Tài liệu Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn streptomyces toxytricini (vn08 a12) kháng bệnh bạc lá lúa do xanthomonas oryzae​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN THỊ VÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA DO Xanthomonas oryzae LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------- NGUYỄN THỊ VÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA DO Xanthomonas oryzae Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Dương Văn Hợp TS. Phạm Thế Hải Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Dương Văn Hợp và TS. Phạm Thế Hải, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn em rất tận tình trong cả quá trình thực hiện đề tài, giúp em vượt qua khó khăn và hoàn thành tốt luận văn này. Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học, trường Đại Học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và cung cấp cho em những kiến thức bổ ích trong suốt hai năm học vừa qua và giúp đỡ em rất nhiều trong việc nắm bắt kiến thức cũng như động viên em rất lớn về mặt tinh thần. Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Kim Nữ Thảo Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt luận văn này. Em cũng xin chân thành cảm ơn TS. Phan Thị Phương Hoa (chủ nhiệm đề tài Nafosted số 106.03 - 2010.34 “Sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn dùng cho đấu tranh sinh học và diệt vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam”) và các thành viên tham gia đề tài đã hỗ trợ cho em kỹ thuật chuyên môn để em hoàn thành luận văn. Em cũng xin gửi lời cảm ơn Ban lãnh đạo và các anh chị Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học đã luôn chia sẻ, giúp đỡ và tạo điều kiện rất lớn trong suốt quá trình em thực hiện luận văn. Em xin cảm ơn TS. Kyung Sook Bae, TS. Song Gun Kim và cử nhân Hyangmi Kim Bảo tàng giống chuẩn (KCTC), Viện Khoa học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong thời gian học tập ngắn hạn tại Hàn Quốc để em hoàn thành luận văn. Em xin cảm ơn TS. Hiroshi Kinoshita trường Đại học Osaka Nhật Bản đã hỗ trợ và giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu để em hoàn thành luận văn này. i Xin cảm ơn sinh viên Vũ Thị Kim Chi đã hỗ trợ em một số công việc thí nghiệm trong quá trình nghiên cứu để em hoàn thành luận văn. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình thân yêu và bạn bè đã luôn ở bên, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn. Hà Nội, ngày 2 tháng 10 năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Vân ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .................................................................................... 3 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN .................................................................................... 4 1.1. Bệnh bạc lá lúa và tác hại của bệnh bạc lá lúa ................................................... 4 1.1.1. Giới thiệu chung............................................................................................4 1.1.2. Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa........................................................................5 1.2. Các cách phòng trừ bệnh bạc lá lúa ................................................................... 7 1.2.1. Sử dụng thuốc hóa học..................................................................................7 1.2.2. Chọn giống lúa kháng bệnh...........................................................................8 1.2.3. Khống chế sinh học.....................................................................................11 1.3. Xạ khuẩn ........................................................................................................ 12 1.3.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn......................................................................12 1.3.2. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn..............................................14 1.3.3. Sử dụng xạ khuẩn trong khống chế sinh học...............................................16 1.4. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn trong kiểm soát bệnh bạc lá lúa ..................... 17 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 19 2.1. Nguyên liệu và hóa chất .................................................................................. 19 2.1.1 Nguyên liệu..................................................................................................19 2.1.1.1. Các chủng Xoo ................................................................................... 19 iii 2.1.1.2. Các chủng xạ khuẩn ........................................................................... 20 2.1.1.3. Vi sinh vật kiểm định ......................................................................... 20 2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị.......................................................................20 2.1.2.1. Hóa chất ............................................................................................. 20 2.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................. 21 2.1.2.3. Môi trƣờng nghiên cứu ....................................................................... 21 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 22 2.2.1. Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật..............................................22 2.2.1.1. Phƣơng pháp thỏi thạch ...................................................................... 22 2.2.1.2. Phƣơng pháp đục lỗ thạch .................................................................. 23 2.2.2. Phân loại bằng đặc điểm hình thái...............................................................23 2.2.2.1. Hình thái khuẩn lạc ............................................................................ 23 2.2.2.2. Hình thái chuỗi sinh bào tử và bề mặt bào tử ...................................... 23 2.2.3. Hóa phân loại...............................................................................................24 2.2.3.1. Phân tích thành phần axit amin trong thành tế bào .............................. 24 2.2.3.2. Phân tích thành phần menaquinone .................................................... 24 2.2.3.3. Phân tích thành phần axit béo ............................................................. 25 2.2.3.4. Phân tích thành phần G+C trong ADN ............................................... 25 2.2.4. Phân loại sinh học phân tử giải trình tự 16S - rADN..................................25 2.2.5. Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy xạ khuẩn......................................................27 2.2.5.1. Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy thích hợp ............................................ 27 2.2.5.2. Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp ................................................ 27 2.2.5.3. Lựa chọn thể tích nuôi cấy thích hợp .................................................. 28 2.2.5.4. Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy ................................................................ 28 iv 2.2.5.5. Lựa chọn cách cấy giống .................................................................... 28 2.2.6. Tinh sạch hoạt chất kháng Xoo...................................................................28 2.2.6.1. Tách dịch chiết thô ............................................................................. 28 2.2.6.2. Tinh sạch bằng silica gel .................................................................... 28 2.2.6.3. Tinh sạch bằng HPLC ........................................................................ 29 2.2.7. Xác định khối lƣợng phân tử bằng khối phổ (MS)......................................29 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 31 3.1. Khả năng kháng vi sinh vật của chủng xạ khuẩn VN08 - A12. ........................ 31 3.2. Phân loại chủng VN08 - A12 .......................................................................... 32 3.2.1. Phân loại bằng hình thái..............................................................................32 3.2.2. Hóa phân loại..............................................................................................33 3.2.2.1. Thành phần axit amin trong thành tế bào ............................................ 33 3.2.2.2. Thành phần menaquinone ................................................................... 34 3.2.2.3.Thành phần axit béo ............................................................................ 35 3.2.2.4. Thành phần G + C trong ADN............................................................ 37 3.2.3. Trình tự 16S rADN......................................................................................38 3.3. Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy của chủng VN08 - A12 .................................... 39 3.3.1. Môi trƣờng nuôi cấy thích hợp....................................................................39 3.3.2. Thời gian nuôi cấy thích hợp.......................................................................40 3.3.3. Thể tích nuôi cấy thích hợp.........................................................................41 3.3.4. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp........................................................................41 3.3.5. Cách cấy giống thích hợp............................................................................42 3.4. Tinh sạch và phân tích hoạt chất kháng Xoo của chủng VN08 - A12 .............. 43 3.4.1. Tinh sạch hoạt chất kháng Xoo của chủng VN08 - A12.............................43 v 3.4.2. Phân tích trọng lƣợng phân tử.....................................................................47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 51 4.1. Kết luận .......................................................................................................... 51 4.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 52 PHỤ LỤC........................................................................................................... - 1 - vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Đặc điểm và nguồn gốc của các gen Xa kháng bệnh bạc lá lúa [37] ............ 8 Bảng 2. Trình tự các đoạn mồi đặc hiệu để phát hiện gen Xa trên lúa [15] ............... 9 Bảng 3. Danh sách 10 chủng Xoo phân lập đƣợc ở miền Bắc Việt Nam đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ........................................................................................... 19 Bảng 4. Chƣơng trình phân tích HPLC .................................................................. 29 Bảng 5. Hoạt tính kháng 10 chủng Xoo của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 ............. 31 Bảng 6. Hoạt tính kháng vi sinh vật của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 ................... 31 Bảng 7. Hoạt tính kháng vi sinh vật có lợi của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 ......... 32 Bảng 8 : Kết quả phân tích thành phần menaquinone của chủng VN08 - A12 ........ 35 Bảng 9. Kết quả phân tích thành phần menaquinone của chủng VN08 - A12 ......... 36 Bảng 10. Kết quả phân tích thành phần GC của chủng VN08 - A12 ...................... 38 Bảng 11. Hoạt chất của VN08 - A12 thu đƣợc từ các phân đoạn khi tinh sạch bằng silica gel ................................................................................................................ 44 Bảng 12. Hoạt chất của VN08 - A12 thu đƣợc từ HPLC từ phân đoạn 4.1 ............. 45 Bảng 13. Chƣơng trình chạy HPLC phân tích thành phần axit amin ................... - 1 Bảng 14. Phân tích thành phần menaquinone chuẩn........................................... - 2 Bảng 15. Phân tích thành phần axit béo chuẩn .................................................... - 3 Bảng 16. Trình tự mồi dùng cho phản ứng đọc trình tự ADNr 16S ..................... - 5 - vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Lúa bị nhiễm bệnh bạc lá do vi khuẩn Xoo. ................................................. 5 Hình 2. Khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn Xoo [9] ................................................... 6 Hình 3. Tổn thƣơng ít trên lá của giống lúa IRBB21 chứa gen Xa21 do bệnh bạc lá lúa ở Ấn Độ [19] ................................................................................................... 10 Hình 4. Khuẩn lạc của một số chủng xạ khuẩn. ..................................................... 14 Hình 5. Cuống sinh bào tử của một số chủng xạ khuẩn. ......................................... 14 Hình 6. Bản đồ phân bố của 10 chủng Xoo ở miền Bắc Việt Nam đƣợc sử dụng trong nghiên cứu .................................................................................................... 20 Hình 7. Khuẩn lạc và chuỗi bào tử của chủng VN08 - A12 .................................... 33 Hình 8. Chuỗi bào tử và bào tử của chủng VN08 - A12 ......................................... 33 Hình 9. Kết quả chạy sắc ký bản mỏng thành phần axit amin trong thành tế bào của chủng VN08 - A12. ............................................................................................... 34 Hình 10. Kết quả phân tích LC thành phần menaquinone của chủng VN08 - A12. 35 Hình 11. Sắc ký đồ thành phần axit béo của chủng VN08 - A12 ............................ 36 Hình 12. Sắc ký đồ thành phần GC của chủng VN08 - A12 ................................... 37 Hình 13. Cây phân loại chủng VN08 - A12 dựa trên trình tự gen 16S – rADN. ..... 39 Hình 14. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy khác nhau đến sự sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08 - A12 ....................................... 40 Hình 15. Ảnh hƣởng của thời gian cấy khác nhau đến sự sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08 - A12 .................................................. 40 Hình 16. Ảnh hƣởng của thể tích môi trƣờng nuôi cấy khác nhau đến sự sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08 - A12 (S. toxytricini) .. 41 Hình 17. Ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy khác nhau đến sự sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08 - A12 ......................... 42 Hình 18. Ảnh hƣởng của cách cấy giống đến sự sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08 - A12. ................................................................... 43 Hình 19. Quy trình tách dịch chiết thô của chủng VN08 - A12 .............................. 44 Hình 20. Phổ HPLC của hoạt chất chủng VN08 - A12........................................... 46 viii Hình 21. Phổ HPLC của hoạt chất sau tinh sạch .................................................... 47 Hình 22. Phổ hấp thụ UV của hoạt chất sau tinh sạch ............................................ 47 Hình 23. Kết quả phân tích khối phổ của chủng VN08 - A12 ................................ 48 Hình 24. Cấu trúc hóa học của factumycin [31] ..................................................... 48 Hình 25. Cấu trúc của factumycin [46] .................................................................. 49 Hình 26. Cụm gen sinh tổng hợp factumycin (A) WAC5292 (Streptomyces toxytricini) và (B) Streptomyces cattleya………………………………………………..49 Hình 27. Sắc ký đồ thành phần menaquinone chuẩn ........................................... - 2 Hình 28. Sắc ký đồ thành phần axit béo chuẩn.................................................... - 4 Hình 29. Hoạt tính kháng Xoo của VN08 - A12 trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau ................................................................................................................... - 7 Hình 30. Hoạt chất kháng sinh của chủng VN08 - A12 ....................................... - 7 - ix TỪ VIẾT TẮT ADN Axit deoxyribonucleic Ala Alanine DAP Diaminopimelic DW Distilled Water (Nƣớc cất) ĐHQGHN Đại học Quốc Gia Hà Nội GC Gas Chromatography (Sắc ký khí) Glu Glutamic acid Gly Glycine HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) Lys Lysine MQ Milli- Q water MS Mass Spectrometry ( Phƣơng pháp khối phổ) MT Môi trƣờng SKS Sinh kháng sinh TLC Thin- layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) VTCC Xoo Vietnam Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật) Xanthomonas oryzae pv. Oryzae x MỞ ĐẦU Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra, xuất hiện khá phổ biến trên các khu vực trồng lúa ở Việt Nam, đặc biệt tập trung ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long. Bệnh gây hại trong vụ lúa hè thu nhiều hơn trong vụ đông xuân do thời tiết ẩm ƣớt, nhiều sƣơng mù, độ ẩm không khí cao. Bệnh xuất hiện và gây hại từ giai đoạn lúa đẻ nhánh đến đòng trổ và chín. Bệnh bạc lá lúa gây thiệt hại rất nặng nề cho ngành nông nghiệp, làm giảm năng suất lúa 25 50 %, thậm chí mất trắng (Số liệu thống kê của cục bảo vệ thực vật). Do đó, việc kiểm soát và ngăn chặn sự bùng phát của bệnh bạc lá lúa là vấn đề rất quan trọng và là mối quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu khoa học. Một trong những giải pháp quan trọng nhất phòng trừ bệnh bạc lá lúa hiện nay là sử dụng các dòng lúa mang gen kháng bệnh. Tuy nhiên, các dòng lúa chỉ mang một vài gen kháng đơn lẻ, đƣợc nuôi trồng liên tục trên diện rộng dẫn đến tình trạng các chủng Xoo có khả năng gây bệnh ngay cả khi có các gen kháng đó [18]. Chính vì vậy, việc kiểm soát bệnh bạc lá lúa bằng biện pháp sinh học đang thu hút đƣợc sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu [36]. Một trong những biện pháp sinh học đó là việc sử dụng xạ khuẩn để khống chế vi khuẩn gây bệnh, đây là biện pháp có triển vọng cao, an toàn với môi trƣờng và có hiệu quả về kinh tế. Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram dƣơng, đƣợc biết đến nhƣ nguồn sinh các chất kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh học. Trong số khoảng hơn 10000 loại thuốc kháng sinh đƣợc phát hiện do vi sinh vật thì có đến hai phần ba đƣợc phân lập từ xạ khuẩn mà chủ yếu thuộc chi Streptomyces; và nhiều chất trong đó là các thuốc kháng sinh đang đƣợc ứng dụng và sản xuất rộng rãi hiện nay [6]. Ngoài ra xạ khuẩn còn là nguồn sinh các loại vitamin, enzym, chất ức chế miễn dịch, hocmôn sinh trƣởng. Số loài xạ khuẩn trong tự nhiên ƣớc tính lớn hơn rất nhiều so với con số 1000 loài đƣợc công bố. Đồng thời xạ khuẩn luôn là nguồn vi sinh vật rất giá trị trong việc tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học mới. Bộ sƣu tập hơn 3000 chủng 1 xạ khuẩn đang đƣợc bảo quản tại Bảo tàng giống chuẩn, Viện Vi Sinh và Công nghệ sinh học, ĐHQGHN hứa hẹn tiềm năng tìm ra các chất có hoạt tính sinh học mới dùng cho việc khống chế và tiêu diệt vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam hiện nay. Trong nghiên cứu này, đƣợc sự tài trợ của quỹ đề tài NAFOSTED, TS. Phan Thị Phƣơng Hoa và các cộng sự đã sàng lọc 2690 chủng xạ khuẩn và lựa chọn đƣợc 17 chủng có khả năng kháng tất cả 10 chủng Xoo. Trong đó, lựa chọn chủng VN08 - A12 là một tác nhân kiểm soát sinh học của bệnh bạc lá lúa. Chủng VN08 A12 có nhiều ƣu điểm nổi bật đã đƣợc thử nghiệm ngoài đồng ruộng và thu đƣợc kết quả rất đáng mừng. Kết quả cho thấy chủng VN08-A12 không chỉ có thể làm giảm chiều dài tổn thƣơng của cây lúa do nhiễm Xoo, mà còn làm giảm đáng kể tổn thất năng suất của giống lúa bị nhiễm Xoo [23] [24]. Chính vì vậy, để phát triển một chế phẩm khống chế sinh học để kiểm soát bệnh bạc lá lúa, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) kháng bệnh bạc lá lúa do Xanthomonas oryzae”. 2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu này đƣợc thực hiện nhằm thực hiện các mục tiêu cụ thể nhƣ sau:  Phân loại chủng xạ khuẩn VN08 - A12.  Lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ƣu nhất để khả năng sinh hoạt chất của chủng xạ khuẩn là cao nhất.  Tinh sạch và xác định cấu trúc của hoạt chất kháng Xoo sinh ra bởi chủng xạ khuẩn VN08 - A12. 3 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Bệnh bạc lá lúa và tác hại của bệnh bạc lá lúa 1.1.1. Giới thiệu chung Bệnh bạc lá lúa - hay còn gọi là bệnh cháy bìa lá lúa (Bacterial leaf blight disease) là một trong những bệnh phổ biến trong các nƣớc trồng lúa. Bệnh bạc lá lúa đƣợc phát hiện lần đầu ở vùng Fukuoko, Kyushu, Nhật Bản ngay từ những năm 1884 [45]. Hiện nay, bệnh bạc lá đã xảy ra trên rất nhiều quốc gia, đặc biệt ở châu Á. Ở nhiều nƣớc châu Á, căn bệnh này đã trở thành đại dịch trên lúa. Bệnh có thể làm giảm sản lƣợng ở mức độ khác nhau, tùy thuộc vào giai đoạn nhiễm bệnh của cây, mức độ nhạy cảm của giống lúa và ảnh hƣởng của môi trƣờng. Ở một số nƣớc châu Á và Đông Nam Á, bệnh bạc lá lúa thƣờng làm giảm năng suất 10 - 20 % nhƣng có thể lên đến 50% [33] [38]. Ở Nhật Bản, thiệt hại năng suất ƣớc tính là 20 30% thậm chí đến 50%. Ở vùng nhiệt đới, bệnh phá hoại gây ảnh hƣởng nặng tới hàng triệu ha lúa. Ở Ấn Độ, thiệt hại về sản lƣợng từ 6 đến 60%. Việc giảm sản lƣợng chủ yếu là do giảm số lƣợng bông và trọng lƣợng hạt [43]. Ở Việt Nam, tuy khả năng lây lan thành dịch của bệnh bạc lá lúa không cao nhƣ các bệnh dịch hại khác nhƣ rầy nâu, đạo ôn, hậu quả do bệnh bạc lá lúa gây ra không hề thua kém những dịch hại khác. Theo số liệu thống kê của cục Bảo vệ Thực vật, từ năm 1999 - 2003 diện tích lúa bị hại do bệnh bạc lá gây ra trong cả nƣớc là 108.691,4 ha (miền Bắc là 86.429,2 ha; miền Nam là 22.262,2 ha), trong đó diện tích bị hại nặng nhất là 156,76 ha và diện tích mất trắng là 80 ha. Cho đến năm 2013 diện tích lúa nhiễm bệnh bạc lá là 135,4 nghìn ha, tăng gấp 6,5 lần so với năm 2010. Từ năm 2010 đến năm 2011 diện tích cây mắc bệnh tăng nhẹ và đột ngột tăng cao trong giai đoạn từ năm 2011 đến năm 2012. Diện tích lúa bị mắc bệnh năm 2012 là 90,543 nghìn ha, cao gấp gần 4 lần so với năm 2011 (26 nghìn ha) đến năm 2013 diện tích lúa bị mắc bệnh đã tăng đến 135,4 nghìn ha. Trong đó diện tích lúa bị nhiễm nặng là hơn 9,5 ngàn ha. Tình trạng mất trắng vẫn đang diễn ra và tăng cao trong các năm trở 4 lại đây tập trung nhiều tại các tỉnh phía bắc và một số tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long. Tuy nhiên, kết quả khảo sát mới đây của chi cục cho thấy, vụ hè thu 2014, lần đầu tiên bệnh này đã xuất hiện tập trung ở cánh đồng huyện Đạ Tẻh , Lâm Đồng và diện tích nhiễm bệnh lên đến 25 ha và tỷ lệ gây hại từ 50% - 80% (cao hơn nhiều so với bình quân chung cả nƣớc). Bệnh bạc lá phát sinh trong suốt thời kỳ lúa chín nhƣng các triệu chứng bệnh điển hình thƣờng xuất hiện từ thời kỳ đẻ nhánh đến thời kỳ trổ và chín, đạt đỉnh ở giai đoạn ra hoa [33]. Bệnh bạc lá lúa đƣợc chia làm hai giai đoạn: giai đoạn “Kresek” và giai đoạn cháy lá. Kresek là giai đoạn phá hoại nghiêm trọng nhất, toàn bộ lá của cây chuyển màu vàng nhạt và héo. Nếu xảy ra trong thời kỳ đẻ nhánh sớm sẽ dẫn đến mất mùa một phần hoặc hoàn toàn. Cây con dƣới 21 ngày tuổi dễ bị kresek ở nhiệt độ từ 28oC đến 34oC [5]. Chính vì vậy, bệnh lây lan dễ dàng hơn ở vùng khí hậu ấm áp và ẩm. Trong giai đoạn cháy lá, lá có màu vàng đặc trƣng với gợn sóng trên phiến lá (hình 1). Hình 1. Lúa bị nhiễm bệnh bạc lá do vi khuẩn Xoo. (www.thaibinhseed.com.vn/benh-bac-la-lua) 1.1.2. Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa là vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo). Vi khuẩn này có tế bào hình que với đầu tròn, với chiều dài từ 0,8 đến 1 µm, 5 chiều rộng 0,4 đến 0,7 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy. Đây là loại vi khuẩn Gram âm và không sinh bào tử, khuẩn lạc hình tròn, lồi, bề mặt nhẵn, màu vàng (hình 2) [9]. Vi khuẩn này chủ yếu xâm nhập vào hệ thống mạch dẫn rồi dẫn đến nhiễm trùng toàn thân cây lúa . Ngoài ra vi khuẩn còn có thể xâm nhập qua lỗ thùy khổng ở mép lá, đầu mút lá dễ dàng gây tổn thƣơng dọc theo gân lá [39]. 5µm Hình 2. Khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn Xoo [9] Loại vi khuẩn này đầu tiên đƣợc các nhà khoa học Nhật Bản, Hori và Bokura đặt tên là Bacillus oryzae từ năm 1911 và đƣợc đổi tên nhiều lần [33]. Sau đó, do phát hiện là tác nhân gây bệnh bạc lá lúa, loài vi khuẩn này đƣợc đổi tên thành Xanthomonas campestris pv. oryzae để phân biệt với các tác nhân gây bệnh sọc lá X. campestris pv. oryzicola [51]. Năm 1990, Swings phát hiện ra vi khuẩn gây bệnh bạc lá và bệnh sọc lá khác biệt với các vi khuẩn gây bệnh X. campestris khác nên phân loại lại thành một loài riêng biệt X. oryzae, bao gồm pv. oryzae và pv. oryzicola. Bằng các phân tích giải trình tự DNA, protein và phân tích thành phần acid béo, vị trí phân loại của Xanthomonas oryzae đã đƣợc khẳng định và công nhận đến ngày nay [49] [50]. Xoo là một loại vi khuẩn Gram âm, màu vàng, sản sinh lƣợng lớn polysaccharide ngoại bào (EPS). Các chủng đột biến thiếu EPS không có khả năng gây bệnh bạc lá lúa [44]. Xoo chỉ có thể tồn tại trong đất từ một đến hai tháng, ngoài ra Xoo có thể tồn tại trong hạt giống của các cây lúa bị nhiễm, hay trong rơm rạ. Vi 6 khuẩn này sẽ đƣợc kích hoạt khi gặp độ ẩm thích hợp và sinh trƣởng trong gốc rạ cũng nhƣ trong một số loại cỏ nhƣ Leersia sp.. Giả thuyết tác nhân gây bệnh là từ giống lúa hay từ ADN của hạt giống nhiễm bệnh đã bị loại bỏ [16] [48]. Các vi khuẩn gây bệnh bạc lá xâm nhập vào cây qua các vết thƣơng xây xát ở trên lá do mƣa bão gây ra và qua các lỗ khí khổng, sau đó sẽ gây bệnh trên các mô và từ đó sẽ nhân và lây lan toàn bộ cây dẫn đến nhiễm trùng toàn thân [26]. Vi khuẩn lây lan thông qua nƣớc tƣới, mƣa và gió. Nƣớc tƣới cũng đƣợc coi là tác nhân đóng góp lớn vào sự lây lan của bệnh này trên diện rộng đất canh tác. Tuy nhiên, vi khuẩn chỉ tồn tại đƣợc trong nƣớc dƣới 15 ngày [45]. 1.2. Các cách phòng trừ bệnh bạc lá lúa Bệnh bạc lá lúa gây tổn thất nặng nề và ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sản xuất lúa gạo trên toàn thế giới, do vậy đòi hỏi phải có chiến lƣợc quản lý nhằm chống lại sự bùng phát của dịch bệnh. Bƣớc đầu cần thực hiện để kiểm soát bệnh bạc lá lúa là làm giảm tác nhân gây bệnh và ngăn chặn phát triển của tác nhân gây bệnh trên cây chủ. Điều này có thể đƣợc thực hiện thông qua việc sử dụng các hóa chất, giống kháng bệnh, và tác nhân sinh học. 1.2.1. Sử dụng thuốc hóa học Thuốc hóa học đƣợc sử dụng để giết chết hoặc ức chế sự nhân lên của các tác nhân gây bệnh bằng cách ngăn chặn con đƣờng trao đổi chất của vi khuẩn. Một số hóa chất đƣợc sử dụng để kiểm soát bệnh bạc lá lúa nhƣ Bordeaux có hoặc không có đƣờng, hỗn hợp đồng xà phòng, thuốc diệt nấm và đồng thủy ngân, dịch phun oxychloride. Ở Ấn Độ, sử dụng bột Clo trong xử lý nƣớc cũng làm giảm bệnh [11]. Một số chất hữu cơ tổng hợp diệt khuẩn cũng đã đƣợc sử dụng nhƣ niken dimethyl dithiocarbamate, dithianone, phenazine và phenazine N- oxit. Ngoài ra, thuốc diệt nấm dithiocarbamate cũng ức chế sự phát triển của Xoo bằng cách ngăn chặn quá trình sinh tổng hợp acid béo và lipid [54]. Một vài loại thuốc kháng sinh nhƣ streptocycline và các thuốc diệt nấm nhƣ zineb, carbendazim cũng đƣợc chứng minh là có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh in vitro. Một số chất diệt khuẩn nhƣ 7 kasugamycin, phenazin và streptomycin có thể ngăn chặn đƣợc các vi khuẩn gây bạc lá lúa, nhƣng lại có nhƣợc điểm là giá thành đắt và không thân thiện với môi trƣờng. Việc sử dụng các thuốc hóa học luôn mang lại hậu quả rất nặng nề đối với môi trƣờng. Đồng thời, cũng chƣa có phƣơng thức kiểm soát bằng hóa chất nào mang lại hiệu quả cao bởi vì khả năng tồn tại và phát triển của các chủng kháng thuốc. 1.2.2. Chọn giống lúa kháng bệnh Chọn giống lúa kháng bệnh hiện nay cũng là phƣơng pháp đang đƣợc quan tâm. Hiện nay, 23 gen kháng bệnh bạc lá lúa (Xa) đã đƣợc công bố (bảng 1). Các đoạn mồi cũng đã đƣợc thiết kế để phát hiện các gen Xa trên các giống lúa khác nhau (bảng 2). Bảng 1. Đặc điểm và nguồn gốc của các gen Xa kháng bệnh bạc lá lúa [37] Tên gen Xa Tên gen Xa mới cũ Nhiễm sắc thể Giống, dòng lúa đại diện Xa1 Xa1 NST 4 Kogyoku Xa1-h Xa-1h NST 4 IR28, IR29, IR30 Xa2 Xa2 NST 4 Rentai Emas2, tẻ tép Xa3 Xa-w NST11 Wase Aikoku3 Xa-4b NST11 Semora Mangga Xa-6 NST-5 Zenith Xa-9 NST-6 Sateng Xa4 Xa-4 NST11 TKM6, IR20, UR22 Xa5 Xa-5 NST 4 DZ192,IR1545-339 Xa7 Xa-7 NST 4 DV85, DZ78 Xa8 Xa-8 NST 4 PI231129 Xa10 Xa-10 NST11 Cas 209 Xa11 Xa-11 RP 9-3, IR8 8