Tài liệu Nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh nấm vào một số giống cà chua thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

Bé GI¸O DôC Vµ §µO T¹O TR¦êNG §¹I HäC N¤NG NGHIÖP Hµ NéI Bïi ThÞ Lan H−¬ng Nghiªn cøu chuyÓn gen kh¸ng bÖnh nÊm vµo mét sè gièng cµ chua th«ng qua vi khuÈn agrobacterium tumefaciens LUËN ¸N TIÕN SÜ N¤NG NGHIÖP Chuyªn ngµnh: Di truyÒn vµ chän gièng c©y trång M· sè : 62 62 05 01 Ng−êi h−íng dÉn: PGS. TS. Lª ThÞ ¸nh Hång PGS.TS. NguyÔn Hång Minh Hµ NéI - 2010 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... i Lêi cam ®oan T«i xin cam ®oan r»ng sè liÖu vµ kÕt qu¶ nghiªn cøu trong luËn ¸n nµy lµ trung thùc vµ ch−a ®−îc sö dông ®Ó b¶o vÖ mét häc vÞ nµo. T«i xin cam ®oan r»ng mäi sù gióp ®ì cho viÖc thùc hiÖn luËn ¸n nµy ®0 ®−îc c¶m ¬n vµ c¸c th«ng tin trÝch dÉn trong luËn ¸n ®Òu ®0 ®−îc chØ râ nguån gèc. T¸c gi¶ Bïi ThÞ Lan H−¬ng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... i Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... ii Lêi c¶m ¬n T«i xin bµy tá lßng biÕt ¬n s©u s¾c ®Õn PGS.TS. NguyÔn Hång Minh Tr−ëng Bé m«n Di truyÒn Chän gièng c©y trång- Tr−êng §¹i häc N«ng NghiÖp Hµ Néi vµ PGS.TS. Lª ThÞ ¸nh Hång - Nguyªn lµ Phã ViÖn Tr−ëng ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp lµ nh÷ng ng−êi thÇy ®0 tËn t×nh gióp ®ì, h−íng dÉn, t¹o mäi ®iÒu kiÖn thuËn lîi vµ chia sÎ nh÷ng khã kh¨n cïng t«i trong suèt 5 n¨m liÒn thùc hiÖn vµ hoµn thµnh luËn ¸n nµy. T«i còng xin bµy tá lßng lêi c¸m ¬n ch©n thµnh ®Õn GS.TS. TrÇn Tó Ngµ ng−êi ®0 hÕt lßng gióp ®ì chØ b¶o t«i nh÷ng kiÕn thøc vÒ di truyÒn häc, nh÷ng tµi liÖu tham kh¶o chuyªn m«n quý gi¸ vµ còng lu«n ®éng viªn t«i trong suèt qu¸ tr×nh nghiªn cøu vµ hoµn thµnh luËn ¸n. Trong thêi gian qua, t«i ®0 nhËn ®−îc sù gióp ®ì quý b¸u cña Ban l0nh ®¹o ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp, c¸c c¸n bé, c¸c b¹n bÌ ®ång nghiÖp trong Phßng BÖnh häc Ph©n tö Thùc vËt vµ Bé m«n Di truyÒn vµ C«ng nghÖ Lóa lai - ViÖn Di TruyÒn N«ng NghiÖp, ban l0nh ®¹o ViÖn M«i Tr−êng N«ng NghiÖp, Bé m«n M«i Tr−êng N«ng Th«n. Nh©n dÞp nµy t«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n sù gióp ®ì quý b¸u ®ã. T«i xin c¶m ¬n c¸c thÇy c« gi¸o ViÖn §µo t¹o Sau ®¹i häc, Khoa N«ng häc vµ Bé m«n Di truyÒn vµ Chän gièng C©y trång - Tr−êng §¹i häc N«ng nghiÖp Hµ Néi ®0 t¹o ®iÒu kiÖn gióp t«i hoµn thµnh tèt mäi môc tiªu nghiªn cøu vµ mäi thñ tôc ®Ó cã thÓ hoµn thµnh luËn ¸n nµy. T«i rÊt biÕt ¬n nh÷ng ng−êi th©n trong gia ®×nh t«i ®0 lu«n bªn t«i quan t©m vµ t¹o ®iÒu kiÖn tèt cho t«i häc tËp vµ nghiªn cøu. Mét lÇn n÷a t«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n sù gióp ®ì quý b¸u cña c¸c tËp thÓ vµ c¸ nh©n ®0 dµnh cho t«i. T¸c gi¶ Bïi ThÞ Lan H−¬ng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... ii Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... iii Môc lôc Lêi cam ®oan i Lêi c¶m ¬n ii Môc lôc iii Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t vii Danh môc b¶ng ix Danh môc h×nh xi Më ®Çu 1 1 TÝnh cÊp thiÕt cña ®Ò tµi 1 2 Môc tiªu cña ®Ò tµi 2 3 ý nghÜa khoa häc vµ thùc tiÔn cña luËn ¸n 2 4 Nh÷ng ®ãng gãp míi cña luËn ¸n 3 5 §èi t−îng vµ ph¹m vi nghiªn cøu 3 Ch−¬ng 1 Tæng quan tµi liÖu 4 1.1 C¬ së khoa häc vµ thùc tiÔn cña ®Ò tµi 5 1.2 Nguån gèc, ph©n lo¹i vµ gi¸ trÞ dinh d−ìng c©y cµ chua 6 1.2.1 Nguån gèc c©y cµ chua 6 1.2.2 Ph©n lo¹i c©y cµ chua 7 1.2.3 Gi¸ trÞ cña cµ chua 8 1.3 Sù ph©n bè vµ s¶n xuÊt cµ chua 9 1.3.1 T×nh h×nh ph©n bè vµ s¶n xuÊt cµ chua trªn thÕ giíi 9 1.3.2 T×nh h×nh ph©n bè vµ s¶n xuÊt cµ chua ë ViÖt Nam 10 1.4 Mét sè nghiªn cøu vÒ chän t¹o gièng cµ chua 11 1.4.1 Nh÷ng nghiªn cøu vÒ chän t¹o gièng cµ chua theo c¸c ph−¬ng ph¸p truyÒn thèng 1.4.2 Nghiªn cøu chän gièng b»ng ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen 1.5 ChiÕn l−îc phßng chèng bÖnh nÊm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... iii 11 15 21 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... iv 1.6 ChuyÓn n¹p gen ë thùc vËt 29 1.6.1 C¸c ph−¬ng ph¸p chuyÓn n¹p gen ë thùc vËt 29 1.6.2 C¸c ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen ë thùc vËt 29 1.7 Kü thuËt nu«i cÊy in vitro øng dông trong c«ng nghÖ chuyÓn gen 33 1.7.1 øng dông nu«i cÊy in vitro trong x©y dùng c¸c hÖ thèng t¸i sinh m¹nh phôc vô cho thao t¸c gen 33 1.7.2 øng dông c«ng nghÖ in vitro trong viÖc nh©n nhanh gièng c©y trång mang gen chuyÓn vµ l−u gi÷ c¸c nguån gen quý hiÕm 35 1.8 Mét sè thµnh tùu vÒ thu nhËn c©y trång chuyÓn gen vµ kh¶ n¨ng øng dông 36 1.8.1 Mét sè thµnh tùu vÒ c©y trång chuyÓn gen 36 1.8.2 M«i tr−êng ph¸p lý ®èi víi c©y trång chuyÓn gen 37 Ch−¬ng 2 VËt liÖu, néi dung vµ ph−¬ng ph¸p 40 2.1 VËt liÖu nghiªn cøu 40 2.2 Néi dung nghiªn cøu 41 2.3 Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 44 2.4 Ph−¬ng ph¸p xö lý sè liÖu 50 Ch−¬ng 3 KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ th¶o luËn 51 3.1 Mét sè kÕt qu¶ nghiªn cøu quy tr×nh t¸i sinh c©y cµ chua phôc vô cho c«ng t¸c chuyÓn gen 51 3.1.1 øng dông kü thuËt DAS-ELISA ®Ó kiÓm tra t×nh h×nh søc khoÎ h¹t cµ chua tr−íc khi ®−a vµo nu«i cÊy In vitro 3.1.2 Nghiªn cøu quy tr×nh t¸i sinh c©y cµ chua phôc vô cho c«ng t¸c chuyÓn gen 51 53 3.2 Nh÷ng kÕt qu¶ ban ®Çu vÒ chuyÓn gen kh¸ng nÊm Glucanase vµo 3 gièng (dßng) cµ chua 3.2.1 3.2.2 84 Kh¶ n¨ng t¸i sinh cña hai gièng cµ chua Balan, H18 vµ dßng d¹i L. pennelli trong ®iÒu kiÖn kh«ng cã kh¸ng sinh 84 TiÒn biÕn n¹p 86 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... iv Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... v 3.2.3 Qu¸ tr×nh biÕn n¹p gen kh¸ng nÊm Glucanase 86 3.2.4 Nghiªn cøu kh¶ n¨ng t¸i sinh cña c¸c mÉu cÊy trªn m«i tr−êng cã chøa kh¸ng sinh 87 3.2.5 §¸nh gi¸ hiÖu qu¶ biÕn n¹p 95 3.2.6 KiÓm tra sù cã mÆt t¹m thêi cña c¸c gen chuyÓn 98 3.3 KÕt qu¶ chuyÓn gen defensin vµo cµ chua 3.3.1 103 Kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y in vitro cña hai gièng cµ chua H18 vµ L. pennelli trong ®iÒu kiÖn kh«ng cã kh¸ng sinh 104 TiÒn nu«i cÊy vµ biÕn n¹p 104 3.3.3 Qu¸ tr×nh biÕn n¹p gen Defensin 105 3.3.2 3.3.4 C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu kh¶ n¨ng t¸i sinh cña c¸c mÉu cÊy trªn m«i tr−êng cã chøa kh¸ng sinh 106 §¸nh gi¸ hiÖu qu¶ biÕn n¹p 112 3.3.5 3.3.6 KiÓm tra sù cã mÆt t¹m thêi cña c¸c gen chuyÓn 3.4 KÕt qu¶ chuyÓn gen Chitinase vµo cµ chua p375 vµ Ph¸p lïn 114 118 3.4.1 Kh¶ n¨ng t¸i sinh cña hai gièng cµ chua P375 vµ Ph¸p lïn trong ®iÒu kiÖn kh«ng cã kh¸ng sinh 3.4.3 Qu¸ tr×nh biÕn n¹p gen Chitinase 118 119 3.4.3 C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu kh¶ n¨ng t¸i sinh cña c¸c gièng sau khi biÕn n¹p gen Chitinase 120 3.4.4 HiÖu qu¶ biÕn n¹p Chitinase vµo cà chua P375 vµ Ph¸p lïn 125 3.4.5 KiÓm tra sù cã mÆt t¹m thêi cña gen chuyÓn 127 KÕt luËn vµ ®Ò nghÞ 129 KÕt luËn 129 §Ò nghÞ 130 C¸c c«ng tr×nh ®· c«ng bè cã liªn quan ®Õn luËn ¸n 131 Tµi liÖu tham kh¶o 132 Phô lôc 143 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... v Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... vi Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... vi Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... vii Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t Ch÷ viÕt t¾t Ch÷ viÕt ®Çy ®ñ ABA Abcisic acid BA Benzyladenine BAP 6-benzyl aminopurine BD§ BÊt dôc ®ùc BHPTTV BÖnh häc Ph©n tö Thùc vËt bp Base pair (cÆp nucleotide) CAMBIA Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture CaMV Cauliflower Mosaic Virus CchCG Cµ chua chuyÓn gen Cd Kim lo¹i nÆng Cadmi Chi 11 Chitinase (gen) CP Coat Protein CPMV Virus kh¶m ®Ëu m¾t cua (Cowpea mosaic virus) DAS Double Antibody SADNwich DCCh Dßng cµ chua DCChCG Dßng cµ chua chuyÓn gen ELISA Enzym linked Immuno Sorbent Assay EtBt Ethidium bromide GA3 Gilberic Acid FEC M« sÑo ph«i xèp HCN Acid Cyanhydric HNL Hydroxynitrile lyase IAA Indolleacetic acid IBA Indole-3-butyric acid IgG kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu kb Kilobase (s) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... vii Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... viii kDa KiloDalton (S) INT-violet Iodonitrotetrazolium violet Ki Kinetin KLN Kim lo¹i nÆng LMV Lecttus mosaic virus MTF Metalloth ioneins MS Murashige ADN Skoog NAA Naphthalenacetic Acid NADP Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate PCR Polymerase Chain Reaction PNPP ParanitrophÐnyl phosphate PPO Polyphenol oxidase PVDF PolyVinylidene Dilfluoride PVX Potato Virus X PVY Potato Virus Y Sd §é lÖch chuÈn SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophores TBC TÕ bµo chÊt ToMV Tomato Mosaic Virus TMV Tobacco Mosaic virus vir Virulence (gen) v/v Thể tích / thể tích Z Zeatin Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... viii Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... ix Danh môc b¶ng STT Tªn b¶ng Trang 3.1 KÕt qu¶ kiÓm tra virus ToMV vµ TMV b»ng kü thuËt DAS- ELISA 52 3.2 HiÖu qu¶ cña thêi gian xö lý lªn tû lÖ sèng sãt cña h¹t cµ chua 54 3.3 ¶nh h−ëng cña c¸c nång ®é vµ tæ hîp kh¸c nhau cña Kinetin víi IAA vµ NAA lªn qu¸ tr×nh t¹o m« sÑo (callus) 3.4 ¶nh h−ëng cña c¸c nång ®é vµ tæ hîp kh¸c nhau cña Zeatin víi IAA vµ NAA lªn qu¸ tr×nh t¹o m« sÑo (callus) 3.5 57 59 ¶nh h−ëng cña c¸c nång ®é vµ tæ hîp kh¸c nhau cña BA víi IAA vµ NAA lªn qu¸ tr×nh t¹o m« sÑo (callus) 62 3.6 ¶nh h−ëng cña c¸c tæ hîp, c¸c nång ®é Kinetin lªn qu¸ tr×nh t¹o chåi 65 3.7 KÕt qu¶ nghiªn cøu sù ¶nh h−ëng cña c¸c tæ hîp, c¸c nång ®é BA lªn qu¸ tr×nh t¹o chåi 3.8 KÕt qu¶ nghiªn cøu sù ¶nh h−ëng cña c¸c tæ hîp, c¸c nång ®é Zeatin lªn qu¸ tr×nh t¹o chåi 3.9 77 ¶nh h−ëng cña c¸c tæ hîp kh¸c nhau cña NAA kÕt hîp víi mét sè Cytokinin (Kinetin, Zeatin vµ BA) lªn qu¸ tr×nh t¹o c©y hoµn chØnh 3.13 74 KÕt qu¶ nghiªn cøu sù ¶nh h−ëng cña c¸c nång ®é vµ tæ hîp kh¸c nhau cña Zeatin víi IAA vµ NAA lªn qu¸ tr×nh nh©n chåi. 3.12 72 KÕt qu¶ nghiªn cøu sù ¶nh h−ëng cña c¸c tæ hîp kh¸c nhau cña BA víi IAA vµ NAA lªn qu¸ tr×nh nh©n chåi 3.11 69 ¶nh h−ëng cña c¸c nång ®é vµ tæ hîp kh¸c nhau cña Kinetin víi IAA vµ NAA lªn qu¸ tr×nh nh©n chåi. 3.10 67 80 ¶nh h−ëng cña c¸c nång ®é vµ tæ hîp kh¸c nhau cña chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng IAA kÕt hîp víi mét sè Cytokinin (Kinetin, Zeatin vµ BA) lªn qu¸ tr×nh t¹o c©y hoµn chØnh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... ix 82 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... x 3.14 Kh¶ n¨ng t¸i sinh c¸c mÉu trô l¸ mÇm vµ l¸ mÇm cña Balan, H18, vµ dßng L. pennelli (tr−íc khi biÕn n¹p gen) 3.15 HiÖu qu¶ biÕn n¹p gen víi c¸c nång ®é vi khuÈn vµ thêi gian xö lý kh¸c nhau ở cà chua Balan, H18 vµ dßng L. pennelli. 3.16 112 Kh¶ n¨ng t¸i sinh c¸c mÉu trô l¸ mÇm vµ l¸ mÇm cña c¸c gièng cµ chua thÝ nghiÖm (L. esculentum Mill) 3.19 104 HiÖu qu¶ biÕn n¹p gen víi c¸c nång ®é vi khuÈn vµ thêi gian xö lý kh¸c nhau ë cà chua H18 vµ dßng L. pennelli 3.18 95 Kh¶ n¨ng t¸i sinh c¸c mÉu trô l¸ mÇm vµ l¸ mÇm cña gièng H18 vµ dßng L. pennelli 3.17 85 118 HiÖu qu¶ biÕn n¹p gen víi c¸c nång ®é vi khuÈn vµ thêi gian ®ång nu«i cÊy kh¸c nhau ë cà chua P375 vµ Ph¸p lïn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... x 125 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... xi Danh môc h×nh STT Tªn h×nh Trang 2.1 CÊu tróc vector mang gen kh¸ng nÊm Glucanase 42 2.2 CÊu tróc vector mang gen kh¸ng nÊm Defensin 43 2.3 CÊu tróc vector mang gen kh¸ng nÊm Chitinase 44 3.1 Cµ chua ph¸t triÓn trong MT dinh d−ìng in vitro 54 3.2 C¸c mÉu ®−a vµo nu«i cÊy in vitro 60 3.3 C¸c callus ®−îc ph¸t triÓn tõ mÐp c¾t mÉu cÊy 60 3.4 Callus kh«ng cã kh¶ n¨ng ph¸t sinh chåi 60 3.5 H×nh ¶nh Callus cña tæ hîp víi Kinetin 60 3.6 Mét sè Callus cña tæ hîp víi Zeatin 60 3.7 H×nh ¶nh Callus cña cña tæ hîp víi BA 61 3.8 ¶nh chåi ë giai ®o¹n cßn non d−íi kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö (bar: 1 mm) 70 3.9 Chåi ph¸t triÓn trªn 70 3.10 Chåi hoµn chØnh ph¸t triÓn trùc tiÕp thµnh c©y con ë tæ hîp víi BA 70 3.11 Chåi ph¸t triÓn trùc tiÕp thµnh c©y con ë tæ hîp víi Zeatin 70 3.12 HÖ sè nh©n/mÉu cña cµ chua víi tæ hîp Kinetin (gièng P375) 73 3.13 HÖ sè nh©n/mÉu gièng (P375) víi tæ hîp BA (Benzyladenin) 76 3.14 HÖ sè nh©n chåi /mÉu víi tæ hîp cña Zeatin (gièng P375) 78 3.15 Chåi vµ hÖ sè nh©n chåi trªn m«i tr−êng víi tæ hîp MS (1962)+(2K +1IAA) 78 3.16 Chåi vµ hÖ sè nh©n chåi (L. pennelli) trªn m«i tr−êng víi tæ hîp MS (1962)+ 2 Z +0,1 IAA. 78 3.17 HÖ sè nh©n trªn m«i tr−êng víi tæ hîp MS (1962) + 0,5BA+0,5IAA 78 3.18 C©y cµ chua hoµn chØnh in vitro trªn m«i tr−êng t¹o c©y hoµn chØnh MS (1962 + 2K +1 IAA) 78 3.19 ¶nh h−ëng cña nång ®é vi khuÈn vµ mÉu cÊy lªn kh¶ n¨ng t¸i sinh chåi 91 3.20 ¶nh h−ëng cña thêi gian ®ång nu«i cÊy lªn tû lÖ t¸i sinh 92 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... xi Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... xii 3.21 MÉu trô l¸ mÇm (tr¸i) vµ l¸ mÇm (ph¶i) ®ång nu«i cÊy trong dung dÞch vikhuÈn 3.22 93 C¸c callus tõ l¸ mÇm vµ trô l¸ mÇm cµ chua trªn m«i tr−êng cã chøa kh¸ng sinh (sau khi ®−îc chuyÓn gen) 93 3.23 Callus cña gièng Balan trªn m«i tr−êng t¸i sinh chåi cã chøa kh¸ng sinh 94 3.24 C¸c chåi cña gièng Balan ph¸t triÓn trªn m«i tr−êng cã chøa kh¸ng sinh 94 3.25 Callus cña gièng H18 trªn MT t¸i sinh (cã chøa kh¸ng sinh) 94 3.26 Chåi cña gièng H18 ph¸t triÓn trªn m«i tr−êng cã chøa kh¸ng sinh) 94 3.27 Callus dßng L. pennelli trªn m«i tr−êng t¸i sinh chåi cã chøa kh¸ng sinh 94 3.28 C¸c phÇn l¸ cña dßng L. pennelli t¸i sinh trªn m«i tr−êng ph¸t triÓn cã chøa kh¸ng sinh 94 3.29 ¶nh h−ëng cña nång ®é vi khuÈn vµ mÉu cÊy lªn hiÖu qu¶ biÕn n¹p 96 3.30 C¸c c©y cµ chua ®0 ®−îc chuyÓn gen cña gièng Ba lan 97 3.31 C©y cµ chua (CGBL8) ®−îc ®−a ra chËu theo dâi trong nhµ kÝnh 97 3.32 C¸c kÕt qu¶ kiÓm tra sù cã mÆt cña gen hpt trong c¸c c©y cµ chua ®0 ®−îc chuyÓn gen b»ng kü thuËt PCR. 3.33 C¸c kÕt qu¶ kiÓm tra sù cã mÆt cña gen Glucanase trong c¸c c©y cµ chua ®0 ®−îc chuyÓn gen kh¸ng nÊm b»ng kü thuËt PCR 3.34 98 99 C¸c kÕt qu¶ kiÓm tra sù cã mÆt cña gen Osmotin (AP) trong c¸c c©y cµ chua ®0 ®−îc chuyÓn gen b»ng kü thuËt PCR 100 3.35 ¶nh h−ëng cña nång ®é vi khuÈn vµ mÉu cÊy lªn kh¶ n¨ng t¸i sinh 109 3.36 ¶nh h−ëng cña thêi gian ®ång nu«i cÊy cÊy lªn Tû lÖ t¸i sinh mÉu 110 3.37 MÉu trô l¸ mÇm (tr¸i) vµ l¸ mÇm (ph¶i) ®ång nu«i cÊy víi vi khuÈn 111 3.38 C¸c callus dßng L. pennelli trªn m«i tr−êng t¸i sinh chåi cã chøa kh¸ng sinh. HiÖn t−îng b¹ch t¹ng cña m« 3.39 3.40 111 C¸c chåi kh«ng hoµn chØnh cña dßng L. pennelli t¸i sinh trªn m«i tr−êng ph¸t triÓn cã chøa kh¸ng sinh 111 C¸c callus gièng H18 trªn m«i tr−êng t¸i sinh chåi cã chøa kh¸ng sinh 111 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... xii Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... xiii 3.41 C¸c chåi ph¸t triÓn cña gièng H18 t¸i sinh trªn m«i tr−êng chän läc cã chøa kh¸ng sinh 3.42 C©y cµ chua (gièng H18)®0 ®−îc chuyÓn gen Defensin (gièng H18) trong m«i tr−ßng t¹o c©y hoµn chØnh cã chøa Kanamycin 3.43 121 Sù kh¸c nhau vÒ tû lÖ t¸i sinh cña 2 gièng P375 vµ Ph¸p lïn tr−íc vµ sau khi biÕn n¹p 3.51 121 C¸c chåi ph¸t triÓn trªn m«i tr−êng nh©n chåi cã chøa kh¸ng sinh (gièng Ph¸p lïn) 3.50 121 C¸c m« sÑo cã kh¶ n¨ng ph¸t sinh chåi trªn m«i tr−êng cã chøa kh¸ng sinh (gièng Ph¸p lïn) 3.49 121 C¸c chåi ph¸t triÓn trªn m«i tr−êng nh©n chåi cã chøa kh¸ng sinh (gièng P375) 3.48 121 C¸c m« sÑo cã kh¶ n¨ng ph¸t sinh chåi trªn m«i tr−êng cã chøa kh¸ng sinh (gièng P375) 3.47 115 C¸c trô l¸ mÇm (tr¸i) l¸ mÇm (ph¶i) ®−îc ®ång nu«i cÊy trong dung dÞch vi khuÈn 3.46 114 C¸c kÕt qu¶ kiÓm tra b»ng kü thuËt PCR sù cã mÆt cña gen Defensin trong c¸c c©y cµ chua ®0 ®−îc chuyÓn gen 3.45 113 C¸c kÕt qu¶ kiÓm tra sù cã mÆt cña gen nptII trong c¸c c©y cµ chua (H18) ®0 ®−îc chuyÓn gen 3.44 111 123 ¶nh h−ëng cña thêi gian ®ång nu«i cÊy cÊy lªn hiÖu qu¶ biÕn n¹p cña gièng P375 vµ Ph¸p lïn 124 3.52 ¶nh h−ëng cña nång ®é vi khuÈn vµ mÉu cÊy lªn hiÖu qu¶ biÕn n¹p 126 3.53 C©y cµ chua t¸i sinh (P375) sau khi biÕn n¹p gen chitinase trong m«i tr−êng t¹o c©y hoµn chØnh 3.54 127 KÕt qu¶ kiÓm tra sù cã mÆt cña gen chitinase trong c¸c c©y ®0 ®−îc biÕn n¹p gen 128 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... xiii Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 1 Më ®Çu 1 TÝnh cÊp thiÕt cña ®Ò tµi C©y cµ chua (Lycopersicon esculentum Mill) ®−îc nhËp néi vµo n−íc ta h¬n 100 n¨m tr−íc. HiÖn nay, b»ng con ®−êng nhËp néi gièng, chóng ta cßn thu thËp ®−îc mét tËp ®oµn gen kho¶ng 1000 mÉu gièng cµ chua kh¸c nhau, tËp trung ë c¸c ViÖn nghiªn cøu, c¸c tr−êng §¹i häc vµ c¸c tØnh... Víi ®iÒu kiÖn khÝ hËu ViÖt Nam, cµ chua lµ mét c©y rau chñ lùc cã diÖn tÝch trång ngµy cµng t¨ng. Cµ chua ®−îc trång ë hÇu hÕt c¸c tØnh thµnh trªn c¶ n−íc. ë n−íc ta, diÖn tÝch trång cµ chua hiÖn nay ®¹t kho¶ng 20.000 ha víi n¨ng suÊt hiÖn nay kho¶ng 30 tÊn/ ha (TrÇn Kh¾c Thi, 2005)[25]. Vµo nh÷ng n¨m 1980 diÖn tÝch trång cµ chua ®¹t 100.000 ha (Ng« ThÞ H¹nh, 2001)[4]. C©y cµ chua ®−îc trång vµo vô §«ng-Xu©n, Xu©n-HÌ, Thu-§«ng (tõ th¸ng 9 ®Õn th¸ng 4 ë miÒn B¾c vµ th¸ng 11 ®Õn th¸ng 4 n¨m sau ë miÒn Nam). Riªng t¹i L©m ®ång, cµ chua ®−îc trång quanh n¨m, do vô §«ng-Xu©n cã thêi tiÕt thÝch hîp mäi n¬i ®Òu trång ®−îc, ë ®©y n¨ng suÊt cµ chua cã thÓ ®¹t 40-60 tÊn/ha. Ng−îc l¹i vô Xu©n-HÌ, miÒn B¾c cã kho¶ng 6 -7 th¸ng (tõ th¸ng 4 ®Õn th¸ng 9) vµ miÒn Nam cã kho¶ng 7-8 th¸ng (tõ th¸ng 5 ®Õn th¸ng 12) lµ nh÷ng th¸ng rÊt khã trång, do ®iÒu kiÖn thêi tiÕt nãng Èm, m−a nhiÒu lµ nh÷ng ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho nhiÒu lo¹i bÖnh ph¸t sinh g©y h¹i c¶ trong ®iÒu kiÖn v−ên −¬m vµ ngoµi ®ång ruéng nh−: Mèc s−¬ng (Phytophtora infestans), thèi Fusarium, thèi cæ rÔ vµ thèi rÔ do Rhizostonia solani vµ Pythium, bÖnh thèi Verticilium, Alternaria, bÖnh ®èm (Stemphylium solani vµ nhiÒu bÖnh nÊm h¹i kh¸c. Ngoµi ra chóng cßn bÞ nhiÒu lo¹i bÖnh vi khuÈn vµ virus g©y h¹i nghiªm träng nh−: Erwinia, Streptomyces, Ralstonia solanacearum, Clavibacter michiganensÝs, sepedonicus vµ PVY, ToLRV, PVX, PVM, TMV, ToMV, TSWV, CMV, ®Æc biÖt hai bÖnh virus TMV vµ ToMV lµ hai bÖnh lan truyÒn qua h¹t. C¸c lo¹i bÖnh h¹i nµy kh«ng chØ ¶nh h−ëng lªn n¨ng suÊt mµ cßn ¶nh h−ëng nghiªm träng lªn chÊt l−îng qu¶, gi¶m kh¶ n¨ng th−¬ng phÈm. V× thÕ, hµng n¨m nh÷ng ng−êi s¶n xuÊt cµ chua ®0 ph¶i sö dông mét l−îng thuèc b¶o vÖ thùc vËt (BVTV) rÊt lín, ®Ó b¶o vÖ n¨ng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 1 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 2 suÊt vµ chÊt l−îng s¶n phÈm. ViÖc sö dông thuèc BVTV mét c¸ch thiÕu thËn träng, ®Æc biÖt lµ thuèc trõ nÊm h¹i ®0 g©y ra nhiÒu hËu qu¶ nghiªm träng, lµm « nhiÔm m«i tr−êng sèng g©y ¶nh h−ëng trùc tiÕp ®Õn søc khoÎ ng−êi s¶n xuÊt vµ ng−êi tiªu dïng, lµm huû diÖt c¸c sinh vËt cã Ých trong ®Êt, n−íc vµ lµm cho c¸c lo¹i vi sinh vËt kh¸ng thuèc, bÖnh h¹i tá ra hung h0n h¬n. Nh− vËy viÖc phßng trõ vµ qu¶n lý chóng khã kh¨n h¬n (TrÇn V¨n Lµi, 2005) [10] Nh÷ng gièng cµ chua cã kh¶ n¨ng kh¸ng ®−îc nhiÒu lo¹i bÖnh kh¸c nhau sÏ gióp rÊt nhiÒu cho ngµnh s¶n xuÊt cµ chua nãi chung, ®©y lµ vÊn ®Ò cã ý nghÜa lín trong n«ng nghiÖp. V× vËy, chóng ®−îc sù quan t©m rÊt lín cña nhiÒu nhµ chän gièng cµ chua trªn thÕ giíi ®ång thêi còng cÇn cã sù tham gia ®ãng gãp tÝch cùc cña nhiÒu lÜnh vùc nghiªn cøu khoa häc. ChuyÓn gen lµ mét biÖn ph¸p bæ sung cho chän t¹o gièng truyÒn thèng, cã thÓ gióp cho viÖc më réng c¸c nguån gen cã lîi sang c¸c gièng kh¸c. C«ng nghÖ chuyÓn gen còng cung cÊp lîi thÕ trong viÖc chuyÓn mét gen ®¬n hoÆc thËm chÝ c¸c gen sè l−îng, tr¸nh ®−îc nh÷ng khã kh¨n mµ ph−¬ng ph¸p chän t¹o gièng truyÒn thèng ph¶i ®−¬ng ®Çu. Cho ®Õn nay, c¸c nhµ khoa häc ®0 chuyÓn thµnh c«ng mét sè gen vµo cµ chua nh»m t¹o ra nh÷ng gièng cµ chua cã n¨ng suÊt vµ chÊt l−îng cao. C¸c vector ®0 ®−îc c¾t, söa ch÷a cã tiÒm n¨ng to lín tiÕp tôc bæ sung cho ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen qua Agrobacterium. (Frary vµ Earle, 1996)[58], ChÝnh v× vËy, chóng t«i thùc hiÖn ®Ò tµi: “Nghiªn cøu chuyÓn gen kh¸ng bÖnh nÊm vµo mét sè gièng cµ chua th«ng qua vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens” 2 Môc tiªu cña ®Ò tµi X¸c ®Þnh c¸c m«i tr−êng nu«i cÊy, t¸i sinh c©y, thiÕt lËp hÖ thèng biÕn n¹p c¸c gen th«ng qua vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens nh»m thu nhËn c¸c c©y t¸i sinh mang c¸c gen chuyÓn ë mét sè gièng cµ chua. 3 ý nghÜa khoa häc vµ thùc tiÔn cña luËn ¸n 3.1. §0 x¸c ®Þnh ®−îc c¸c ®iÒu kiÖn vµ qui tr×nh t¸i sinh c©y cµ chua in vitro øng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 2 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 3 dông cho chuyÓn n¹p gen vµ c¸c môc tiªu nghiªn cøu kh¸c. 3.2. §0 gãp phÇn x¸c ®Þnh ®−îc hiÖu qu¶ sö dông 2 vector ®óp h÷u Ých (Vector mang gen Chitinas-Glucanas vµ vector mang gen Glucanase- Osmotin) trong chuyÓn n¹p gen vµo mét sè gièng cµ chua nghiªn cøu. 3.3. §©y lµ nh÷ng tµi liÖu cã hµm l−îng khoa häc tèt vÒ c«ng nghÖ nu«i cÊy in vitro, chuyÓn n¹p gen ë cµ chua. Chóng cã gi¸ trÞ tham kh¶o trong nghiªn cøu c«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp øng dông vµ trong c«ng t¸c gi¶ng d¹y ë c¸c tr−êng ®¹i häc. 4 Nh÷ng ®ãng gãp míi cña luËn ¸n 1. LuËn ¸n ®0 x¸c ®Þnh ®−îc c¸c m«i tr−êng nu«i cÊy nh»m thu nhËn c©y cµ chua t¸i sinh ®èi víi c¸c gièng P375, H18, Ba lan vµ gièng Ph¸p lïn, ®Æc biÖt ®èi víi c¸c loµi cµ chua d¹i L. pennelli 2. LÇn ®Çu tiªn ë ViÖt nam ®0 thùc hiÖn thµnh c«ng c¸c quy tr×nh chuyÓn gen kh¸ng nÊm Chitinas-Glucanas vµ Glucanase-Osmotin th«ng qua vi khuÈn Agrobacterrium tumefaciens vµo mét sè dßng, gièng cµ chua nh− P375 vµ H18 ®Ó t¹o gièng kh¸ng nÊm. 3. §0 t¹o ®−îc mét sè dßng cµ chua mang gen kh¸ng nÊm nh− Defensin (gièng H18), Chitinase (gièng P375), Glucanase (gièng Balan). Sù cã mÆt cña gen chuyÓn ®0 ®−îc kiÓm tra b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p ®Þnh tÝnh (sinh häc) vµ ph©n tö. 5 §èi t−îng vµ ph¹m vi nghiªn cøu 5.1 §èi t−îng nghiªn cøu - §Ò tµi ®0 sö dông 2 chñng vi khuÈn: + Chñng vi khuÈn Agrobacterium tumerfaciens EHA 105 + Chñng vi khuÈn Agrobacterium tumerfaciens LBA4404 - C¸c gièng cµ chua: Ba lan, Ph¸p lïn, P375, H18 vµ dßng cµ chua d¹i L. pennelli 5.2 Ph¹m vi nghiªn cøu - Nghiªn cøu ®−a ra c¸c m«i tr−êng t¹o callus vµ t¸i sinh c©y cã hiÖu qu¶ phôc vô cho thÝ nghiÖm chuyÓn n¹p gen. - Thùc hiÖn c¸c qui tr×nh chuyÓn n¹p gen, nh»m thu ®−îc c¸c c©y cµ chua t¸i Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 3 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 4 sinh mang gen chuyÓn. ThÈm ®Þnh sù cã mÆt cña chóng b»ng ph−¬ng ph¸p chØ thÞ ph©n tö. 5.3 §Þa ®iÓm nghiªn cøu Phßng thÝ nghiÖm cña Phßng BÖnh Häc Ph©n Tö - ViÖn Di TruyÒn N«ng nghiÖp - Tõ Liªm Hµ Néi vµ Tr¹i Thùc nghiÖm cña ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp V¨n Giang - H−ng Yªn Thêi gian nghiªn cøu: 2004 - 2008 Ch−¬ng 1 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 4 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 5 Tæng quan tµi liÖu 1.1 C¬ së khoa häc vµ thùc tiÔn cña ®Ò tµi Cµ chua trång (Licopersicon esculentum Mill.) thuéc hä Solannaceae chi Lycopersicon. Cµ chua lµ c©y rau cã gi¸ trÞ kinh tÕ cao ®−îc ph¸t triÓn ë hÇu hÕt c¸c n−íc trªn thÕ giíi tõ c¸c n−íc hµn ®íi ®Õn c¸c n−íc nhiÖt ®íi (Rick,1978) [116]; (T¹ Thu Cóc,1994) [1] C©y trång bÞ tÊn c«ng bëi c¸c lo¹i vi sinh vËt vµ c«n trïng g©y h¹i lµ mét th¸ch thøc to lín trong s¶n xuÊt n«ng nghiÖp. Hµng n¨m, trªn thÕ giíi, s¶n l−îng c©y trång gi¶m sót ®¸ng kÓ do chóng bÞ nhiÔm nhiÒu lo¹i s©u, bÖnh h¹i kh¸c nhau nh−: virus, viroid, vi khuÈn, nÊm còng nh− tuyÕn trïng vµ c«n trïng g©y h¹i kh¸c. §ã lµ mét trong nh÷ng nguyªn nh©n g©y nªn sù ®ãi kÐm cña ng−êi n«ng d©n nãi riªng vµ ®e do¹ trÇm träng nÒn kinh tÕ cña céng ®ång x0 héi nãi chung. Song chóng ta còng biÕt r»ng: “Nh÷ng c©y trång kh«ng thÓ ch¹y trèn c¸c vÊn ®Ò cña chÝnh m×nh, chóng cÇn ph¶i ®èi mÆt víi c¸c vÊn ®Ò ®ã”. Trong tù nhiªn, c¸c lo¹i c©y trång ®0 thÝch øng ®−îc víi m«i tr−êng xung quanh nhê ph¸t triÓn nh÷ng c¬ chÕ kú l¹ vµ c¸c c¬ chÕ liªn quan (Jeon,1998) [67]. C¸c ¸p lùc do m«i tr−êng g©y ra th−êng lµ: nãng, l¹nh, mÆn, chua, c¸c lo¹i kim lo¹i nÆng ®éc h¹i, ¸nh s¸ng v. v. vµ c¸c yÕu tè sinh häc nh−: viroid, micoplasma, virus, vi khuÈn vµ nÊm (Hu K.l, 2002) [64]. Mét vµi c¬ chÕ trong chóng x¶y ra rÊt nhanh, cã nghÜa lµ ph¶n øng chØ x¶y ra sau vµi gi©y hoÆc vµi phót sau khi bÞ kÝch thÝch vµ dÉn ®Õn nh÷ng thay ®æi trong ho¹t ®éng cña gen. Mét sè ph¶n øng x¶y ra chØ trong kho¶nh kh¾c, sau vµi phót hoÆc vµi giê (vÝ dô khi cã sù tÊn c«ng cña c¸c t¸c nh©n g©y bÖnh). Nh÷ng ph¶n øng thø cÊp, cã thÓ x¶y ra trong nh÷ng phÇn c¸ch biÖt cña c©y, sau mét hoÆc hai ngµy khi g©y chÊn th−¬ng ban ®Çu. Nh×n chung, nh÷ng ph¶n øng muén nµy lµ kÕt qu¶ tõ nh÷ng thay ®æi trong c¸c ho¹t ®éng cña gen, lµm s¶n sinh ra nh÷ng protein mµ b×nh th−êng c©y trång kh«ng s¶n sinh ra ®−îc hoÆc chØ s¶n sinh ra mét sè l−îng Ýt ái trong c¸c c¬ quan ®Æc thï. Thªm vµo ®ã, do kh«ng cã c¸c bé phËn t−¬ng øng cña ®éng vËt, nªn c©y trång kh«ng cã kh¶ n¨ng nhËn biÕt rÊt nhiÒu tÝn hiÖu t¸c ®éng tõ m«i tr−êng xung quanh. (Bennett,1993) [38] Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 5 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ............ 6 HiÖn nay, víi sù ph¸t triÓn v« cïng nhanh chãng cña c«ng nghÖ di truyÒn, ng−êi ta ®0 biÕt ®Õn c¸c tiÕn bé cña c«ng nghÖ nµy, øng dông trong c«ng t¸c gièng c©y trång (NguyÔn Nh− Khanh, 2002) [8]. C¸c tiÕn bé vÒ c«ng nghÖ gen ®0 ®¹t tíi viÖc nhËn ra c¬ chÕ ph©n tö ®Çy ®ñ gi÷a c©y chñ víi c¸c t¸c nh©n g©y bÖnh vµ chiÕn l−îc tù vÖ tù nhiªn cña c©y chñ. MÆt kh¸c c«ng nghÖ nµy còng ®−îc sö dông ®Ó kiÓm tra vµ t¸i sinh cã hiÖu qu¶ sù ®a d¹ng di truyÒn. ChÝnh c«ng nghÖ di truyÒn cho phÐp nhanh chãng nhËn d¹ng, t¸ch dßng vµ kiÓm tra nh÷ng t¸i tæ hîp gen trong in vitro vµ kh¶ n¨ng ®Ó nhËn biÕt c¸c kiÓu gen −a thÝch, v−ît xa kh¶ n¨ng cña ph−¬ng ph¸p chän gièng cæ ®iÓn (ph−¬ng ph¸p lai h÷u tÝnh vµ lai dßng soma) (Stanton B, 1994) [106]. Thö nghiÖm thµnh c«ng ®Çu tiªn thùc hiÖn trªn sù c¶i t¹o tÝnh kh¸ng ®èi víi bÖnh virus, vi khuÈn, nÊm vµ c«n trïng b»ng thiÕt kÕ c©y chuyÓn gen. PhÇn lín c¸c chiÕn l−îc nµy ®−îc dùa trªn c¬ së chñ yÕu lµ sù thÓ hiÖn c¸c protein ®¬n m0 hoÆc g©y ®éc ®èi víi t¸c nh©n g©y bÖnh, c«n trïng hoÆc g©y trë ng¹i cho chu tr×nh t¸i sinh cña chóng. ChÝnh v× vËy, gi÷a nh÷ng n¨m 1987-1991 côc Liªn bang Quèc gia N«ng nghiÖp Mü ®0 nhËn ®−îc trªn 100 ®Ò nghÞ cho thö nghiÖm ngoµi ®ång c¸c c©y ®−îc chuyÓn gen. PhÇn lín c¸c thö nghiÖm nµy lµ dù tÝnh thö c¸c gièng ®0 ®−îc t¨ng kh¶ n¨ng chèng chÞu víi c¸c ®iÒu kiÖn kh¾c nghiÖt do c¸c yÕu tè sinh häc (biotic) vµ v« sinh (abiotic) g©y ra. §ång thêi, mét sè thÝ nghiÖm kh¸c song song cã liªn quan ®Õn vÊn ®Ò chÊt l−îng s¶n phÈm nh−: Lµm chËm thêi gian chÝn, biÕn ®æi hµm l−îng protein cña h¹t, t¨ng hµm l−îng carbonhydrate ë cñ, biÕn ®æi hµm l−îng dÇu ®Ó gi¶m sù g©y mïi, vÊn ®Ò mµu s¾c cña hoa.v.v.[31]; [32]. Cã nhiÒu ®Þnh nghÜa vÒ c©y trång biÕn n¹p gen, ®©y lµ mét ®Þnh nghÜa cã tÝnh bao qu¸t nhÊt:“C©y biÕn n¹p gen lµ c©y ®−îc chuyÓn mét hay nhiÒu gen míi tõ ®ã ta ®M thu ®−îc thªm mét hay nhiÒu ®Æc ®iÓm míi. C¸c gen ®−îc chuyÓn vµo c©y kh«ng ph¶i b»ng con ®−êng lai h÷u tÝnh gi÷a hai bè mÑ, mµ ®−îc chuyÓn b»ng c¸c kÜ thuËt di truyÒn (mét c©y chuyÓn gen mang nh÷ng ®o¹n ADN thu ®−îc b»ng nh÷ng thao t¸c trong in vitro). KÕt qu¶ còng gièng nh− tÊt c¶ c¸c c¬ chÕ khi cã mét gen l¹ th©m nhËp vµo tÝnh di truyÒn ®−îc biÕn ®æi (OGM-Organismes Genetiquement Modifiees)” (Macheix, 1997) [73] 1.2 Nguån gèc, ph©n lo¹i vµ gi¸ trÞ dinh d−ìng c©y cµ chua 1.2.1 Nguån gèc c©y cµ chua Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn tiến sĩ nông nghiệp ........... 6