Tài liệu Nghiên cứu chiết xuất và bào chế viên giảo cổ lam

BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI • • • • NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ BÀO CHÊ VIÊN GIẢO cổ LAM (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ược s ĩ KHOÁ 2002 - 2007) Người hướng dẫn: GS.TS. Phạm Thanh Kỳ. PGS.TS. Phạm Ngọc Bùng. Nơi thực hiện: Trường Đại học Dược Hà Nội. Thời gian thực hiện: Từ 1/2007 đến 5/2007. HÀ NỘI, THÁNG 5 - 2007 m íUO Lời cảm ơn Trong suốt quá trình làm Khóa luận té t nghiệp, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ thầy cô, gia đình và bạn bè. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: GS,TS, Phạm Thanh K ỳ PGS,TS, Phạm Ngọc Bùng Những người thầy đã tận tình hướng dãn, tạo điều kiện tốt nhất và trực tiếp giúp đ ỡ tôi hoàn thành Khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban Trường Đại học Dược Hà Nội; cảm ơn tấ t cả các thầy cô, các Kỹ thuật viên của Bộ môn Dược liệu, Bộ môn Vật lý - Hóa lý và Bộ môn Bào chê đã tạo điều kiện thuận ỉợi cho tôi trong thời gian qua. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân yêu nhất trong gia đình, cảm ơn bạn bè - những người ỉuôn sát cánh bên tôi, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như làm Khoá luận. Hà Nội, ngày 20 thảng 5 năm 2006. Sinh viên Lê Thị Á n h CHỮ VIẾT TẮT CT: Công thức. DC: Dịch chiết. DD: Dung dịch. DĐVNIII: Dược điển Việt Nam, lần xuất bản thứ 3. DL: Dược liệu. DM: Dung môi. EtOH: Ethanol. FeClj: Sắt (III) Chlorid. HPMC: Hydroxy propyl methyl cellulose. KTTP: Kích thước tiểu phân. PEG: Polyetylenglycol. RSD: Độ lệch chuẩn tương đối. TT: Thuốc thử. TiOj: Titan dioxyd. vđ: Vừa đủ. MỤC LỤC Trang ĐẶT VÂN Đ Ể ................................................................................................. 1 PHẦN I: TỔNG QUAN...............................................................................2 1.1. Cây giảo cổ lam............. ..................... ........... .......................................2 1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân b ố .......................................................... 2 1.1.2. Thành phần hoá học.......................................................................... 2 1.1.3. Tác dụng và công dụng..................................................................... 4 1.1.4. Độc tính............................................................................................ 6 1.1.5. Tiêu chuẩn chất lượng......................................................................6 1.2. Các công trình nghiên cứu chế phẩm thuốc từ dược liệu Giảo cổ lam.... 7 1.2.1. Các tư liệu nghiẽn cứu về chiết xuất Saponin và Flavonoid từ dược liệu Giảo cổ lam...................................................................... 7 1.2.2. Các chế phẩm thuốc từ Giảo cổ lam ...............................................7 1.2.3. Các phương pháp định tính, định lượng Saponin và Flavonoid trong Giảo cổ lam............................................................................. 8 1.3. Kỹ thuật bào chê cao thuốc và thuốc viên chứa cao dược liệu ....8 1.3.1. Kỹ thuật bào chế cao thuốc............................................................. 8 1.3.2. Kỹ thuật bào chế viên nén và nang cứng có chứa cao dược liệu....9 PHẦN II: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ........................................... 11 2.1. N guyên - vật liệu và phương pháp nghiên c ứ u ....................................... 11 2.1.1. Nguyên - Vật liệu............................................................................11 2.1.2. Phương pháp nghiên cứ u ............................................................... 12 2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận x é t ..................................................... 19 2.2.1. Xác định độ lặp lại kết quả của phương pháp định lượng Saponin và Flavonoid....................................................................................19 2.2.2. Nghiên cứu điều chế cao khô Giảo cổ lam ..................................20 2.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn cho cao khô giảo cổ lam.............................28 2.2.4. Nghiên cứu bào chế viên nén từ cao khô Giảo cổ lam..................29 2.2.5. Nghiên cứu bào chế viên nang cứng từ cao khô Giảo cổ lam ...... 32 2.2.6. Bước đầu đánh giá độ ổn định của viên........................................34 2.2.7. Hoàn ửdện tiêu chuẩn chất lượng cho viên nén Giảo cổ lam đã bào chế.... 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT.................................................................. 36 TẦI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỂ Theo xu hướng chung hiện nay, con người ngày càng ưa dùng sản phẩm đi từ thiên nhiên để chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ. Việt Nam chúng ta là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Bởi vậy vấn đề nghiên cứu cây cỏ làm thuốc luôn được nhiều nhà khoa học quan tâm. Trong Xã hội phát triển, nhu cầu của con người về thuốc không chỉ dừng lại ở hiệu lực và sự an toàn, mà còn đòi hỏi cả sự tiện lợi trong sử dụng và bảo quản. Vì vậy ngành Y tế đã có chủ trương hiện đại hoá Y học cổ truyền, trong đó có có một nội dung quan trọng là nghiên cứu chuyển các dạng thuốc sắc, hãm... cổ truyền thành các dạng thuốc hiện đại như viên nén, viên nang... Cây Giảo cổ lam được phát hiện ở Việt Nam và đã có một số công trình nghiên cứu của GS.TS. Phạm Thanh Kỳ về đặc điểm thực vật, thành phần hoá học cũng như thử độc tính và một số tác dụng sinh học. Kết quả của các công trình này đã cho thấy Giảo cổ lam là một dược liệu có nhiều tác dụng điều trị bệnh như hạ Cholesterol, hạ Lipid máu, hạ đường huyết, chống huyết khối, chống viêm, tăng sức đề kháng... Hiện nay một số nước trên Thế giới đã có các chế phẩm Giảo cổ lam ở dạng chè, viên nang có nhiều tác dụng tốt. Trên thị trường Việt Nam cũng đã có chè Giảo cổ lam của công ty Tuệ Linh. Để góp phần hiện đại hóa dạng bào chế thuốc Giảo cổ lam. Chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất và bào chế viên Giảo cổ lam” với 2 mục tiêu: > Lựa chọn phương pháp chiết xuất và bào chế cao khô từ dược liệu Giảo cổ lam. Xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng cho cao khô Giảo cổ lam. > Nghiên cứu bào chế và xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho viên nén Giảo cổ lam. Bước đầu theo dõi độ ổn định của thuốc. -1 - PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1. CÂY GIẢO CỔ LAM -Tên khoa học: Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, Cucurbitaceae. - Tên gọi khác: cổ yếm, Thư tràng năm lá [12], Thất diệp đởm, Tiểu khổ dược (Nhật Bản), Cam ù*à man, Công la oa đổ, Biển địa sLnh căn, Giao dịch lam [15]. 1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố s Đặc điểm thực vật Thân thảo mọc leo yếu, không lông, vòi đơn. Lá kép có cuống chung dài 3 - 4 cm, phiến do 5 - 7 lá chét vói mép có răng dài 3 - 9 cm, rộng 1 ,5 -3 cm. Cây khác gốc; Qiuỳ hoa thòng. Hoa nhỏ, hình sao, ống bao hoa rất ngắn; Cánh hoa rời nhau cao 2,5 cm; Nhị 5, bao phấn đính thành đĩa, bầu có 3 vòi nhụy. Quả khô, tròn, đường kính 5 - 9 mm, màu đen; Hạt 2 - 3 , treo, to 4 mm. Hoa tháng 7 - 8 , quả tháng 9 - 10 [7], [12]. 13 Phân bố Cây mọc trên đất đá vôi, đá hoa cương và đất núi lửa, trong rừng thưa, lùm bụi từ vùng đồng bằng đến vùng núi cao 2000m. ở nước ta, cây mọc từ Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hoà Bình, Thừa Thiên - Huế, Kon Tum vào tới Đồng Nai [7], [8]. Phân bố ở Ân Độ, Xii Lanca, Mianma, Băngladet, Nepal, Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Việt Nam và bán đảo Mã Lai [8], [54]. 1.1.2. Thành phần hoá học - Bằng phương pháp định tính trong ống nghiệm, các tác giả ở Việt Nam đã xác định được trong thân và lá Giảo cổ lam có Flavonoid, Saponin, acid hữu cơ, acid amin, và sterol; Không có alcaloid, glycosid tim, anthranoid, coumarin, tanin, chất béo, caroten và đưòfng khử [6 ], [9], [10], [11], [14]. -2- - Các tài liệu [21], [29], [33] cho thấy dịch chiết phần trên mặt đất của Giảo cổ lam có Rutin, Ombuin và 1 acid hữu cơ là acid Malonic; Saponin triterpen phần aglycol có khung Dammaran. - Các tác giả đã phân lập và xác định được cấu trúc của một số chất: + Quercetin, Rutin, Rhamnazin, 1 Saponin có công thức C47H76O 17 được dự kiến cấu trúc thuộc nhóm Triterpenoid có khung Dammaran và 5,6-dimethoxy-7,3',4'-trihydroxyflavone [6 ], [10], [11], [13], [14]. + 1 chất 4a-methylsterol mới có cấu trúc 4a,14a-dimethyl-5a-esgosta7,9(1 l),24(28)trien-3p-ol [16]. + 4 glycoside có khung Dammaran mới [33]: . 20(S),3P,20,23Ịtrihydroxydammar-24-en-21-oicacid-21,231acton. . Epimer ở C21: 20(R). . 20(S)dammar-23-en-3B,20,25,26-tetraol. li , 20(S)dammar-25-en-3 p,20,21,2-tetraol. - Theo Cui J. và cộng sự [21], phần aglycol có khung Dammaran của Gypenoside phân lập từ dịch chiết phần trên mặt đất của Giảo cổ lam có cấu trúc giống với cấu trúc của aglycol của Ginsenoside trong nhân sâm (Protopanaxadiol và Protopanaxatriol). - Theo tài liệu [33] và [56], Giảo cổ lam có 82 Gypenosides, trong đó có 4 Gypenosides có cấu trúc và tác dụng giống vói các Gypenosides trong nhân sâm, 70 Gypenosides khác khi thủy phân cũng thu được các chất tương tự trong nhân sâm. - Bằng phương pháp đo phổ phát xạ tia X, các tác giả đã xác định trong Giảo cổ lam có chứa các nguyên tố Al, Si, Mg, p, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag. Trong đó cao nhất là Si (10%) và thấp nhất là Ag (0,0001%) [6 ], [9], [10], [11], [14]. - Các tác giả cũng đã tiến hành định lượng 2 thành phần chính của -3- Giảo cổ lam [6 ], [11], [13], [14]. Kết quả thu được như ghi trong bảng 1.1. Bảng 1.1: Kết quả định lượng trong thân và lá cây Giảo cổ lam ở Cao Bằng Lá Thân Hàm lượng Flavonoid (%) 5,58 1,17 Hàm lượng Saponin (%) 7,39 3,79 1.1.3. Tác dụng và công dụng s Tác dụng dược lý * Hạ Cholesterol, hạ lipid máu: Có khả năng giảm LDL (Cholesterol xấu), trong khi đó lại tăng lượng HDL (Cholesterol tốt), tăng cường chuyển hóa lipid và giảm lắng đọng mỡ trên thành mạch [37]; Đẩy mạnh quá trình chuyển đường và Carbohydrate đến các cơ thay vì chuyển hóa thành dạng triglycerid dự trữ [25]; ức chế sự tăng Cholesterol ở động vật thínghiệm[10], [11], [13], [14]. * Chống huyết khối: Kìm hãm sự tích tụ tiểu cầu và đẩy nhanh quá trình tan cục máu đông [34]. * ức chế khối u: Có tác dụng tới acid nucleic, protein và tế bào của bệnh nhân ung thư phổi [23]; Có khả năng ức chế sự phát triển khối u trên động vật thí nghiệm [13], [38], [39], [40]. * Chống viêm: Tác dụng chống viêm mạnh hơn Indomethacin [26], [27], [28]. * Hạ đường huyết: Trên thực tế, GS.TS. Phạm Thanh Kỳ và cộng sự đang tiến hành thử nghiệm lâm sàng để đánh giá tác dụng hạ đường huyết đối với sản phẩm trà tan GX7 chứa 3 g Giảo cổ lam. *Tăng sức đề kháng: Tăng cường đáp ứng miễn dịch [10], [11], [13], [14], [36]; Tăng cường sự chống đỡ đối với tình trạng suy yếu ở bệnh nhân ung thư [24]. -4- * Chống bức xạ: Hồi phục sự suy giảm số lượng bạch cầu, GOT, GPT, IgG trong huyết thanh chuột sau khi bị chiếu tia gamma (y) [20]; Kìm hãm sự cảm ứng tia ư v của thực khuẩn lambda trong tương tác với E. coli [41]. * Bảo vệ tế bào gan: Làm giảm rõ rệt chỉ số AST (Aspartate aminotransferase) và ALT (Alanine aminotransferase) [26], [27], [28]; Chống xơ hóa tế bào gan, ức chế sự phát triển của dòng tế bào Huh-7, Hep3B và HA22T [17], [18], [19]. * Chống oxy hoá: Có khả năng thu dọn gốc tự do anion Superoxide 0 ’2 và Hydrogen peroxide 'OH [26], [29]. HI Công dụng ở Trung Quốc, Giảo cổ lam được dùng làm thuốc tu bổ cường tráng [7]; Các chế phẩm dạng chè thuốc, thuốc sắc được dùng để chữa viêm, trị ho, dưỡng tâm an thần và làm thuốc bổ [15]. ở Quảng Tây, dùng trị tiêu chảy và dùng ngoài trị rắn cắn; ở Vân Nam, cây được sử dụng để chữa viêm khí quản mạn tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm thận, loét dạ dày và hành tá tràng, phong thấp đau khớp, bệnh về tim [8 ]. Theo tài liệu [15], dược liệu dùng để trị bệnh tăng huyết áp, bệnh mỡ máu, bệnh mạch vành, bệnh béo phì, tiểu đường, trị ung thư, viêm phế quản mãn tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm bể thận, viêm loét dạ dày - ruột, trúng gió, sỏi mật; Tăng sức khoẻ, chống lão suy. s Liều dùng - Liều dùng tính cho dược liệu: Liều 5 - 1 0 g/ngày [14]. - Liều dùng tính theo Gypenosides: được thể hiện trong bảng sau: -5- Bảng 1.2: Liều sử dụng (tính theo Gypenosỉdes) của các chếphẩm Giảo cổ lam [551 Mục đích điều trị Liều dùng Hỗ trợ tỉm mạch 20 mg/lần X 2 hoặc 3 lần/ngày Bồi bổ sức khỏe 20 mg/lần X 2 hoặc 3 lần/ngày Hạ huyết áp: + Phòng 20 mg/lần X 2 hoặc 3 lần/ngày + Điều trị 60ing/lần X 2 hoặc 3 lần/ngày Hạ Cholesterol: + Phòng + Điều trị 20 mg/lần X 2 hoặc 3 lần/ngày 60 mg/lần X 3 lần/ngày Chống huyết khối: + Phòng 20 mgAần X 1 hoặc 2 lần/ngày 60 mg/lần X 3 lần/ngày + Điều trị Tăng tái tạo bạch cầu: + Phòng 20 mg/lần X 2 hoặc 3 lần/ngày 60 mg/lần X 3 lần/ngày + Điều trị 60 mg/lần X 2 hoặc 3 lần/ngày Tăng cường miễn dịch ức chế sự phát triển của khối u: + Phòng + Điều trị Tiểu đường, rối loạn chức năng gan, viêm phế quản, chống oxy hóa. 20 mg/lần X 2 lần/ngày. 60 mg/lần X 3 lần/ngày 20 mg/lần X 3 lần/ngày 1.1.4. Độc tính Theo các nghiên cứu thu được trong nước, có thể thấy Giảo cổ lam là một dược liệu lành tính, không biểu hiện độc tính trong điều kiện thí nghiệm. - Độc tính cấp: Thử trên chuột với liều 50 g/Kg (tưcmg đương với 1250 lần liều dùng cho người) không có biểu hiện ngộ độc cấp [6 ], [10], [14].. - Độc tính bán trường diễn: Thử trên thỏ với liều 3 g/Kg/ngày, dùng liên tục trong một tháng không thấy biểu hiện ngộ độc [6 ], [10], [14]. l . l . s Tiêu chuẩn chất lượng Theo GS.TS. Phạm Thanh Kỳ, tiêu chuẩn của dược liệu Giảo cổ lam được trình bày như phụ lục 1. -6- 1.2. CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN c ứ u CHÊ PHẨM THUỐC từ DƯỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM 1.2.1. Các tư liệu nghiên cứu về chiết xuất Saponin và Flavonoid từ dược liệu Giảo cổ lam Hiện chúng tôi chưa tìm thấy một công trình nào công bố về quy trình sản xuất 2 nhóm chất chính (Flavonoid và Saponin) trong Giảo cổ lam. Hầu hết các tác giả trong quá trình nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng sinh học đều sử dụng dung môi chiết xuất là nước và Ethanol; Khi định lượng cần chiết kiệt thì các tác giả sử dụng Methanol. Tuy nhiên chưa có sự đánh giá về hiệu quả chiết xuất của các dung môi này. 1.2.2. Các chế phẩm thuốc từ Giảo cổ lam Hiện nay đã có một số nước trên Thế giới sản xuất các chế phẩm của Giảo cổ lam như: Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan. Các mặt hàng này tồn tại chủ yếu dưới dạng trà túi lọc, một số sản phẩm dạng viên nang, cao thuốc, có duy nhất 1 viên nén được sản xuất bởi nhà máy Guangxi Health Tonic and Pharmaceutical ở Trung Quốc [57]. Các chế phẩm này thường được dùng để bồi bổ sức khỏe hoặc sử dụng hỗ trợ trong điều trị xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, ung thư và một số bệnh khác. Nhưng hiện tại ở Việt Nam chưa có mặt các sản phẩm này mà mới chỉ có sản phẩm trà túi lọc do công ty Tuệ Linh sản xuất. Tìm kiếm trên các Website, chúng tôi thu được khá nhiều hình ảnh về các chế phẩm có chứa Giảo cổ lam, nhiều nhất là các chế phẩm ở dạng trà và viên nang. Các chế phẩm dạng viên thường được bào chế từ dịch chiết Gypenoside toàn phần của dược liệu này. -7- Hình 1.1: Một số hình ảnh chế phẩm Giảo cổ lam lổ3J, [49], [51], [54], [56]. 1.2.3. Các phương pháp định tính, định lượng Saponin và Flavonoid trong Giảo cổ lam Để định tính Flavonoid, các tác giả đã sử dụng phương pháp định tính trong ống nghiệm và sắc ký lớp mỏng [10], [13], [14]. Để định tính Saponin, các tác giả dựa trên tính chất tạo bọt, chỉ số phá huyết, các phản ứng màu và sắc ký lófp mỏng [ 10], [ 11]. Để định lượng 2 nhóm chất này, các tác giả sử dụng phương pháp cân [6 ], [11], [13]. 1.3. KỸ THUẬT BÀO CHẾ CAO THUỐC VÀ THUỐC VIÊN CHỨA CAO DƯỢC LIỆU 1.3.1. Kỹ thuật bào chế cao thuốc ỈUQuá trình bào chế cao thuốc nói chung được phân thành 4 giai đoạn [2]: * Chiết xuất dược liệu: Phân chia dược liệu và chiết xuất với dung môi thích hợp bằng phương pháp ngâm lạnh, hầm, sắc, ngấm kiệt hoặc ngấm kiệt cải tiến... để thu dịch chiết. -8- * Loại tạp chất trong dịch chiết: Gồm các tạp tan trong nước (tinh bột, gôm, chất nhầy...) và tạp tan trong EtOH (nhựa, chất béo...) được loại bằng các phương pháp thích hợp như dùng nhiệt, Ethanol cao độ, muối kim loại nặng, acid hữu cơ... * Cô đặc, sấy khô: Nhằm thu được cao có thể chất thích hợp. - Cô đặc: Áp dụng để bào chế cao lỏng hoặc cao đặc. Có thể cô ở áp suất thường (bình cách thủy) hoặc cô ở áp suất giảm (cất quay, thiết bị cô áp suất giảm). - Sấy khô: Nhằm thu được cao khô. Có thể sấy dưới áp suất giảm (tủ sấy chân không); Sấy khô bằng trống quay; Sấy khô bằng sấy phun sương; Đông khô. * Hoàn chỉnh chế phẩm: Xác định và điều chỉnh hàm lượng hoạt chất nếu có quy định. s Tuỳ theo từng loại dược liệu, nếu dược liệu đã được xác định rõ hoạt chất thì cần lựa chọn dung môi và phương pháp chiết phù hợp để thu được hàm lượng hoạt chất cao nhất. 1.3.2.Kỹ thuật bào chế viên nén và nang cứng có chứa cao dược liệu Hiện nay ở Việt Nam có nhiều cơ sở kinh doanh sản xuất các chế phẩm đi từ dược liệu, tiêu biểu như Công ty cổ phần Dược phẩm Traphaco (gần 40 sản phẩm), Viện Dược liệu (hơn 30 sản phẩm), Domesco (khoảng 20 sản phẩm), Công ty dược liệu TW I (hơn 15 sản phẩm), các Xí nghiệp Dược phẩm Nam Hà, Hà Tây, Công ty cổ phần Dược phẩm OPC... [42], [44], [46], [48], [50]. Các sản phẩm này có thể được tạo ra bằng các cách khác nhau: - Tạo chế phẩm từ bột dược liệu. -Tạo chế phẩm từ dịch chiết dược liệu. - Tạo chế phẩm từ hoạt chất tinh khiết được tách ra từ dược liệu. -9- Cách sản xuất chế phẩm từ dịch chiết dược liệu là phổ biến nhất ở nước ta hiện nay. Bằng cách này các công ty đã cho ra đời nhiều chế phẩm, ví dụ như: Hoạt huyết dưỡng não, Ampelop, Boganic, Cebral, Dưỡng cốt hoàn, Hà thủ ô, Tradin extra, ích mẫu... của Traphaco; Cantonin, Morantin, Geranin, Dentonin, Panacrin, Haina... của Viện Dược liệu; Garlic, Dogarlic, Dogarlicin, Dogarlic-Trà xanh, Doragon, Dogarlic 300mg, Doladi, Hà Thủ ô, Domeric, ích mẫu, Morinda Citrifolia... của Dome SCO; Kim tiền thảo OPC, linh chi OPC, Thuốc dưỡng não OPCan, Viên an thần Mimosa... của Công ty cổ phần Dược phẩm OPC...[42], [44], [46], [48], [50]. Trong kỹ thuật bào chế viên nén chứa cao dược liệu thường sử dụng tá dược độn Lactose hoặc Calci carbonat, tá dược rã Tinh bột hoặc tá dược đa năng độn, dính, rã như Avicel, tá dược trơn thường dùng là Talc và Magnesi stearat. Nang cứng chứa cao dược liệu chủ yếu sử dụng tá dược độn Lactose, tá dược rã Tinh bột, tá dược trơn Talc và Magnesi stearat. -10- PHẦN II: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 2.1. NGUYÊN - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứt 2.1.1. Nguyên - Vật liệu 2.1.1.1. Nguyên liệu Dược liệu Giảo cổ lam được thu hái ở Cao Bằng đă được xử lý đạt tiêu chuẩn cơ sở theo phụ lục 1. 2.1.1.2. Vát liệu ^T huốc thử, dung môi, hoá chất Các thuốc thử: HCl đậm đặc, Magnesi kim loại, FeCl3.5 % (TT). Dung môi, hoá chất: EtOH.90%, Chloroform, Methanol, cồn tuyệt đối, Aceton, Ethyl acetat, nước cất. IUCác tá dược Bảng 2.1: Các tá dược sử dụng STT Tá dược Nguồn gốc 1 Avicel 101 2 Amidon (Tinh bột) Lactose Magnesi stearat Đài Loan Pháp 3 4 5 6 7 8 9 Talc HPMC PEG 6000 TÌO2 Tartrazin Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc 13 Dụng cụ, thiết bị - Bình ngấm kiệt. - Bộ Soxhlet. - Nồi cách thuỷ; Bộ cất thu hồi dung môi (cất quay). - Tủ sấy SHELLAB. - 11 - - Máy nghiền thô, nghiền mịn (cỡ rây l,5mm) tại Bộ môn Công nghiệp Dược, trường Đại học Dược Hà Nội (Việt Nam). - Cân phân tích Mettler - Cân kỹ thuật Sartorius. - Máy dập viên ERWEKA. - Máy đóng nang thủ công (Ấn Độ). - Máy đo độ cứng ERWEKA. - M áyđođộrãERW EKA. - Máy đo tỷ trọng ERWEKA SVM. - Máy đo độ trơn chảy ERWEKA GWF. - Cân xác định độ ẩm nhanh Sartorius MA 30. - Thiết bị bao màng mỏng truyền thống. - Các dụng cụ, thiết bị khác; dụng cụ thuỷ tinh, bếp điện, nồi đun, bình gạn, dao cầu, chày, cối, rây... 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu 2.1.2.1. Phương pháp điều chế cao khô giảo cổ lam Dựa theo kỹ thuật chung điều chế cao khô được ghi trong Dược điển Việt Nam [5], chúng tôi tiến hành điều chế cao khô Giảo cổ lam theo sơ đồ sau: Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn điều chế cao khô Giảo cổ lam. - 12- * Phương pháp chiết xuất: - Phưcmg pháp ngấm kiệt: + Nhiệt độ: nhiệt độ phòng: 17 - 25°c. + Dung môi: Ethanol vói các nồng độ khác nhau. + Dung tích bình ngấm kiệt: 300 ml. + Thời gian làm ẩm: 2 giờ. + Tỷ lệ DM/DL dùng để làm ẩm là 7:3. + Tỷ lệ DM/DL dùng để ngâm là 5:1. + Tốc độ rút dịch chiết: 1 ml/phút. - Phương pháp sắc: sử dụng dung môi nước, sắc 3 lần: + Lần 1: sôi 3 giờ. + Lần 2: sôi 2 giờ. + Lần 3: sôi 2 giờ. - Phương pháp ngâm lạnh: Ngâm 2 lần, sử dụng dung môi Ethanol. 2.1.2.2. Phương pháp định tính, định lượng Saponin và Flavonoid \^Định tính Flavonoid và Saponin: Chúng tôi tiến hành định tính Flavonoid và Saponin bằng phương pháp định tính trong ống nghiệm theo phương pháp ghi trong tài liệu [4]: - Flavonoid (dùng phản ứng Cyanidin): Lấy mẫu thử (dược liệu, cao khô, bột thuốc), thêm Ethanol.96% và đun sôi cách thủy khoảng 10 phút. Lọc, lấy khoảng 2 ml dịch lọc cho vào một ống nghiệm, thêm một ít bột Mg kim loại và 3 - 4 giọt HCl đặc. Sau vài phút màu của dung dịch chuyển từ vàng sang đỏ. - Saponin (quan sát hiện tượng tạo bọt): Lấy mẫu thử cho vào một ống nghiệm to, thêm nước, lắc mạnh trong 2 phút. Để yên, cột bọt phải bền sau 15 phút. SĐ /n/ỉ lượng Flavonoid và Saponin: Chúng tôi tiến hành định lượng Flavonoid và Saponin theo tài liệu [13]. Quá trình định lượng được biểu diễn theo sơ đồ sau: - 13- Mẫu thử ^ Chiết Soxhlet DD Chloroform Chiết Soxhlet DD Methanol Bã I Dịch chiết Methanol ị Cất quay, cô Methanol thu hồi Hòa tan Ethanol tuyệt đối Cắn Dịch chiết Ethanol Khuấy nhẹ DD Aceton ’^;ị.Tủa-SäpSi^''- <----------------------ị«Dịch Ethanol - Aceton '^Bốc hơi dung môi Cắn Hòa tan và lọc ^-------- ^ Dịch chiết nước LắCy gạn nhiều lần Nước cất nóng Ethyl acetat Dịch chiết Ethylacetat ...................................... ...... •••.. ................... ---- i W." " 1 ịỶ — Cất quay, cô -s .............; r ' ' ■ ^ Ethyl acetat thu hồi cần Mávòỉiọdd toằn p h ^ Sơ đồ 2.2: Sơ đồ tóm tắt quy trình định lượng Saponin và Flavonoid . Mô tả quy trình: Cân một lượng chính xác mẫu thử và cho vào túi giấy lọc, đặt túi vào bình Soxhlet. Chiết bằng Chloroform tới khi dịch chiết trong suốt, lấy túi bã dược liệu ra để bay hơi hết Chloroform. Sau đó chiết bằng Methanol cho tới khi không còn Flavonoid (thử bằng phản ứng Cyanidin) và Saponin (quan sát hiện tượng tạo bọt). Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để lấy dịch đặc rồi cô tới cắn. Hòa tan cắn trong một lượng tối thiểu Ethanol tuyệt đối, rót từ từ vào 50ml Aceton và khuấy nhẹ sẽ xuất hiện tủa. -14- Lọc lấy tủa thu được Saponin toàn phần, sấy ở 70°c đến khối lượng không đổi, cân khối lượng Saponin. Phần dịch lọc đem cô tới cắn, hòa tan vào khoảng 20ml nước nóng, lọc lấy dịch lọc cho vào bình gạn, chiết Flavonoid bằng Ethyl acetat nhiều lần cho đến khi kiệt Flavonoid (thử bằng phản ứng Cyanidin). Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi, cô cách thủy đến cắn. Sấy cắn ở 70°c đến khối lượng không đổi. Cân khối lượng Flavonoid. Tính ra hàm lượng Flavonoid và Saponin theo công thức: Hàm lượng Flavonoid (Saponin) (%) = ----- ------ .100 • ^ Trong đó: ^ ^ ^ Aạoo-X) a: Khối lượng cắn khô Flavonoid (Saponin) (g) A: KJiối lượng mẫu thử đem định lượng (g) X; Độ ẩm của mẫu thử (%) 2.1.23. Phương pháp bào chế viên nén và nang cứng từ cao Giảo cổ lam. s Phương pháp bào chế viên nén Phương pháp dập thẳng. Tiến hành theo sơ đồ sau: Sơ đồ 2.3: Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn bào chế viên nén theo phương pháp dập thẳng. -15-