Tài liệu Nghiên cứu công nghệ sản xuất chất bảo quản sinh học bacterioxin bằng phương pháp vi sinh có ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ CÔNG THƯƠNG NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Tên Đề tài: NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẤT BẢO QUẢN SINH HỌC BACTERIOXIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH CÓ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM MÃ SỐ: 04/2008/HĐ-NĐT Cơ quan chủ trì đề tài: VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chủ nhiệm đề tài : TS. NGUYỄN LA ANH 8722 Hà Nội – 2010 BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ CÔNG THƯƠNG NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Tên Đề tài: NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẤT BẢO QUẢN SINH HỌC BACTERIOXIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH CÓ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM MÃ SỐ: 04/2008/HĐ-NĐT Chủ nhiệm đề tài: Cơ quan chủ trì đề tài TS. Nguyễn La Anh Bộ Khoa học và Công nghệ (ký tên đóng dấu trước gửi lưu trữ) Hà Nội – 2010 MỤC LỤC MỞ ĐẦU…………………………………………….……………………………….1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN…………………………………………………….........3 1.1. Giới thiệu về bacterioxin và vi khuẩn lactic………………………………...………3 1.1.1. Giới thiệu về bacterioxin……………………………………………………3 1.1.2. Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin…………………………….…….5 1.2. Giới thiệu về nisin…………………………………………………………..…...….7 1.2.1. Vi sinh vật sinh tổng hợp nisin………………………………………….…..7 1.2.2. Cấu trúc phân tử của nisin…………………………………………………..9 1.2.3. Tính chất của nisin…..…………………………………………..…...……10 1.2.4. Cơ chế tác dụng của nisin……………………………….............................11 1.2.5. Sinh tổng hợp và điều hòa phiên mã……………………............................14 1.2.6. Sự liên hệ giữa các tính trạng lên men sucrose, sinh tổng hợp nisin và kháng nisin………………………………………………..……………………….16 1.2.7. Sự ổn định tính trạng Suc-Nis……………………………………………..17 1.2.8. Sự sắp xếp lại plasmid của Lactococcus trong quá trình ít dinh dưỡng kéo dài…………………………………………………………………...……..18 1.3. Ứng dụng bacterioxin và nisin…………………………………………..…...….…21 1.4. Công nghệ sản xuất sản xuất nisin……………………………………...……....….26 1.4.1. Công nghệ lên men………………………………..………………………26 1.4.2. Công nghệ lên men kết hợp hấp phụ nisin…………………….…………..28 1.4.3. Công nghệ thu hồi ………………………………………….……….…28 1.5. Giới thiệu một số công nghệ tinh chế và thu nhận protein ……….…………….32 1.5.1. Chiết pha rắn …………………………………………………..…………32 1.5.2. Phương pháp lọc tiếp tuyến - cắt phân đoạn ……………….……….……35 1.5.3. Phương pháp sấy phun………………………………………….…………39 1.5.4. Phương pháp sấy phun xung đốt…………………………………..………42 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP................................................45 2.1. Nguyên vật liệu……………………………………………………...…………….45 2.1.1. Các chủng vi sinh vật…………………………...…………………………45 2.1.2. Môi trường…………………………………………..…………………….45 2.1.3. Các nguyên vật liệu hấp phụ ………………………….………………….46 2.2. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………………..47 2.2.1. Phân lập vi sinh vật………………………………………………………..47 2.2.2. Phương pháp bảo quản giống……………………….……………………..47 2.2.3. Phân loại bằng hình thái tế bào và khuẩn lạc………………….…………..47 2.2.4. Phương pháp xác định kiểu hình axit lactic……………………………….48 2.2.5. Phương pháp xác định meso- DAP trong thành tế bào…………………….48 2.2.6. Phương pháp xác định kiểu hình lên men của vi khuẩn lactic……..……...48 2.2.7. Phương pháp xác định khả năng lên men các loại đường…………………48 2.2.8. Kiểm tra tính nhạy cảm với kháng sinh clindamycin……………...………48 2.2.9. Kiểm tra tính nhậy cảm của bacterioxin với protease……………….…….49 2.2.10. Kiểm tra tính bền nhiệt của bacterioxin……………………………….…..49 2.2.11. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacterioxin………………………...…..49 2.2.12. Phương pháp tách DNA tổng số………………………………………..….50 2.2.13. Phương pháp đinh tên bằng đọc trình tự đoạn gen V1-V3 16S r.DNA…....50 2.2.14. Phương pháp tách plasmid………………………………………………...51 2.2.15. Phương pháp PCR để tách dòng gen nis…………………………………..51 2.2.16. Tinh sạch sản phẩm DNA gen nis…………………….…………………...52 2.2.17. Xác định trình tự gene nis bằng phương pháp đọc trình tự trực tiếp……....52 2.2.18. Xác định trình tự gene nis thông qua AT cloning…………………………53 2.2.19. Phương pháp xác định kích thước phân tử bacterioxin……………………53 2.2.20. Phương pháp Điện di Tricine –SDS – PAGE……………………………..54 2.2.21. Phương pháp đọc trình tự amino acid từ N- terminus……………………..54 2.2.22. Xác định hoạt tính bacterioxin bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch….55 2.2.23. Xác định hoạt tính nisin bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch ……..55 2.2.24. Xác định hoạt tính nisin bằng phương pháp HPLC……………………….56 2.2.25. Phương pháp xác định sinh khối…………………………………………..57 2.2.26. Phương pháp xác định đường tổng………………………………………...57 2.2.27. Phương pháp xác định đạm…………………………………..……………57 2.2.28. Phương pháp lên men………………………………………………….…..57 2.2.29. Phương pháp hấp phụ-phản hấp phụ bằng tế bào chủng sản xuất ……..58 2.2.30. Phương pháp kết tủa bằng amonium sulphate…………………..………...58 2.2.31. Phương pháp thu hồi bằng vật liệu hấp phụ …………………….……….59 2.2.32. Các phương pháp tinh sạch nisin……………………………………….......60 2.2.33. Các thiết bị cần cho công đoạn thu nhận sản phẩm ……………………..60 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………………...61 3.1. Phân lập, sưu tập, trao đổi, lưu giữ bảo quản các chủng giống có hoạt tính sinh bacterioxin…………………………………………….……………………….....61 3.2. Nghiên cứu khảo sát, tuyển chọn các chủng giống có đặc tính sinh bacterioxin……………………….…………………………...……………….….63 3.2.1. Sự nhạy cảm của bacterioxin với enzym proteinase …..……..….………..64 3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của bacterioxin…...............................65 3.3. Nghiên cứu định tên chủng giống…………………………………...…………….65 3.3.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hoá………………………….65 3.3.2. Nghiên cứu đọc trình tự đoạn gen 16SrDNA…………………….………..68 3.3.3. Khảo sát tính nhạy cảm với kháng sinh clindamycin…...............................69 3.4. Nghiên cứu đặc điểm bacterioxin…………………………………...……….…….70 3.4.1. Khảo sát sự có mặt gen mã hóa nisin ở các chủng vi khuẩn..……….…….70 3.4.2. Đọc trình tự đoạn gen mã hóa nisin ………………………….………….71 3.4.2.1. Đặc điểm gen nis của chủng Lactococcus lactis subsp. lactis DSM 20729……………………………...…………………………………..71 3.4.2.2. Trình thự gen nis của chủng Lactococcus garvieae BV20…………….72 3.4.2.3. Trình thự gen nis của chủng Lactococcus garvieae Tn63………….….73 3.4.2.4. Trình thự gen nis của chủng Lactococcus lactis subsp. lactis PĐ14…..74 3.4.3. Nghiên cứu đọc trình tự amino axit từ N-terminus…………….………….78 3.5. Ổn định hoạt tính chủng giống……………………………………….……………80 3.5.1. Sàng lọc phân lập chủng giống sinh tổng hợp nisin cao……….………….80 3.5.2. Xác định vị trí gen mã hóa nisin……………….…………………………..83 3.5.3. Nguyên nhân gây đến sự giảm hoạt tính…………….…………………….86 3.5.4. Ảnh hưởng quá trình hoạt hóa đến hoạt lực chủng giống……...…….……94 3.5.5. Quy trình biện pháp duy trì hoạt tính chủng ………………….………….96 3.6. Nghiên cứu công nghệ sinh tổng hợp bacterioxin (nisin)………………..………..98 3.6.1. Nghiên cứu thành phần môi trường………………………………….…….98 3.6.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men………………..105 3.6.3. Nghiên cứu quá trình lên men theo mẻ…………………………………..107 3.6.4. Nghiên cứu quá trình lên men tiếp dần nồng độ…………………..……..110 3.6.5. Nghiên cứu quá trình lên men kết hợp hấp phụ bacterioxin……………..114 3.6.5.1. Nghiên cứu quá trình lên men theo mẻ kết hợp với hấp phụ……..……115 3.6.5.2. Nghiên cứu quá trình lên men tiếp dần nồng độ kết hợp với hấp phụ…118 3.7. Tiến hành lên men quy mô thực nghiệm………………………..….…………….122 3.8. Nghiên cứu công nghệ thu hồi sản phẩm………………………………….……..124 3.8.1. Nghiên cứu các biện pháp tách sản phẩm khỏi dịch canh trường ……124 3.8.1.1. Thu hồi nisin bằng phương pháp hấp phụ - phản hấp phụ tế bào……...124 3.8.1.2. Thu hồi nisin bằng phương pháp kết tủa bằng amonium sulphate……..125 3.8.1.3. Thu hồi nisin bằng phương pháp sử dụng vật liệu hấp phụ……………125 3.8.1.3.1. Nghiên cứu thu thu hồi nisin bằng silicone ……………………126 3.8.1.3.2. Nghiên cứu thu thu hồi nisin bằng diatomite……………….........127 3.8.1.3.3. Thu hồi nisin bằng vật liệu hấp phụ là hạt trao đổi cation……….130 3.8.1.3.4. Nghiên cứu thu thu hồi nisin bằng silica gel……………………..133 3.8.1.3.5. Nghiên cứu thu thu hồi nisin bằng axit silicic……………………136 3.8.1.3.6. Kết luận nghiên cứu thu hồi nisin bằng vật liệu hấp phụ………...141 3.8.1.4. Kết quả so sánh các phương pháp thu hồi nisin………………………..142 3.8.2. Nghiên cứu các phương pháp tinh sạch………………………..…………143 3.8.2.1. Lọc và cô đặc dịch phản hấp phụ………………………………………143 3.8.2.2. Tinh sạch bằng SPE……………………………………………………145 3.8.3. Nghiên cứu các phương pháp tạo sản phẩm……………………………...146 3.8.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt lực nisin trong dung dịch…….146 3.8.3.2. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của nisin………………………………146 3.8.3.3. Tạo sản phẩm bằng phương pháp sấy phun……………………………146 3.9. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất bacterioxin………………………...…..150 3.10. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở, phân tích tính vệ sinh an toàn thực phẩm của sản phẩm ……………………………………………………………………………153 3.10.1. Tiêu chuẩn cơ sở cho phụ gia thực phẩm - Chế phẩm Firisin T…………153 3.10.2. Tiêu chuẩn cơ sở cho phụ gia thực phẩm - Chế phẩm Firisin P………….154 3.11. Áp dụng sản phẩm tại cơ sở sản xuất…………………………………………..156 3.11.1. Áp dụng sản phẩm tại cơ sở sản xuất nước mắm………………………...156 3.11.1.1. Khảo sát một số loại nước mắm trên thị trường……………….....156 3.11.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng ức chế Staphylococcus aureus và Bacillus cereus của nisin……………..………..………157 3.11.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt lực nisin theo thời gian…159 3.11.1.4. Lựa chọn nồng độ nisin thích hợp cho việc ứng dụng trong quá trình sản xuất nước mắm……………………………………………….159 3.11.1.5. Ảnh hưởng của nisin đến S. aureus và B. cereus trong giai đoạn lên men nước mắm……………………………………………………161 3.11.1.6. Ảnh hưởng của nisin đến Staphylococcus aureus CNTP6083 và Bacillus cereus CNTP6089 bổ sung trong nước mắm thành phẩm…162 3.11.1.7. Ứng dụng nisin trong quá trình chế biến nước mắm và trong bảo quản nước mắm thành phẩm tại cơ sở sản xuất…………………..163 3.11.2. Áp dụng sản phẩm tại cơ sở sản xuất sữa………………………………...165 3.11.2.1. Xác định kháng khuẩn của nisin đối với chủng kiểm định Listeria monocytogenes ATCC13932……………………………………..165 3.11.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng chất béo trong sữa đến khả năng nisin ức chế Listeria monocytogenes ATCC13932………………………..166 3.11.2.3. Ảnh hưởng của chất nhũ tương hóa đến khả năng nisin ức chế Listeria monocytogenes ATCC13932 trong môi trường sữa……..167 3.11.2.4. Ảnh hưởng của nisin và polysorbate 80 0,1% đến Listeria monocytogenes ATCC13932 trong môi trường sữa……………...169 3.11.2.5. Ứng dụng nisin và polysorbate 80 trong bảo quản sữa tươi trong điều kiện phòng thí nghiệm……………………………………………170 3.11.2.6. Ứng dụng nisin và polysorbate 80 trong bảo quản sữa tươi tại cơ sở sản xuất…………………………………………………………...172 CHƯƠNG IV. CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC…………………………………………...173 4.1. Hoàn thành các nội dung nghiên cứu với kết quả có độ tin cậy cao ……………173 4.2. Sản phẩm của đề tài được thực hiện đầy đủ và cụ thể như sau…………………..174 4.3. Tác động đối với kinh tế, xã hội và môi trường………………………………….175 4.4. Một số hạn chế của đề tài………………………………………………………...175 KẾT LUẬN………………………………………………………………………..……..177 KIẾN NGHỊ…………………………………………………………………………..….179 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………………..180 PHỤ LỤC BẢNG CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết tắt EDTA ACN AU bp CFU CNTP DAP DNA DSM EDTA FAO HPLC IU JCM kDa LAB MDa MIC MRS CT1 MRS CT2 NCBI NFRI OD RNA SDC SDS SDS-PAGE: SPE STG TCVN TFA w/v v/v WHO Ethylenediaminetetraacetic acid Acetonitrile Arbitary Unit Base pair(s) Colony Forming Unit Ký hiệu chủng giống thuộc Bộ sưu tập giống, Viện Công nghiệp thực phẩm Diaminopimelic acid Deoxyribonucleic acid Ký hiệu chủng giống thuộc Bộ sưu tập Vi sinh vật và Tế bào của Đức, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Ethylenediaminetetraacetic acid Food and Agriculture Organization High-performance liquid chromatography or high-pressure liquid chromatography International Unit Japanese Collection of Microorganism Kilodalton Lactic acid bacteria – Vi khuẩn lactic Megadalton Minimal Inhibitory Concentration Môi trường MRS cải tiến số 1 Môi trường MRS cải tiến số 2 National Centerfor Biotechnology Information National Food Research Institute, Japan Optical density Ribonucleic acid Sodium deoxycholate Sodium dodecyl sulfate Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis Solid phase extraction Sưu tập giống vi sinh vật công nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm Tiêu chuẩn Việt Nam Trifluoroacetic acid Weigh/volume Volume/volume World Health Organisation DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số bacterioxin từ vi khuẩn lactic………………....…………..……………4 Bảng 1.2. Sự đa dạng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin…..………………...……6 Bảng 1.3. So sánh đặc điểm máy sấy phun xung với các dạng sấy phun khác…….……44 Bảng 3.1. Thống kê các chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin………………61 Bảng 3.2. Một số đặc điểm của chủng LAB mới phân lập…………..…………………..62 Bảng 3.3. Một số đặc điểm các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh.........…63 Bảng 3.4. Sự nhậy cảm của bacterioxin với enzym proteinase…………..……………...65 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền của bacterioxin…………………….……65 Bảng 3.6. Một số đặc điểm sinh trưởng, sinh hóa………………………………….……66 Bảng 3.7. Một số đặc điểm hình thái, sinh trưởng, sinh hóa…………………………….66 Bảng 3.8. Một số khả năng lên men đường…………………….………………………..67 Bảng 3.9. Sự tính nhảy cảm với clindamycin của các chủng nghiên cứu……………..…70 Bảng 3.10. Sự phát triển của chủng kiểm định khi có mặt bacterioxin với pH khác nhau..76 Bảng 3.11. Phổ kháng khuẩn của bacterioxin từ chủng 0-5 và DSM 20729……………...76 Bảng 3.12. Tinh chế bacterioxin từ chủng 0-5…...………………………………………..77 Bảng 3.13. Trình tự 18 amino acids từ đầu N-terminus của bacterioxin từ chủng 0-5……78 Bảng 3.14. Hoạt lực còn lại của các chủng dẫn xuất sau sàng lọc so với thời điểm bắt đầu bảo quản (%)………………………………………………...………….……..87 Bảng 3.15. Khả năng sống sót của các chủng dẫn xuất sau sang lọc kể từ thời điểm bắt đầu bảo quản……………………………………………………………………….89 Bảng 3.16. So sánh hoạt lực chủng giống bằng các phương pháp hoạt hóa khác nhau…...95 Bảng 3.17. So sánh các phương pháp bảo quản và hoạt hóa các chủng giống dẫn xuất từ DSM 20729 về khả năng sinh tổng hợp nisin………………………………...97 Bảng 3.18. Ảnh hưởng hàm lượng sucrose đến sinh trưởng và sinh tổng hợp nisin…….100 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của nguồn phospho lên sinh trưởng và sinh tổng hợp nisin……..101 Bảng 3.20. Ảnh hưởng của tỉ lệ NH4H2PO4……………………………………………..102 Bảng 3.21. Hàm lượng đạm hòa tan trong các nguyên liệu nguồn nitơ………………….103 Bảng 3.22. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ khác nhau………………………………103 Bảng 3.23. Ảnh hưởng của tỉ lệ đạm trong sữa gầy……………………………………...104 Bảng 3.24. Ảnh hưởng của nhiệt độ……………………………………………………...105 Bảng 3.25. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy…………………………………….106 Bảng 3.26. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống…………………………………………………...107 Bảng 3.27. Điều kiện bổ sung cơ chất của các mẫu thí nghiệm khác nhau……………...111 Bảng 3.28. Động học của quá trình lên men tiếp dần nồng độ…………………….…….111 Bảng 3.29. Hiệu suất thu hồi nisin khi lên men kết hợp với hâp phụ với thời điểm bổ sung acid silicic khác nhau………………...………………………………………117 Bảng 3.30. Kết quả thu hồi nisin trong lên men tiếp dần nồng độ 50% cơ chất so với ban đầu, kết hợp với hấp phụ……………………………………………………119 Bảng 3.31. Điều kiện bổ sung cơ chất với các nồng độ khác nhau ...…………………120 Bảng 3.32. Kết quả thí nghiệm lên men tiếp dần nồng độ kết hợp thu hồi với nồng độ bổ sung cơ chất khác nhau…………………………………………………...…121 Bảng 3.33. Động học của quá trình lên men theo mẻ quy mô thiết bị lên men………….122 Bảng 3.34. Kết quả thu hồi nisin bằng phương pháp hấp phụ-phản hấp phụ tế bào……..124 Bảng 3.35. Kết quả thu hồi nisin bằng phương pháp kết tủa bởi amonium sulphate…….125 Bảng 3.36. Ảnh hưởng của tỷ lệ silicone tới khả năng hấp phụ nisin……………………126 Bảng 3.37. Ảnh hưởng của chất phản hấp phụ đến sự phản hấp phụ nisin từ diatomite...128 Bảng 3.38. Kết quả thu hồi nisin khi sử dụng diatomite với các tỷ lệ khác nhau………..129 Bảng 3.39. Ảnh hưởng của nồng độ SDS tới hiệu quả phản hấp phụ nisin từ diatomite...129 Bảng 3.40. Ảnh hưởng của tỷ lệ hạt trao đổi cation tới khả năng hấp phụ nisin …....…..131 Bảng 3.41. Ảnh hưởng của pH dịch canh trường tới khả năng hấp phụ nisin của hạt trao đổi cation………………………..…………………………………………...132 Bảng 3.42. Ảnh hưởng của các chất phản hấp phụ đến sự phản hấp phụ nisin từ hạt trao đổi cation……………………………………..……………………………...132 Bảng 3.43. Ảnh hưởng của tỷ lệ silica gel tới khả năng hấp phụ nisin…………………..133 Bảng 3.44. Ảnh hưởng pH dịch canh trường tới sự hấp phụ nisin của silica gel………...134 Bảng 3.45. Ảnh hưởng thành phần dịch phản hấp phụ tới sự phản hấp phụ từ silica gel..135 Bảng 3.46. Xác định thành phần phù hợp của dung dịch NaCl 1M và ethanol………….135 Bảng 3.47. Ảnh hưởng của tỷ lệ axit silicic tới khả năng hấp phụ nisin…………………136 Bảng 3.48. Ảnh hưởng pH dịch canh trường khả năng hấp phụ nisin của axit silicic…...137 Bảng 3.49. Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dịch phản hấp phụ so với dịch lên men ban đầu khi sử dụng axit silicic làm chất hấp phụ……………………………………138 Bảng 3.50. Hiệu suất thu hồi nisin với các chất phản hấp phụ…………………………...139 Bảng 3.51. Xác định thành phần tỷ lệ dịch phản hấp phụ đối với axit silicic……………140 Bảng 3.52. Ảnh hưởng của thời gian phản hấp phụ……………………………………...140 Bảng 3.53. So sánh các phương pháp thu hồi bằng vật liệu hấp phụ…………………….141 Bảng 3.54. Kết quả thu hồi nisin bằng phương pháp hấp phụ bởi axit silicic 6% w/v..…141 Bảng 3.55. Các kết quả phân tích dịch thu hồi trong lọc dòng tiếp tuyến cô đặc………..144 Bảng 3.56. Các kết quả phân tích dịch thu hồi trong SPE………………………………146 Bảng 3.57. Sự bền hoạt tính của nisin ở các pH khác nhau theo thời gian………………147 Bảng 3.58. Khảo sát nhiệt độ đầu vào trong việc tạo sản phẩm sấy phun……………….148 Bảng 3.59. Tinh sạch và thu nhận sản phẩm nisin thô và tinh…………………...………148 Bảng 3.60. Các chỉ tiêu chất lượng chủ yếu của nisin thô……………………………….153 Bảng 3.61. Các chỉ tiêu vi sinh vật của nisin thô………………………………………...153 Bảng 3.62. Hàm lượng kim loại nặng của nisin thô……………………………………...153 Bảng 3.63. Hàm lượng các chất không mong muốn của nisin thô ...…………………….154 Bảng 3.64. Các chỉ tiêu chất lượng chủ yếu của nisin tinh………………………………154 Bảng 3.65. Các chỉ tiêu vi sinh vật của nisin tinh………………………………………..154 Bảng 3.66. Hàm lượng kim loại nặng của nisin tinh……………………………………..155 Bảng 3.67. Hàm lượng các chất không mong muốn của nisin tinh………………………155 Bảng 3.68. Một số chỉ tiêu hóa học của nước mắm……………………………………...156 Bảng 3.69. Chỉ số vi sinh của các mẫu nước mắm……………………………………….156 Bảng 3.70. Ảnh hưởng nồng độ muối đến khả năng nisin ức chế S. aureus CNTP6083..157 Bảng 3.71. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng nisin ức chế B. cereus CNTP6089 ………………………………………………………………….158 Bảng 3.72. Khả năng ức chế B. aureus CNTP6089 và S. aureus CNTP6083 của nisin ở các nồng độ khác nhau trong điều kiện hàm lượng muối 20%...................160 Bảng 3.73. Khả năng nisin ức chế Listeria monocytogenes ATCC13932….……………165 Bảng 3.74. Ảnh hưởng của hàm lượng chất béo trong sữa đến khả năng nisin ức chế Listeria monocytogenes ATCC13932……………………………………….166 Bảng 3.75. Ảnh hưởng của lecithin đến khả năng nisin ức chế L.monocytogenes ATCC 13932 trong môi trường sữa……………………………..…………………..168 Bảng 3.76. Ảnh hưởng của Polysorbate 80 đến khả năng nisin ức chế L.monocytogenes ATCC 13932 trong môi trường sữa……………...…………………………..168 Bảng 3.77. Ảnh hưởng của nisin và polysorbate80 đến sự ức chế Listeria monocytogenes ATCC13932 trong môi trường sữa…………………………………………..169 Bảng 3.78. Chỉ tiêu vi sinh trong sữa tươi có bổ sung nisin và polysorbate 80………….171 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc phân tử nisin (Gross và Morell, 1971)………………………………10 Hình 1.2. Mô hình nisin tấn công làm thủng màng tế bào………………………………13 Hình 1.3. Các gen tham gia vào sản xuất nisin Z, điều hòa và đề kháng…………...…...15 Hình 1.4. Điện di agarose gel plasmid DNA…………………………………………….17 Hình 1.5. Điện di thành phần plasmid…………………………………………………...18 Hình 1.6. Sơ đồ phương pháp lọc dòng chảy ngang…………………………………….35 Hình 1.7. Dòng tuần hoàn của phương pháp lọc dòng chảy ngang……………………...36 Hình 1.8. Phân loại các dạng lọc dòng chảy ngang theo kích cỡ lỗ trên vật liệu lọc……38 Hình 1.9. Mô hình, thiết bị và vật liệu trong lọc dòng chảy ngang……………………...39 Hình 1.10. Sơ đồ hoạt động của máy sấy phun…………………………………………...41 Hình 1.11. Các loại đầu phun của máy sấy phun SDX®…………………………………42 Hình 1.12. Sơ đồ máy sấy phun xung đốt…………………………………………………43 Hình 3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin…………...63 Hình 3.2. Kiểm tra hoạt lực tính bacterioxin của vi khuẩn lactic bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch với chủng kiểm định JCM 1149………………………..64 Hình 3.3. Phát hiện gen mã hóa prenisin…………...……………………………………69 Hình 3.4. Các cấu tử bacterioxin do chủng 0-5 sinh tổng hợp…………………………..77 Hình 3.5. Điện di trên Tricine-SDS-PAGE bacterioxin từ các chủng nghiên cứu……..78 Hình 3.6. Xác định trình tự amino acids từ N-terminus của chủng 0-5…………………79 Hình 3.7. Tỷ lệ sống sót của tế bào Lactococcus lactis sp. lactis DSM 20729 trên môi trường MRS- sucrose có bổ sung nisin ở các nồng độ 300-1200IU/ml…...…81 Hình 3.8. Tỷ lệ các chủng dẫn xuất từ DSM 20729 dưới áp lực tuyển chọn nisin có hoạt lực sinh tổng hợp nisin khác nhau…………………………………………….82 Hình 3.9. Kiểu hình plasmid của chủng DSM 20729 thay đổi theo thời gian lên men….84 Hình 3.10. Điện di sản phẩm PCR gen nis với khuôn là các băng DNA cắt ra từ gel trên hình 3.16 A……………………………………………………………………85 Hình 3.11. Sự thay đổi hoạt lực sinh tổng hợp nisin của các chủng dẫn xuất từ DSM 20729 theo thời gian, được bảo quản bằng phương pháp cấy truyền, tại 40C, trên các môi trường khác nhau…………………………………………...……………88 Hình 3.12. Kiểu hình plasmid của chủng DSM 20729 ở các điều kiện bảo quản khác nhau…………………………………………………………………………...90 Hình 3.13. Kiểu hình plasmid của chủng DSM 20729 ở các điều kiện không có dinh dưỡng với các điều kiện môi trường khác nhau trong 24 giờ……………..….93 Hình 3.14. Ảnh hưởng môi trường lên men tới sinh tổng hợp nisin……………………...98 Hình 3.15. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh tổng hợp nisin của DSM 20729….99 Hình 3.16. Động học sinh trưởng và sinh tổng hợp nisin của chủng dẫn xuất DSM 20729 hoạt lực mạnh đã qua quy trình ổn định hoạt lực………………….………...108 Hình 3.17. Động học sinh trưởng và sinh tổng hợp nisin của chủng DSM 20729 gốc….108 Hình 3.18. Sinh tổng hợp nisin trong lên men tiếp dần nồng độ với cơ chất khác nhau...113 Hình 3.19. Khả năng sinh tổng hợp nisin của chủng DSM 20729 đã qua quy trình ổn định hoạt lực chủng giống trên quy mô bình tam giác và thiết bị lên men……….123 Hình 3.20. So sánh hiệu quả của các phương pháp thu hồi nisin………………………..143 Hình 3.21. Điện di về các mẫu thu nhận và tinh sạch nisin từ DSM 20729……………..146 Hình 3.22. Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm nisin từ chủng vi khuẩn Lactococcus lactis subsp. lactis DSM 20729 ( hay CNTP 6520)……………………..….150 Hình 3.23. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt lưc của nisin ức chế Bacillus cereus CNTP6089 và Staphylococcus aureus CNTP6083………………………….158 Hình 3.24. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt lực nisin theo thời gian…………….159 Hình 3.25. Nồng độ nisin và khả năng ức chế Bacillus cereus CNTP6089 và Staphylococcus aureus CNTP6083 ………………………………………....160 Hình 3.26. Ảnh hưởng của nisin đến B. cereus CNTP6089 và S. aureus CNTP6083 trong lên men nước mắm…………………………………………………………..161 Hình 3.27. Ảnh hưởng của nisin đến S.aureus CNTP6083 và B.cereus CNTP6089 bổ sung trong nước mắm thành phẩm………………………………………………...162 Hình 3.28. Sơ đồ ứng dụng nisin trong quá trình chế biến và bảo quản nước mắm tại Công ty Cổ phần Thủy sản Nghệ An………………………………………………164 Hình 3.29. Đường cong chuẩn của nisin ức chế Listeria monocytogenes ATCC13932...166 MỞ ĐẦU Bacterioxin là chất bảo quản thực phẩm mới, nếu so sánh với chất bảo quản tổng hợp hóa học truyền thống. Nhu cầu về chất bảo quản tự nhiên này đang tăng nhiều vì xu hướng sử dụng thực phẩm gần với thiên nhiên trở nên phổ biển. Việc sử dụng chất kháng sinh có nguốn gốc hoá học trong công nghiệp thực phẩm, thức ăn chăn nuôi hiện nay đã bị hạn chế, thậm chí là nghiêm cấm sử dụng do khó bị phân huỷ, để lại dư lượng trong thực phẩm, dẫn tới hiện tượng nhờn kháng sinh cho người và động vật, làm thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột. Do đó chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học đã trở thành mối quan tâm lớn của các nhà khoa học và sản xuất. Hiện nay các chất bảo quản này được sản xuất chủ yếu bởi các công ty ở Châu Âu, Mỹ và gần đây ở Trung Quốc. Trên thế giới bacterioxin được sản xuất bằng công nghệ lên men vi sinh bởi vi khuẩn lactic vì vi khuẩn này được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và được coi là an toàn. Tìm kiếm các dạng khác nhau của bacterioxin là hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học tham gia, nhằm tìm ra các bacterioxin có đặc tính mới, ứng dụng cao, nhằm cung cấp các thông tin trong việc giải thích mối liên hệ giữa cấu trúc và chức năng của bacterioxin – một vấn đề đến nay còn chưa được sáng tỏ hoàn toàn. Bacterioxin được nghiên cứu nhiều nhất là nisin được sinh tổng hợp bởi Lactococcus lactis subsp. lactis. Việc các nhà khoa học phát hiện ra nisin - chất bảo quản sinh học có giá trị vào đầu thế kỉ 20 được xem là có ý nghĩa rất lớn. Ngoài khắc phục được những nhược điểm của phương pháp sử dụng hoá chất, chất kháng sinh có nguồn gốc hoá học, nhiệt độ, chiếu xạ... nisin còn có nhiều ưu điểm khác như phạm vi ứng dụng của nisin khá rộng bao gồm các sản phẩm tươi sống như thịt, cá, sữa, rau quả, các thực phẩm lên men, đồ hộp... ; nisin giúp làm giảm thời gian và nhiệt độ thanh trùng của các sản phẩm dẫn tới hiệu quả kinh tế cao, đảm bảo chất lượng, giá trị dinh dưỡng, cảm quan vị sản phẩm; nisin không ảnh hưởng tới sức khoẻ con người, có khả năng phân huỷ trong cơ thể con người nhờ tác dụng của enzym pancreatin trong tuyến tuỵ ở 370C trong 15 – 30 phút. 1 Trên thế giới, sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học cũng như công nghệ vi sinh vật, việc nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng bacterioxin đã đạt được nhiều thành công trong các lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y học. Các hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay là tìm kiếm các bacterioxin mới, nghiên cứu sản xuất và ứng dụng các bacterioxin trong các lĩnh vực cải tạo chủng giống, xây dựng và áp dụng các kỹ thuật lên men hiệu quả, nâng cao hiệu suất thu hồi, xây dựng các phương pháp đơn giản, hiệu quả cao. Tại Việt nam, các nghiên cứu về bacterioxin ở vi khuẩn lactic chỉ mới bắt đầu trong những năm gần đây và đạt được một số kết quả ban đầu. Với chủ trương của Nhà nước là ưu tiên phát triển công nghệ sinh nhằm hình thành và phát triển ngành công nghiệp sinh học nội địa trong cả bốn lĩnh vực gồm nông nghiệp, công nghiệp chế biến, y dược và bảo vệ môi trường, sự quan tâm của các khoa học đến nghiên cứu bacterioxin từ vi khuẩn lactic với mục đích ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau là hiện tượng đáng khích lệ. Để thực hiện được nhiệm vụ này, việc hợp tác quốc tế trong lĩnh vực nghiên cứu, đặc biệt với các nước có ngành công nghệ sinh học phát triển là rất cần thiết. Giáo sư, tiến sĩ Jun Shima nguyên là trưởng nhóm nghiên cứu thuộc Khoa Vi sinh vật ứng dụng, thuộc Viện Nghiên cứu Thực phẩm Quốc gia (Tsukuba, Nhật Bản), đến 4/2010 ông giữ trách nhiệm Chủ nhiệm Bộ phận nghiên cứu về lĩnh vực các khoa học Vi sinh, trường Đại học Tổng hợp Kyoto. Ông là chuyên gia có nhiều năm nghiên cứu về các hoạt chất kháng sinh, hoạt chất kháng khuẩn từ vi sinh vật, đã thực hiện nhiều hợp tác nghiên cứu với doanh nghiệp, tham gia hướng dẫn đào tạo các nghiên cứu viên trong và ngoài nước. Do đó chúng tôi đã cùng hợp tác với GS.TS. Shima và các đối tác Nhật Bản thực hiện đề tài nghị định thư “ Nghiên cứu công nghệ sản xuất chất bảo quản sinh học bacterioxin bằng phương pháp vi sinh có ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm” với các mục tiêu như sau: (i)- Có được bộ chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh một số bacterioxin với các đặc điểm được xác định; (ii)- Có được quy trình công nghệ sản xuất nisin bằng phương pháp sinh tổng hợp hiệu suất đạt 30%; (iii)- Có kết quả ứng dụng nisin trong cơ sở sản xuất sữa và nước mắm . 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về bacterioxin và vi khuẩn lactic 1.1.1. Giới thiệu về bacterioxin Bacterioxin là một nhóm chất được tạo ra bởi vi khuẩn, có bản chất là polypeptide, có đặc tính tiêu diệt các vi khuẩn có quan hệ họ hàng với chủng sinh ra nó (Cleveland và cs. 2001). Bacterioxin có hoạt tính kháng khuẩn, được sản sinh ra bởi nhiều nhóm vi khuẩn đa dạng, có thể khác nhau bởi phương thức và phổ hoạt động, phân tử lượng, đặc điểm sinh hóa và nguồn gốc gen (Klaenhammer 1993). Bacterioxin được biết đến đầu tiên là colicin - tạo bởi một chủng vi khuẩn Gram âm E. coli có tác dụng chống lại các chủng E. coli khác. Đến năm 1953 Jacob và các cộng sự đã gọi bằng thuật ngữ “Bacterioxin” để chỉ chung các protein có khả năng kháng khuẩn. Bacterioxin được phát hiện ở cả vi khuẩn Gram dương và âm, nhưng bacterioxin từ vi khuẩn lactic nhận được sự quan tâm đặc biệt bởi hiệu quả, mức độ an toàn và khả năng ứng dụng làm chất bảo quản tự nhiên trong công nghiệp thực phẩm. Bacterioxin được ứng dụng làm chất kháng khuẩn trong chế biến thực phẩm. Trên thế giới bacterioxin được sản xuất bằng công nghệ lên men vi sinh bởi vi khuẩn lactic. Bacterioxin từ vi khuẩn lactic được xác định là các peptide mang điện dương, có kích cơ nhỏ, được tổng hợp tại ribosome và có khả năng thấm qua màng tế bào (Klaenhammer 1993, Jack và cs. 1995). Bacterioxin từ vi khuẩn lactic bao gồm các nhóm sau đây (Klaenhammer 1993): - Nhóm I: Gồm các lanbiotics hoặc các bacterioxin nhỏ, kích thước phân tử lượng thường nhỏ hơn 5Kda, chịu nhiệt, có chứa Lanthionine hoặc β-methyllanthionine s và một số axit amin dehydrat (2,3-didehydroalanine do serine khử nước); có cấu tạo từ một hoặc hai peptide. - Nhóm II: Bacterioxin nhỏ, kích thước phân tử thường nhỏ hơn 10Kda, chịu nhiệt không chứa Lanthionine ; bao gồm các nhóm nhỏ: (IIa)- bacterioxin chống 3 Listeria; (IIb)- bacterioxin gồm 2 peptide; (IIc)- bacterioxin vòng, được kích hoạt bởi nhóm thiol. - Nhóm III: Bacteriolysin hoặc protein có kích thước lớn, không chịu nhiệt, thường có tính thủy phân murein. - Nhóm IV: Bacterioxin có cấu tạo phức giữa peptide/ protein với các nhóm khác. Trong nhiều báo cáo phân loại bacterioxin đôi khi người ta gộp nhóm III và nhóm IV vào cùng một nhóm (De Vuyst & Leroy, 2007). Sự đa dạng về bacterioxin được thể hiện ở bảng 1.1. Về cơ chế hoạt động, bacterioxin thuộc nhóm I và II thường là các peptide mang điện dương và có khả năng thấm qua màng tế bào, gây thủng màng tế bào và làm thất thoát các ion, ATP và thành phần nội bào, dẫn đến tiêu diệt tế bào (Klaenhammer 1988,1993; Jack và cs. ,1995). Nhóm lantibiotics là nhóm được chú ý nhất trong các nghiên cứu hiện nay. Đây là nhóm gồm các bacterioxin có khả năng phân tử nhỏ hơn 5 kDa, β-methyllanthion có khả năng chịu nhiệt, chứa các axit amin bất thường (Lanthionine, Đến nay bacterioxin do vi khuẩn lactic sinh ra được phát hiện có đặc tính ức chế một số vi khuẩn Gram dương, trong đó có các vi khuẩn gây bệnh, gây hỏng thực phẩm như Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus... Bacterioxin cũng được chứng minh có tác dụng lên vi khuẩn Gram âm như E. coli và Samonella nhưng chỉ khi màng ngoài của tế bào bị tổn thương bởi các yếu tố sau: sốc thẩm thấu, pH thấp, sự có mặt của chất bề mặt (EDTA), chất có tính chất chelat, sốc bởi xung điện trường hoặc áp suất cao (Stevens và cs., 1991). Bảng 1.1. Một số bacterioxin từ vi khuẩn lactic Bacterioxin Nisin (A và Z) Lacticin 481 Lactocin S Chủng vi sinh vật Nhóm I: Lantibiotics Lactococcus lactis Lactococcus lactis Lactococcus sake Phổ tác dụng Rộng Rộng Rộng Kích thước (số axit amin) 34 27 37 4 Bacterioxin Chủng vi sinh vật Phổ tác dụng Carnocin U149 Carnobacterium pisicola Rộng Variacin Micrococcus varians Rộng Nhóm II: Phi-lantibiotics , kích thước nhỏ, bền nhiệt Lactococcin A Lactococcus lactis Hẹp Lactococcin B Lactococcus lactis Hẹp Lactococcin M Lactococcus lactis Hẹp Leuconostoc Mesenterocin 52B Hẹp mesenteroides Curvaticin FS47 Lactobacillus curvatus Trung bình Bacterioxin giống Pediocin Sakacin A Lactobacillus sake Trung bình Sakacin P Lactobacillus sake Trung bình CarnoBacterioxin A,B Carnobacterium piscicola Trung bình Pediocin AcH/PA-1 Pediococcus acidilactici Trung bình Leucocin A-UAL-187 Leuconostoc gelidum Trung bình Enterocin 1146/A Enterococcus faecium Trung bình Piscicolin 126 Carnobacterium piscicola Trung bình Leuconostoc Mesenterocin Y105 Trung bình mesenteroides Helveticin J Nhóm III: Kích thước lớn, kém bền nhiệt Lactobacillus helveticus Hẹp Kích thước (số axit amin) 37-37 25 54 47 48 32 31 41 41 48; 53 44 37 47 44 37 333 Bacterioxin thường nhạy cảm với ít nhất một enzym thuỷ phân protein (De Vuyst và Vandamme, 1994). Một số bacterioxin không nhạy cảm với dịch vị thường được sử dụng trong sản xuất phomat. Một số bacterioxin như helvetixin J và plantarixin B của Lactobacillus helveticus và Lb. plantarum không bị ảnh hưởng bởi tác dụng của một số enzym như lipase, amylase hay phospholipase (Desmazeaud, 1996). 1.1.2. Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin Các nghiên cứu gần đây đã công bố những phát hiện mới về bacterioxin ở các loài thuộc chi Lactococcus, Lactobacillus, Carnobacterium, Enterococcus và Pediococcus. Các bacterioxin được phát hiện là brevicin ở chủng Lb. brevis (Filipov, 1979; Benoit và cs., 1997), bacterioxin từ P. acidilactici (Bhunia và cs., 1988; Chikindas và cs., 1993; Martinez và cs.,1998), từ Lb. fermenti, Lb. buchneri (Filipov, 1979), từ Lb. pentosus (Okkers và cs., 1999), divercin từ Carnobacterium divergen (Metivier và cs., 1998), lactoccocin từ Lactococcus lactis (Martinez và cs.,1999; 5 Ivanova và cs., 2000), mundticin từ Enterococcus mundtii (Kawamoto và cs., 2002), enterocin từ Enterococcus faecium (Đỗ Thị Huyền, 2009)... Những vi khuẩn này thường có mặt trong thực phẩm lên men, rau quả muối chua và sản phẩm từ sữa (Diop và cs., 2007; Leroy & De Vuyst, 2004; Ennahar và cs., 1999). Tìm kiếm các dạng khác nhau của bacterioxin là hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học tham gia theo đuổi, nhằm tìm ra các bacterioxin mới và có đặc tính ứng dụng cao; nhằm so sánh các bacterioxin để cung cấp các thông tin quý báu trong việc giải thích mối liên hệ giữa cấu trúc và chức năng của bacterioxin – một vấn đề đến nay còn chưa được sáng tỏ (Tagg và cs., 1976; Eijsink và cs., 1998; Sato và cs., 2002; Sakayori và cs., 2003). Bacterioxin có hoạt tính mạnh nhất thường phát hiện ở vi khuẩn Lactococcus, ở các chi khác thường yếu hơn. Sự đa dạng vi khẩn lactic sinh bacterioxins thể hiện trên bảng 1.2. Vi khuẩn lactic đựơc coi là an toàn (GRAS- genrally regarded as safe), do vậy đã có nhiều công trình về xây dựng các công cụ gen để biểu hiện/sản xuất các protein quan trọng trong vi khuẩn lactic. Chẳng hạn như việc sử dụng gen khởi động cấu trúc (consitutive promotor) của Lac. lactis để sản xuất protein có năng suất cao (de Vos,1999) và hiện tại thông dụng và hiệu quả nhất là hệ biểu hiện được kiểm soát bởi gen khởi động cảm ứng bởi nisin (NICE- nisin controlled gen expression system) (Kuipers và cs., 1998; Zhou và cs., 2006). Bảng 1.2. Sự đa dạng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin Lb. plantarum Lb. plantarum Lb. plantarum Lb. plantarum Lb. plantarum LL441 Lb. acidophilus Lb. acidophilus JCM1132 Lb. acidophilus TK9201 Lb. heleveticus Lb. helveticus Tên bacterioxin Trích dẫn Lactobacillus plantaricin A plantaricin EF plantaricin JK plantaricin S plantaricin C acidocin acidocin J1132 acidocin A helveticin J helveticin V-1829 Nissen-Meyer và cs., 1993 Anderssen và cs., 1998 Anderssen và cs., 1998 Jimenez-Diaz và cs., 1995 Gonzalez và cs., 1994 B Leer và cs., 1995 Tahara và cs., 1996 Kanatani và cs., 1995 Joerger & Klaenhammer, 1986 Vaughan và cs., 1992 6 Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin Lb. sake Tên bacterioxin Trích dẫn Lactocin S Mortvedt và cs., 1991 Cintas và cs., 1998 Lb. sake sakacin A Lb. sake sakacin P Lb. brevis brevicin Holck và cs., 1992 Guyonnet và cs., 2000 Tichaczek và cs., 1992 Guyonnet và cs., 2000 Filipov, 1979; Benoit và cs., 1997 Larsen & Norrung, 1993 Lb. bavaricus bavaricin A Lb. curvatus LTH1174 Lb. johnsonii curvacin A lactacin F Lactococcus Nisin Lacticin 481 lacticin 3147 Lac.lactis subsp.lactis Lac.lactis Lac.lactis Eijsink và cs., 1998 Allison và cs., 1994 Hurst 1981 Piard và cs., 1992 Ryan và cs., 1996 Lac.lactis lactococcin MMFII Lac.lactis lactococcin G Nissen-Meyer và cs., 1992 Lac.lactis lactococcin M Van Belkum và cs., 1991 Martinez và cs.,1999 Ivanova và cs., 2000 Zajdel et al., 1985 Lac.lactics subsp. cremoris Pediococcus acidilactici Pediococcus pentosaceous Pediococcus acidilactici PAC 1.0 Lactostrepsin Pediococcus pediocin PA-1/AcH Pediocin pediocin PA-1 E. faecium Carnobacterium Carnocin Piscicolin divercin Enterococcus enterocin E. mundtii mundticin Carnobacterium spp. Carnobacterium piscicola Carnobacterium divergen Ferchichi và cs., 2001 Bhunia và cs., 1988; Henderson và cs., 1992; Motlagh và cs., 1992 Piva & Headon, 1994 Cintas và cs., 1998 Eijsink và cs., 1998 Chikindas và cs., 1993; Martinez và cs.,1998 Stoffels và cs., 1992 Schillinger và cs., 1993 Metivier và cs., 1998 Aymerich và cs., 1996; Đỗ Thị Huyền, 2009 Kawamoto và cs., 2002 7