Tài liệu Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của loài vi tảo lục haematococcu

  • Số trang: 190 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 254 |
  • Lượt tải: 0
dangvantuan

Tham gia: 02/08/2015

Mô tả:

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LƯU THỊ TÂM NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TẠO SINH KHỐI GIÀU ASTAXANTHIN CỦA LOÀI VI TẢO LỤC Haematococcus pluvialis FLOTOW NHẰM ỨNG DỤNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2017 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LƯU THỊ TÂM NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TẠO SINH KHỐI GIÀU ASTAXANTHIN CỦA LOÀI VI TẢO LỤC Haematococcus pluvialis FLOTOW NHẰM ỨNG DỤNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đặng Diễm Hồng Viện Công nghệ sinh học HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến: PGS. TS. Đặng Diễm Hồng, nguyên Trưởng phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - người thầy đã định hướng, chỉ bảo những kiến thức khoa học, tận tâm giúp đỡ và động viên tôi vượt qua những trở ngại và khó khăn trong suốt thời gian thực hiện luận án. Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, bộ phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học (ThS. Bùi Thị Hải Hà – phụ trách đào tạo), Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu. Sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của các cô chú, anh chị, các bạn đồng nghiệp đã và đang làm việc tại phòng Công nghệ Tảo: TS. Ngô Thị Hoài Thu, TS. Hoàng Thị Lan Anh, TS. Hoàng Thị Minh Hiền, ThS. Lê Thị Thơm, ThS. Nguyễn Cẩm Hà, ThS. Đinh Đức Hoàng, ThS. Bùi Đình Lãm, ThS. Đinh Thị Ngọc Mai, ThS. Nguyễn Thị Thu Thủy, KTV. Đỗ Thị Là. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó. Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài cấp Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn “Nghiên cứu công nghệ nuôi vi tảo Haematococcus pluvialis và công nghệ chiết xuất astaxanthin” 2010 – 2013 thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực thủy sản do ThS. Ngô Thị Hoài Thu làm chủ nhiệm và đề tài cán bộ trẻ cấp Viện Công nghệ sinh học “Tách dòng gen mã hóa cho tổng hợp astaxanthin - carotenoid hydroxylase (CHY) từ vi tảo lục Haematococcus pluvialis giàu astaxanthin” của năm 2016 do tôi làm chủ nhiệm. Xin cảm ơn Ông Vũ Văn Cảnh - Công ty Cổ phẩn Thủy điện Chu Va, huyện Tam Đường, tỉnh Lai Châu đã giúp đỡ luận án thực hiện thí nghiệm trên cá hồi nuôi tại Công ty. Tôi xin chân thành cám ơn ThS. Võ Văn Bình - Viện Nuôi trồng thủy sản 1 đã giúp đỡ thực hiện các thí nghiệm trên cá Koi Nhật. Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp - những người đã luôn bên cạnh, khuyến khích và ủng hộ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả Lưu Thị Tâm i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm./. Hà Nội, ngày tháng Tác giả năm 2017 Lưu Thị Tâm ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU……………………………………………………………. 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………... 4 1.1 Giới thiệu chung về astaxanthin…………………………………... 5 1.1.1 Đặc điểm chung……………………………………………………... 5 1.1.2 Cấu trúc của astaxanthin…………………………………………….. 6 1.1.3 Sinh tổng hợp astaxanthin…………………………………………... 6 1.1.4 Các nguồn cung cấp astaxanthin…………………………………….. 7 1.1.5 Sinh hóa học của astaxanthin………………………………………... 12 1.1.6 Đặc tính chống ôxy hóa của astaxanthin……………………………. 12 1.1.7 Ứng dụng của astaxanthin…………………………………………... 13 1.2 Giới thiệu chung về chi vi tảo lục Haematococcus……………….. 16 1.2.1 Vị trí phân loại và phân bố………………………………………….. 16 1.2.2 Các loài Haematococcus………………………………………………….. 16 1.2.3 Đặc điểm sinh học và đặc điểm hình thái…………………………… 17 1.2.4 Thành phần sinh hóa học của tảo H. pluvialis…………………………. 19 1.2.5 Quy trình sản xuất astaxanthin ở H. pluvialis…………………………. 21 1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất astaxanthin từ H. pluvialis 21 1.3 Tình hình nghiên cứu và công nghệ nuôi trồng tảo H. pluvialis cho sản xuất astaxanthin…………………………………………………. 22 1.3.1 Nuôi cấy quang tự dưỡng…………………………………………… 23 1.3.2 Nuôi cấy dị dưỡng và tạp dưỡng……………………………………. 28 1.3.3 Nâng cao hiệu quả sản xuất astaxanthin từ H. pluvialis………………. 30 1.4 Thách thức sản xuất astaxanthin thƣơng mại từ tảo H. pluvialis 35 1.5 Ứng dụng sinh khối tảo H. pluvialis trong nuôi trồng thủy sản… 36 1.6 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo H. pluvialis ở Việt Nam 38 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Vật liệu……………………………………………………………… 40 2.1.1 Vật liệu……………………………………………………………… 40 2.1.2 Các bộ kít sinh phẩm………………………………………………... 40 iii 2.1.3 Động vật thí nghiệm………………………………………………… 40 2.1.4 Hóa chất…………………………………………………………….. 40 2.1.5 Máy móc và thiết bị………………………………………………... 41 2.1.6 Môi trường nuôi cấy……………………………………………….. 42 2.1.7 Địa điểm nghiên cứu……………………………………………….. 42 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu………………………………………….. 42 2.2.1 Các phương pháp liên quan đến sàng lọc, định tên khoa học của chủng vi tảo lục Haematococcus sp. HB.…………………………… 2.2.2 Các phương pháp liên quan đến sinh trưởng, đặc điểm sinh học của chủng vi tảo lục Haematococcus sp. HB……………………………. 2.2.3 42 45 Các phương pháp liên quan đến sử dụng sinh khối chủng HB giàu astaxanthin cho cá hồi Vân và cá Koi Nhật…………………………. 48 2.3 Bố trí thí nghiệm…………………………………………………… 49 2.3.1 Nghiên cứu sự thay đổi hình thái, kích thước của tế bào trong vòng đời của chủng Haematococcus pluvialis HB ở cấp độ bình tam giác 250 – 1000 mL và bình nhựa 1,5 và 10 L……………………………….…… 2.3.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh trưởng của chủng Haematococcus pluvialis HB trong điều kiện phòng thí nghiệm…………………………………………………………………. 2.3.3 50 Nghiên cứu điều kiện nuôi thích hợp cho sinh trưởng của tảo Haematococcus pluvialis HB đạt MĐTB cao................................. 2.3.4 49 51 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu cho tích lũy astaxanthin ở tảo Haematococcus pluvialis HB trong pha 2........................................... 53 2.3.5 Thu hoạch sinh khối tảo……………………………………………... 55 2.3.6 Sử dụng sinh khối chủng vi tảo lục Haematococcus pluvialis HB 2.4 3.1 làm thức ăn cho cá Koi Nhật và cá hồi Vân……………………… 56 Xử lý số liệu………………………………………………………… 57 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………….. 58 Sàng lọc và đặc điểm sinh học của chủng vi tảo tiềm năng cho sản xuất astaxanthin…………………………………...................... 58 iv 3.1.1 Sàng lọc chủng vi tảo tiềm năng cho sản xuất astaxanthin……… 3.1.2 Định tên khoa học ở mức độ phân tử dựa vào đọc và so sánh trình tự gen 18S rRNA…………………………………………….. 3.1.3 64 Sự thay đổi hình thái và kích thƣớc tế bào trong vòng đời của H. pluvialis HB……………………………………………………... 3.2 60 Tách dòng và phân tích trình tự gen mã hóa cho enzyme carotenoid hydroxylase (CHY)…………………………………… 3.1.4 58 67 Nuôi trồng vi tảo lục H. pluvialis HB giàu astaxanthin trong các hệ thống khác nhau…………………………………………………... 75 3.2.1 Nuôi cấy vi tảo lục H. pluvialis HB trong pha 1...................................... 75 3.2.2 Điều kiện tối ưu cho tích lũy astaxanthin của chủng HB trong pha 2 91 3.3 Thử nghiệm bổ sung sinh khối tảo H. pluvialis HB giàu astaxanthin cho cá Koi Nhật và cá hồi Vân……………………… 107 3.3.1 Đánh giá chất lượng sinh khối tảo H. pluvialis HB…………………. 107 3.3.2 Thử nghiệm thức ăn có phối trộn astaxanthin từ sinh khối tảo H. 4.1 pluvialis HB lên màu sắc của cá Koi Nhật và cá hồi Vân…………... 108 CHƢƠNG IV. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………... 117 Đặc điểm sinh học của chủng Haematococcus sp. HB lựa chọn đƣợc…………………………………………………………… 4.2 Nuôi trồng vi tảo lục H. pluvialis HB giàu astaxanthin trong các hệ thống khác nhau.............................................................................................. 4.3 117 120 Sử dụng sinh khối tảo H. pluvialis HB giàu astaxanthin trong nuôi trồng thủy sản……………………………………………….. 129 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………... 132 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 134 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH……………………... 135 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………..... 140 PHỤ LỤC…………………………………………………………… v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết Tên đầy đủ Tên Tiếng Việt tắt AAPH 2,2'-Azobis (2-amidinopropane) 2,2'-Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride ACC dihydrochloride 1-aminocyclopropane-1-cacboxylic acid Axit 1-aminocyclopropane-1cacboxylic APXs Ascorbate peroxidase Ascorbate peroxidase ARA Arachidonic acid Axít arachidonic BHA Hydroxyanisole butylated Hydroxyanisole butylated BKT β - carotene oxygenase β - carotene oxygenase CHY β -carotene hydroxylase β -carotene hydroxylase C/N Carbon/nitrogen Các bon/nitơ DHA Docohexanenoic acid Axít docohexanenoic DNA Deoxyribonucleic acid Axít deoxyribonucleic DPA Docosanpentaenoic acid Axít docosanpentaenoic E. coli Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli EMS Etyl methanesulphonate Etyl methanesulphonate EPA Eicosapentaenoic acid Axít eicosapentaenoic EPR 2, 4-epibrassinolide 2, 4-epibrassinolide GA3 Gibberellic acid Axít gibberellic HB Hòa Bình Hòa Bình HTNK Hệ thống nuôi kín Hệ thống nuôi kín HTNH Hệ thống nuôi hở Hệ thống nuôi hở JA Jasmonic acid Axít jasmonic LB Lauria Betani Môi trường LB MB Methylene Blue Xanh methylene MĐTB Mật độ tế bào Mật độ tế bào vi MJ Methyl jasmonate Methyl jasmonate MNNG Methylnitronitrosoguanidine Methylnitronitrosoguanidine MV Methyl viologen Methyl viologen NTTS Nuôi trồng thủy sản Nuôi trồng thủy sản ORAC Oxygen radical absorbance capacity Chỉ số đánh giá khả năng chống ôxy hóa của một chất PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp ROS Reactive oxygen species phân tử ô xy có hoạt tính rRNA Ribosomal ribonucleic acid ARN riboxom SOD Superoxide dismutase Super oxide dismutase SEM Scanning electron microscope Kính hiển vi điện tử quét SKK Sinh khối khô Sinh khối khô TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng TB Tế bào Tế bào vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 1.3 Bảng 1.4 Bảng 1.5 Bảng 1.6 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 Bảng 3.12 Trang Nguồn cung cấp astaxanthin khác nhau……………………….. 10 So sánh hiệu quả của các phương pháp sản xuất astaxanthin khác nhau……………………………………………………………… 11 Thành phần dinh dưỡng của tảo H. pluvialis ở 2 giai đoạn sinh trưởng khác nhau………………………………………………... 20 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy astaxanthin ở vi tảo lục H. pluvialis…………………………………………………. So sánh một số thông số ở các kiểu nuôi trồng tảo khác nhau….. Nuôi trồng vi tảo lục H. pluvialis trong các hệ thống nuôi khác nhau……………………………………………………………... Bảng thống kê tỷ lệ phần trăm tương đồng (ma trận tam giác trên) và khoảng cách di truyền (ma trận tam giác dưới) của đoạn gen 18S rRNA giữa các loài thuộc chi Haematococcus………….. Bảng hệ số tương đồng về trình tự nucleotide giữa gen chy của loài H. pluvialis HB và các loài Haematococus trên ngân hàng gen Quốc tế……………………………………………………… Tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a của vi tảo H. pluvialis HB ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau…………………………............ Bảng so sánh thông số sinh trưởng của tảo H. pluvialis HB trong các môi trường nuôi và các cấp độ nuôi khác nhau……............... Sự thay đổi pH và nhiệt độ ở các hệ thống bể hở và kín………. Sinh trưởng của chủng HB ở HTNK 26 L…………………….. Sinh trưởng của chủng HB trong các HTNK 50 và 100 L……. Thành phần dinh dưỡng, kim loại nặng, vi sinh vật tổng số và hàm lượng astaxanthin của sinh khối tảo H. pluvialis HB nuôi trồng được dùng để phối trộn với thức ăn nuôi cá hồi Vân …… Đánh giá của 7 người có lứa tuổi và giới tính khác nhau về màu sắc của cá ở các giai thí nghiệm và giai đối chứng……………… Sinh trưởng của cá hồi Vân ở các lô đối chứng và thí nghiệm khác nhau Thành phần dinh dưỡng, hàm lượng kim loại nặng của thịt cá hồi Vân ở các lô thức ăn khác nhau……………………………. Hàm lượng lipít và thành phần axít béo của thịt cá hồi Vân ở các lô thí nghiệm và đối chứng……………………………………… 22 23 29 63 66 70 77 85 87 90 107 109 111 114 115 viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Cấu trúc của astaxanthin……………………………………. 6 Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp astaxanthin ở H. pluvialis………... 7 Hình 1.3 Phản ứng tổng hợp astaxanthin……………………………... 8 Hình 1.4 Vị trí hoạt động của astaxanthin trên màng tế bào…………. 12 Hình 1.5 Hình thái tế bào tảo H. pluvialis…………………………………. 17 Hình 1.6 Sự thay đổi hình thái tế bào (A) và sự phân bào (B) trong vòng đời của tảo H. pluvialis…………………………………… 18 Hình 1.7 Nuôi tảo H. pluvialis trong bể hở…………………………… 24 Hình 1.8 Các dạng HTNK nuôi tảo H. pluvialis………………………… 25 Hình 1.9 Phương pháp nuôi tảo H. pluvialis theo kiểu “Perfusion”…. 27 Hình 1.10 Mô hình nuôi cấy tảo H. pluvialis theo phương pháp nuôi gắn màng - Attached cultivation……………………………. Hình 2.1 Thanh màu sắc để so sánh màu sắc của cá ở các thí nghiệm khác nhau…………………………………………………… Hình 3.1 59 Sàng lọc các chủng vi tảo Haematococcus sp. tiềm năng trên môi trường thạch đĩa có chiếu ánh sáng cao…………… Hình 3.3 49 Thay đổi MĐTB của 9 chủng Haematococcus sp. sàng lọc trong môi trường RM lỏng………………………………….. Hình 3.2 31 59 Ảnh hình thái tế bào ở các giai đoạn sinh trưởng của chủng HB chụp dưới kính hiển vi quang học (hàng trên) và điện tử quét (SEM) (hàng dưới)……………………………………. Hình 3.4 Lưu giữ thành công vi tảo lục Haematococcus sp. HB trên môi trường C thạch và trong môi trường RM và C lỏng Hình 3.5 Hình 3.6 60 60 Kết quả tách chiết ADN tổng số (A) và sản phẩm PCR nhân một phần gen 18S rRNA (B) của mẫu HB…………………. 61 Sản phẩm PCR tinh sạch 1 phần gen 18S rRNA (A); PCR- 62 ix checking các dòng tế bào mang vectơ tái tổ hợp có một phần gen 18S rRNA (B) và tinh sạch DNA plasmid chứa vector tái tổ hợp (C) của mẫu vi tảo Haematococcus sp. HB……… Hình 3.7 Cây phát sinh chủng loại của mẫu Haematococcus sp. HB… 63 Hình 3.8 Tách dòng gen chy của loài H. pluvialis HB........................ 65 Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại của gen CHY từ vi tảo H. pluvialis HB với một số gen CHY của các loài thuộc chi Haematococcus đã được công bố trên ngân hàng GenBank Hình 3.10 Thay đổi MĐTB trong vòng đời của chủng HB nuôi ở các thể tích khác nhau (250, 500, 1000 mL; 1,5 và 10 L)...... 66 71 Hình 3.11 Sự thay đổi của hàm lượng chlorophyll a, astaxanthin và protein nội bào của chủng HB nuôi ở các cấp độ khác nhau trong môi trường RM (250, 500, 1000 mL; 1,5 và 10 L)....... 72 Hình 3.12 Ảnh chạy TLC dạng sắc tố của tế bào H. pluvialis HB ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau …………………………… 73 Hình 3.13 Sự thay đổi hình thái và kích thước tế bào trong vòng đời của chủng HB quan sát dưới kính hiển vi quang học………. 74 Hình 3.14 Sự thay đổi của MĐTB của chủng HB ở nhiệt độ (A) và cường độ ánh sáng (B) khác nhau…………………………... 79 Hình 3.15 Sự thay đổi của MĐTB của chủng HB ở pH (A) và nguồn nitơ (B) khác nhau…………………………………………... 79 Hình 3.16 Thay đổi MĐTB tảo H. pluvialis HB ở các nồng độ NO3trong bình tam giác 250 mL………………………………… 81 Hình 3.17 Thay đổi MĐTB (A) và hàm lượng astaxanthin (B) của chủng HB khi được nuôi cấy ở các chế độ chiếu sáng khác nhau…………………………………………………………. 82 Hình 3.18 Ảnh minh họa hình thái tế bào chủng HB ở chế độ chiếu sáng khác nhau kết hợp với nồng độ nitrate cao……………. 83 Hình 3.19 Thay đổi MĐTB của chủng HB khi nuôi cấy trong môi trường RM-4X có chiếu ánh sáng cao và UV, chu kì sáng: 84 x tối là 16:8 giờ kết hợp với kỹ thuật làm mới môi trường nuôi…………………………………………………………. Hình 3.20 Đồ thị tối ưu sinh trưởng của chủng HB trong HTNK 26 L... 87 Hình 3.21 Hình thái tế bào của chủng HB trong HTNK 26 L chụp dưới kính hiển vi quang học (A, x 400 lần) và huỳnh quang sau khi nhuộm Nile Red (B, x 12000 lần)………………………. Hình 3.22 Hình thái tế bào chủng HB dưới kính hiển vi quang học (A) 89 và nhuộm bằng Nile Red (B) ở HTNK 100 L………………. 90 Hình 3.23 Sự thay đổi MĐTB (A) và hàm lượng chlorophyll a (B) của chủng HB trong thí nghiệm nuôi cấy 2 pha (pha 2 - thiếu hụt nitơ)…………………………………………………………. 92 Hình 3.24 Sự thay đổi hàm lượng astaxanthin (A) và protein (B) của chủng HB trong thí nghiệm nuôi cấy 2 pha (pha 2 - thiếu hụt nitơ)…………………………………………………………. 92 Hình 3.25 Ảnh bình thí nghiệm ở pha thiếu hụt nitơ (đối chứng và thí nghiệm) và ở giai đoạn nảy mầm của chủng HB…………… 93 Hình 3.26 Một số ảnh hình thái tế bào của chủng HB ở thí nghiệm nuôi cấy 2 pha (pha 2 - thiếu hụt nitơ)…………………………… 93 Hình 3.27 Sự thay đổi MĐTB (A) và hàm lượng chlorophyll a (B) của H. pluvialis HB ở thí nghiệm nuôi cấy 2 pha (pha 2 - chiếu ánh sáng cao)………………………………………………... 94 Hình 3.28 Sự thay đổi hàm lượng astaxanthin (A) và protein (B) của chủng HB ở thí nghiệm nuôi cấy 2 pha (pha 2- chiếu ánh sáng cao)……………………………………………………. 94 Hình 3.29 Một số ảnh hình thái tế bào chủng HB ở các giai đoạn trong quá trình nuôi cấy 2 pha (pha 2 - chiếu ánh sáng cao)…… 95 Hình 3.30 Sự thay đổi MĐTB (A) và tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a (B) chủng HB ở các nồng độ muối khác nhau……………… 96 Hình 3.31 Ảnh minh họa hình thái tế bào của chủng HB ở nồng độ NaCl khác nhau sau 35 ngày nuôi ở cấp độ bình tam giác 97 xi 500 mL được chụp bằng kính hiển vi quang học (độ phóng đại ảnh 2000 X)……………………………………………... Hình 3.32 Sự thay đổi hàm lượng chlorophyll (A) và astaxanthin (B) của chủng HB trong thí nghiệm nuôi cấy 2 pha với pha 2 sốc muối NaCl 0,8, 1,5 và 2,5%.............................................. 98 Hình 3.33 Sự thay đổi hàm lượng chlorophyll (A) và astaxanthin (B) của chủng HB trong thí nghiệm nuôi cấy 2 pha với pha 2 sốc muối NaCl 0,8, 1,5 và 2,5%.............................................. Hình 3.34 Sự thay đổi hàm lượng lipit tổng số của chủng HB ở nồng 98 độ sốc muối khác nhau……………………………………… 99 Hình 3.35 Hình thái tế bào chủng HB chụp dưới kính hiển vi quang học (A) và huỳnh quang sau khi nhuộm Nile Red (B) (x 1000 lần) ở công thức đối chứng, công thức 1,5 và 2,5% NaCl trong 100 bình tam giác 250 mL. Thanh thước kích thước 10 µm……… Hình 3.36 Sự thay đổi MĐTB của chủng HB ở các tỷ lệ C/N khác nhau…………………………………………………………. 101 Hình 3.37 Thay đổi hàm lượng astaxanthin (A) và tỷ lệ astaxanthin/ chlorophyll a (B) của chủng HB ở các tỷ lệ C/N khác nhau………………………………………………………… 102 Hình 3.38 Thay đổi MĐTB (A) và hàm lượng astaxanthin (B) của chủng HB ở các nồng độ bicarbonate khác nhau…………… 103 Hình 3.39 Hình thái tế bào của chủng HB ở pha 2 được cảm ứng tích lũy astaxanthin ở các nồng độ bicarbonate khác nhau. Thanh thước có kích thước 10 µm…………………………………. 104 Hình 3.40 Bình nuôi và tế bào chủng HB chuyển màu đỏ ở pha 2 - cảm ứng tích lũy astaxanthin ở nồng độ 100 mM HC03-……….. 104 Hình 3.41 Ảnh minh họa bình nuôi tảo H. pluvialis HB ở pha 2 - cảm ứng tích lũy astaxanthin bằng nồng độ bicarbonate khác nhau………………………………………………………… 104 Hình 4.42 Ảnh minh họa bước lắng trọng lực của sinh khối chủng HB 106 xii Hình 3.43 Hiệu quả lắng tương đối của sinh khối chủng HB………… 106 Hình 3.44 Sắc ký đồ astaxanthin chuẩn 50 ppm (A) và astaxanthin được tách từ tảo H. pluvialis HB (B)……………………….. 107 Hình 3.45 Cá Koi thí nghiệm (trên) và cá ĐC (dưới) có màu sắc khác nhau…………………………………………………………. 110 Hình 3.46 So sánh màu sắc của cá Koi ở các giai thí nghiệm khác nhau (Đối chứng (A); Thí nghiệm bổ sung astaxanthin: (B) 100 mg/kg thức ăn, (C) 150 mg/kg thức ăn và (D) 200 mg/kg thức ăn………………………………………………………. 110 Hình 3.47 Tăng trưởng khối lượng và chiều dài cá Koi của các giai thí nghiệm khác nhau theo thời gian…………………………… 111 Hình 3.48 Ảnh chụp minh họa kích thước của cá hồi Vân ở các lô đối chứng (ăn cám Pháp), lô thí nghiệm ăn cám Việt Nam và ăn cám Việt Nam có bổ sung thêm 61 mg astaxanthin từ sinh khối vi tảo H. pluvialis HB/ 1kg thức ăn…………………… 113 Hình 3.49 Ảnh minh họa về màu sắc thịt cá hồi ở 3 công thức được nuôi bằng thức ăn khác nhau……………………………….. 113 xiii 1   MỞ ĐẦU Vi tảo là mắt xích đầu tiên và then chốt trong chuỗi thức ăn của thủy vực; chúng sử dụng nguồn CO2 cho quang hợp, góp phần giảm thiểu phát thải khí nhà kính nhằm duy trì hệ sinh thái trái đất. Ngoài lợi ích sinh thái, vi tảo là một nguồn thức ăn có giá trị dinh dưỡng đồng thời chúng còn tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị sinh học cao. Với sự phát triển rất mạnh của ngành công nghệ sinh học vi tảo, nhiều hướng nghiên cứu và ứng dụng mới đã được mở ra. Trong đó, việc sử dụng vi tảo nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng thức ăn cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản (NTTS) và khai thác các chất có hoạt tính sinh học cao vẫn là lĩnh vực chiếm ưu thế, mang lại lợi nhuận cao và có tiềm năng phát triển trong tương lai. NTTS xuất khẩu là một trong những thế mạnh của Việt Nam. Trong ngành NTTS Việt Nam, nuôi cá hồi đang là một hướng đi mới, với nhiều tiềm năng về giá trị kinh tế và dinh dưỡng. Tuy nhiên, ngành nuôi cá hồi ở Việt Nam hiện nay đang gặp nhiều khó khăn, chủ yếu là do nguồn thức ăn kém chất lượng. Astaxanthin là thành phần carotenoid chính để tạo màu sắc cho cá hồi và một số cơ thể thủy hải sản khác. Cá hồi không tự tổng hợp được astaxanthin trong cơ thể mà phải được cung cấp từ thức ăn nhân tạo. Hiện nay, toàn bộ thức ăn cho cá hồi đều nhập ngoại vì trong nước chưa sản xuất được astaxanthin. Astaxanthin có thể được tổng hợp nhân tạo. Tuy nhiên, với astaxanthin nhân tạo, cá hồi khó hấp thu. Do vậy, việc tìm kiếm nguồn sinh vật có khả năng sinh tổng hợp astaxanthin tự nhiên cao đang được tập trung nghiên cứu cả trong nước và quốc tế. Trong tự nhiên, mặc dù một số loại thực vật, vi khuẩn và nấm men có khả năng tổng hợp astaxanthin nhưng hàm lượng astaxanthin nội bào của chúng rất thấp. Trong khi đó, vi tảo lục Haematococcus pluvialis (H. pluvialis) có khả năng tích lũy astaxanthin từ 3-7% sinh khối khô (SKK). Đây là một ứng cử viên tiềm năng cao để khai thác nguồn astaxanthin tự nhiên. Trước đây, giá thành sản xuất vi tảo lục H. pluvialis rất cao (khoảng 200÷250 đô la/kg SKK) nên không thể sử dụng 2   loài này như một nguồn cung cấp astaxanthin tự nhiên cho mục đích thương mại. Hiện nay, do sự phát triển của công nghệ sinh học tảo nói chung và công nghệ nuôi trồng vi tảo nói riêng đã đem lại những kết quả quan trọng trong nuôi trồng một số loại tảo, trong đó có H. pluvialis. Trên thế giới, việc nghiên cứu đặc điểm sinh học, công nghệ nuôi trồng và ứng dụng loài vi tảo lục này với mục đích tạo màu sắc cho các đối tượng NTTS đã được quan tâm và triển khai rộng rãi. Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu nhằm khai thác và ứng dụng sinh khối tảo Haematococcus giàu astaxanthin làm tăng màu sắc và chất lượng thịt của các đối tượng NTTS tiềm năng vẫn còn mới mẻ, hứa hẹn sẽ mang lại nhiều lợi ích thực tiễn cho đời sống con người. Hơn nữa, loài tảo này có tốc độ sinh trưởng chậm, có chu trình sống phức tạp và nhạy cảm với sự thay đổi của điều kiện nuôi cấy nên cần có những nghiên cứu sâu về đặc điểm sinh học, thiết lập được qui trình công nghệ nuôi trồng phù hợp đối với tảo này ở các cấp độ nuôi khác nhau. Chính vì vậy, nhằm tháo gỡ những khó khăn hiện nay trong nuôi trồng loài vi tảo lục nêu trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của loài vi tảo lục Haematococcus pluvialis Flotow nhằm ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản” với mục đích: Có được điều kiện nuôi cấy tối ưu một chủng/loài vi tảo lục Haematococcus pluvialis tiềm năng cho sản xuất astaxanthin để làm thức ăn bổ sung cho một số đối tượng nuôi trồng thủy sản. Để thực hiện được mục tiêu nêu trên, một số nội dung nghiên cứu cần được thực hiện như sau: ü Sàng lọc, định tên khoa học dựa trên các đặc điểm hình thái và trình tự gen 18S rRNA và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi tảo lục Haematococcus sp. HB tiềm năng lựa chọn được; ü Tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng Haematococcus pluvialis HB trong các hệ thống nuôi khác nhau (bình tam giác, bình nhựa 1,5 và 10 Lít (L); Hệ thống nuôi kín 20, 50 và 100 L) ở điều kiện phòng thí nghiệm; ü Tối ưu điều kiện tích lũy astaxanthin của chủng Haematococcus pluvialis HB ở qui mô phòng thí nghiệm; 3   ü Sử dụng sinh khối chủng tảo Haematococcus pluvialis HB giàu astaxanthin làm thức ăn bổ sung cho cá Koi Nhật (Cyprinus carpio) và cá hồi Vân (Oncorhynchus mykiss) nhằm tăng màu sắc và chất lượng thịt của cá. Những đóng góp mới của luận án 1. Lần đầu tiên nghiên cứu có hệ thống về đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của vi tảo lục Haematococcus pluvialis Flotow HB nguồn gốc Việt Nam đạt mật độ 4,02 x 106 TB/mL và 48,8 mg astaxanthin/g sinh khối khô. 2. Bước đầu thử nghiệm hiệu quả việc sử dụng sinh khối của chủng H. pluvialis HB giàu astaxanthin bổ sung vào thức ăn cho cá hồi Vân và cá Koi Nhật ở Việt Nam. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 1. Có được những dẫn liệu khoa học về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng Haematococcus pluvialis HB sàng lọc được có tiềm năng sản xuất astaxanthin; 2. Chứng minh được khả năng ứng dụng sinh khối chủng HB giàu astaxanthin trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản, giúp chủ động nguồn thức ăn giàu astaxanthin cho các trại nuôi cá hồi và cá cảnh. 4   CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Vi tảo là thành phần chủ yếu tạo nên năng suất sơ cấp của thủy vực và giữ vai trò quan trọng trong việc duy trì sự phát triển của hệ sinh thái nước. Hàng năm, trong số 200 tỉ tấn chất hữu cơ được tạo thành trên trái đất, có 170 - 180 tỉ tấn do tảo tạo ra, còn lại 20 - 30 tỉ tấn là do các loài thực vật khác. Ý nghĩa lớn lao của các loài tảo là giải phóng ôxy thông qua hoạt động quang hợp cung cấp cho các sinh vật sống dưới nước, khép kín chu trình vật chất trong các thuỷ vực và tăng tốc độ quay vòng của các chu trình đó (Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền (1994)). Trong tự nhiên, vi tảo là thành phần cơ bản của chuỗi thức ăn của thuỷ vực. Với kích thước cơ thể phù hợp, giàu dinh dưỡng, dễ tiêu hoá ít gây ô nhiễm môi trường, nhiều loại không có độc tố và có khả năng nuôi sinh khối lớn nên vi tảo đã trở thành nguồn thức ăn không thể thiếu trong các giai đoạn sinh trưởng của nhuyễn thể hai mảnh vỏ, giai đoạn ấu trùng của một số loài giáp xác, các giai đoạn sinh trưởng sớm của một số loài cá hoặc để sản xuất khối lượng lớn các động vật phù du như Artemia, Luân trùng (Rotifer)….Ngoài nguồn thức ăn truyền thống như thịt, cá, trứng, sữa, rau, quả, củ có nguồn gốc từ động vật và thực vật, tảo là một nguồn thức ăn dinh dưỡng cho người và vật nuôi. Nhiều loài vi tảo không chỉ có hàm lượng protein cao mà còn giàu gluxit, lipít, vitamin và các axít béo mạch dài không bão hòa đa nối đôi (PUFAs) có mạch carbon trên 20 như axít arachidonic (ARA; C20:4n-6), axít eicosapentaenoic (EPA; C20:5n-3), axít docohexanenoic (DHA; C22:6n-3) và axít docosanpentaenoic (DPA; C22:5n-6) - các chất có vai trò quan trọng trong dinh dưỡng của người và đặc biệt trong hoạt động của não và mắt. Ngoài ra, vi tảo có khả năng sử dụng nguồn CO2 trong khí quyển cũng như hấp thụ nguồn CO2 được thải ra từ các nhà máy thông qua quá trình quang hợp, góp phần làm giảm thiểu phát thải khí nhà kính gây ra hiện tượng ấm lên của trái đất và dẫn đến biến đối khí hậu toàn cầu. 5   Tuy nhiên, ứng dụng phổ biến nhất hiện này của vi tảo vẫn là làm thức ăn trong NTTS và tách chiết các chất có hoạt tính sinh học có tiềm năng thương mại lớn (Spolaore và cs, 2006). Trong các sản phẩm từ tảo thì astaxanthin có giá trị thương mại lớn do các ứng dụng đa dạng với giá thành cao (khoảng 2.500 – 3000 $/kg) (Lorenz & Cysewski, 2000). Astaxanthin có nhiều chức năng sinh học như có hoạt tính chống ôxy hoá, là tiền chất của một số hormone nhất định, tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể. Chúng có tác dụng cải thiện khả năng sinh sản, thúc đẩy sự phát triển và chức năng bảo vệ cơ thể khỏi tác dụng của ánh sáng cao. Chính những đặc điểm trên mà astaxanthin ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực của đời sống con người như trong y học, dược phẩm, mỹ phẩm và trong ngành NTTS. Sau đây, chúng tôi xin trình bày khái quát những đặc điểm chính về astaxanthin. 1.1. Giới thiệu chung về astaxanthin 1.1.1. Đặc điểm chung Astaxanthin (3,3`-dihydroxy-β,β`-carotene-4,4`-dione ) là một carotenoid có màu đỏ cam, là dẫn xuất của các hợp chất isoprenoid, chúng tạo thành các chất có màu sắc khác nhau trong tự nhiên và có chức năng sinh học thiết yếu đối với động vật. Astaxanthin có thể được tìm thấy trong nhiều loại thuỷ hải sản như cá hồi, cá vền, tôm, cua, trứng cá, đôi khi astaxanthin cũng được phát hiện ở một số loài chim. Động vật có vú không có khả năng tổng hợp astaxanthin và phải được cung cấp từ khẩu phần ăn (Higuera-Ciapara và cs, 2006). Astaxanthin có công thức phân tử là C40H52O4, điểm nóng chảy xấp xỉ 224oC. Chúng không hoà tan trong các dung dịch lỏng và hầu hết các dung môi hữu cơ, tuy nhiên, chúng có thể hoà tan trong các dung môi không phân cực như acetone, dimethyl-sulfoxide ngay ở nhiệt độ phòng. So với các loại carotenoid khác, astaxanthin dễ dàng được hấp thụ và tích luỹ. 1.1.2. Cấu trúc của astaxanthin Phân tử astaxanthin có hai carbon không đối xứng ở vị trí 3 và 3’ của vòng βionone. Astaxanthin có ba dạng cấu hình là astaxanthin tự do, monoester và diester
- Xem thêm -