Tài liệu Nghiên cứu đặc điểm di truyền gen ha và na của vi rút cúm a(h1n1)pdm lưu hành tại miền trung việt nam, 2013 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ---------------- ĐOÀN THỊ THANH THỦY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN GEN HA VÀ NA CỦA VI RÚT CÚM A(H1N1)pdm LƯU HÀNH TẠI MIỀN TRUNG VIỆT NAM, 2013-2015 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ---------------- ĐOÀN THỊ THANH THỦY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN GEN HA VÀ NA CỦA VI RÚT CÚM A(H1N1)pdm LƯU HÀNH TẠI MIỀN TRUNG VIỆT NAM, 2013-2015 LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 Quyết định giao đề tài: 607/QĐ-ĐHNT ngày 28/8/2016 Quyết định thành lập HĐ: 685/QĐ-ĐHNT ngày 02/08/2017 Ngày bảo vệ: 21/8/2017 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN VĂN DUY Chủ tịch Hội đồng: PGS.TS NGÔ ĐĂNG NGHĨA Khoa sau đại học: LỜI CAM ĐOAN KHÁNH HÒA – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền gen HA và NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm lưu hành tại Miền Trung Việt Nam, 2013-2015” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào cho tới thời điểm này. Khánh Hòa, ngày 06 tháng 7 năm 2017 Tác giả luận văn Đoàn Thị Thanh Thủy iii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của Quý phòng ban Trường Đại học Nha Trang, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Khoa Sau đại học đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được hoàn thành đề tài. Đặc biệt là sự hướng dẫn tận tình của PGS.TS Nguyễn Văn Duy đã giúp tôi hoàn thành tốt đề tài. Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến sự giúp đỡ này. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Pasteur Nha Trang, Khoa Vi rút Viện Pasteur Nha Trang đã đồng ý hỗ trợ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện đề tài tại Viện Pasteur Nha Trang. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và tất cả bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, ngày 06 tháng 7 năm 2017 Tác giả luận văn Đoàn Thị Thanh Thủy iv MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iii LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................vii DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................... ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .......................................................................................... x MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 5 1.1. Tổng quan về vi rút cúm ..................................................................... 5 1.1.1. Phân loại vi rút cúm........................................................................ 5 1.1.2. Đặc điểm của vi rút cúm A.............................................................. 6 1.1.3. Cấu trúc, chức năng của protein Hemagglutinin và Neuraminidase ................................................................................................ 10 1.1.4. Các yếu tố quyết định độc lực ....................................................... 14 1.1.5. Các phương thức biến đổi kháng nguyên ..................................... 14 1.1.6. Sự hình thành vi rút cúm A/(H1N1)pdm ....................................... 17 1.1.7. Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của vi rút cúm A trong tế bào ..... 18 1.1.8. Các triệu chứng lâm sàng, điều trị và phòng ngừa bệnh cúm A(H1N1)pdm ................................................................................................... 20 1.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước về vi rút cúm A(H1N1)pdm ....... 21 1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước về vi rút cúm A(H1N1)pdm ....... 23 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 25 2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................... 25 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................... 25 2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................ 25 2.2. Thiết bị và hóa chất chuyên dụng ..................................................... 25 2.2.1. Thiết bị chuyên dụng ..................................................................... 25 2.2.2. Hoá chất và sinh phẩm ................................................................. 25 2.3. Cách tiếp cận tổng quát của đề tài .................................................... 26 v 2.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................. 27 2.4.1. Phân lập vi rút cúm A(H1N1)pdm trên tế bào MDCK ................. 27 2.4.2. Xác định hiệu giá kháng nguyên bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu ....................................................................................................... 27 2.4.3. Tách chiết RNA tổng số ................................................................ 28 2.4.4. Khuếch đại gen bằng kỹ thuật RT-PCR ........................................ 28 2.4.5. Tinh sạch sản phẩm PCR .............................................................. 29 2.4.6. Giải và phân tích trình tự nucleotide ............................................ 29 2.4.7. Xử lý và phân tích số liệu.............................................................. 30 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 31 3.1. Đặc điểm của mẫu nghiên cứu .......................................................... 31 3.2. Kết quả phân lập các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm trên dòng tế bào MDCK ...................................................................................................... 31 3.3. Kết quả thực hiện thử nghiệm ngưng kết hồng cầu HA ................... 32 3.4. Kết quả RT-PCR và tinh sạch để tạo sản phẩm cho giải trình tự ..... 34 3.5. Kết quả giải trình tự phát hiện đột biến trên gen HA và gen NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm ................................................................................. 35 3.5.1. Kết quả phát hiện đột biến trên gen HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm ................................................................................................... 35 3.5.2. Cây phát sinh loài gen HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm ............. 40 3.6. Kết quả giải trình tự phát hiện đột biến trên gen NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm .................................................................................................. 42 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ......................................................... 47 4.1. Kết luận ............................................................................................. 47 4.2. Khuyến nghị ...................................................................................... 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 49 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 55 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ Viết theo tiếng Anh BSA Albumin huyết thanh bò Bovine Serum Albumin CDC Trung tâm Kiểm soát và phòng ngừa Center for Disease Control bệnh tật Hoa Kỳ and Prevention Trung tâm cúm quốc gia Trung Chinese National Influenza Quốc Center CPE Hiện tượng hủy hoại tế bào Cytopathogenic effect FBS Huyết thanh bào thai bê Fetal Bovine Serum HA Kháng nguyên Heamagglutinin Heamagglutinin Antigen Tế bào thận khỉ xanh Madin-Darby Canine Kidney CNIC MDCK Cells NA Kháng nguyên Neuraminidase Neuraminidase Antigen Trung tâm quốc gia về thông tin National Center for công nghệ sinh học Biotechnology Information Viện quốc gia về nghiên cứu các National Institute of bệnh truyền nhiễm Nhật Bản Infectious Diseases Viện nghiên cứu Y khoa quốc gia National Institute for Medical Anh Research Phản ứng HA Phản ứng ngưng kết hồng cầu Haemagglutination Assay Phản ứng HI Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu Haemagglutination Inhibition NCBI NIID NIMR Assay PCR Phản ứng khuếch đại chuỗi Polymerase Chain Reaction RNA Acid ribonucleic Ribonucleic Acid Phản ứng phiên mã ngược khuếch Reverse Transcription đại chuỗi Polymerase Chain Reaction RT-PCR VIDRL Phòng thí nghiệm tham chiếu các Victoria Infectious Diseases bệnh truyền nhiễm bang Victoria (Úc) Reference Laboratory WHO Tổ chức Y tế thế giới World Health Organization vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm thực hiện phản ứng HA Bảng 3.2: Vị trí acid amin thay đổi trên protein HA của chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm Bảng 3.3: Vị trí acid amin thay đổi trên protein NA của chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc của vi rút cúm Hình 1.2 Đột biến điểm của hiện tượng trôi kháng nguyên (antigenic drift) ở vi rút cúm A . Hình 1.3 Đột biến tái tổ hợp của hiện tượng trượt kháng nguyên (antigenic shift) của vi rút cúm A Hình 1.4 Sự hình thành chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm Hình 1.5 Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của vi rút cúm A trong tế bào Hình 2.1 Qui trình nghiên cứu gen HA và NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm. Hình 3.1. Phân bố mẫu nghiên cứu theo độ tuổi và giới tính Hình 3.2 Tế bào MDCK trước khi gây nhiễm vi rút cúm(A) và hiện tượng hủy hoại tế bào (CPE) trên tế bào MDCK theo thời gian (B,C,D) Hình 3.3 Kết quả thực hiện kỹ thuật HA trên chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm thu thập từ nước nổi tế bào MDCK Hình 3.4 Kết quả RT-PCR trên nước nổi tế bào của 2 chủng phân lập có CPE nhưng không có hiệu giá HA Hình 3.5: Kết quả RT-PCR cho giải trình tự (A) và kết quả tinh sạch phân đoạn số 1 (B) của gen HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm Hình 3.6. Vị trí thay đổi acid amin D222G Hình 3.7: Cây phát sinh loài gen HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm. Hình 3.8: Cây phát sinh loài gen NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Cúm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan theo đường hô hấp, do các type vi rút gồm cúm A, B và C gây nên. Bệnh khởi phát đột ngột bằng sốt cao, nhức đầu, đau mỏi toàn thân và những dấu hiệu hô hấp, dễ dẫn đến viêm phổi, tỷ lệ tử vong cao. Bệnh có thể gây thành đại dịch, ảnh hưởng tới 50% dân số trên toàn cầu. Vi rút cúm A(H1N1)pdm xuất hiện lần đầu tiên ở Việt Nam từ tháng 5 năm 2009 và tiếp tục lưu hành ở Việt Nam như các vi rút cúm mùa A(H3N2), cúm B. Khánh Hòa là địa phương đầu tiên ghi nhận ca tử vong do nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm vào năm 2009. Theo báo cáo của chương trình giám sát cúm quốc gia khu vực miền Trung, vi rút cúm A(H3N2) cũng được ghi nhận lưu hành quanh năm và số ca mắc ở Khánh Hòa là nhiều nhất so với các điểm giám sát khác của khu vực miền Trung. Do đó việc giám sát phát hiện sự thay đổi ở mức độ phân tử gồm phát hiện kháng thuốc Tamiflu, amantadine và một số đột biến khác trên các chủng vi rút cúm lưu hành tại Khánh Hòa đóng vai trò quan trọng trong công tác giám sát cúm ở khu vực miền Trung. Để chủ động trong công tác giám sát vi rút cúm, phát hiện theo dõi một số thay đổi acid amin liên quan đến tình trạng kháng thuốc và một số đặc điểm sinh học của các chủng vi rút cúm lưu hành tại miền Trung, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm di truyền gen HA và NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm lưu hành tại Miền Trung Việt Nam, 2013-2015” với mục tiêu nghiên cứu các đặc điểm di truyền gen HA, gen NA liên quan đến đặc điểm sinh học của vi rút cúm A(H1N1)pdm lưu hành tại khu vực Miền Trung giai đoạn 2013-2015. Nghiên cứu của chúng tôi tiến hành trên 30 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm phân lập được trong giai đoạn 2013-2015 tại một số tỉnh thuộc khu vực miền Trung. Các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm được giải trình tự gen HA và NA. Kết quả chỉ đưa vào phân tích 29 trình tự gen HA và 28 trình tự gen NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm Kết quả nghiên cứu cho thấy, so với chủng sản xuất vắc xin A/California/07/2009, đã phát hiện được 01/29 chủng có sự thay đổi acid amin D222G trên gen HA là đột biến có có liên quan tới tăng mật độ vi rút trong máu gây viêm phổi nặng và có liên quan đến bệnh nhân đã tử vong do nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm năm 2014. Nghiên cứu không phát hiện chủng nào mang đột biến G155E và N156K có liên quan đến sự giảm thấp hơn 4 bậc khả năng tương tác x với kháng huyết thanh chồn sương trong phản ứng HI khi so sánh với chủng vắc xin A/California/07/2009. Sự thay đổi acid amin ở vị trí P183S, S185T, S203T, S451N và E499K xảy ra ở tất cả các chủng nghiên cứu với tỉ lệ là 100%. Đột biến P83S, I321V xuất hiện ở 27/28 chủng chiếm tỉ lệ 96,4%. Đột biến D97N xuất hiện ở 26/28 chủng chiếm tỉ lệ 92,9%. Ở vị trí K283E và E374K,sự sai khác acid amin xảy ra trên 23/28 chủng nghiên cứu, chiếm tỉ lệ 82,1%. Đột biến K163Q xuất hiện ít hơn ở 17/28 chủng nghiên cứu tương ứng với tỉ lệ là 60,7%. Đột biến A256T và V234I xảy ra lần lượt trên 13/28 và 11/28 chủng, chiếm tỉ lệ là 46,4% và 39,3%. Các đột biến ở vị trí A141E, S162R và A186T xuất hiện ở 8/28 chủng với tỉ lệ thấp là 28,8 %. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài của gen HA cho thấy 28 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm lưu hành tại khu vực miền Trung giai đoạn 2013-2015 đều thuộc nhóm 6 với 100% chủng đều xuất hiện đột biển mang tính chỉ điểm cho nhóm là S185T, S203T, S451T và E499K. Các chủng vi rút này xuất hiện thêm một số đột biến khác nhau nên được chia thành 2 phân nhóm là 6B 17/28 chủng và 6C với 11/28 chủng. Các chủng phân lập trong năm 2013 đều thuộc phân nhóm 6C, trong khi toàn bộ các chủng phân lập trong năm 2015 lại thuộc phân nhóm 6B. Các chủng phân lập trong năm 2014 thuộc 2 phân nhóm 6B và 6C gồm 11 chủng phân lập năm 2014 thuộc nhóm 6B, 6 chủng thuộc nhóm 6C. Đối với gen NA, kết quả nghiên cho thấy không có sự xuất hiện của đột biến tại vị trí acid amin H275Y kháng với thuốc điều trị cúm Tamiflu trên 29 chủng vi rút nghiên cứu trong giai đoạn 2013-2015. Trong khi đó, đột biến N369K xuất hiện ở hầu hết 29/29 chủng vi rút nghiên cứu. Ở vị trí N200S, có 24/29 chủng xuất hiện đột biến chiếm tỉ lệ là 82,3%. Các đột biến N44S, V241I xuất hiện ở 22/29 chủng, chiếm tỉ lệ 75,9%. Đột biến tại vị trí N248D xuất hiện ở 15/29 chủng với tỉ lệ là 51,7 % và đột biến K432E xuất hiện trên 13/29 chủng, chiếm tỉ lệ 44,8%. Đột biến Y282N, I321V xuất hiện trên 10/29 chủng với tỉ lệ là 34,5%. Các đột biến khác như I34V, S82P, N397K xuất hiện ở 9/29 chủng vi rút chiếm tỉ lệ 31,1%. Đột biến V83A được phát hiện ở 8/29 chủng chiếm tỉ lệ 27,6%. Đột biến tại vị trí S237P xuất hiện rải rác ở 5/29 chủng với tỉ lệ là 17,2%. Chỉ phát hiện 3/29 chủng có sự khác biệt acid amin tại vị trí P154S. Kết quả trên cây phát sinh loài gen NA cho thấy các chủng vi rút cúm lưu hành trong giai đoạn 2013 - 2015 trong nghiên cứu có trình tự tương đồng với các chủng lưu hành cùng năm trên thế giới và tách ra 2 phân nhóm xi khác nhau gồm: phân nhóm 6B và phân nhóm 6C. Tương tự như gen HA, gen NA của các chủng nghiên cứu năm 2015 thuộc phân nhóm 6B và các chủng phân lập năm 2013 có gen NA thuộc nhóm 6C. Có 8 chủng phân lập năm 2014 có gen NA thuộc nhóm 6C và 10 chủng phân lập năm 2014 có gen NA thuộc nhóm 6B. Những kết quả nghiên cứu trên đã cung cấp một số thông tin bước đầu về sự thay đổi ở mức độ kiểu gen trên một số chủng cúm lưu hành tại một số tỉnh khu vực miền Trung, góp phần vào công tác giám sát cúm tại khu vực miền Trung. Từ khóa: cúm A(H1N1)pdm, gen HA, gen NA. xii MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Bệnh cúm là một bệnh truyền nhiễm đường hô hấp do vi rút cúm gây ra với các triệu chứng sốt, ho và đau cơ. Bệnh có thể gây thành đại dịch, ảnh hưởng tới 50% dân số trên toàn cầu. Mỗi người trong đời có thể mắc nhiều lần trong đó người già, trẻ em và người mắc một số bệnh mãn tính dễ bị bệnh cúm và có thể bị tử vong do biến chứng bội nhiễm vi khuẩn ở phổi. Ở những người khỏe mạnh, vi rút cúm cũng gây bệnh dù nhẹ cũng phải nghỉ ốm nhiều ngày, gây tổn hại về mặt kinh tế xã hội. Ở Đức, chi phí cho trận dịch cúm năm 1996-1997 ước tính khoảng 1045 triệu đô la Mỹ. Ở Mỹ, tiêu tốn hàng năm cho cúm vào khoảng 11.000-18.000 triệu đô la Mỹ. Từ năm 1580 tới nay đã có hơn 30 đại dịch cúm bùng phát trên qui mô thế giới. Trầm trọng nhất là dịch cúm Tây Ba Nha vào năm 1918-1919 làm gần 21 triệu người chết trên toàn thế giới, hơn cả số người chết trong chiến tranh thế giới lần thứ nhất (trích dẫn trong Lê Văn Hiệp, 2009). Năm 1957-1958, dịch cúm tại châu Á do H2N2 làm 1 triệu người tử vong và cúm Hồng Kông do H3N2 gây chết gần 1 triệu người nữa vào những năm 1968-1969 (trích dẫn trong Lê Văn Hiệp, 2009). Đến tháng 3 năm 2009, một lần nữa thế giới lại ghi nhận sự xuất hiện và gây thành đại dịch trên toàn cầu của vi rút cúm A(H1N1)pdm. Cũng giống như vi rút cúm gây đại dịch ở thế kỷ trước, sau khi gây bệnh và lan truyền với tốc độ nhanh và cao trên toàn thế giới, đến ngày 10/8/2009, Tổ chức Y tế Thế giới đã tuyên bố chấm dứt giai đoạn biểu hiện đại dịch của vi rút cúm A(H1N1)pdm và vi rút này tiếp tục lưu hành như các vi rút cúm mùa A(H3N2), cúm B và đã thay thế hoàn toàn cho vi rút cúm A(H1N1) cũ. Tuy nhiên, theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới, ước tính khoảng 284 000 trường hợp tử vong do cúm A(H1N1)pdm trong 12 tháng đầu tiên lan truyền dịch. Ở Việt Nam, theo Bộ Y tế, có tổng cộng 11 047 trường hợp mắc với 50 trường hợp tử vong đã được báo cáo cho đến ngày 21 tháng 12 năm 2009. Theo báo cáo của Chương trình giám sát cúm quốc gia, tính chung giai đoạn từ năm 2006-2014, có 10,7% tổng số bệnh nhân đến khám tại các cơ sở y tế có chẩn đoán mắc Hội chứng cúm và 20% số ca xét nghiệm có kết quả dương tính với vi rút cúm. Riêng tại khu vực miền Trung, tỉ lệ này tương ứng là 7% và 23,2%. Số ca xét nghiệm có kết quả 1 dương tính ở miền Trung là 22,7%, cao nhất so với khu vực miền Bắc là 20,1%, miền Nam là 22,4% và Tây Nguyên là 6,1%. Cũng theo báo cáo Chương trình giám sát cúm quốc gia, trong giai đoạn từ năm 2009 đến năm 2013, từ 46,6% các trường hợp nhiễm vi rút cúm được xác định là cúm A(H1N1)pdm trong năm 2009 giảm xuống còn 28% vào năm 2010 khi nó lưu hành đồng thời với vi rút cúm A(H3N2) và cúm B, sau đó tiếp tục tăng lên 74,1% trong năm 2011. Sau khi lưu hành với tỉ lệ thấp vào năm 2012 thì vi rút cúm A(H1N1)pdm lại chiếm ưu thế vào năm 2013 với khoảng 30% các trường hợp bị nhiễm được báo cáo. Vi rút cúm A(H1N1)pdm là một phân type trong nhóm vi rút cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, có protein Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) trên bề mặt capsid của hạt vi rút mang tính kháng nguyên tham gia quá trình đáp ứng miễn dịch. Kháng nguyên HA có 16 type (ký hiệu từ H1 đến H16) và kháng nguyên NA có 9 type (ký hiệu từ N1 đến N9). Kháng nguyên HA được mã hóa bởi phân đoạn 4 của hệ gen vi rút cúm A, có đặc tính kết hợp với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng của tế bào nhiễm. HA có khả năng đột biến trong gen tạo nên sự khác biệt làm thay đổi tính kháng nguyên, hoặc tái tổ hợp biến chủng làm thay đổi kháng nguyên bề mặt dẫn đến sự thay đổi tương quan đáp ứng miễn dịch. Kháng nguyên NA do phân đoạn 6 mã hóa, đây là một protein bề mặt làm nhiệm vụ enzym phân giải thụ thể tế bào và cắt liên kết glycosid của phân tử acid sialic (N acetylneuramic acid) giải phóng vi rút trong quá trình lây nhiễm. Sự thay đổi kháng nguyên HA và NA của vi rút cúm dẫn đến sự xuất hiện của các chủng vi rút cúm mới, làm giảm hiệu quả của vaccin phòng bệnh. Sự thay đổi kháng nguyên này cũng làm xuất hiện tình trạng kháng các loại thuốc điều trị cúm hiện nay như Tamiflu và amantadine, gây bệnh tiến triển nặng trên bệnh nhân nhiễm cúm và ảnh hưởng đến kết quả điều trị. Kể từ khi sự xuất hiện của vi rút cúm A(H1N1)pdm, có nhiều nghiên cứu phân tích phân tử đã xác định được một số đột biến liên quan tới biểu hiện lâm sàng, bệnh sinh, và đáp ứng miễn dịch đối với vi rút cúm. Ví dụ, thay thế acid amin ở vị trí D222G / E / N trong phân tử HA có liên quan tới tăng mật độ vi rút trong máu gây viêm phổi nặng và tử vong; đột biến ở vị trí I219K ở vị trí gắn kết thụ thể của HA làm gia tăng số lượng thụ thể gắn kết của 2 người (Hang K. L. Nguyen và cs, 2015). Ngoài ra, thay đổi acid amin ở vị trí I117V, I223R, và H275Y trên protein NA làm giảm tính nhạy cảm với oseltamivir (Doherty và cs, 2006). Hơn nữa, vi rút cúm A(H1N1)pdm cũng có khả năng tái tổ hợp với các vi rút cúm mùa khác để tạo ra chủng vi rút mới làm tăng khả năng gây bệnh. Do tính chất thay đổi của vi rút cúm A(H1N1)pdm, hệ thống cảnh báo và giám sát cúm toàn cầu (GISRS) của WHO đã yêu cầu các quốc gia trên thế giới giám sát sự thay đổi về kiểu gen, và tính kháng nguyên của vi rút cúm. Để chủ động trong công tác giám sát cúm, phát hiện theo dõi một số thay đổi acid amin liên quan đến tình trạng kháng thuốc và một số đặc điểm sinh học của các chủng vi rút cúm lưu hành tại khu vực miền Trung, tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm di truyền gen HA và NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm lưu hành tại Miền Trung Việt Nam, 2013-2015”. 2. Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu đặc điểm di truyền gen HA và NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm lưu hành tại khu vực miền Trung, 2013-2015 3. Nội dung của đề tài - Phân lập một số chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm lưu hành tại khu vực miền Trung giai đoạn 2013-2015 trên tế bào MDCK. - Kiểm tra hiệu giá kháng nguyên của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm bằng thử nghiệm ngưng kết hồng cầu HA - Khuếch đại gen HA và NA bằng kỹ thuật RT-PCR - Xác định trình tự gen HA và NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm - Xây dựng cây phát sinh loài và phân tích các thay đổi acid amin trên protein HA và NA liên quan đến đặc tính sinh học của vi rút cúm A(H1N1)pdm. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài  Ý nghĩa khoa học: Xác định trình tự gen HA và NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm lưu hành tại khu vực miền Trung giai đoạn 2013-2015, làm cơ sở dữ liệu cho việc xác định đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm cũng như phân tích các đặc điểm vi rút học của các vi rút này.  Ý nghĩa thực tiễn: Nâng cao kỹ năng phân lập vi rút cúm trên tế bào cảm nhiễm trong phòng thí nghiệm. Việc phân tích trình tự nucleotide của gen HA và NA của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm còn có ý nghĩa lớn trong việc xác định biến 3 đối di truyền của các chủng tại các địa phương khác nhau của khu vực miền Trung, so sánh với các quốc gia và các vùng địa lý khác nhau, giúp cho việc sưu tập và duy trì các chủng theo đặc tính di truyền và nghiên cứu tiến hoá, từ đó có thể biết dịch tễ học ở mức độ sinh học phân tử. Mặt khác, do vi rút cúm có khả năng biến đổi kháng nguyên cao, có thể chủng vi rút cúm phân lập ở đầu và cuối ổ dịch đã khác nhau về đặc điểm di truyền và đặc tính kháng nguyên, vì vậy, cần phải có một số lượng các chủng đa dạng theo thời gian tạo tiền đề định hướng giám sát nguồn gốc dịch bệnh. Do đó, việc so sánh các trình tự nucleotide và acid amin từ các chủng phân lập hàng năm giúp chúng ta tìm hiểu những vùng gen thường thay đổi và không thay đổi trong toàn bộ hệ gen, góp phần xác định được loại vaccine phù hợp cho công tác phòng chống dịch cúm A(H1N1)pdm. Cuối cùng, kết quả giải trình tự các chủng vi rút cúm có thể ứng dụng để nghiên cứu tính kháng thuốc của vi rút cúm, tiến tới xác định đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm. 4 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về vi rút cúm 1.1.1. Phân loại vi rút cúm Vi rút cúm chủ yếu gây bệnh đường hô hấp ở người và động vật được phân thành các nhóm: 1/ Nhóm vi rút cúm A (Influenza A virus) thường tồn tại trong các loài động vật (gia cầm, ngựa, gà, vịt, ngỗng, ngan và các loài chim di cư hoang dã) sau đó tiếp xúc với con người và gây bệnh cho người. Vi rút cúm A có thể gây nên những vụ dịch hoặc những trận đại dịch toàn cầu. 2/ Nhóm vi rút cúm B (Influenza B virus) thường tồn tại trong cơ thể con người, chủ yếu gây bệnh ở người, một số ít tồn tại trong loài hải cẩu. 3/ Nhóm vi rút cúm C (Influenza C virus) tồn tại trên người và lợn. Ba nhóm vi rút cúm A, B, C được nhận diện bởi sự khác nhau trong cấu trúc kháng nguyên bề mặt, phức hợp protein cũng như vai trò gây bệnh khác nhau trên động vật có xương sống. Vi rút cúm A và B có kháng nguyên bề mặt là protein hemagglutinin (HA), còn ở cúm C là HEF (hemagglutinin esterase fusion). 4/ Nhóm Thogoto vi rút gây bệnh cho động vật, người và động vật không xương sống (muỗi, rận biển). Kháng nguyên bề mặt của Thogotovi rút là GP (glycoprotein). Vi rút cúm A được định type phụ dựa vào phản ứng huyết thanh học của các glycoprotein bề mặt HA và NA. Hiện nay, người ta đã xác định được 16 sub-type HA (H1 - H16) và 9 sub-type NA (N1 - N9). Từ năm 1980, việc xác định phân type HA đã được chuẩn hóa cho tất cả các vi rút cúm type A từ gia cầm, chim, ngựa và người. Huyết thanh từ gia cầm và chồn sương hồi phục sau khi mắc bệnh và kháng thể đơn dòng được thu thập dùng để xác định sự có mặt kháng nguyên của vi rút cúm trong từng phân type. Kháng thể đơn dòng được dùng trong nghiên cứu chi tiết về các epitope trong từng kháng nguyên như so sánh HA của các vi rút H1N1 từ gà tây và lợn để thiết lập mối quan hệ về tính kháng nguyên của các HA của chúng (Frederick G Hayden, 2009) 5 1.1.2. Đặc điểm của vi rút cúm A 1.1.2.1. Đặc điểm hình thái Dưới kính hiển vi điện tử, hầu hết các hạt của vi rút (virion) có dạng hình cầu đường kính từ 50 - 100 nm (Hình 1.1A). Một số ít có dạng hình sợi đường kính 20 nm và dài từ 200 - 300 nm. Hạt vi rút có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi chứa RNA. Vỏ vi rút với bản chất là protein có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm đã được đặc hiệu hóa để gắn protein màng của vi rút vào, bao gồm một số protein được glycosyl hoá (glycoprotein) và một số protein dạng trần không được glycosyl hoá (non-glycosylated protein). Protein bề mặt có cấu trúc từ glycoprotein, bao gồm protein gây ngưng kết hồng cầu HA, protein enzym cắt thụ thể NA và protein đệm M (matrix). Lipid tập trung ở màng vi rút, chủ yếu là lipid có gốc photpho, số còn lại là cholesterol, glucolipid và một ít carbohydrate gồm các loại đường galactose, mannose, ribose, fructose, glucosamin. Bên trong vi rút có cấu trúc phức tạp gồm protein capsid và các sợi RNA nối với nhau thành các nucleocapsid có cấu trúc đối xứng xoắn. Vỏ của vi rút được cấu tạo bởi 2 lớp lipid, trên bề mặt có khoảng 500 các gai khác nhau nhú lên từ bề mặt của vi rút, mỗi gai có độ dài từ 10 14 nm. Các gai này được cấu tạo bởi các glycoprotein. Có hai loại glycoprotein là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Các gai HA thường nhiều hơn và xen kẽ với các gai NA với tỷ lệ là (4-5):1. Hệ gen vi rút cúm A là RNA sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt (Hình 1.1B), mã hoá cho 11 protein khác nhau của vi rút, các phân đoạn được sắp xếp theo trật tư: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M (gồm M1 và M2), NS (gồm NS1 và NS2) (Murphy, 1996 và Rabadan, 2006). Mỗi phân đoạn RNA của vi rút cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α đối xứng dài 50 - 100 nm, đường kính 9 - 10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP) với bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1.1C). Các phân đoạn của hệ gen vi rút cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide tạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy nhất có độ dài từ 10.000 - 15.000 nucleotide (tuỳ theo từng chủng vi rút cúm A) và có cấu trúc xoắn α (α-helix) bên trong vỏ vi rút. HA có chức năng giúp vi rút bám dính vào tế bào cảm thụ và làm xâm nhập vật liệu di truyền của vi rút vào bên trong tế bào. NA có chức năng thúc đẩy sự lắp 6 ráp để giải phóng vi rút từ các tế bào cảm thụ. Các glycoprotein HA và NA quyết định tính kháng nguyên đặc hiệu của từng phân type vi rút khác nhau và cũng là vị trí để các loại thuốc kháng vi rút trong điều trị bệnh sẽ gắn kết và phát huy tác dụng diệt vi rút. Đồng thời HA và NA còn có vai trò quan trọng trong việc quyết định tính kháng nguyên trong sản xuất vaccine. Phân tích thành phần hoá học các hạt vi rút cúm A có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA, 70-75% là protein, 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbohydrate (Murphy, Webster 1996). (A) (B) (C) Hình 1.1. Cấu trúc của vi rút cúm A (A) Ảnh các dạng hình thái của vi rút cúm A được nhuộm âm tính trên kính hiển vi điện từ truyền qua. (Nguồn: Centers for Disease Control and Prevention Public Health Image Library); (B) Mô hình cấu tạo hạt vi rút cúm A (hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA, PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị phức hợp enzym polymerase của vi rút), (C) Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP của vi rút cúm (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge). Về mặt dịch tễ học, theo Webster (1998), Ito T, Couceiro và cs (1998), vi rút cúm A có nhiều biến chủng khác nhau, thích ứng hầu như với mọi loài vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên những vụ dịch cúm trong lịch sử ở động vật và người. Do đặc tính biến đổi nội gen nhanh chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới truyền lây trong quần thể sinh vật, cho nên vi rút cúm A thuộc nhóm vi rút nguy hiểm gây bệnh động vật sang người (zoonotic infections). 1.1.2.2. Cấu trúc hệ gen của vi rút cúm A Nhóm vi rút cúm A đều có hệ gen là RNA chứa 8 phân đoạn mã hoá cho 11 protein, có độ dài tùy từng phân type, được nối với nhau thành một sợi RNA liên 7 tục, nhưng hệ gen lại phân thành nhiều đoạn, mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hóa cho một loại protein của vi rút. Hai đầu 5' và 3' của RNA của hệ gen có hai chuỗi nucleotide bảo tồn, đó là 5'- AGUAGAACAAGG... và 3'- UCG(U/C)UUUCGUCC... (Ito T và cs, 1998) . Cũng theo Ito T và cs (1998), sáu phân đoạn (từ 1- 6) mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hoá cho một loại protein riêng biệt, phân đoạn 7 và 8 mã hoá cho từng phần của gen, mỗi gen mã hoá cho một phân tử RNA thông tin và mỗi phân tử RNA thông tin này sau khi được xử lý nhờ cơ chế nối-ghép (splicing) sẽ được dịch mã tổng hợp protein. Mỗi đoạn RNA được bao xung quanh bởi nucleoprotein (NP) tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP). RNP kết hợp với 3 loại polymerase PB2, PB1, PA chịu trách nhiệm cho sự phiên mã và sao chép RNA của vi rút. Protein kháng nguyên bề mặt là HA thuộc protein màng type I liên quan đến sự bám dính của vi rút và là thụ thể của vi rút, có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà, hợp nhất vỏ vi rút với màng tế bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hoà vi rút. Nucleocapsid protein (NP) là một loại protein được photphoryl hoá, có biểu hiện đặc tính kháng nguyên đặc hiệu theo nhóm và tồn tại trong hạt vi rút theo dạng liên kết với mỗi phân đoạn RNA, cho nên NP còn được gọi là ribonucleoprotein. Protein mang hoạt tính enzym là NA thuộc protein màng type II có chức năng của một enzym cắt thụ thể để vi rút thực hiện quá trình giải phóng ra khỏi tế bào. Chỉ có các phân đoạn HA, NA (glycoprotein màng) của vi rút có chức năng "gắn" vào màng tế bào chủ bị tấn công rồi sau đó tiếp tục thực hiện quá trình nhân lên và giải phóng vi rút. Protein màng không được glycosyl hóa là MA mang tính chất protein đệm, bao gồm M1 và M2 có vai trò bao gói RNA của hệ gen vi rút và là kênh vận chuyển các thành phần của vi rút qua màng. Một protein khác là protein không cấu trúc NS (non-structural protein) gồm hai tiểu phần NS1và NS2, có vai trò bảo vệ hệ gen của vi rút, nếu thiếu chúng vi rút sinh ra không hoàn chỉnh, trở thành vi rút thiểu năng. 1.1.2.3. Chức năng các phân đoạn trong hệ gen của vi rút cúm A Phân đoạn 1 mã hoá cho enzym polymerase PB2 (polymerase basic protein 2) là tiểu đơn vị của polymerase (RNA transcriptase) chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã, có độ dài 2341 nucleotide, có trọng lượng phân tử theo tính toán là 84 kDa (thực tế là: 87 kDa) (Ito T và cs, 1998). Phân đoạn 2 mã hoá cho enzym polymerase PB1 (polymerase basic protein 1) là tiểu đơn vị xúc tác của polymerase (RNA transcriptase), có độ dài 8