Tài liệu Nghiên cứu chuyển gen kháng nguyên ha1 của virus h5n1 vào bèo tấm wolffia globosa nguyên cây thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------------
 ---------- NGUYỄN HỮU HẢI NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG NGUYÊN Ha1 CỦA VIRUT H5N1 VÀO BÈO TẤM Wolffia globosa THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 60.62.05 Người hướng dẫn khoa học: TS. PHẠM THỊ LÝ THU HÀ NỘI - 2010 LỜI CAM ðOAN - Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. - Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Nguyễn Hữu Hải Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………i LỜI CẢM ƠN ðể luận văn này ñược thành công tôi ñã nhận ñược sự quan tâm giúp ñỡ của rất nhiều người. Trước hết, tôi xin trân trọng cảm ơn ban lãnh ñạo Viện ñào tạo Sau ñại học và các thầy cô của trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. Những người ñã tận tình truyền thụ kiến thức và tạo mọi ñiều kiện cho tôi ñược học tập, nghiên cứu trong suốt 2 năm qua. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến tiến sỹ Phạm Thị Lý Thu, người thầy ñã dành nhiều thời gian, công sức tận tình chỉ bảo và dìu dắt tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài. Tôi cũng xin cảm ơn ban lãnh ñạo Viện Di truyền Nông nghiệp và tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Trọng ñiểm công nghệ tế bào thực vật ñã giúp ñỡ, tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành ñề tài. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia ñình, bạn bè, những người luôn ở bên cạnh giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt thời gian qua! Tác giả luận văn Nguyễn Hữu Hải Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………ii MỤC LỤC Lời cam ñoan 1 Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii 1 MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích và yêu cầu của ñề tài 2 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu chung về bèo tấm Wolffia globosa 3 2.2 Cơ sở khoa học của chuyển gen ở thực vật 5 2.3 Cơ sở khoa học của phương pháp PCR 15 2.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16 3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Vật liệu 22 3.2 Nội dung nghiên cứu 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu 24 3.4 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 35 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Nghiên cứu tối ưu hoá một số yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình biến nạp gen vào bèo tấm Wolffia globosa 4.1.1 36 Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào bèo tấm Wolffia globosa nguyên cây 36 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………iii 4.1.2 Xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen vào bèo tấm Wolffia globosa 4.1.3 Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen 4.1.4 41 Xác ñịnh thời gian lây nhiễm thích hợp của vi khuẩn A.tumefaciens với bèo tấm Wolffia globosa 4.1.5 38 43 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng Acetosyringone (AS) ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen 45 4.1.6 Xác ñịnh môi trường ñồng nuôi cấy bèo tấm – vi khuẩn thích hợp. 47 4.1.7 ðánh giá ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen 4.2 Nghiên cứu xác ñịnh nồng ñộ chất kháng sinh (Cefotaxim, Timentin) thích hợp ñể loại bỏ vi khuẩn A. tumefaciens sau biến nạp 4.3 48 50 Nghiên cứu xác ñịnh ngưỡng gây chết của kháng sinh thực vật ñến bèo tấm W.globosa 51 4.4 Phân tích PCR cây chuyển gen 57 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 59 5.1 Kết luận 59 5.2 ðề nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 66 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AS acetosyringone bp base pair CaMV35S- P Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter CTAB Cetyltrimeethylammonium bromide DNA Deoxy ribo-Nucleic Acid ðC ðối chứng EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Acid Et-Br Ethidium Bromide gus β- glucuronidase gene = gen mã hoá β-glucuronidase NOS Nopaline Synthetase NOS-P Nopaline Synthetase Promotor nptII Neomycin phosphotransferase gene = gen mã hoá neomyciphosphotransferase OD600 Mật ñộ vi khuẩn ño ở bước sóng 600nm bằng quang phổ kế DUR800 Spectrophotometer của hãng Beckman Coulter PCR Polymerase Chain Reaction T-DNA transferred-DNA = DNA chuyển Ti- Plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u thực vật X-Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………v DANH MỤC BẢNG STT 1 Tên bảng Trang Lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm Wolffia globosa 2 Ảnh hưởng mật ñộ vi khuẩn lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo tấm Wolffia globosa chuyển gen 3 46 Xác ñịnh môi trường ñồng nuôi cấy thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm Wolffia globosa 7 44 Ảnh hưởng của Acetosyringone ñến biểu hiện của gen gus ở bèo tấm Wolffia globosa chuyển gen 6 42 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo tấm Wolffia globosa chuyển gen 5 39 Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo tấm Wolffia globosa chuyển gen 4 37 47 Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở Wolffia globosa chuyển gen 49 8 Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ngưỡng gây chết của Geneticin 52 9 Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ngưỡng gây chết của Paromomycin 53 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………vi DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Cây phân loại họ Bèo tấm (Lemnaceae) 2.2 Cấu trúc Ti-Plasmid dạng octopin 10 2.3 Cơ chế lây nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật 12 2.4 Sơ ñồ cấu trúc hệ vector nhị thể 13 2.5 Sơ ñồ cấu trúc vector liên hợp 15 3.1 Bèo tấm Wolffia globosa nuôi trên ñĩa thạch 22 3.2 Vectơ nhị phân pCAMBIA1301 và vector p6d35SUbiHa1 23 4.1 Biểu hiện của gen gus khi biến nạp bằng các chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefacies 4.2 38 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo tấm W. globosa sau khi biến nạp với A. tumefaciens 4.3 4 40 Ảnh hưởng của cách phương thức lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen. 42 4.4 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus 45 4.5 Ảnh hưởng của Acetosyringone (AS) ñến biểu hiện của gen gus ở bèo tấm W. globosa chuyển gen 4.6 Biểu hiện của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen trên các môi trường ñồng nuôi cấy khác nhau 4.7 50 Ảnh hưởng của Geneticin tới sự sinh trưởng và phát triển của bèo tấm Wolffia globosa 4.10 48 Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus ở Wolffia globosa chuyển gen. 4.9 47 53 Ảnh hưởng của Paromomycin tới sự sinh trưởng và phát triển của bèo tấm Wolffia globosa 53 4.8 Biểu hiện của gen gus khi chuyển gen bằng quy trình hoàn thiện 55 4.10 Kết quả kiểm tra DNA tổng số của 12 mẫu bèo W. globosa 4.11 chuyển gen 57 Kết quả phân tích PCR của 12 dòng bèo W. globosa chuyển gen 58 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………vii 1. MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ñời sống con người cũng không ngừng ñược nâng cao. Việc chăm sóc sức khỏe cộng ñồng ngày càng ñược quan tâm chú ý hơn. Nhất là trong giai ñoạn hiện nay, khi mà hiện tượng kháng thuốc ñối với các tác nhân gây bệnh cũ khá phổ biến và số lượng các tác nhân gây bệnh mới xuất hiện ngày càng nhiều thì việc chăm sóc sức khỏe con người ñã trở thành một vấn ñề bức thiết của toàn xã hội. Các phương pháp phòng bệnh luôn ñược ưu tiên hàng ñầu ở mọi quốc gia. Tuy nhiên, do giá thành vaccine sản xuất còn rất cao và lượng vaccine sản xuất còn hạn chế nên nhiều nước ñang phát triển vẫn không thể cung cấp ñầy ñủ vaccine ñể phòng ngừa các loại bệnh nguy hiểm. Ngoài ra, việc bảo quản và sử dụng các loại vaccine sống nhược ñộc cũng phải tuân thủ những quy tắc rất nghiêm ngặt nếu không sẽ mất tác dụng, thậm chí có thể quay trở lại dạng ñộc gây nguy hiểm cho người sử dụng. Vì vậy, một yêu cầu ñặt ra cho các nhà khoa học trên thế giới là phải tìm ra phương pháp sản xuất vaccine mới có hiệu quả cao và giá thành hạ. Hiện nay, một hướng nghiên cứu mới ñang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới, ñó chính là ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất vaccine thực vật, hay còn gọi là “Vaccine thực phẩm”. ðây chính là các protein tái tổ hợp do thực vật tạo ra sau khi ñược chuyển gen. So với phương pháp sản xuất vaccine truyền thống, hệ thống thực vật có nhiều lợi thế hơn hẳn. Vaccine thực phẩm an toàn hơn hẳn so với các loại vaccine nhược ñộc hiện nay do chúng không có khả năng quay trở lại dạng ñộc ñể gây nguy hiểm cho người sử dụng. Về mặt giá thành, thực vật có thể trồng trên diện tích rộng với chi phí thấp hơn rất nhiều so với việc nuôi cấy tế bào ñộng vật ñể sản xuất các loại vaccine nhược ñộc. Ngoài ra, việc bảo quản và sử dụng vaccine cũng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………1 ñươn giản hơn nhiều. Thay vì việc tiêm chủng thường gây chi phí tốn kém, người sử dụng chỉ cần ăn các loại rau quả mang vaccine thực phẩm. Nhiều loài cây trồng ñã ñược các nhà khoa học chọn làm ñối tượng ñể nghiên cứu cho mục tiêu trên và thu ñược những thành công ñáng kể. Trong số các loài thực vật ñược nghiên cứu ñể sử dụng làm hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp, các loài thuộc họ Bèo tấm (Lemnaceae) ñang ñược ñặc biệt chú ý bởi chúng có rất nhiều ưu ñiểm. Bèo tấm Wolffia globosa là một thực vật nhỏ bé nhưng lại có sức sống mạnh mẽ. Chúng có thể sống ở nhiều vùng khí hậu khác nhau; có khả nhân sinh khối nhanh; chứa nhiều loại vitamin A, B1, B2,… và ñặc biệt là chúng có bộ máy sản xuất protein khá mạnh. Với những ưu ñiểm ñó bèo tấm Wolffia globosa mang nhiều lợi thế cho việc sản xuất các loại protein tái tổ hợp. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi ñã thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu chuyển gen kháng nguyên Ha1 của virus H5N1 vào bèo tấm Wolffia globosa nguyên cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”. 1.2. Mục ñích và yêu cầu của ñề tài 1.2.1. Mục ñích - Xây dựng thành công quy trình chuyển gen kháng nguyên Ha1 cảu virus vào bèo tấm W. globosa nguyên cây thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. - Tạo ñược mẫu bèo tấm Wolffia globosa mang gen Ha1. 1.2.2. Yêu cầu - Tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưỏng ñến quá trình biến nạp gen, bao gồm: Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens thích hợp cho biến nạp gen, mật ñộ vi khuẩn thích hợp ñể biến nạp, thời gian biến nạp,… - Sử dụng các loại kháng sinh như: Geneticin, Paromomycin ñể chọn lọc cánh bèo chuyển gen và nhân dòng. - Kiểm tra sự có mặt của gen Ha1 trong hệ gen của bèo tấm Wolffia globosa bằng phản ứng PCR. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về bèo tấm Wolffia globosa 2.1.1. Nguồn gốc và vị trí phân bố Wolffia globosa ñược tìm thấy ở các vùng thung lũng có khí hậu nóng thuộc trung tâm và miền nam California, ở vùng bùn lầy của các kênh mương dọc miền tây Nevada, và cả những cánh ñồng lúa ở trung tâm Valley. Ngoài California người ta còn tìm thấy Wolffia globosa ở những vùng khác của Mỹ như miền nam Florida. Wolffia globosa còn phân bố rộng khắp các vùng nhiệt ñới nóng ẩm trên thế giới như Châu Phi, Ấn ðộ, ðông Nam Á, ðảo Hawai,…. [22], [23]. 2.1.2. Phân loại thực vật Họ Bèo tấm (Lemnaceae) có 5 chi: Spirodela, Landoltia, Lemna, Wolffia, Wolffiella và ñược chia làm 38 loài. Trong họ Lemnaceae, chi Spirodela ñược xem là nguyên thủy nhất với 2 loài là Spirodela polyrhiza và Spirodela intermedia. Nó ñược xếp ñầu tiên trong cây phân loại. Trái lại, chi Wolffia ñược coi là chi tiến hóa nhất do có ít ñặc ñiểm giống với Spirodela nhất, nằm ở vị trí cao nhất trong cây phân loại. Xét về hình thái thì Spirodela, Landoltia, Lemna có quan hệ gần gũi với nhau. Ba chi này có rất nhiều ñặc ñiểm chung, trong ñó Landoltia mang hình thái chung gian giữa Spirodela và Lemna [22], [23]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………3 Hình 2.1: Cây phân loại họ Bèo tấm (Lemnaceae) (Nguồn: http://waynesword.palomar.edu/1wayindx.htm) 2.1.3. ðặc ñiểm của bèo tấm Wolffia globosa Wolffia globosa là loài thực vật hạt kín có hoa nhỏ bé nhất. Chúng không có rễ, cây có dạng hình trứng hoặc hình elíp ống dài và toàn bộ cây có màu xanh trong suốt, kích thước từ 0,4 – 0,9mm. Hoa của chúng rất nhỏ bé, phát triển ngay trên thân cây chứa 1 nhị và 1 nhụy ñơn ñược bao bọc bởi một cái túi nhỏ, không có ñài và những cánh hoa. Bèo tấm có 2 hình thức sinh sản, ñó là: sinh sản hữu tính và vô tính. Trong ñó, bèo tấm sinh sản bằng hình thức nảy chồi vô tính là chủ yếu. Các cánh bèo con ñược sinh ra từ vùng mô phân sinh nằm sâu trong cánh bèo mẹ và chúng tách khỏi cánh bèo mẹ khi trưởng thành, Mỗi cánh bèo con ñại diện cho Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………4 một thế hệ bèo mới, chúng mang ñầy ñủ các bộ phận và chức năng như cánh bèo mẹ. Khi các cánh bèo con hình thành, bản thân chúng ñã mang sẵn các thế hệ cánh bèo kế tiếp ñang ñược hình thành ở vùng mô phân sinh của chúng. Khi gặp ñiều kiện bất lợi như: thiếu chất dinh dưỡng, nhiệt ñộ quá cao hay quá thấp,… bèo tấm có khả năng tạo chồi ngủ gọi là “turion”. Các chồi ngủ này lắng xuống ñáy bùn ao hồ và nảy mầm thành những cây bèo mới khi gặp ñiều kiện thuận lợi. ðôi khi, bèo tấm Wolffia globosa cũng sinh sản hữu tính thông qua sự ra hoa và kết hạt tương tự như các loại thực vật hạt kín khác [23], [24]. 2.1.4. Những ưu ñiểm của bèo tấm W. globosa W.globosa là cây một lá mầm thuộc họ Lemnaceae [23] nên nó mang ñầy ñủ những ñặc ñiểm chung của họ Bèo tấm: - Có khả năng nhân ñôi trong vòng 24 – 72 giờ tùy thuộc vào ñiều kiện môi trường, là một trong số những loài có tốc ñộ nhân sinh khối lớn nhất trong giới thực vật [22], [23]. - Có bộ máy sản xuất protein mạnh, khoảng 15% protein tính trên trọng lượng chất khô (Landolt, 1986). Protein của bèo tấm W. globosa còn chứa hầu hết các axít amin không thay thế và rất nhiều loại vitamin khác như A, B1, B2, E,.... [22], [24]. - Rất dễ nuôi trồng; chỉ cần nước, ánh sáng, CO2 và ñặc biệt không phụ thuộc vào thời vụ (Landolt và Kandeler, 1987) [22], [23]. - Sinh sản vô tính là chủ yếu nên hạn chế ñược sự trao ñổi gen giữa các loài gần gũi về di truyền [24], ñiều này ñảm bảo tốt ñiều kiện về an toàn sinh học cho cây biến ñổi gen. - Cải tạo môi trường nước [10], [22], [41]. 2.2. Cơ sở khoa học của chuyển gen ở thực vật Chuyển gen hữu ích vào cây trồng là một bước tiến nhảy vọt trong chọn giống thực vật và là một thành quả rất quan trọng của công nghệ sinh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………5 học hiện ñại. Hiệu quả chuyển gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhưng quan trọng nhất là bản chất cây trồng, ñặc tính di truyền của cây và ñặc biệt là phương pháp chuyển gen vào cây. Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật ñưa một hay nhiều gen lạ ñã ñược thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của vi sinh vật nói chung (vi sinh vật, ñộng vật. . .) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào hệ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt ñộng tổng hợp nên các protein ñặc trưng dẫn ñến việc xuất hiện những ñặc tính mới của sinh vật chuyển gen. Có hai phương pháp chính chuyển gen vào thực vật, ñó là: Phương pháp chuyển gen trực tiếp và phương pháp chuyển gen gián tiếp. 2.2.1. Phương pháp chuyển gen trực tiếp Ở phương pháp chuyển gen trực tiếp, gen ñược chuyển trực tiếp vào tế bào thực vật thông qua những thiết bị và thao tác nhất ñịnh. Người ta thường sử dụng một số cách chuyển gen trực tiếp sau: Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm Kỹ thuật siêu âm dùng ñể chuyển gen vào các tế bào trần. Sau khi tách tế bào trần, tạo huyền phù tế bào trần với các plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn và gen chọn lọc. Cắm ñầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập trong huyền phù tế bào trần 3mm. Cho máy phát siêu âm với tần số 20 kHz theo từng nhịp ngắn 110 mili giây. Tổng thời gian tác ñộng khoảng 500–900 mili giây. Sau ñó ñem tế bào trần nuôi trong các môi trường thích hợp hoặc môi trường chọn lọc ñể tách các tế bào trần ñã nhận ñược DNA. Nuôi cấy tái sinh cây [2]. Chuyển gen nhờ kỹ thuật ñiện xung (electroporation) Kỹ thuật này ñược sử dụng cho việc chuyển gen vào tế bào trần. Tạo một ñiện thế cao trong một thời gian ngắn thì có thể tạo nên các lỗ trên màng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………6 tế bào trần làm cho DNA bên ngoài có thể thâm nhập vào bộ gen của tế bào. Người ta chuẩn bị một huyền phù tế bào trần với các plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn và gen chọn lọc. Dùng thiết bị ñiện xung tạo ñiện thế cao 200 – 600 V/cm trong khoảng thời gian 4 – 5 phần nghìn giây. Kết quả sẽ làm cho màng tế bào trần xuất hiện những lỗ thủng tạm thời giúp cho DNA ngoại lai có thể xâm nhập. Quá trình ñược thực hiện trong các cuvet chuyên dụng hoặc các “buồng xung ñiện” có các tấm cực bằng kim loại ñặt cách nhau 1 – 4 mm. Sau quá trình ñiện xung ñem tế bào trần nuôi trong các môi trường thích hợp hoặc môi trường chọn lọc ñể tách các tế bào trần ñă nhận ñược DNA. Nuôi cấy tái sinh và tiếp tục chọn lọc [2]. Kỹ thuật chuyển gen nhờ silicon carbide Silicon carbide là những vật liệu dạng sợi do hãng Arco Metals sản xuất. Sợi silicon carbide có ñường kính rất nhỏ khoảng 0,6 micromet và dài khoảng 10-80 micromet. Khi lắc một huyền phù tế bào ñơn và plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn, gen chọn lọc với silicon carbide trên máy lắc vortex khoảng 5 giây, các tế bào sẽ bị thủng và DNA ngoại lai có thể xâm nhập. Nuôi cấy tế bào, tái sinh thành mô sẹo và cây, chọn lọc ñể tách ra những cây ñã chuyển gen. Thường huyền phù tế bào ñơn thu hoạch vào ngày thứ 5 hoặc thứ 6 sau khi cấy chuyển là giai ñoạn tốt nhất ñể thực hiện quy trình chuyển gen [2]. Phương pháp chuyển gen trực tiếp thông qua ống phấn Phương pháp chuyển gen này ñược gọi là phương pháp chuyển gen không qua nuôi cấy mô. Theo phương pháp này thì DNA chuyển vào có thể theo ñường ống phấn chui vào bầu nhuỵ cái và chuyển gen ngay sau khi hạt phấn mọc qua vòi nhuỵ và bắt ñầu ñưa tinh tử vào thụ tinh. Theo nghiên cứu thì chuyển gen qua bao phấn tốt nhất ngay sau khi quá trình thụ tinh xảy ra ở noãn nhưng tế bào sinh dục cái chưa phân chia. Như vậy sự chuyển gen chỉ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………7 xảy ra ñối với một tế bào sinh sản cái duy nhất và khi tái sinh cây sẽ không xuất hiện thể khảm [2]. Chuyển gen bằng súng bắn gen Nguyên tắc chung của phương pháp là sử dụng những viên ñạn có kích thước nhỏ nhưng có tỉ trọng cao ñể ñạt gia tốc cao, dưới tác dụng của một lực nén chúng có thể xuyên qua các lớp vỏ và màng tế bào ñưa một lớp bọc ngoài (DNA cần chuyển) vào tế bào và tiếp cận bộ gen của tế bào. Người ta thường sử dụng hạt tungsten hoặc hạt vàng có ñường kính từ 1-1,5 micromet làm các hạt vi ñạn (microprojectile). Việc chuyển gen bằng súng bắn gen có nhiều thuận lợi do dễ dàng tiến hành và ñặc biệt ñối tượng nhận gen rất ña dạng (ở dạng mô, phôi, tế bào trần, tế bào) . Người ta sử dụng thành công súng bắn gen vào callus ñể chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, gen kháng rầy, kháng nấm cho nhiều ñối tượng cây trồng không kể cây hai hay một lá mầm. Phương pháp này ñược áp dụng với các cây trồng mà việc chuyển gen thông qua Agrobacterium khó thực hiện ñược. Phương pháp này ñược sử dụng tương ñối rộng rãi với các ưu nhược ñiểm sau: Ưu ñiểm: - Có thể áp dụng hầu hết với các loại mô, tế bào. - Chuyển DNA ngoại lai và tế bào nhanh. - Dễ sử dụng: quy trình ñơn giản, một số lượng lớn mẫu có thể ñược xử lí trong thời gian ngắn. - Các vector ñược thiết kế ñơn giản: không ñòi hỏi các trình tự DNA cho ñoạn T-DNA như chuyển gen bằng Agrobacterium. - Cần một lượng nhỏ plasmid DNA. - Biểu hiện gen tạm thời có thể ñược quan sát sau vài ngày. Nhược ñiểm: - Nhiều bản sao ñược chuyển vào tế bào cùng một lúc, gây khó khăn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………8 cho việc phân tích biểu hiện gen ñã chuyển, dẫn tới sự biểu hiện của các gen không bền vững. - Hiệu quả chuyển gen thấp. - Thiết bị ñắt tiền, không phải bất cứ phòng thí nghiệm nào cũng có thể mua ñược, giá thành vật tư ñắt [2]. 2.2.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp Phương pháp chuyển gen gián tiếp, ở ñây gen ñược chuyển vào tế bào thực vật qua một sinh vật trung gian, thường là vi khuẩn, virus. Chuyển gen nhờ virus Virus ñược sử dụng làm vector chuyển gen cho cây trồng do rất dễ thâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật. Mặt khác trong cấu tạo của virus cũng có mặt axit nuclêic làm cơ sở cho việc gắn các gen cần chuyển vào. Tuy nhiên ñể làm vector chuyển gen thì virus cần có các tiêu chuẩn sau: - Bộ genome của virus có cấu tạo DNA chứ không phải RNA - Có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các plasmodest (lỗ thành tế bào) - Có khả năng tải ñược các ñoạn DNA gắn vào - Có phổ ký chủ rộng - Không gây hại hoặc gây hại không ñáng kể Tuy nhiên hiện nay, việc chuyển gen nhờ virus rất ít ñược sử dụng, do virus về nguyên tắc không chuyền qua hạt do vậy việc nhân giống các cây chuyển gen nhờ virus phải tiến hành bằng phương pháp vô tính. ðiều này không phải thực hiện ñược với tất cả các loại cây. ðây chính là một nhược ñiểm lớn của phương pháp chuyển gen bằng virus [2]. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium DNA ñược chuyển vào tế bào thực vật nhờ cơ chế truyền ñặc trưng của loài vi khuẩn Agrobacterium làm môi giới. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………9 Agrobacterium là các vi khuẩn ñất nhuộm gram (-). Chúng gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương. Trong chi Agrobacterium có các loài chính sau: A. tumefaciens: gây bệnh u thân. A. rhisogenes: gây bệnh tạo rễ. A. rubi: gây u ở các loại dâu ñất, mâm xôi. A. radiobacter: sản sinh kháng sinh ñặc trưng ngăn cản tác hại của các loài Agrobacterium kể trên. Trong ñó A. tumenfaciens ñược áp dụng nhiều nhất cho việc chuyển gen. Từ lâu người ta ñã phát hiện hiện tượng hình thành các u ở thân cây khi cây bị nhiễm vi sinh vật ñất A. tumefaciens qua các vết thương. Phân tích các u cho thấy trong u có sự hình thành một số vật chất mới như: nopaline, octopine, gọi chung là opine, các chất này không tồn tại ở các cây bình thường. ðiều ñặc biệt là khối u không ngừng tăng trưởng kể cả khi ñã diệt vi khuẩn. ðiều này cho phép kết luận: vi khuẩn ñã chuyển vào cây tác nhân gây khối u dưới dạng vật chất di truyền, ñó chính là các plasmid, chắc chắn các plasmid này ñã truyền vào tế bào thực vật các vật chất di truyền gây bệnh u cho cây, do vậy người ta gọi chúng là Ti- plasmid (Tumo inducing plasmid). Ti- plasmid ñã chuyển một ñoạn DNA của nó nhập vào gen của cây [2], [7]. Hình 2.2: Cấu trúc Ti-Plasmid dạng octopin Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………10 Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn này ñã ñược áp dụng rất thành công trên nhiều ñối tượng cây trồng ñặc biệt là trên cây hai lá mầm (khoai tây, cà chua, thuốc lá, ñu ñủ…). Sự chuyển nạp nhờ vi khuẩn vào cây một lá mầm là khó thành công. Cây một lá mầm như hoà thảo thường không có sự phản ứng với sự thương tổn (cây họ ñậu là cây hai lá mầm nhưng không có sự phản ứng với sự thương tổn nên cũng khó chuyển nạp bằng Agrobacterium). Vết thương không dẫn ñến sự phản phân hoá tế bào lân cận. Mặt khác, vi khuẩn khó gắn kết với thành tế bào, hoạt tính promoter T- DNA giảm, hoạt ñộng vùng vir bị ức chế. Gần ñây ñã chuyển ñược gen nhờ Agrobacterium ở một số cây hoà thảo: lúa (HIEI, 1994; Rashie, 1996; Khush và Datta, 1996…), ngô (Ishida, 1996) rất thành công. Trong trường hợp này người ta dùng tế bào phôi ở dạng huyền phù làm ñối tượng chuyển nạp, một trường nuôi cấy có bổ sung chất dẫn dụ Acetosyringone. * Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium. Phổ vật chủ của Agrobacterium ñược xác ñịnh là rất rộng, song hiệu quả biến nạp gen lại không giống nhau ở các ñối tượng thực vật. Nhìn chung ở cây hai lá mầm tần suất chuyển nạp gen cao hơn nhiều so với cây một lá mầm. Ngoài ra hiệu quả biến nạp gen còn phụ thuộc nhiều vào kiểu gen của thực vật. Hiệu quả biến nạp gen thông qua Agrobacterium ở thực vật phụ thuộc vào một số yếu tố chính như dạng mô lây nhiễm, mật ñộ vi khuẩn và thời gian lây nhiễm, tiền xử lý mô thực vật, chủng vi khuẩn Agrobacterium và cấu trúc vector biến nạp. Khi phân tích biểu hiện gen gus ở mô lúa, Hiei và cộng sự (1994) ñã phát hiện mô sẹo tạo thành từ tế bào sctellum là vật liệu phù hợp nhất ñể chuyển gen thông qua Agrobacterium so với các loại mô khác (mô lá, ñỉnh sinh trưởng, ñầu rễ). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………11 Thời gian nuôi cộng sinh cũng ảnh hưởng tới tần suất biến nạp, ở lúa khoảng thời gian nuôi cộng sinh vào khoảng 2-3 ngày là lý tưởng nhất. Sardana cho thấy rằng mật ñộ vi khuẩn cao 1010 tế bào/ml ñã làm tăng hiệu quả biến nạp gen cao hơn so với mật ñộ thấp 106 tế bào/ ml ở cây thuốc lá và Arabidopsis [26], [33]. Tuy nhiên mật ñộ vi khuẩn lây nhiễm không ảnh hưởng ñến hiệu quả biến nạp gen ở Petunia. Hiệu quả biến nạp gen phụ thuộc vào khả năng chuyển T-DNA của các gen vir. Tăng khả năng biểu hiện của các gen vir ñạt ñược bằng cách gây tiền cảm ứng vi khuẩn với hợp chất phenol như Acetosyringone (AS). Tiền xử lý trong môi trường chứa AS ñã làm tăng tần suất biến nạp gen ở các cây thuốc lá. Bổ xung AS vào môi trường nuôi cộng sinh cũng ảnh hưởng tới hiệu quả chuyển gen thông qua Agrobacterium [28]. Ngoài ra ñộ pH của môi trường lây nhiễm cũng ảnh hưởng trực tiếp ñến sự chuyển nạp T-DNA vào tế bào thực vật. Khả năng cảm ứng gen vir tăng khi giá trị pH dao ñộng từ 5,2-5,8. Nhiệt ñộ thích hợp cho sự cảm ứng gen vir là từ 21-25oC, ở nhiệt ñộ cao làm giảm chức năng của các gen vir [2], [7]. Hình 2.3: Cơ chế lây nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật Hệ thống vectơ chuyển nạp Kích thước lớn của Ti-plasmid gây không ít khó khăn trong việc sao chép ở mức phân tử cũng như không ñơn giản ñể chuyển nạp gen thông qua Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………12