Tài liệu NGHIÊN CỨU CHỌN CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CÓ HOẠT TÍNH DIỆT SÂU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ------ Nguyễn Thiện Phú NGHIÊN CỨU CHỌN CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CÓ HOẠT TÍNH DIỆT SÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ------ Nguyễn Thiện Phú NGHIÊN CỨU CHỌN CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CÓ HOẠT TÍNH DIỆT SÂU Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. TRẦN THANH THỦY Thành Phố Hồ Chí Minh - 2013 LỜI CẢM ƠN  Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy, người đã tận tình hướng dẫn, luôn quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình tôi tiến hành đề tài.  Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh đã hết lòng dạy dỗ tôi.  Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Hữu Phúc, TS. Võ Thị Hạnh (Viện Sinh học Nhiệt đới), cô Tâm, chị Trang, anh Nghĩa (Công ty Vipesco) đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đề tài.  Tôi xin cảm ơn chị Trần Thị Minh Định, chị Phùng Ngọc Thùy Linh, chị Hồ Thị Mỹ Linh, bạn Phạm Thị Lịch đã nhiệt tình giúp đỡ và động viên tôi.  Tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn bên cạnh, động viên và ủng hộ tôi. Nguyễn Thiện Phú 1 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Các tài liệu tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực. Tác giả luận văn Nguyễn Thiện Phú 2 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... 1 LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. 2 MỤC LỤC ......................................................................................................................... 3 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. 6 MỞ ĐẦU............................................................................................................................ 7 1. Lí do chọn đề tài.................................................................................................................. 7 2. Mục tiêu ............................................................................................................................... 7 3. Nhiệm vụ .............................................................................................................................. 8 4. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................................... 8 5. Ý nghĩa của đề tài ............................................................................................................... 8 6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................................... 8 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 9 1.1. Sơ lược về RNM Cần Giờ ............................................................................................... 9 1.2. Tổng quan về Bt ............................................................................................................. 12 1.2.1. Lịch sử phát hiện ra Bt ............................................................................................... 12 1.2.2. Đặc điểm phân loại .................................................................................................... 13 1.2.3. Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của Bt .............................................................. 16 1.2.4. Độc tố và cơ chế gây độc ........................................................................................... 17 1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, hình thành bào tử, tinh thể độc.... 21 1.2.6. Đối tượng tác động của Bt ......................................................................................... 22 1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng Bt ......................................................................... 24 1.3.1. Các nghiên cứu ngoài nước ....................................................................................... 24 1.3.2. Các nghiên cứu trong nước ........................................................................................ 26 1.3.3. Các hướng phát triển của thuốc trừ sâu Bt ................................................................ 27 1.4. Phương pháp sản xuất chế phẩm Bt ............................................................................ 28 1.4.1. Tuyển chọn chủng ...................................................................................................... 28 1.4.2. Lên men chìm ............................................................................................................ 29 1.4.3. Thu hồi sản phẩm ....................................................................................................... 30 1.4.4. Tạo chế phẩm ............................................................................................................. 30 1.4.5. Kiểm tra chất lượng sản phẩm ................................................................................... 30 3 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 32 2.1. Vật liệu ............................................................................................................................ 32 2.1.1. Đối tượng ................................................................................................................... 32 2.1.2. Hóa chất ..................................................................................................................... 32 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................................... 32 2.1.4. Các môi trường nghiên cứu đã sử dụng ..................................................................... 32 2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................................. 33 2.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bt ............................................................................ 33 2.2.2. Phương pháp bảo quản giống bằng dầu khoáng ........................................................ 34 2.2.3. Định danh đến loài các chủng Bacillus bằng sinh học phân tử ................................. 34 2.2.4. Phương pháp nhân giống ........................................................................................... 35 2.2.5. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào, BT, tinh thể Bt ........................ 36 2.2.6. Phương pháp xác định số lượng BT, tinh thể độc ..................................................... 37 2.2.7. Định lượng mật độ TB bằng phương pháp đo mật độ quang .................................... 37 2.2.8. Phương pháp nuôi và nhân giống sâu tơ .................................................................... 38 2.2.9. Phương pháp thử hoạt tính diệt sâu ........................................................................... 39 2.2.10. Khảo sát ảnh hưởng của Mg2+ và Mn2+ đến khả năng sinh trưởng và hình thành tinh thể độc .................................................................................................................................. 40 2.2.11. Phương pháp kiểm tra sự hiện diện của gen sinh nội độc tố của Bt ........................ 41 2.2.12. Phương pháp tạo chế phẩm Bt ................................................................................. 43 2.2.13. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm .................................................................. 43 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .................................................................. 44 3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng VK Bacillus từ đất RNM Cần Giờ ........................... 44 3.2. Khảo sát hoạt tính diệt sâu của các chủng VK có tinh thể độc ................................. 49 3.2.1. Kết quả xác định số lượng BT, tinh thể ..................................................................... 50 3.2.2. Kết quả hoạt lực diệt sâu ............................................................................................ 51 3.3. Định danh bằng sinh học phân tử chủng P14 ............................................................. 54 3.4. Đặc điểm sinh học của chủng đã tuyển chọn .............................................................. 54 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của Mg2+ và Mn2+ đến khả năng sinh trưởng và hình thành bào tử, tinh thể độc ............................................................................................................... 56 3.5.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của Mg2+ đến khả năng sinh trưởng và hình thành bào tử, tinh thể độc ..................................................................................................................... 56 4 3.5.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của Mn2+ đến khả năng sinh trưởng và hình thành BT, tinh thể độc ........................................................................................................................... 58 3.6. Bước đầu khảo sát so sánh khả năng sinh trưởng và sinh tinh thể độc của chủng Btk14 phân lập từ RNM Cần Giờ và từ chế phẩm trừ sâu của Đài Loan ...................... 60 3.6.1. So sánh khả năng sinh trưởng, sinh tinh thể độc ....................................................... 60 3.6.2. So sánh hoạt tính diệt sâu .......................................................................................... 62 3.7. Kết quả kiểm tra sự hiện diện gen sinh nội độc tố của Btk14 ................................... 64 3.8. Tạo chế phẩm và thử nghiệm hoạt tính chế phẩm ..................................................... 66 3.9. Kiểm tra khả năng sống sót của chủng Btk14 trong chế phẩm ................................ 68 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 70 4.1. Kết luận........................................................................................................................... 70 4.2. Kiến nghị......................................................................................................................... 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 72 PHỤ LỤC ........................................................................................................................ 78 5 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BT Bào tử Bt Bacillus thuringiensis Btk Bacillus thuringiensis var. kurstaki CFU Colony forming unit (Số đơn vị khuẩn lạc) kDa kiloDalton KHV Kính hiển vi KL Khuẩn lạc NXB Nhà xuất bản OD Mật độ quang PBS Dung dịch đệm RNM Rừng ngập mặn TB Tế bào VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật 6 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Sinh vật hại cây trồng là một trong những nguyên nhân lớn nhất làm giảm năng suất, gây thiệt hại nặng nề cho ngành nông nghiệp. Trung bình mỗi năm lượng nông sản bị mất mát do sinh vật hại khoảng 22% (Khan, 2008). Vì vậy, việc tiêu diệt chúng trở nên vô cùng cấp thiết. Trong giai đoạn đầu, thuốc hóa học bảo vệ thực vật được sử dụng rộng rãi vì có nhiều ưu điểm nổi trội. Tuy nhiên, thuốc hóa học cũng có nhiều nhược điểm như gây ra những tác dụng không nhỏ với môi trường và sức khỏe con người, gây mất cân bằng sinh thái và tạo nên hiện tượng kháng thuốc ở sinh vật hại. Vì vậy, việc tạo ra thuốc trừ sâu có nguồn gốc sinh học (từ VSV), sẽ khắc phục các nhược điểm của thuốc hóa học, và tạo nên một bước tiến mới trong công tác bảo vệ thực vật. Các sinh vật như: virus, VK, nấm, tuyến trùng… được ứng dụng rộng rãi để hạn chế tác hại của các sinh vật hại cây trồng. Trong số hàng loạt những VK có khả năng tiêu diệt sâu hại, Bt là tác nhân sinh học đầu tiên được nghiên cứu sản xuất thành thuốc trừ sâu vi sinh trên thế giới, đồng thời là sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học nổi tiếng nhất hiện nay. RNM Cần Giờ có hệ sinh thái đa dạng phong phú, độ đa dạng sinh học được đánh giá cao trong khu vực Đông Nam Á. Ngoài hệ động thực vật, rừng ngập mặn Cần Giờ còn chứa đựng một tài nguyên sinh vật khác – đó là thành phần khu hệ VSV nơi này. Các chủng VSV phân lập từ RNM được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nông nghiệp, nhờ khả năng sinh ra các chất có hoạt tính sinh học cao. Trong những năm gần đây, các nhà khoa học thuộc Trung tâm Nghiên cứu hệ sinh thái RNM đã phát hiện trong đất nơi này có Bt có khả năng diệt sâu. Từ những lí do trên, tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu chọn chủng Bacillus thuringiensis từ rừng ngập mặn Cần Giờ có hoạt tính diệt sâu”. 2. Mục tiêu - Thu nhận các chủng Bt có hoạt lực mạnh trong diệt sâu hại cây trồng làm cơ sở khoa học trong việc tạo chế phẩm. 7 3. Nhiệm vụ 1. Phân lập các chủng Bacillus từ RNM Cần Giờ. 2. Tuyển chọn các chủng VK có hoạt tính diệt sâu tơ hại bắp cải. 3. Phân loại chủng VK tuyển chọn đến loài bằng sinh học phân tử. 4. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng Bt được tuyển chọn. 5. Khảo sát khả năng sinh trưởng, sinh tinh thể độc của chủng Bt nghiên cứu và so sánh với chủng phân lập từ chế phẩm nước ngoài. 6. Kiểm tra sự hiện diện của gen sinh độc tố của chủng Bt nghiên cứu. 7. Bước đầu tạo chế phẩm diệt sâu và thử nghiệm hoạt tính của chế phẩm. 4. Đối tượng nghiên cứu - Các chủng Bt phân lập từ RNM Cần Giờ. - Chủng Bt phân lập từ chế phẩm trừ sâu của Đài Loan. - Sâu tơ hại bắp cải nhận từ Công ty thuốc sát trùng Việt Nam - Vipesco. 5. Ý nghĩa của đề tài 5.1. Ý nghĩa khoa học Góp phần tìm hiểu khả năng diệt sâu tơ gây hại bắp cải của Bt ở RNM Cần Giờ. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Dựa vào kết quả thu được của đề tài có thể ứng dụng tạo chế phẩm để phòng trừ sâu tơ hại bắp cải. 6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian: từ tháng 12/2012 đến tháng 09/2013. - Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh. 8 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lược về RNM Cần Giờ Theo Phan Nguyên Hồng (1999) RNM Việt Nam chia thành 4 khu vực với 12 tiểu khu. Khu vực I: Ven biển Đông Bắc, từ Mũi Ngọc đến mũi Đồ Sơn. Khu vực II: Ven biển đồng bằng Bắc Bộ, từ mũi Đồ Sơn đến mũi Lạch Trường. Khu vực III: Ven biển Trung Bộ, từ mũi Lạch Trường đến mũi Vùng Tàu. Khu vực IV: Ven biển Nam Bộ, từ mũi Vùng Tàu đến mũi Nai - Hà Tiên.[12] Địa điểm thu mẫu Hình 1.1. Bản đồ RNM Cần Giờ ( http://www.diaoconline.vn/tin-tuc/ban-do-thanh-pho-c20) Trong số các RNM ở Việt Nam, RNM Cần Giờ có độ đa dạng sinh học được đánh giá cao ở khu vực Đông Nam Á. RNM Cần Giờ được phát triển dựa trên sự lắng đọng và bồi tụ 9 phù sa từ sông Sài Gòn, hạ lưu là sông Lòng Tàu, Ngã Bảy, sông Đồng Tranh và Soài Rạp, nằm ở cửa ngõ Đông Nam của thành phố Hồ Chí Minh. RNM Cần Giờ có diện tích rừng và đất rừng là 38.664 ha với đặc điểm tự nhiên như sau: • Khí hậu: có hai mùa, mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau. Nhiệt độ trung bình là 25,8oC. Lượng mưa thấp từ 1,300 – 1,400mm/năm. • Địa hình: tương đối bằng phẳng, cao trung bình 1,5m. • Thổ nhưỡng: gồm các loại đất mặn, đất mặn ít phèn, đất mặn phèn nhiều, đất cát mịn có pha ít bùn ven biển. • Chế độ thủy triều: có chế độ bán nhật triều không đều, mực triều trung bình là 2m, khi triều cao có thể dâng đến 4m. • Độ mặn: độ mặn lớn nhất khi triều cường và nhỏ nhất khi triều kém. Vào khoảng tháng 4, nước mặn chiếm ưu thế hơn trong mối tương tác sông – biển, nước mặn xâm nhập sâu hơn vào trong vùng đất liền. [56] RNM Cần Giờ có hệ sinh thái đa dạng phong phú. Tuy nhiên, những nghiên cứu về RNM Cần Giờ chủ yếu tập trung vào hệ động, thực vật. VSV là đối tượng phân bố rộng rãi và được xem là “kho báu” của hệ sinh thái RNM Cần Giờ nhưng chỉ mới được quan tâm gần đây. Những nghiên cứu về vi sinh vật RNM cho thấy chúng có tính thích nghi cao với điều kiện khí hậu khắc nghiệt ở đây và chúng có khả năng tạo ra các sản phẩm trao đổi chất đặc biệt hơn so với điều kiện môi trường khác. Nhiều công trình nghiên cứu ở trong và ngoài nước cho thấy RNM là nơi lưu giữ và phân huỷ các chất thải từ nội địa chuyển ra. Nhờ các VSV mà các chất này trở thành chất dinh dưỡng cho nhiều sinh vật khác và môi trường được trong sạch [60]. VSV trong đất RNM bao gồm VK, nấm sợi, nấm men và xạ khuẩn đều có khả năng khả năng sinh các enzym ngoại bào mạnh như cellulase, amylase, protease, chitinase giúp phân huỷ các hợp chất ở lớp đất mặt như tinh bột, cenlulose, pectin, gelatin, casein, chitin có trong xác động vật và thực vật và một số hợp chất phức tạp hơn như carboxyl methyl cellulose (CMC), các chất lignocellulose ở các mức độ khác nhau. Một số nấm sợi phân giải được các hợp chất phospho khó tan. Chúng phân huỷ các mùn bã cây ngập mặn tại chỗ, cung cấp nguồn thức ăn cho khu hệ động thực vật RNM rất phong phú ở các kênh rạch và vùng biển nông. [59] 10 Theo Aksornkoae (1993), VK cùng với nấm là những sinh vật quan trọng nhất tham gia vào quá trình phân hủy thực vật rụng của cây ngập mặn. Trong thời gian phân hủy lá, sinh khối của nấm giảm trong khi sinh khối VK ổn định hoặc tăng trong suốt giai đoạn phân hủy. Hieber & Gessner (2002) cho rằng thời gian tạo ra thế hệ mới của VK ngắn hơn so với nấm nên sinh khối VK tạo ra là rất lớn, vì vậy VK có vai trò vô cùng quan trọng khi tham gia vào quá trình phân hủy xác thực vật. VK dị dưỡng là nhóm có số lượng nhiều nhất trong các nhóm vi sinh vật có vai trò chủ chốt trong quá trình phân hủy vật chất hữu cơ, khép kín chu trình sinh địa hóa hệ sinh thái RNM. Chúng tham gia phân hủy xác động thực vật và chất rơi rụng trong RNM tạo nguồn thức ăn phế liệu phong phú cung cấp cho các loài động vật ăn phế liệu. Chúng cũng tham gia phân hủy các hợp chất hữu cơ tạo nguồn thức ăn khoáng cho cây ngập mặn trong hệ sinh thái. Bản thân VK cũng là nguồn thức ăn giàu đạm cho nhiều loài động vật nhỏ và ấu trùng của một số loài. Khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ thường gặp trong hệ sinh thái RNM của các chủng VK dị dưỡng phân lập từ đất RNM mới phục hồi cũng như RNM tự nhiên là tương đối cao. [60] Trong số VK dị dưỡng phân lập từ đất RNM, có rất nhiều chủng là VK hiếu khí không bắt buộc, chúng có thể sinh trưởng và phát triển tốt trong cả điều kiện môi trường có oxy và thiếu oxy. Chúng có vai trò không nhỏ trong quá trình phân hủy xác động thực vật RNM, bên cạnh nấm và các sinh vật phân hủy khác, khi những sinh vật này chỉ có thể phát triển tốt trong điều kiện môi trường có sẵn oxy tự do. Đại đa số VK dị dưỡng ở đất RNM và trong lá đang phân hủy có hình que, có khả năng di động và số VK Gram âm (-) chiếm tỷ lệ tương đối lớn. Phần lớn chúng là VK chịu mặn và ưa ấm. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 22-37oC, khi độ mặn trong môi trường nuôi cấy lên đến 5% thì đa số các chủng bị ức chế sinh trưởng. [60] Sự phân bố về số lượng cũng như thành phần loài của VSV trong các thủy vực khác nhau là rất khác nhau, trong đó các yếu tố có tính chất quyết định là hàm lượng muối, chất hữu cơ, pH, độ đục, nhiệt độ. Trong các vùng ven biển nước lợ với nồng độ muối thường dưới 3% ngoài các VK biển thật sự và các VK nước ngọt chịu mặn, còn tìm thấy các VK nước lợ ưa mặn. Nồng độ muối tối ưu của chúng thường nằm trong khoảng 0,5% đến 2%. Các VK nước lợ thường phát triển rất yếu hoặc hoàn toàn không phát triển được trong các môi trường nước ngọt và rất hay bị ức chế sinh trưởng ở các nồng độ muối trên 3%. [56] 11 Khả năng sinh kháng sinh của nhiều loài VK, nấm men, đặc biệt là nấm sợi. Các chủng VSV có hoạt tính kháng sinh mạnh thuộc các chi Trichoderma, Penicillium, Cephaloporium, Paecilomyces. Các VSV sinh kháng sinh này còn có tác dụng ức chế các VSV gây bệnh cho động, thực vật, làm sạch môi trường bị ô nhiễm ven biển.[59] Các nghiên cứu VSV trong RNM vùng ven biển cho thấy có tới 83/199 chủng nấm sợi có khả năng phân giải dầu mỏ ở các mức độ khác nhau như các loài nấm sợi thuộc một số chi Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Paecilomyces, Canninghamela (Trang và cs, 2003) làm cho môi trường nước biển trong sạch, tạo điều kiện thuận lợi cho các tảo phù du quang hợp, cung cấp O2 cho nhiều loài hải sản. Sự phát triển của chúng cũng làm tăng nguồn thức ăn cho các động vật ở vùng biển. [59] Qua phân tích các mẫu đất ở RNM Cần Giờ (TP.HCM), các nhà khoa học đã phát hiện những chủng Bt sinh nhiều tinh thể có khả năng diệt trừ đặc hiệu một số loài côn trùng gây hại cho người và động, thực vật như các loài sâu róm, sâu tơ, bọ nẹt, ấu trùng muỗi… Nhiều nghiên cứu đã chứng minh độc lực của chủng Bt phân lập từ RNM Cần Giờ là rất cao với ấu trùng sâu và muỗi. [59] Như vậy, việc nghiên cứu các chủng VSV trong đó có VK từ RNM là một hướng đi đúng đắn. 1.2. Tổng quan về Bt 1.2.1. Lịch sử phát hiện ra Bt Việc nghiên cứu và ứng dụng Bt ra đời và phát triển cùng với sự phát triển khoa học kỹ thuật của nhân loại. Bt đã được nghiên cứu và ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau. [7], [53] Năm 1870, Louis Pasteur, khi nghiên cứu về bệnh trên dâu tằm, đã phát hiện ra một loại VK gây bệnh cho tằm và đặt tên là Bacillus bombycos. Năm 1901, Ishiwatari Shigetane - nhà sinh vật học người Nhật, khi đang thực hiện một cuộc điều tra nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh Sotto làm chết đột ngột nhiều quần thể tằm, đã phân lập được một loại VK đặt tên là Bacillus sotto. Đến năm 1911, Ernst Berliner - nhà sinh vật học người Đức, đã phân lập được VK giết hại mối Mediterranean flour. Ông phát hiện ra đây chính là loài VK mà Ishiwatari Shigetane đã 12 công bố, và đặt tên lại cho loài VK này là Bacillus thuringiensis. Tên gọi này được xuất phát từ địa danh Thuringia, là một thị trấn nhỏ ở Đức, nơi đã phát hiện ra con mối đó. Năm 1915, Matter khi phân lập từ ấu trùng bướm – mọt bột (Anagasta keuehmella) đã tái phát hiện ra VK gây bệnh này và chính thức được đặt tên là Bacillus thuringiensis. Cũng trong thời gian này, Ernst Berliner tiếp tục đưa ra báo cáo về một loại độc tố có bản chất là protein được Bt sản sinh ra trong cơ thể, và theo ông đó chính là nguyên nhân khiến các con mối bị giết hại. Tuy nhiên, tác dụng và cơ chế hoạt động của loại protein này vẫn chưa được khám phá. Năm 1920, những người nông dân ở các trang trại lớn tại các nước phát triển bắt đầu sử dụng sinh khối Bt phun cho cây trồng như một loại thuốc phòng trừ sâu bệnh. Pháp là nước sử dụng Bt sớm nhất (1938), đồng thời đã chế tạo các loại thuốc có nguồn gốc từ bào tử và xác sâu nhiễm Bt, gọi là Sporine dùng để diệt mọt bột. Năm 1956, Hannay, Fitz - James và Angus đã nghiên cứu và phát hiện ra tác nhân chính quyết định khả năng tiêu diệt mối và sâu bọ của Bt là các phân tử protein, được sản sinh trong cơ thể Bt. Những kết quả nghiên cứu trên đã mở ra cho các nhà khoa học hướng nghiên cứu mới về tác nhân, cơ chế diệt sâu và di truyền của Bt. Từ năm 1958, các chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt bắt đầu được sử dụng rộng rãi ở Mỹ, Anh, Đức… Đến năm 1961, Bt được đánh giá là một loại thuốc trừ sâu thân thiện với con người và môi trường trong chiến lược phát triển nông nghiệp của tổ chức bảo vệ môi trường EPA (Environmental Protection Agency) ở Mỹ. Năm 1977, đã có 13 loài Bt được phát hiện và công bố. Các nghiên cứu về phổ kháng cho thấy Bt không chỉ gây độc với một giai đoạn nhất định trên ấu trùng của bộ cánh vảy, mà còn gây độc cả với ấu trùng của bộ cánh cứng. Từ năm 1980 trở đi, khả năng kháng độc của sâu bệnh với các loại thuốc hoá học kể cả các loại cực độc như DDT và 666,… ngày càng gia tăng. Để giải quyết những vấn đề đó, các chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt ngày càng được sử dụng rộng rãi bởi tinh thể độc do Bt tiết ra có bản chất là một loại protein, dễ dàng bị phân huỷ nhanh chóng trong môi trường, không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người, vật nuôi. [8], [18], [23], [27]. 1.2.2. Đặc điểm phân loại Vị trí phân loại của Bt 13 - Lớp Shyzomycetes - Bộ Eubacteriales - Họ Bacillaceae - Giống Bacillus - Loài Bacillus thuringiensis [5] Bt được chia làm nhiều loài phụ dựa trên các đặc điểm sau: - Khả năng hình thành enzyme leucitinase. - Cấu trúc tinh thể và khả năng gây bệnh cho côn trùng. - Đặc tính huyết thanh học. - Phản ứng ngưng kết của các tế bào sinh dưỡng với các huyết thanh tương ứng. [6] Đến nay, phương pháp phân loại Bt được sử dụng phổ biến là dựa trên các đặc tính huyết thanh học. Đặc tính huyết thanh học của chủng Bt được xác định chủ yếu dựa trên kháng nguyên tiên mao H và được tiến hành bằng phản ứng ngưng kết các tế bào sinh dưỡng với các kháng huyết thanh tương ứng. Tuy nhiên, việc phân loại chỉ dựa trên type huyết thanh chưa phản ánh được mối liên hệ giữa chủng giống và hoạt lực diệt côn trùng. Việc phân lập và tuyển chọn các chủng Bt có giá trị vẫn gặp khó khăn. Vì vậy, gần đây một số nhà khoa học đã đề nghị đưa ra phương pháp phân loại mới. Phương pháp này dựa trên kết quả xác định type huyết thanh, hình dạng tinh thể, hoạt lực diệt côn trùng, gen Cry và thành phần protein tinh thể. [3] Bảng 1.1. Một số type huyết thanh và các chủng đại diện tương ứng Type huyết thanh Chủng đại diện Viết tắt Người nghiên cứu 1 Bt. var. thuringiensis THU Bliner (1915), Heimpel & Angus (1958) 3a, 3b Bt var. kurstki KUR De Barjac & Lemill (1970) 4a, 4b Bt var. sotto SOT Ishiwata (1905), Heimpel & Angus (1958) 5a, 5b Bt var. candensis CAN De Barjac & Bonnefoi (1972) 8b, 8d Bt var. nigeriensis NIG Weiser & Prasertphon (1954) 14 Bt var. israelensis ISR De Barjac & cộng sự (1992) 30 Bt var. medellin MED Orduz & cộng sự (1992) 33 Bt var. leesis LEE Lee &cộng sự (1944) 14 46 Bt var. chanpansis CHA Chainpaisang (1994) 48 Bt var. balearica BAL Iriate Garcia (1995) 49 Bt var. muju MUJ Park (1995) 50 Bt var. navarrersis NAV Iriate Garcia 15 1.2.3. Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của Bt Bt là trực khuẩn Gram (+) sinh bào tử hiếu khí không bắt buộc, kích thước 1 - 1,2 x 3 - 5 µm, có phủ tiêm mao không dày, tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành từng chuỗi, chứa tinh thể độc có khả năng diệt sâu. Tinh thể protein được hình thành trong giai đoạn tạo bào tử, kích thước 0,6 – 2 µm. Bt phát triển trong điều kiện nhiệt độ 15 - 450C nhưng thích hợp nhất 290C – 300C. Bào tử dạng hình oval, hình trứng dài 1,6 – 2 µm. Hình 1.2. Hình thái tế bào của Bt ( http://www.komunich.de/vincent-sanchis/france/bacillus-thuringiensis.html) Phản ứng sinh lý, sinh hóa của Bt bao gồm:  Làm ngưng kết sữa, làm trong đường glucose, fructose, glycerol, tinh bột, maltose…, hình thành acid.  Không hình thành indol, có phản ứng dương tính với methyl đỏ, phản ứng VP dương (ethiryl methyl methanol)  Có tác dụng hòa tan môi trường huyết thanh ngựa agar, có thể mọc trên môi trường cianate, khử muối nitrate thành nitrite, không khử muối sulphate, sản sinh enzyme phospholipase.[1], [26], [27]. 16 Hình 1.3. Tinh thể protein của Bt (http://www.learner.org/courses/biology/archive/images/1006.html) 1.2.4. Độc tố và cơ chế gây độc 1.2.4.1. Các độc tố của Bt Bt có khả năng tạo 4 loại độc tố:  Ngoại độc tố α (α - exotoxin): được phát hiện giữa những năm 1950 từ VK Bacillus thuringiensis vanenlesti bởi C.Toumaroff. Ngoại độc tố α còn gọi là enzyme leucintinase, có hoạt tính phospholipase, tác động chủ yếu lên gốc phospholipid của màng tế bào sâu, giúp cho VK gây bệnh dễ xâm nhập vào các xoang trong cơ thể côn trùng. Do vậy, enzyme leucintinase đã trực tiếp tham gia vào việc tấn công, gây tổn thương tế bào ở thành ruột của sâu. [5], [28]  Ngoại độc tố β (β - exotoxin): do Hall và Arkavc phát hiện vào năm 1959 khi nuôi ấu trùng muỗi bằng thức ăn chứa Bt. Đây là một độc tố bền nhiệt có bản chất là nucleotide. Khi độc tố này được xử lý ở 120oC trong 15 phút vẫn giữ được hoạt tính. Cơ chế tác động của ngoại độc tố β là cạnh tranh ATP với các enzyme RNA polymerase, dẫn đến kìm hãm hoạt động của enzyme, ngừng tổng hợp RNA, gây rối loạn sinh tổng hợp protein. Mặt khác, khi ngoại độc tố β cộng hưởng tác động với nội độc tố δ có thể khiến côn trùng chết nhanh chóng. Ngoại độc tố δ làm dập vỡ, phá huỷ vùng biểu mô ruột giữa côn trùng, còn ngoại độc tố β xâm nhập vào huyết tương và máu gây ra biến đổi sinh lý của ấu trùng. Ngoại độc tố β gây độc cho nhiều loại côn trùng thuộc bộ cánh cứng, hai cánh, đặc biệt khi côn trùng ở giai đoạn ấu trùng, sâu non. 17 Ngoại độc tố β gây cản trở sự lột xác của côn trùng. Nếu được sử dụng ở nồng độ cao, độc tố β còn tiêu diệt cả trứng côn trùng. [28]  Ngoại độc tố γ (γ - exotoxin): là một phospholipase, có bản chất là mạch peptide ngắn và một số amino acid tự do. Độc tố này tan tốt trong nước, mẫn cảm với không khí, ánh sáng, nhiệt độ và oxy nên ít hữu dụng trong thực tế đồng ruộng. Cơ chế tác dụng của ngoại độc tố γ cũng tương tự như ngoại độc tố α. [30], [39]  Nội độc tố δ (δ - endotoxin) còn được gọi là tinh thể Cry hay ICPs. So với 3 nhóm ngoại độc tố trên, tinh thể độc Cry được tạo ra với lượng lớn hơn nhiều và có hiệu quả gây độc cho côn trùng hơn. Tinh thể Cry được tạo thành trong giai đoạn tạo BT, tác dụng độc đặc hiệu với các loài côn trùng. Lượng tinh thể độc cũng như phổ tác dụng thay đổi theo chủng. Tinh thể có thể ổn định trong các dung dịch có phạm vi pH rộng (4 – 12), có thể bị biến tính trong acid trichloacetic, chlorua thủy ngân. Tuy nhạy cảm với nhiệt độ cao song có tính chịu nhiệt nhất định (ở 65oC có thể giữ được 1 h, 80oC có thể giữ được 20 phút). Những nghiên cứu gần đây về cấu trúc nội độc tố δ cho thấy protein này có 3 vùng chức năng:  Vùng I là một bó gồm 7 chuỗi xoắn α. Một vài chuỗi hoặc tất cả các chuỗi có thể cài vào màng tế bào ruột, tạo ra các lỗ, từ đó các ion có thể qua lại tự do.  Vùng II chứa 3 dải β không song song tương tự như vùng gắn kháng nguyên của globulin miễn dịch. Vùng này có vai trò gắn với thụ thể trên bề mặt tế bào biểu mô ruột.  Vùng III có nhiệm vụ bảo vệ độc tố đã được hoạt hóa không bị phân hủy bởi protease ở ruột. Với cấu trúc phúc tạp như vậy, nội độc tố δ liên kết đặc hiệu với các thụ thể trên màng tế bào biểu mô ruột của sâu, gây ra tác động dây chuyền. Chính điều này làm nên tính đặc hiệu rất cao trong hiệu quả tác động của Bt lên sâu hại. Đã có hơn 50 gen mã hóa cho protein tinh thể độc đã được giải mã cho phép phân loại các chất độc này thành 15 nhóm dựa trên sự giống nhau trong trình tự gen. [26], [31], [34] 18