase từ sữa bò (0,8 U/mg protein, 13 mg protein/ml), xanthin ≥ 99% (Sigma Aldrich). - Na2HPO4, KH2PO4, HCl, NaOH, dimethyl sulfoxid (Merck). - Quercetin ≥ 98%, dạng rắn, tiêu chuẩn HPLC (Sigma Aldrich). 12 - Các thuốc thử, dung môi, hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích theo tiêu chuẩn Dƣợc điển Việt Nam IV. 2.2.2. Thiết bị, máy móc, dụng cụ - Bản mỏng silica gel F254 và RP-18 F254S tráng sẵn trên tấm nhôm (Merck). - Bột silica gel pha thƣờng cỡ hạt 40-200 µm, pha đảo RP-18 cỡ hạt 30-50 µm (Merck). - Cân kỹ thuật Sartorius, cân phân tích Precisa XT 220A. - Máy xác định độ ẩm Precisa XM60-HR, tủ sấy Shellab, đèn tử ngoại. - Kính hiển vi quang học; hệ thống cắt tiêu bản và vi phẫu thực vật - Hệ thống chiết hồi lƣu dung tích bình cầu 10 lít, máy cất quay. - Dụng cụ thủy tinh: các loại cột sắc ký đƣờng kính từ 1-10cm, dài từ 30-100 cm; bình cầu ngoại dung tích 50-2000 ml; ống nghiệm, ống đựng mẫu NMR, pipet chính xác… - Máy đo phổ khối lƣợng (MS): AGILENT 6310 LC-MSD Trap. - Máy đo phổ hồng ngoại (IR) FT-IR Spectrophotometer 1650-Perkin Elmer. - Máy đo phổ cộng hƣởng hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer. - Máy đo điểm nóng chảy: Kofler micro-hostade. - Cân phân tích AY 220 (SHIMADZU), Máy đo pH (EUTECH). - Hệ thống ELISA gồm máy đọc khay vi tinh thể (Biotek, Hoa Kì) và máy ủ lắc khay (Awareness, Hoa Kì). - Đĩa UV 96 giếng đáy ph ng Costar 3635 (Corning). - Micropipet đơn kênh và đa kênh các loại. - Các dụng cụ thí nghiệm khác thuộc Viện dƣợc liệu, Bộ môn Dƣợc học cổ truyền và Bộ môn Dƣợc lực - trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. 13