Tài liệu Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào phôi hợp tử chưa trưởng thành của cây ngô thông qua vi khuẩn agrobacterium

  • Số trang: 65 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 88 |
  • Lượt tải: 0
nguyetha

Đã đăng 8490 tài liệu

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- PHẠM THỊ HƢƠNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ VÀO PHÔI HỢP TỬ CHƢA TRƢỞNG THÀNH CỦA CÂY NGÔ THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- PHẠM THỊ HƢƠNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ VÀO PHÔI HỢP TỬ CHƢA TRƢỞNG THÀNH CỦA CÂY NGÔ THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 420 114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. PHẠM THỊ LÝ THU Hà Nội – 2014 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này trước tiên tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Phạm Thị Lý Thu đã tận tâm, nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn thạc sĩ này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo phòng Sau Đại học, thầy cô giáo khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội quan tâm và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian hoàn thành khóa học cũng như khi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn các cô chú, anh chị em đồng nghiệp Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp đã quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình trong suốt thời gian tôi thực hiện luận văn. Cuối cùng cho phép tôi được gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và tất cả những người thân yêu đã luôn động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với những giúp đỡ quý báu đó. Hà Nội, tháng 9 năm 2014 Học viên Phạm Thị Hương ii MỤC LỤC Lời cảm ơn .............................................................................................................................................. i Danh mục bảng .................................................................................................................................... . iv Danh mục hình ..................................................................................................................................... .. v Ký hiệu viết tắt ..................................................................................................................................... . vi MỞ ĐẦU ................................................................................................................................................. 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................................. 3 1.1. Nguồn gốc, phân loại và vai trò của cây ngô......................................................................... .. 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây ngô ................................................................................... .. 3 1.1.2. Vai trò của cây ngô........................................................................................................... .. 4 1.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen vào cây một lá mầm nhờ vi khuẩn Agrobacterium ................................................................................................................................. .. 6 1.2.1. Ảnh hưởng của kiểu gen .................................................................................................. .. 6 1.2.2. Dạng mẫu mô đích .......................................................................................................... .. 7 1.2.3. Chủng Agrobacterium và plasmid ............................................................................ .. 8 1.2.4. Các điều kiện xử lý mẫu mô đích, lây nhiễm và đồng nuôi cấy ........................... .. 8 1.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô..................................................................... 10 1.4. Nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ ................................................. 13 1.4.1. Thuốc trừ cỏ Glyphosate.................................................................................................. 13 1.4.2. Thuốc diệt cỏ gluphosinate .............................................................................................. 15 1.4.3. Các gen sử dụng trong tạo giống cây trồng biến đổi gen chống chịu thuốc trừ cỏ... 16 1.4.4. Giống cây trồng biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ - Thành tựu và triển vọng ............ 18 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 20 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị .................................................................................................... 20 2.1.1. Vật liệu ............................................................................................................................... 20 2.1.2. Hoá chất và thiết bị máy móc .......................................................................................... 21 2.1.3. Địa điểm thực hiện ........................................................................................................... 21 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................................................... 21 2.2.1. Phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.................................. 21 2.2.2. Chọn lọc nồng độ glyphosate để chọn lọc cây ngô chuyển gen trong điều kiện nhà lưới ........................................................................................................................................ 23 2.2.3. Thử khả năng kháng thuốc trừ cỏ của các cây chuyển gen trong điều kiện nhà lưới ........................................................................................................................................ 24 iii 2.2.4. Thí nghiệm nảy mầm của hạt ngô thế hệ T0 .................................................................. 24 2.2.5. Phương pháp phân tích sinh học phân tử cây chuyển gen........................................... 24 2.2.6. Phương pháp thu thập số liệu thống kê .......................................................................... 27 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................. 28 3.1. Nghiên cứu đánh giá khả năng tiếp nhận gen CP4 EPSPS của các dòng ngô ................... 28 3.2. Chọn lọc nồng độ glyphosate để chọn lọc cây ngô chuyển gen trong điều kiện nhà lƣới .33 3.3. Kết quả phân tích PCR sự có mặt của gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS của các dòng ngô chuyển gen thế hệ T0....................................................................................................................... 34 3.4. Kết quả phân tích Southern blot các dòng ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ ................ 39 3.5. Đánh giá sự có mặt của protein EPSPS trong các dòng ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ .... 41 3.6. Kết quả đánh giá khả năng kháng thuốc trừ cỏ glyphosate của các dòng ngô chuyển gen EPSPS trong điều kiện nhà lƣới ..................................................................................................... 43 3.7. Đánh giá sự phân ly của gen EPSPS trong các dòng ngô chuyển gen kháng cỏ thế hệ T1 . 45 CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 48 4.1 Kết luận ...................................................................................................................................... 48 4.2 Kiến nghị .................................................................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................................... 49 PHỤ LỤC iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Công thức môi trƣờng ......................................................................................... 23 Bảng 2.2. Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng PCR .......................................... 26 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR gen EPSPS .............................................................. 26 Bảng 3.1. Kết quả biến nạp gen EPSPS vào các dòng ngô vụ Đông Xuân ......................... 29 Bảng 3.2. Kết quả biến nạp gen EPSPS vào các dòng ngô vụ Hè Thu ............................... 30 Bảng 3.3. Khảo sát nồng độ glyphosate đối với các cây chuyển gen .................................. 33 Bảng 3.4. Hàm lƣợng ADN của các cây chuyển gen .......................................................... 35 Bảng 3.5. Kết quả phân tích PCR gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS trong các dòng ngô chuyển gen ........................................................................................................................... 36 Bảng 3.6. Hiệu quả chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .............. 39 Bảng 3.7. Kết quả xác định protein EPSPS trong các dòng ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ .......................................................................................................................................... 42 Bảng 3.8. Đánh giá khả năng kháng thuốc diệt cỏ của các dòng chuyển gen ..................... 44 Bảng 3.9. Kết quả nảy mầm của hạt chuyển gen thế hệ T0 ................................................. 45 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây ngô ...................................................................................................... 3 Hình 2.1. Các dòng ngô trồng làm vật liệu chuyển gen trong nhà lƣới cách ly côn trùng ...................................................................................................... 20 Hình 2.2. Cấu trúc vector chuyển gen mang gen EPSPS ......................................... 20 Hình 2.3. Tách phôi từ bắp ngô dòng CM8 (Vụ Hè Thu, 8 ngày sau thụ phấn) ..... 22 Hình 3.1. Kết quả biến nạp gen EPSPS vào 3 dòng ngô vụ Đông Xuân ................. 30 Hình 3.2. Kết quả biến nạp gen EPSPS vào 3 dòng ngô vụ Hè Thu ....................... 31 Hình 3.3. Các giai đoạn của quá trình chuyển gen EPSPS vào dòng ngô VH1, CM8, CH9 .................................................................................................... 32 Hình 3.4. Khảo sát nồng độ glyphosate xử lí trên bề mặt lá ngô chuyển gen và mẫu đối chứng (lá cây ngô không chuyển gen) ............................................................... 34 Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra mẫu DNA tổng số trên gel agarose 0,8% ......... 35 Hình 3.6. Kết quả phân tích PCR gen EPSPS ở các cây T0 của dòng CM8 ........... 37 Hình 3.7. Kết quả phân tích PCR gen EPSPS ở các cây T0 của dòng CH9 ............ 37 Hình 3.8. Kết quả phân tích PCR gen EPSPS các cây T0 dòng VH1 .............................. 39 Hình 3.9. DNA tổng số của các dòng ngô chuyển gen đƣợc cắt bằng enzyme BamHI .......................................................................................................... 40 Hình 3.10. Kết quả phân tích Southern blot các dòng ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS ............................................................................................................ 41 Hình 3.11. Kết quả đánh giá sự hiện diện của protein EPSPS trong các dòng ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ ................................................................................ 43 Hình 3.13. Kết quả đánh giá khả năng nảy mầm hạt của các dòng ngô chuyển gen thế hệ T1 trên môi trƣờng chọn lọc. ......................................................................... 46 Hình 3.14. Cây chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ thế hệ T1 dòng CH9 sau 3 lần phun Vifosate .................................................................................................................... 47 vi KÝ HIỆU VIẾT TẮT 2,4D Dichlorophenoxy acetic acid ADN Deoxyribonucleic Acid AS Acetosyringone bp Base pair CTAB Cetyltrimethylammonium Bromide CIMMYT International maize and wheat improvement center EPSPS 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit FAO Food and Agriculture Organization nptII neomycin phosphotransferase OD optical density PCR Polymerase Chain Reaction Pat/bar phosphinotricin acetyltransfer T-AND Transfer-DNA 1 MỞ ĐẦU Ngô là một trong ba cây lƣơng thực quan trọng nhất trên thế giới (cùng với lúa mì và gạo) và là cây lƣơng thực có vai trò kinh tế quan trọng bậc nhất. Tính đến năm 2013 diện tích trồng ngô thế giới vào khoảng 177 triệu ha [65]. Theo dự đoán vào năm 2020, nhu cầu ngô sẽ tăng lên 50% với hơn 852 triệu tấn một năm và có thể vƣợt qua cả gạo và lúa mì [35] Hiện nay ngành sản xuất ngô thế giới nói chung và nƣớc ta nói riêng đang phải đối mặt với rất nhiều vấn đề nhƣ: khí hậu biến đổi phức tạp, hạn hán, lũ lụt ngày càng nặng nề hơn, đặc biệt cỏ dại cũng là một vấn đề lớn trong nông nghiệp đã làm giảm năng suất cây trồng từ 10 – 15%. Do đó, hàng loạt các biện pháp phòng trừ cỏ dại đã đƣợc áp dụng nhƣ: sử dụng các loại thuốc diệt cỏ chọn lọc hoặc không chọn lọc. Đặc biệt ở những vùng có hiện tƣợng xói mòn đất, thuốc diệt cỏ đƣợc sử dụng nhƣ một giải pháp duy nhất để loại trừ cỏ dại. Tuy nhiên, việc lạm dụng một số thuốc diệt cỏ có độc tính cao đã và đang gây ra các hậu quả nghiêm trọng đối với môi trƣờng, hệ sinh thái và sức khỏe con ngƣời. Điều này đặt ra nhiệm vụ to lớn cho các nhà chọn giống, các nhà nghiên cứu công nghệ sinh học chọn tạo ra các giống ngô mới có năng suất cao, chống chịu thuốc diệt cỏ. Các giống cây trồng biến đổi gen mang các đặc tính khác nhau đã đƣợc nghiên cứu và áp dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng, tăng thu nhập cho ngƣời lao động. Hàng năm, số lƣợng nông dân và các quốc gia trồng cây trồng biến đổi gen liên tục gia tăng. Cây ngô chuyển gen đầu tiên đƣợc thƣơng mại hóa vào năm 1996, đến năm 2013 diện tích trồng ngô biến đổi gen đạt 57,4 triệu ha tại 17 nƣớc, trong đó có 5 nƣớc trồng hơn 1 triệu ha bao gồm: Hoa Kỳ (35,6 triệu ha), Brazil (12,9 triệu ha), Argentina (3,2 triệu ha), Nam Phi (2,4 triệu ha) và Canada (1,7 triệu ha). Ngô chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ luôn là giống cây trồng ƣu thế, chiếm 7,8 triệu ha tƣơng đƣơng với 5% diện tích cây trồng chuyển gen toàn cầu và đƣợc trồng tại 9 nƣớc [37] Ở Việt Nam, trong thời gian gần đây, các nghiên cứu chuyển gen vào các loài cây trồng đã đƣợc quan tâm, chú ý nhiều hơn, tuy nhiên với đối tƣợng cây ngô, có 2 thể nói đây là loài cây trồng tƣơng đối khó tính trong quá trình nuôi cấy invitro cũng nhƣ chuyển nạp gen, hiệu quả biến nạp gen còn rất thấp. Mặt khác, việc tạo ra cây trồng chuyển gen có khả năng áp dụng vào sản xuất từ những nghiên cứu trong nƣớc đang là đòi hỏi cấp thiết đối với lĩnh vực nghiên cứu công nghệ sinh học và ngành nông nghiệp của Việt Nam. Các giống cây trồng biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ đã mang lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần làm giảm ô nhiễm môi trƣờng và chi phí lao động của nông dân Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn và dựa trên các cơ sở lý luận khoa học nêu trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào phôi hợp tử chưa trưởng thành của cây ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium” Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá khả năng tiếp nhận gen kháng thuốc trừ cỏ của một số dòng ngô Việt Nam Nôi dung nghiên cứu 1. Nghiên cứu đánh giá khả năng tiếp nhận gen EPSPS vào các dòng ngô Việt Nam 2. Phân tích sinh học phân tử PCR sự có mặt của gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS của các dòng ngô chuyển gen thế hệ T0 và thế hệ T1 3. Phân tích Southern blot sự có mặt của gen kháng thuốc trừ cỏ 4. Đánh giá sự có mặt của protein EPSPS trong các dòng ngô chuyển gen kháng cỏ 5. Đánh giá khả năng kháng thuốc trừ cỏ glyphosate của các dòng ngô chuyển gen EPSPS trong điều kiện nhà lƣới 3 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguồn gốc, phân loại và vai trò của cây ngô 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây ngô Phân loại khoa học Ngô (Zea mays. L) thuộc: Chi : Maydeae Họ: Poaceae (hòa thảo) Bộ: Poales (Hòa thảo) Lớp: Monocotyledons (Một lá mầm) Ngành: Angiospermatophyta (Hạt kín) Loài: Zea mays. L Hình 1.1. Cây ngô (Nguồn: www.nongnghiep.vn) Ngô, trong tiếng Anh “maize” xuất phát từ tiếng Tây Ban Nha (maíz) là thuật ngữ trong tiếng Taino để chỉ loài cây này, là từ thông dụng Vƣơng quốc Anh để chỉ cây ngô. Tại Hoa Kỳ, Canada và Australia, thuật ngữ hay đƣợc sử dụng là corn, là từ trƣớc đây dùng để gọi cho một loại cây lƣơng thực, hiện nay thuật ngữ này dùng để chỉ cây ngô, là dạng rút gọn của "Indian corn" là “cây lƣơng thực của ngƣời Anh điêng”. Lịch sử nghiên cứu thuộc các lĩnh vực khảo cổ, di truyền học, thực vật học, dân tộc học và địa lý học…quan tâm và đƣa ra nhiều giả thuyết. Có giả thuyết cho là nguồn gốc cây ngô khoảng năm 5.500 tới 10.000 trƣớc công nguyên (TCN). Những nghiên cứu về di truyền học gần đây cho rằng quá trình thuần hóa ngô diễn ra vào khoảng năm 7000 TCN tại miền trung Mexico và tổ tiên của nó là loại cỏ teosinte hoang dại gần giống nhất với ngô ngày nay vẫn còn mọc trong lƣu vực sông Balsas. Liên quan đến khảo cổ học, ngƣời ta cũng đã phát hiện các bắp ngô có sớm nhất tại hang Guila Naquitz trong thung lũng Oaxaca, có niên đại vào khoảng năm 4.250 TCN, các bắp ngô cổ nhất trong các hang động gần Tehuacan, Puebla, có niên đại vào khoảng 2750 TCN. Một số giả thuyết cho rằng, có lẽ sớm nhất khoảng năm 1500 TCN, ngô bắt đầu phổ biến rộng và nhanh, ngô là lƣơng thực chính của phần lớn các nền văn hóa tiền Columbus tại Bắc Mỹ, Trung Mỹ, Nam Mỹ và khu 4 vực Caribe. Với ngƣời dân bản xứ tại đây, ngô đƣợc suy tôn nhƣ bậc thần thánh và có tầm quan trọng về mặt tôn giáo do ảnh hƣởng lớn của nó đối với đời sống của họ Hiện trên thế giới đang tồn tại hai hệ thống phân loại đối với Zea: Wilkes (1967) [63] và Doebly (1980) [23] . Theo hệ thống phân loại của Wilkes ngô là Zea mays, còn theo hệ thống phân loại mới là Zea mays mays. Từ loài Zea mays L. dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt đƣợc phân thành các loại phụ. Những loài phụ chính bao gồm: Zea mays subsp. Indurata Sturt – Ngô đá Zea mays subsp. Indentata Sturt – Ngô răng ngựa Zea mays subsp. Ceratina Kulesh – Ngô nếp Zea mays subsp. Saccharata Sturt – Ngô đƣờng Zea mays subsp. Everta Sturt – Ngô nổ Zea mays subsp. Amylacea Sturt – Ngô bột Zea mays subsp. Tunecata Sturt – Ngô bọc 1.1.2. Vai trò của cây ngô Cây ngô là cây lƣơng thực quan trọng đứng thứ ba trên thế giới (sau lúa mỳ và lúa gạo) và đứng thứ hai ở Việt Nam (sau lúa). Ngô đƣợc trồng rộng rãi trên toàn thế giới, với tổng sản lƣợng hàng năm lớn hơn bất kỳ loại ngũ cốc nào khác. Hoa Kỳ sản xuất khoảng 40% tổng sản lƣợng ngô trên thế giới, sau Hoa Kỳ là các nƣớc Trung Quốc, Brazil, Mexico, Indonesia, Ấn Độ, Pháp và Argentina. Chỉ tính riêng trong năm 2013, tổng diện tích trồng ngô toàn cầu là hơn 177 triệu ha, đạt sản lƣợng 963 triệu tấn, nhiều hơn gạo (745 triệu tấn) hoặc lúa mì (708,5 triệu tấn) [65]. Ngô là loại cây lƣơng thực nuôi sống gần 1/3 số dân trên toàn thế giới. Bên cạnh giá trị lƣơng thực, cây ngô còn là cây thức ăn gia súc quan trọng, 70% chất tinh trong thức ăn hỗn hợp là từ ngô. Cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua rất tốt cho chăn nuôi gia súc lớn, đặc biệt là bò sữa. Những năm gần đây, cây ngô còn là loại cây thực phẩm đƣợc ƣa chuộng. Ngƣời ta dùng bắp ngô bao tử để làm rau cao cấp. Đây là loại rau có hàm lƣợng chất dinh dƣỡng cao và không có dƣ lƣợng các chất bảo vệ thực vật. Các loại ngô nếp, ngô đƣờng đƣợc dùng để luộc, nƣớng hoặc đóng hộp làm đồ hộp. Ngô có một số vai trò chính: 5 - Là nguồn có giá trị dinh dƣỡng: Ngô có chứa các chất nhƣ protein (10,6%), lipid (4-5%), glucid (69%), ngoài ra hàm lƣợng vitamin trong ngô cũng khá cao, tập chung chủ yếu ở lớp ngoài hạt ngô và ở mầm - Làm lƣơng thực, thực phẩm cho con ngƣời Cây ngô là một trong ba cây trồng quan trọng nhất đƣợc sử dụng làm thức ăn cho ngƣời và gia súc. Toàn thế giới sử dụng 17% sản lƣợng ngô làm lƣơng thực cho ngƣời trong đó ở các nƣớc đang phát triển là 30%, các nƣớc phát triển khoảng 40%. Các nƣớc ở Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi sử dụng ngô làm lƣơng thực chính. Khẩu phần ăn ở các nƣớc châu Mỹ La Tinh là bánh ngô, đậu đỗ và ớt giống nhƣ các nƣớc châu Á sử dụng cơm (gạo), cá, rau xanh và các nƣớc châu Âu sử dụng bánh mỳ, khoai tây, sữa. Tại Mỹ, hơn 90% sản lƣợng ngô đƣợc sử dụng làm thức ăn chăn nuôi và 10% làm thức ăn cho ngƣời thông qua các sản phẩm chế biến công nghiệp. Ở châu Phi và một số nƣớc châu á, hơn 90% sản lƣợng ngô đƣợc sử dụng làm lƣơng thực cho con ngƣời, cung cấp 80-90% năng lƣợng [16] - Ngô làm thức ăn chăn nuôi Theo số liệu thống kê của CIMMYT, giai đoạn 1997 – 1999, thế giới dùng ngô làm thức ăn chăn nuôi là 66% - khoảng 400 triệu tấn/năm. Các nƣớc phát triển có tỷ lệ dùng ngô làm thức ăn chăn nuôi cao, thƣờng trên 70% Hiện nay, Việt Nam cũng dùng ngô làm thức ăn chăn nuôi là chính (khoảng 90%) song tỷ lệ ngô trong tổng số chất tinh chỉ khoảng 50%, vì ta còn dùng thêm gạo gẫy, cám, bột sắn.... Từ ngô hạt có thể xay vỡ nuôi gia cầm (gà, vịt, ngan, ngỗng…), nghiền thành bột và chế biến làm thức ăn cho trâu bò, lợn và gia cầm, chế biến thức ăn cho cá. Thân lá ngô có thể cho trâu bò ăn tƣơi, sau khi thu hoạch (nhất là ngô thu bắp non) băm nhỏ ủ chua làm thức ăn cho gia súc. Chế biến thức ăn chăn nuôi từ ngô: Ngô nghiền thành bột và có thể trộn theo thành phần và tỷ lệ khác nhau với bột sắn (khoai mỳ), cám gạo, khô dầu lạc, khô dầu đậu tƣơng, bột cá, vỏ tôm, vỏ sò …để chế biến làm các loại thức ăn cho gia súc, gia cầm và thủy sản 6 Giá trị dinh dƣỡng của thân, lá ngô khá lớn, phụ thuộc vào giống ngô và thời vụ thu hoạch. Trong 1 kg thân cây ngô có 600 - 700 g chất khô, 60-70 g protein, 280-300 g xơ. Do vậy, thân, lá ngô là nguồn thức ăn thô quan trọng cho trâu bò ở nhiều vùng. Giá trị dinh dƣỡng thân, lá ngô còn tăng lên nếu đƣợc chế biến theo cách lên men ủ chua. - Làm nguyên liệu cho một số ngành công nghiệp Ngô đƣợc sử dụng làm nguyên liệu cho một số ngành công nghiệp: sản xuất thức ăn gia súc, sản xuất rƣợu cồn, tinh bột dầu, glucose, bánh kẹo..... trong thành phần khối lƣợng của hạt ngô, tinh bột chiếm tỷ lệ 65-83% là nguồn nguyên liệu quan trọng trong công nghiệp gia công tinh bột. Nguồn tinh bột này đƣợc sử dụng phổ biến trong công nghiệp chế biến các loại đƣờng: sản xuất glucose dùng trong sản xuất bánh kẹo, công nghiệp keo dán, sản xuất xăng sinh học, chế biến đồ giải khát, bia, rƣợu 1.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen vào cây một lá mầm nhờ vi khuẩn Agrobacterium Sự thành công trong việc tạo ra thực vật chuyển gen phụ thuộc vào một loạt các yếu tố nhƣ tần số biến nạp, tác nhân chọn lọc hoặc sàng lọc và khả năng tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh từ các tế bào và mô mang gen chuyển nạp. Đối với phƣơng pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium thì tần số biến nạp phụ thuộc vào các yếu tố liên quan đến vi khuẩn và các yếu tố liên quan đến thực vật. Các yếu tố liên quan đến vi khuẩn bao gồm: chủng vi khuẩn, mật độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm, hoạt tính của gen vir, khả năng xâm nhập vào các cây chủ và loại vectơ. Các yếu tố liên quan đến thực vật gồm loại cây, kiểu gen, dạng mẫu mô, khả năng phân bào của các tế bào đích, thành phần môi trƣờng [20]. Sau đây là một số yếu tố chính 1.2.1. Ảnh hưởng của kiểu gen Nhìn chung, hiệu quả chuyển gen rất khác nhau giữa các kiểu gen của cùng một loài. Đa số các báo cáo về chuyển gen chỉ đề cập ảnh hƣởng của kiểu gen đến tần số chuyển gen bền vững, vì thế ngƣời ta không biết đƣợc kiểu gen có ảnh hƣởng đến khả năng chuyển T-ADN hay phản ứng nuôi cấy in vitro. Trong số các loài cây 7 một lá mầm đã đƣợc chuyển gen, cây lúa là đối tƣợng chuyển gen ít phụ thuộc vào kiểu gen nhất. Hơn 40 kiểu gen của các giống lúa indica, japonica và javanica đã đƣợc chuyển gen. Đối với ngô, lúa mỳ, lúa mạch và mía, các dòng mô hình đƣợc sử dụng cho chuyển gen bằng súng bắn gen đều có phản ứng tốt trong chuyển gen thông qua Agrobacterium. Các dòng mô hình đó là ngô: A188 và các dòng lai với A188; lúa mỳ: Bobwhite và Fielder; Lúa mạch: Golden Promise và Igri; Mía: Ja 605 [20] Xây dựng đƣợc quy trình biến nạp không phụ thuộc vào kiểu gen của một loài cây trồng nhất định là một yêu cầu đối với các nhà nghiên cứu. Gần đây, các cây chuyển gen đã đƣợc tạo ra từ các dòng/giống chọn lọc của nhiều loài cây ngũ cốc nhƣ: giống lúa miến PHI391; giống ngô PHP38 và PHN46; giống lúa mạch Schooner. Tuy nhiên, tần số chuyển gen của các dòng chọn lọc này thấp hơn so với các dòng mô hình tƣơng ứng [59], [60], [20] 1.2.2. Dạng mẫu mô đích Mô sẹo phôi hoá Mô sẹo phôi hoá tạo thành từ phôi trƣởng thành của các giống lúa japonica đƣợc cho là dạng mô thích hợp nhất cho biến nạp gen thông qua Agrobacterium [31]. Tiếp đó, dạng tế bào này đã đƣợc sử dụng để chuyển gen vào các giống lúa và lúa mỳ có kiểu gen khác nhau [19]. Các nghiên cứu chuyển gen vào cây măng tây A. officinalis [39]; cây hẹ tây [24], tỏi [38], và các loài hoa Lily [51] cũng sử dụng hệ thống tế bào đích này. Mô sẹo phôi hoá tạo thành từ mô phân sinh hoặc từ cây mía in vitro [25]; từ lá của hai loài cây cảnh Agapanthus praecox ssp. Orientalis L. và Muscari armeniacum Leichtl. Ex Bak., cũng đã đƣợc chuyển gen thành công [51] Phôi non mới tách Phôi non mới tách đã đƣợc tìm thấy là dạng mẫu mô đích tốt nhất, có khả năng tái sinh cao, thích hợp cho lây nhiễm với Agrobacterium của các kiểu gen của giống lúa indica [12], ngô [34], [42], [61], [27], [29], [58] và lúa 8 mạch [52]. Quy trình chuyển gen đối với các loài Allium sử dụng phôi non đã đƣợc xây dựng [25] Huyền phù tế bào Huyền phù tế bào là dạng tế bào đầu tiên đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu biến nạp ở lúa [32]. Các nghiên cứu sau này cho thấy huyền phù tế bào là các tế bào đích tuyệt vời không chỉ đối với chuyển gen ở cây lúa [54], mà còn rất thích hợp cho các loài khác nhƣ ngô [46], lúa mạch [64], lúa mỳ [19], chuối [28], mía [14], và cây cỏ [17] 1.2.3. Chủng Agrobacterium và plasmid Các nghiên cứu chuyển gen thành công thông qua A. tumefaciens cho thấy hiện tại chỉ có 3 chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng hiệu quả ở các loài cây một lá mầm đó là LBA4404, C58 và EHA 101; và các chủng cải biên (EHA105 từ EHA101, AGL0 & AGL1 từ EHA101) [20]. Dạng Ti-plasmid của Agrobacterium cũng có vai trò trong quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật. Các nghiên cứu cho thấy, Ti-plasmid dạng nopalin có hiệu quả hơn trong việc lây nhiễm Agrobacterium vào ngô so với Ti-plasmid dạng octopin 1.2.4. Các điều kiện xử lý mẫu mô đích, lây nhiễm và đồng nuôi cấy Tiền xử lý mẫu mô biến nạp Hệ thống chuyển gen có hiệu quả đã đƣợc xây dựng đối với phôi non tiền nuôi cấy đƣợc xử lý co nguyên sinh [40]. Thổi khô phôi non lúa mỳ tiền nuôi cấy sau khi lây nhiễm với Agrobacterium đã làm tăng rõ rệt hiệu quả chuyển gen [19]. Xử lý chống thối hoại mô biến nạp Các thao tác in vitro đối với mẫu mô thực vật sau khi lây nhiễm với Agrobacterium là rất cần thiết để kích thích khả năng chuyển T-ADN vào tế bào thực vật và để phục hồi tế bào sau khi biến nạp. Xử lý áp suất thẩm thấu Xử lý này có hiệu quả trong chuyển gen thông qua Agrobacterium ở một số loài cây một lá mầm. Nghiên cứu của Uze và cộng sự (1997) [53] cho 9 thấy xử lý phôi lúa non tiền nuôi cấy trên môi trƣờng áp suất thẩm thấu 10% sucrose đã cải thiện khả năng chuyển T-ADN. Tuy nhiên, ảnh hƣởng của môi trƣờng xử lý áp suất thẩm thấu đến hiệu quả chuyển T-ADN và chuyển gen bền vững không rõ rệt trong các nghiên cứu chuyển gen ở ngô [61], [27]. Điều này cho thấy tác động của xử lý áp suất thẩm thấu đến chuyển gen thông qua Agrobacterium phụ thuộc nhiều vào loài. Thổi khô mẫu Một yếu tố ảnh hƣởng đáng kể đến hiệu quả chuyển gen ở các loài cây một lá mầm đó là thổi khô mẫu trƣớc hoặc sau khi lây nhiễm. Thổi khô huyền phù tế bào mía với thời gian từ 10-15 phút đã kích thích khả năng chuyển TADN và tần số chuyển gen bền vững [14], [54] Nhiệt độ đồng nuôi cấy mô thực vật với vi khuẩn Agrobacterium Nhiệt độ thích hợp cho chuyển gen bền vững cũng cần phải đƣợc đánh giá với mỗi dạng mẫu mô đích và với mỗi chủng Agrobacterium biến nạp [48]. Nghiên cứu của Kondo và cộng sự (2000) [38] cho thấy biểu hiện gus tạm thời trong chuyển gen vào mô sẹo cây tỏi đạt đƣợc cao nhất ở 22 oC, trong khi đó tần số chuyển gen cao hơn đã nhận đƣợc ở phôi ngô non sau khi biến nạp đồng nuôi cấy ở 20oC [27], [29] Thành phần môi trường lây nhiễm và đồng nuôi cấy Thành phần môi trƣờng cũng là những yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen. Trong chuyển gen vào phôi ngô non, Ishida và cộng sự (1996) [34] đã sử dụng môi trƣờng LS, Zhao và cộng sự (2001) [61] sử dụng môi trƣờng N6 có bổ sung nitrat bạc. Môi trƣờng với hàm lƣợng khoáng giảm đã kích thích khả năng chuyển T-ADN trong biến nạp gen vào mô sẹo phôi hoá ở phôi non ở ngô [15], [58]. Việc bổ sung acetosyringone (AS) - chất kích thích sự hoạt động của các gen vir [13], [33], đã có trong hầu hết các quy trình chuyển gen ở cây một lá mầm. Trong môi trƣờng không có AS, mức độ biểu hiện tạm thời của gen gus rất thấp, không tái sinh đƣợc các cây lúa và cây hành chuyển gen [31], [19]. 10 Các chất kháng sinh để loại bỏ Agrobacterium Các chất kháng sinh nhƣ: cefotaxim, carbenicillin, timentin thƣờng đƣợc sử dụng để loại bỏ vi khuẩn sau khi nuôi cộng sinh trong các nghiên cứu chuyển gen thông qua A. tumefaciens [50]. Cefotaxim biểu hiện rất hiệu quả trong các nghiên cứu chuyển gen ban đầu ở ngô và lúa Mật độ vi khuẩn Agrobacterium Mật độ vi khuẩn Agrobacterium cao thƣờng gây chết tế bào thực vật, giảm khả năng tái sinh của các tế bào sau khi biến nạp, dẫn tới giảm tần số chuyển gen bền vững. Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn lây nhiễm cao là cần thiết đối với chuyển gen vào các loài, các mẫu mô khó, tần số chuyển gen có thể đƣợc cải thiện bằng cách lây nhiễm thời gian ngắn, rửa mẫu sau khi lây nhiễm hoặc bổ sung các chất kìm hãm vi khuẩn vào môi trƣờng đồng nuôi cấy [61], [58] 1.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô trên thế giới Chuyển gen vào thực vật hai lá mầm thông qua vi khuẩn A.tumefaciens đã đƣợc biết đến nhƣ là một cơ chế đƣa ADN mong muốn vào thực vật với hiệu quả cao. Tuy nhiên, hầu hết các cây một lá mầm đều không phải là vật chủ của A.tumefaciens, do vậy những nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô ban đầu đƣợc xây dựng và phát triển hệ thống tái sinh từ việc chuyển gen vào các tế bào đặc biệt. Vào năm 1993, cây lúa là cây một lá mầm chuyển gen đầu tiên đƣợc thu nhận nhờ lây nhiễm phôi non với A.tumefaciens [18]. Tiếp đó, cây ngô chuyển gen cũng đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp này. Một trong những nguyên nhân dẫn đến sự chậm trễ trong các nghiên cứu biến nạp gen vào cây ngũ cốc thông qua A.tumefaciens là do thiếu phản ứng gây tổn thƣơng hoặc phản ứng gây tổn thƣơng kém ở mô tế bào của cây ngũ cốc. Phản ứng này là một trong những yếu tố cần thiết đối với sự lây nhiễm thành công A.tumefaciens vào tế bào thực vật [45] Cây ngô chuyển gen (Zea mays) đầu tiên đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp sử dụng súng bắn gen vào năm 1990. Kể từ sau đó công nghệ chuyển gen vào cây ngô 11 đã trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu chất nguyên sinh của phôi và nghiên cứu về các vấn đề sinh học cơ bản thông qua nghiên cứu về cây ngô chuyển gen. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là lựa chọn tốt hơn về sự kết hợp của gen vào cây ngô so với việc sử dụng phƣơng pháp súng bắn gen. Hệ thống chuyển gen này giúp cho tỉ lệ ổn định của gen cao hơn, số bản sao của gen chuyển trong cây thấp hơn phƣơng pháp súng bắn gen [34], [60] và có ƣu điểm là có thể chuyển phân mảnh ADN có kích thƣớc lớn tới các tế bào nhận, hiệu quả chuyển gen cao hơn. Phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium cho hiệu quả cao đã đƣợc chứng minh tại nhiều phòng thí nghiệm. Tần số chuyển gen có thể đạt từ 530% khi đồng nuôi cấy Agrobacterium mang vector nhị thể ”super-binary” với phôi chƣa trƣởng thành của dòng ngô A188 [34] Một tiến bộ mới trong cải tiến quy trình biến nạp gen ở ngô là sử dụng chủng A.tumefaciens LBA4404 và hệ thống siêu vector hai nguồn đã tạo bƣớc đột phá trong chuyển gen thông qua A.tumefaciens [34], cải thiện tần số chuyển gen lên đến 5 - 30%. Các nghiên cứu chuyển gen vào tế bào ngô thông qua A.tumefaciens cho thấy quá trình chuyển gen thƣờng bị tắc nghẽn ở sự kết hợp của T-ADN trong hệ gen của thực vật [41]. Sự kết hợp của ADN ngoại lai trong hệ gen thực vật có thể xảy ra thông qua sự tái tổ hợp bất thƣờng. Sử dụng các siêu vector hai nguồn, gen hpt/bar đƣợc chuyển vào phôi non dòng ngô A188 và các dòng lai với A188 [34] Negrotto và cộng sự (2000) [42] đã sử dụng phospho-mannose-isomerase giống nhƣ chỉ thị chọn lọc đã thu đƣợc các cây ngô chuyển gen bằng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium. Zhao và cộng sự (2001) [61] đã tối ƣu hóa các điều kiện chuyển gen vào callus của giống ngô Hi-II tăng hiệu suất chuyển gen trung bình xấp xỉ 40%. Frame và cộng sự (2002 [27] sử dụng vi khuẩn Agrobacterium mang vector nhị thể chuyển gen vào dòng ngô A188 thu đƣợc hiệu suất chuyển gen đạt 5,5%. Xueqing Huang và cộng sự (2005) [56] đã cải tiến quy trình chuyển gen vào bốn dòng ngô chọn lọc, hiệu suất thu đƣợc đạt từ 2,35 – 5,26%. 12 Năm 2002, trong nghiên cứu của mình, Frame và cộng sự đã tiến hành chuyển gen vào phôi non mới tách của dòng ngô lai HiII, sử dụng vector hai nguồn và bổ sung cystein trong môi trƣờng nuôi cộng sinh thu đƣợc hiệu quả chuyển gen tƣơng đối cao lên đến gần 5,5%. Gần đây nhất, Hensel và cộng sự (2009) [30] đã sử dụng hệ thống vector hai nguồn pGH218 để chuyển thành công gen chỉ thị chọn lọc pat và gen gus vào phôi non của dòng ngô lai HiII với tần số lên đến 24%. Mặc dù vậy, các công trình chuyển gen thành công ở ngô vẫn bị giới hạn bởi việc sử dụng dòng ngô A188 hoặc dòng lai trong đó dòng A188 là bố hoặc mẹ làm vật liệu. Trong hầu hết các nghiên cứu biến nạp gen thành công ở ngô nhờ vi khuẩn A.tumefaciens, phôi non mới tách đƣợc xem là dạng vật liện ban đầu có khả năng chuyển nạp tốt nhất. Mặc dù vậy, một số nghiên cứu gần đây cho thấy các dạng mẫu mô khác của cây ngô nhƣ cờ non, bao phấn, cây con in vitro và tế bào gốc là cũng có khả năng tái sinh và sử dụng làm vật liệu cho biến nạp gen [20]. Các nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium của các dòng ngô sử dụng các mẫu mô khác nhau bao gồm callus phôi hóa [22], callus bắt nguồn từ lá [11]. Năm 2006, Sidorov và cộng sự đã nhận đƣợc cây chuyển gen khi biến nạp vector mang gen gfp và nptII/CP4 vào mô sẹo tạo thành từ đốt thân mầm của cây con in vitro 7 - 10 ngày tuổi của 5 dòng ngô khác nhau. Tần số biến nạp thu đƣợc từ 2 - 11% và có khoảng 60% cây To có 1 – 2 bản copy của gen chuyển [55]. Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô tại Việt Nam Tại Việt Nam cùng với phƣơng pháp chọn tạo giống truyền thống ngày càng hiệu quả hơn thì việc ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo các giống cây trồng có khả năng chống chịu với điều kiện bất thuận sinh học và phi sinh học đã đƣợc nghiên cứu. Bắt đầu từ các nghiên cứu nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy noãn ngô để tạo dòng ngô thuần, Lê Huy Hàm và cộng sự (2003) [3], Nguyễn Thị Khánh Vân và cộng sự (2005) [10] đã thực hiện và chuyển giao ứng dụng thành công tại Viện Nghiên cứu Ngô.
- Xem thêm -