Tài liệu Nghiên cứu đa dạng hệ vi khuẩn và enzyme thủy phân lignocellulose từ dữ liệu metagenome của vi khuẩn trong dạ cỏ dê

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- LƢU HÀN LY NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN VÀ ENZYME THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE TỪ DỮ LIỆU METAGENOME CỦA VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ DÊ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- LƢU HÀN LY NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN VÀ ENZYME THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE TỪ DỮ LIỆU METAGENOME CỦA VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ DÊ Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Đỗ Thị Huyền PGS.TS Nguyễn Lai Thành Hà Nội – 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Đỗ Thị Huyền và PGS.TS. Nguyễn Lai Thành. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào. Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài liệu của các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ. Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn. Học viên Lƣu Hàn Ly LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã trang bị kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Đỗ Thị Huyền – Viện Công nghệ Sinh học và PGS.TS. Nguyễn Lai Thành – Khoa Sinh học – Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh bản Luận văn Thạc sĩ này. Xin được cảm ơn đề tài Độc lập cấp nhà nước mã số ĐTĐLCN.15/14: “Nghiên cứu metagenome của một số hệ sinh thái mini tiềm năng nhằm khai thác các gen mới mã hóa hệ enzyme chuyển hóa hiệu quả lignocellulose" do Viện Công nghệ sinh học chủ trì, Bộ Khoa học Công nghệ chủ quản đã hỗ trợ tôi về mọi phương diện để thực hiện nghiên cứu này. Tôi xin cảm ơn các cán bộ Phòng Kĩ thuật Di truyền - Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện, giúp đỡ cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Học viên Lƣu Hàn Ly năm BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DNA Acid deoxyribonucleic RNA Acid ribonucleic PCR Polymerase chain reaction CBM Carbohydrate binding module GH Glycosyl hydrolase CE Carbohydrate esterase PL Polysaccharide lyase ORF Open reading frame KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes COG Cluster of Orthologous Groups CAZy Carbohydrate-Active enZYmes GO Gene Ontology OTUs Operation taxonomic units i MỤC LỤC BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... i DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. iv DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. v MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2 1.1. Lignocellulose và hệ enzyme phân giải lignocellulose ........................ 2 1.1.1. Cấu trúc lignocellulose ............................................................................ 2 1.1.1.1. Cellulose........................................................................................... 2 1.1.1.2. Hemicellulose ................................................................................... 3 1.1.1.3. Lignin ............................................................................................... 4 1.1.2. Hệ enzyme phân giải lignocellulose ........................................................ 4 1.1.2.1. 1.1.2.2. Hemicellulase ................................................................................... 6 1.1.2.3. Cellulase........................................................................................... 7 1.1.2.4. 1.2. Enzyme tiền xử lý ............................................................................. 5 Hoạt động của cellulosome .............................................................. 9 Hệ vi sinh vật dạ cỏ dê - nguồn khai thác lignocellulase tiềm năng 11 1.2.1. Cấu trúc hệ tiêu hóa ở dê ....................................................................... 11 1.2.2. Hệ vi sinh vật dạ cỏ động vật nhai lại ................................................... 12 1.2.3. Enzyme thủy phân lignocellulose có nguồn gốc từ vi sinh vật dạ cỏ ... 16 1.3. Metagenomics ...................................................................................... 19 1.3.1. Khái quát về phương pháp metagenomics ............................................ 19 1.3.2. Các phương pháp tiếp cận tìm gen mới bằng Metagenomics ............... 19 1.3.2.1. Phân lập gen từ thư viện DNA metagenome .................................. 20 1.3.2.2. Khai thác và phân lập gen từ dữ liệu trình tự DNA metagenome . 21 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU-PHƢƠNG PHÁP ......................................................... 22 2.1. Đối tƣợng .............................................................................................. 22 2.2. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu ................................................. 22 2.2.1. Thiết bị................................................................................................... 22 ii 2.2.2. Dụng cụ vật tư tiêu hao ......................................................................... 22 2.2.3. Hóa chất sử dụng ................................................................................... 23 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................... 23 2.3.1. Phương pháp tách chiết và tinh sạch ..................................................... 23 2.3.1.1. Phương pháp thu mẫu vi khuẩn từ mẫu dịch dạ cỏ dê .................. 23 2.3.1.2. Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA metagenome .............. 24 2.3.1.3. Phương pháp kiểm tra chất lượng DNA metagenome ................... 25 2.3.2. Phân tích và khai thác dữ liệu DNA metagenome bằng các công cụ tin sinh ........................................................................................................ 27 2.3.2.1. Giải mã và lắp ráp hệ gen.............................................................. 27 2.3.2.2. Dự đoán chức năng gen ................................................................. 27 2.3.2.3. Phân tích thống kê.......................................................................... 28 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN.............................................................. 29 3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA metagenome hệ vi sinh vật dạ cỏ dê . 29 3.1.1. Nghiên cứu phương pháp tách chiết DNA metagenome ....................... 29 3.1.2. Tách chiết DNA metagenome ............................................................... 32 3.2. Phân tích dữ liệu DNA metagenome hệ vi khuẩn dạ cỏ dê ............. 33 3.3. Đa dạng hệ vi khuẩn trong dạ cỏ dê .................................................. 36 3.4. Đa dạng hệ enzyme phân giải lignocellulase từ vi khuẩn dạ cỏ dê . 43 3.4.1. Đa dạng enzyme tiền xử lý trong dữ liệu DNA metagenome vi khuẩn dạ cỏ dê ....................................................................................................... 44 3.4.2. Đa dạng enzyme hemicellulase trong dữ liệu DNA metagenome vi khuẩn dạ cỏ dê ....................................................................................... 45 3.4.3. Đa dạng enzyme cellulase trong dữ liệu DNA metagenome vi khuẩn dạ cỏ dê ....................................................................................................... 48 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ .................................................................................... 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 52 iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Thành phần cấu trúc của lignocellulose [75] .............................................. 2 Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của lignin [65] ................................................................. 4 Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống các enzyme tham gia thủy phân hemicellulase hoàn toàn 7 Hình 1.4. Sơ đồ hoạt động của các enzme tham gia thủy phân hoàn toàn cellulose . 8 Hình 1.5. Cấu trúc cellulosome của C. thermocellum [1] ......................................... 10 Hình 1.6. Cấu trúc hệ tiêu hóa dê. ............................................................................. 12 Hình 3.1. So sánh DNA metagenome thu được từ các phương pháp tách chiết khác nhau .......................................................................................................... 31 Hình 3.2. Sản phẩm PCR khuếch đại gen mã cho 16s rDNA của các mẫu DNA thu được từ các phương pháp tách chiết khác nhau ....................................... 31 Hình 3.3. Kết quả điện di kiểm tra mẫu DNA metagenome đã tách chiết và tinh sạch bằng PSP kit ............................................................................................. 32 Hình 3.4. Thành phần dữ liệu thô DNA metagenome .............................................. 34 Hình 3.5. Đồ thị phân bố chiều dài các đoạn contig ................................................. 34 Hình 3.6. Thành phần các ngành vi khuẩn trong dữ liệu DNA metagenome dạ cỏ dê37 Hình 3.7. Thành phần vi khuẩn có khả năng thủy phân lignocellulose có mặt trong dữ liệu DNA metagenome vi khuẩn dạ cỏ dê .......................................... 41 Hình 3.8. Thành phần enzyme lignocellulase trong dữ liệu DNA metagenome vi khuẩn dạ cỏ dê ......................................................................................... 44 Hình 3.9. Thành phần các họ enzyme tiền xử lý trong dữ liệu DNA metagenome vi khuẩn dạ cỏ dê ......................................................................................... 45 Hình 3.10. Thành phần các họ enzyme hemicellulase trong dữ liệu DNA metagenome vi khuẩn dạ cỏ dê................................................................ 46 Hình 3.11. Thành phần các họ enzyme cellulase trong dữ liệu DNA metagenome vi khuẩn dạ cỏ dê ......................................................................................... 49 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần chính của một số loại phế phẩm phụ lignocellulose [78] ....... 3 Bảng 2.1. Các thiết bị nghiên cứu được sử dụng trong đề tài ................................... 22 Bảng 2.2. Các phương pháp tách chiết DNA được sử dụng trong nghiên cứu......... 24 Bảng 2.3. Trình tự mồi 16S rDNA ............................................................................ 26 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR ....................................................................... 26 Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ........................................................... 27 Bảng 3.1. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA metagenome sử dụng các phương pháp tách chiết khác nhau ..................................................................................... 29 Bảng 3.2. Kết quả đo quang phổ ............................................................................... 33 Bảng 3.3. Thành phần hệ vi sinh vật dạ cỏ dê .......................................................... 35 Bảng 3.4. Số lượng ORFs phù hợp với các cơ sở dữ liệu khác nhau ....................... 35 Bảng 3.5. Đa dạng sinh vật (đã được định loại) trong dạ cỏ dê ................................ 36 Bảng 3.6. Các loài vi khuẩn có khả năng tham gia thủy phân lignocellulose có mặt trong dữ liệu DNA metagenome vi khuẩn dạ cỏ dê..................................... 39 v MỞ ĐẦU Ngày nay, nhân loại đang phải đối mặt với tình trạng suy kiệt nguồn nguyên liệu hóa thạch cũng như các hệ quả nghiêm trọng của việc tích tụ khí thải nhà kính. Do đó, việc nghiên cứu sử dụng nguồn năng lượng carbonhydrate có khả năng tái tạo là cần thiết. Một trong những nguồn carbohydrate dồi dào trên Trái Đất là lignocellulose, có thể được tận dụng từ các phế thải nông nghiệp như lá cây, rơm rạ, bã mía…Ở Việt Nam, lượng rơm rạ hàng năm đạt khoảng 30-40 triệu tấn nhưng chỉ một lượng nhỏ đươ ̣c sử du ̣ng làm phân bón sinh h ọc, sản xuất nấm ăn còn chủ yếu được đốt bỏ ngay trên cánh đồng gây lãng phí và ảnh hưởng xấu đến môi trường. Vì vậy, việc chuyển hóa chúng thành các sản phẩm có giá trị không những có thể giảm thiểu ô nhiễm môi trường mà còn góp phần giải quyết nhu cầu năng lượng quốc gia, tạo nguồn thu nhập tại chỗ cho nông dân. Tuy việc tận dụng nguồn lignocellulose có nhiều ưu điểm nhưng trên thực tế, việc chuyển hóa lignocellulose trong công nghiệp hiện nay chủ yếu bằng các phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, có giá thành cao và chưa thực sự hiệu quả và khó xử lý các chất thải hóa học. Do đó, việc khai thác các enzyme phân giải lignocellulose đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Hệ vi sinh vật trong dạ cỏ của động vật nhai lại là nguồn khai thác enzyme tiềm năng. Nhiều gen mã hóa cho hệ enzyme này đã được tìm thấy khá nhiều trong hệ tiêu hóa của dê cùng với các gen mã cho những yếu tố quan trọng cấu thành hệ phân giải cellulosome. Từ đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đa dạng của hệ vi khuẩn và enzyme thủy phân lignocellulose từ dữ liệu metagenome của vi khuẩn trong dạ cỏ dê” với mong muốn khai thác được các enzyme lignocellulose mới và có hiệu quả phân giải cao. 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Lignocellulose và hệ enzyme phân giải lignocellulose 1.1.1. Cấu trúc lignocellulose Lignocellulose là nguồn sinh khối tái tạo dồi dào nhất với sản lượng hàng năm trên thế giới đạt khoảng 200 tỉ tấn [80]. Phần lớn chúng có nguồn gốc từ phế thải lâm nghiệp, nông nghiệp hoặc công nông nghiệp như mùn cưa, bã mía, giấy vụn, thân và lá cây, rơm rạ, cỏ, lõi ngô, trấu, vỏ lạc… Các loại chất thải này tích lũy hàng năm gây ra các vấn đề về môi trường. Tuy nhiên, do thành phần hóa học chủ yếu hình thành nên lignocellulose là từ các loại đường nên chúng có thể được sử dụng để sản xuất một số sản phẩm có giá trị như ethanol, phụ gia thực phẩm, axit hữu cơ… Các thành phần chính của lignocellulose bao gồm: cellulose (25–55%), hemicellulose (8–30%) và lignin (18–35%) [113]. Về cơ bản, cellulose là bộ khung cho sinh khối thực vật và được bao quanh bởi hemicellulose và lignin. Hàm lượng của mỗi thành phần rất khác nhau giữa các loài thực vật, giữa các bộ phận khác nhau và phụ thuộc vào tuổi của thực vật. Hình 1.1. Thành phần cấu trúc của lignocellulose [73] 1.1.1.1. Cellulose Cellulose là m ột polymer mạch thẳng, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n. Các đơn phân hoàn toàn cấu tạo từ đường D-glucose liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4-glucoside với số lượng lên tới hơn 10.000. Cấu trúc liên kết thẳng cho phép hình thành liên kết hydro trong và giữa phân tử tạo ra các vi sợi từ 36 chuỗi cellulose xếp song song, hay cấu trúc tinh thể của cellulose [21]. Ở thực vật, cellulose là thành phần chính tạo nên thành tế bào. Chúng đóng góp từ 15-30% sinh khối khô của thành tế bào sơ cấp và trên 40% đối với thành tế 2 bào thứ cấp. Cấu trúc của cellulose ở thành tế bào thực vật được chia thành cấu trúc tinh thể và cấu trúc vô định hình. Cấu trúc tinh thể chiếm khoảng 2/3 tổng số cellulose với nhiều liên kết hydro nên bền vững trước tác động của enzyme và vi sinh vật [96]. Trong khi đó, cellulose vô định hình có cấu trúc lỏng lẻo, dễ bị thủy phân bởi các enzyme cellulase. 1.1.1.2. Hemicellulose Bảng 1.1. Thành phần chính của một số loại phế phẩm phụ lignocellulose [76] Cellulose (% khối lƣợng) Hemicellulose Lignin (% khối (% khối lƣợng) lƣợng) Rơm lúa mạch 33,8 21,9 13,8 Lõi ngô 33,7 32,9 6,1 Thân ngô 35,0 16,8 7,0 Thân cây bông 58,5 14,4 21,5 Rơm kiều mạch 39,4 27,1 17,5 Rơm lúa 36,2 19,0 9,9 Rơm 37,6 30,5 19,0 Thân đậu nành 34,5 24,8 19,8 Bã mía 40,0 27,0 10,0 Thân cây hoa hướng dương 42,1 29,7 13,4 Rơm lúa mì 32,9 24,0 8,9 Hemicellulose là polymer mạch thẳng, có nhánh với thành phần đơn phân đa dạng bao gồm năm loại phân tử đường chính: D-glucose, D-galactose, D-mannose, D-xylose, L-arabinose cũng như một số thành phần khác như D-glucuronic acid và 4-O-methyl-D-glucuronic acid với số lượng đơn phân dưới 200 và có thể bị acetyl hóa [60]. Phụ thuộc vào thành phần đơn phân chủ yếu cấu tạo nên khung đường, hemicellulose được chia thành nhiều loại như xylan, mannan, glucan, glucuronoxylan, arabinoxylan, glucomannan, galactomannan, galactoglucomannan, β-glucan hoặc xyloglucan. Những loài thực vật khác nhau thì có thành phần 3 hemicellulose khác nhau. Những thực vật thuộc họ Cỏ (Poaceae) như lúa, lúa mì và kiều mạch có thành phần khung cấu trúc chủ yếu là glucuronoarabinoxylan [12], các loại cây gỗ mềm và cây gỗ cứng có thành phần hemicellulose lần lượt là acetylated (galacto) glucomannan (hay còn gọi là arabinoglucuronoxylan) và glucuronoxylan [84]. 1.1.1.3. Lignin Khoảng trống giữa cellulose và hemicellulose lấp đầy bởi chất keo dính lignin [97]. Lignin có cấu trúc phân tử phức tạp với các chuỗi polymer của phenol propane (ví dụ như p-coumaryl alcohol, coniferyl alcohol và sinapyl alcohol) liên kết chéo với nhau. Lignin trong thành phần thành tế bào thực vật có chức năng như một hàng rào bảo vệ, giúp thực vật chống lại các tác động vật lý, hóa học và sâu bệnh ở môi trường ngoài. Tuy nhiên, thành phần này ngăn cản tiếp xúc của cellulase và hemicellulase với cơ chất làm giảm hiệu quả phân giải lignocellulose. Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của lignin [63] 1.1.2. Hệ enzyme phân giải lignocellulose Enzyme thủy phân lignocellulose được tìm thấy ở nhiều loại vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn và nấm. Trong tự nhiên, sinh khối lignocellulose được phân hủy hoàn 4 toàn bởi hỗn hợp các enzyme thủy phân từ vi sinh vật trong khu hệ đặc trưng như ở ruột mối, dạ cỏ bò và một số môi trường khắc nghiệt. Những khu hệ này có thể ưa khí hoặc kị khí, chỉ bao gồm vi khuẩn hoặc chỉ bao gồm nấm hoặc có cả nấm và vi khuẩn [106]. Lignocellulose gồm ba thành phần chính: lignin, hemicellulose và cellulose tương ứng với ba nhóm enzyme phân giải riêng biệt là nhóm các enzyme tiền xử lý, glycosyl hydrolase bao gồm hemicellulase và cellulase. 1.1.2.1. Enzyme tiền xử lý Lignin là thành phần chiếm tỉ lệ nhỏ trong thành phần thành tế bào thực vật nhưng có vai trò quan trọng đảm bảo tính vững chắc và tăng sức đề kháng của thực vật với các mầm bệnh. Tuy nhiên, lignin lại gây cản trở quá trình phân giải lignocellulose do ngăn cản hemicellulase và cellulase tiếp xúc với cơ chất đặc hiệu của chúng. Quá trình tiền xử lý có mục đích chính là phân giải lignin, nới lỏng các liên kết giữa hemicellulose và cellulose. Trong công nghiệp, để phá vỡ cấu trúc của lignin, người ta thường sử dụng phối hợp các biện pháp vật lý (nghiền, cắt hoặc xử lý nhiệt độ và áp suất cao) và biện pháp hóa học (axit hoặc kiềm). Tuy nhiên, những biện pháp này có giá thành cao, tiêu tốn nhiều năng lượng và ảnh hưởng xấu tới môi trường [96]. Do đó, các biện pháp sinh học đang nhận được nhiều quan tâm và nghiên cứu. Tới nay, nhiều nghiên cứu đã được công bố về một số chủng vi sinh vật như nấm sợi, nấm mục và một số loại vi khuẩn có khả năng sản xuất các enzyme phân giải lignin, gọi chung là các ligninase. Các enzyme này được chia làm hai họ: (1) phenol oxidase (laccase) và (2) peroxidase, gồm có lignin peroxidase (LiP), manganese peroxidase (MnP) và peroxidase đa năng. Vi sinh vật phân giải lignin hiệu quả nhất đến nay được xác định thuộc họ nấm mục trắng [18]. Taniguchi và cộng sự đã đánh giá hiệu quả tiền xử lý của rơm lúa bằng bốn loại nấm mục trắng (Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Ceriporiopsis subvermispora và Pleurotus ostreatus) dựa trên những thay đổi về số lượng và thành phần cấu trúc rơm rạ sau xử lý cũng như tính nhạy cảm với enzyme thủy phân [98]. Kết quả là P. ostreatus có khả năng thủy phân chọn lọc lignin và làm tăng hiệu quả của cellulase 5 và hemicellulase. Một số vi khuẩn cũng có thể được sử dụng cho tiền xử lý nguyên liệu lignocellulose. Nhóm nghiên cứu của Kurakake đã cho thấy khả năng thu hồi đường từ giấy văn phòng lên tới 94% khi tiền xử lý sinh học giấy văn phòng với hai chủng vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis và Bacillus circulans ở điều kiện tối ưu [61]. 1.1.2.2. Hemicellulase Nhóm enzyme phân giải hemicellulose rất phong phú do thành phần đa dạng của hemicellulose. Hemicellulase chia thành ba nhóm chính dựa trên khả năng phân cắt của nó: glycoside hydrolase (thuộc vào 29 họ GH) thủy phân liên kết glycoside, carbohydrate esterase (thuộc khoảng 9 họ CE) thủy phân liên kết ester và polysaccharide lyase (thuộc khoảng 5 họ PL) cắt liên kết glycoside [95]. Ngoài ra, hemicellulase có thể được gọi tên theo loại cơ chất thủy phân đặc trưng của chúng. Do có thành phần phức tạp nên quá trình phân hủy hemicellulose đòi hỏi sự tham gia của nhiều loại enzyme và phụ thuộc vào thành phần hemicellulose. Xylanase thủy phân liên kết β-1,4 giữa các phân tử xylan với nhau, giải phóng các phân tử ngắn xylooligomer, gồm có endo-xylanase và exo-xylanase. Trong khi endoxylanase phân cắt liên kết β-1,4-xyloside trong mạch xylan thì exo-xylanase thủy phân liên kết β-1,4-xyloside ở các đầu tự do. Sản phẩm của các enzyme này là xylobiose sẽ được tiếp tục thủy phân thành đường đơn xylose bằng enzyme βxylosidase. Với hemicellulose cấu tạo chủ yếu từ mannan, β-mannanase sẽ tham gia thủy phân galacto-glucomannan và giải phóng các tiểu phần β-1,4-manno-oligomer. Sau đó các tiểu phần này có thể bị thủy phân thành các đơn phân mannose bởi enzyme β-mannosidase.Cùng với đó, các nhóm bên cũng sẽ bị phân cắt bởi một số hemicellulase khác như: α-L-arabinofuranosidase, glucuronidase, xyloglucan hydrolase và pectinase. 6 α-L-arabinanase, α-D- Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống các enzyme tham gia thủy phân hemicellulase hoàn toàn [20] Ví dụ về sự phân cắt arabinoxylan. Mũi tên chỉ vị trí phân cắt của mỗi enzyme 1.1.2.3. Cellulase Sự phá hủy chất keo dính lignin và các chuỗi hemicellulose là điều kiện cần thiết cho phép các enzym cellulase tiếp cận tối đa với cellulose để thực hiện quá trình thủy phân cellulose tạo đường đơn glucose. Cellulase là enzyme thuộc lớp glycosyl hydrolase (GHF), thủy phân các hợp chất polysaccharide và oligosaccharide được tìm thấy trong tự nhiên (cellulose, tinh bột, chitin, xylan, laminarin và cellobiose). Cellulase được chia thành ba nhóm lớn là exoglucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), endoglucanase (EC 3.2.1.4) và β-glucosidase (EC 3.2.1.21). Exoglucanase di chuyển dọc theo sợi cellulose và cắt cellulose thành cellobiose. Trong khi đó, endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên liên kết β-1,4glucoside bên trong sợi cellulose còn β-glucosidase có khả năng thủy phân cellobiose thành glucose cũng như cắt glucose ra khỏi cellooligosaccharide. Những enzyme này hỗ trợ nhau trong quá trình thủy phân cellulose bằng cách tạo ra những vị trí tiếp cận cho nhau, loại bỏ vật cản và hạn chế ảnh hưởng của các chất ức chế [28]. 7 Hình 1.4. Sơ đồ hoạt động của các enzme tham gia thủy phân hoàn toàn cellulose [20] Mũi tên chỉ vị trí phân cắt của mỗi enzyme Cellulase có cấu trúc gồm hai phần: vùng xúc tác (Catalytic domain_CD) và một hoặc nhiều vùng liên kết với carbohydrate (Carbohydrate binding modules_CBMs) nối với nhau bởi đoạn peptide ngắn. Vùng CBM có nhiệm vụ neo bám vùng xúc tác với cơ chất, từ đó làm tăng hiệu quả thủy phân cho enzyme. Chúng có thể nằm ở đầu N hoặc đầu C của vùng CD [112]. CBM từ các enzyme khác nhau và nguồn sinh vật khác nhau được phân chia thành các họ dựa trên độ tương đồng về trình tự amino acid và cấu trúc không gian ba chiều. Ở nấm hiếu khí, CBM luôn thuộc họ 1 với kích thước nhỏ (khoảng 30-35 amino acid). Trong khi đó, CBM của cellulase vi khuẩn có kích thước lớn khoảng 100 đến 150 amino acid, thường thuộc họ 2 hoặc 3 [43]. Vùng xúc tác của cellulase có thể có hoạt tính endoglucanase hoặc exoglucanase (riêng β-glucosidase không có thành phần CBM [112]). Tùy thuộc hoạt tính xúc tác mà domain này có cấu hình lõi khác nhau. Trung tâm hoạt động của endoglucanase có dạng rãnh. Do đó, một chuỗi cellulose có thể đi vào trung tâm xúc tác ở vị trí ngẫu nhiên và các liên kết sẽ bị phân cắt dọc theo chuỗi cellulose. Ngược lại, vùng hoạt động của exoglucanase cấu trúc theo dạng “đường hầm”, tạo bởi một vòng dài các phân tử protein cuộn xung quanh vị trí xúc tác [19]. Kết quả là, cơ chất chỉ có thể được đưa vào từ một đầu của trung tâm 8 xúc tác, sự thủy phân liên kết diễn ra bên trong “đường hầm” và giải phóng sản phẩm cellobiose từ đầu còn lại. 1.1.2.4. Hoạt động của cellulosome Để tăng cường hiệu quả phân giải sinh khối lignocellulose và giảm giá thành xử lý, chúng ta cần nghiên cứu các enzyme có hoạt tính mạnh và cơ chế hoạt động của chúng. Trong tự nhiên, lignocellulose được chuyển hóa hoàn toàn bởi hỗn hợp các enzyme lignocellulase sản xuất từ nhiều loại vi sinh vật, chủ yếu là nấm và vi khuẩn kị khí hoặc ưa khí. Dựa trên cấu trúc, các enzyme này được chia thành hai nhóm là enzyme tự do và cellulosome. Enzyme tự do được sản xuất bởi cả hai nhóm vi sinh vật ưa khí và yếm khí. Trong khi đó, cellulosome chỉ được tiết ra từ nhóm vi sinh vật kị khí. Cellulosome là một phức hệ đa enzyme thủy phân hiệu quả cellulose. Phức hệ này được nhóm nghiên cứu của Bayer, Lamed và cộng sự phát hiện lần đầu tiên ở vi khuẩn chịu nhiệt yếm khí Clostridium thermocellum khoảng đầu những năm 1980 [62]. Từ đó, nhiều công trình đã hé lộ thêm kiến thức về tính chất, độ đa dạng và cơ chế tương tác của chúng với thành tế bào thực vật và xác định được thêm nhiều loại vi sinh vật có khả năng sản xuất cellulosome, trong đó có nhiều loài nấm và vi khuẩn kị khí cư trú trong dạ cỏ như Butyrivibrio fibrisolvens, Clostridium cellobioparum, Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens, Neocallimastix patriciarum [25]. Cấu trúc của cellulosome được đặc trưng bởi hai thành phần: vùng protein khung không có khả năng xúc tác (scaffodin) và vùng enzyme. Hai thành phần chính này được lắp ghép thành cellulosome hoàn chỉnh nhờ ái lực liên kết cao của cohesin trên protein khung với dokerin thuộc miền mang hoạt tính xúc tác. Tất cả các enzyme thuộc cellulosome đều chứa dockerin. Dockerin có kích thước khoảng 70 axit amin với hai đoạn lặp (khoảng 22 axit amin) và thường định vị ở đầu C của enzyme trong phức hệ. Cohesin là trình tự dài 150 axit amin, phân bố lặp ngẫu nhiên trên protein khung [32]. Tương tác cohesin-dockerin đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành cellulosme và có tính đặc hiệu cao. Ví dụ, protein khung của C. thermocellum chứa 9 cohesin loại I và một cohesin loại II ở đầu C. Tuy nhiên, cohesin loại II không nhận biết dockerin loại I nằm ở vùng xúc tác mà nhận biết 9 dockerin loại II định vị trên protein bề mặt tế bào vi khuẩn. Cohesin/dockerin loại I không thể tương tác được với dockerin/cohesin loại II đã đảm bảo phức hệ được lắp ráp chính xác và phân biệt với liên kết trên bề mặt tế bào [64]. Ngoài ra, tương tác này còn mang tính đặc trưng cho loài. Nhóm nghiên cứu của Page và cộng sự (1997) đã chứng minh được dockerin của enzyme cellulosome ở C. cellulolyticum không nhận biết và liên kết với cohesin của scaffoldin ở C. thermocellum [78]. Protein khung trong cellulosome đóng nhiều vai trò liên kết: (1) liên kết phức hệ cellulosome (2) liên kết với cơ chất đặc hiệu và (3) liên kết với protein trên bề mặt tế bào. Protein khung có thể chứa số lượng cohesin khác nhau từ 1 đến 11 (thường trên 4) dẫn đến nhiều loại enzyme khác nhau có thể được liên kết vào cellulosome. Các enzyme của cellulosome gồm có cellulase, hemicellulase, pectinase, chitinase và nhiều enzyme phụ trợ giúp phân giải thành tế bào thực vật. Vì vậy, cellulosome có khả năng thủy phân hiệu quả hơn hẳn các enzyme thủy phân tự do đơn lẻ. Trong khi cohesin giúp liên kết với các enzyme thủy phân thì vai trò liên kết với cơ chất thuộc về yếu tố CBM. Đến nay, tất cả yếu tố CBM thuộc scaffoldin của cellulosome được nghiên cứu đều nằm trong họ CBM3. Đây là họ CBM có liên kết mạnh với bề mặt cellulose tinh thể, giải thích cho tính đặc hiệu của cellulosome với cơ chất của chúng [6]. Hình 1.5. Cấu trúc cellulosome của C. thermocellum [1] 10 Thành phần scaffoldin (CipA) liên kết với thành tế bào vi khuẩn thông qua tương tác giữa cohesin loại II và dockerin loại II. CipA chứa một CBM giúp phức hệ bám vào cơ chất và cohesin loại I liên kết với dockerin loại I của đơn vị xúc tác. Tóm lại, phức hệ cellulosome có những ưu thế vượt trội, làm tăng hiệu quả thủy phân cellulose như sau:  Tổ chức phức hệ là tối ưu nhờ tỉ lệ và vị trí sắp xếp hợp lý giữa các thành phần trong phức hệ  Cấu trúc không gian tối ưu, tránh tình trạng cản trở hoạt động giữa các thành phần.  Không có cạnh tranh liên kết giữa các thành phần do toàn bộ phức hệ liên kết với một vị trí duy nhất thông qua domain liên kết mạnh nhưng độ đặc hiệu thấp, liên kết với phổ rộng vị trí trên thành tế bào thực vật.  Sự thủy phân diễn ra liên tiếp đến sản phẩm cuối nhờ hỗn hợp các enzyme có hoạt tính khác nhau 1.2. Hệ vi sinh vật dạ cỏ dê - nguồn khai thác lignocellulase tiềm năng 1.2.1. Cấu trúc hệ tiêu hóa ở dê Dê thuộc lớp Thú (Mammalia) trong họ Bò (Bovidae), bộ Guốc chẵn (Artiodactyla). Ở Việt Nam, dê đã được nuôi từ lâu nhằm mục đích lấy thịt và sữa, trong đó các giống dê phổ biến là dê Cỏ, dê Bách Thảo, dê Boer... Giống như phần lớn các đại diện khác cùng họ, dê là động vật ăn cỏ. Chúng không có răng cửa cũng như răng nanh. Việc lấy thức ăn hoàn toàn phụ thuộc vào phần lợi cứng trên, răng cửa dưới, môi và lưỡi. Để tiêu hóa và hấp thụ được nguồn thức ăn nghèo dinh dưỡng này, dạ dày của dê có cấu tạo kép gồm bốn ngăn (túi): Ba túi trước (dạ cỏ, dạ tổ ong, dạ lá sách) và túi thứ tư tương tự dạ dày của động vật dạ dày đơn, gọi là dạ múi khế. Trong đó, dạ cỏ là dạ lớn nhất, chiếm hầu hết nửa trái khoang bụng, từ cơ hoành đến xương chậu. Thành trong dạ cỏ tạo thành những nếp gấp lớn và được bao phủ bởi các nhú gai. Đâyđược coi là một bể lên men kị khí, là nơi cư trú của nhiều loài vi sinh vật. Hệ vi sinh vật này tiết ra một hệ các enzyme phân giải phong phú biến dạ cỏ trở thành một bể lên men kị khí tự nhiên. Các quá trình lên men chính được diễn ra ở đây nhờ các enzyme tạo bởi hệ vi sinh vật này. 11