Tài liệu Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein từ ba kích làm nguyên liệu thiết lập chuẩn

MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3 1.1. BA KÍCH............................................................................................... 3 1.1.1. Tên khoa học................................................................................ 3 1.1.2. Mô tả cây ...................................................................................... 3 1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến ...................................................... 4 1.1.4. Công dụng .................................................................................... 5 1.1.5. Thành phần.................................................................................. 6 1.2. NHÓM HOẠT CHẤT IRIDOID GLYCOSID ................................. 8 1.3. MONOTROPEIN................................................................................. 9 1.3.1. Đặc điểm và tính chất ................................................................. 9 1.3.2. Tác dụng dược lý của monotropein......................................... 10 1.4. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TỪ DƯỢC LIỆU .............................................................................................. 11 1.4.1. Vài nét về chiết xuất dược liệu ................................................. 11 1.4.2. Vài nét về phân lập và tinh chế ................................................ 12 1.5. CHẤT CHUẨN ĐẶC TRƯNG TỪ DƯỢC LIỆU .......................... 12 1.5.1. Vài nét về chất chuẩn................................................................ 12 1.5.2. Khái quát về thiết lập chất chuẩn từ dược liệu ...................... 14 1.5.3. Tình hình nghiên cứu chất chuẩn kiểm nghiệm Ba kích ...... 16 1.6. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HOÁ LÝ SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI ..................................................................................................................... 17 1.6.1. Sắc ký lớp mỏng ........................................................................ 17 1.6.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).......................................... 20 1.6.3. Phổ khối (MS) ............................................................................ 23 1.6.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)....................................... 24 1.6.5. Sắc ký cột ................................................................................... 25 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 28 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................... 28 2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................ 28 2.1.2. Chế phẩm ................................................................................... 28 2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ...................................................... 29 2.2.1. Thiết bị, dụng cụ ....................................................................... 29 2.2.2. Dung môi, hoá chất ................................................................... 30 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................... 31 2.3.1. Chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein từ Ba kích .... 31 2.3.2. Định tính, xác định cấu trúc monotropein tinh chế được ..... 32 2.3.3. Xác định hàm lượng monotropein tinh chế được .................. 32 2.3.4. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein trong Ba kích ................................................................ 33 2.3.5. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein trong chế phẩm chứa Ba kích ..................................... 35 2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................ 36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................... 37 3.1. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ MONOTROPEIN TỪ BA KÍCH.................................................................................................... 37 3.1.1. Chiết xuất iridoid glycosid ....................................................... 37 3.1.2. Phân lập và tinh chế monotropein từ hỗn hợp các iridoid glycosid ................................................................................................. 39 3.2. ĐỊNH TÍNH, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MONOTROPEIN TINH CHẾ ĐƯỢC ............................................................................................... 42 3.3. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONOTROPEIN TINH CHẾ ĐƯỢC ..................................................................................................................... 45 3.3.1. Xác định tinh khiết bằng HPLC .............................................. 45 3.3.2. Xác định hàm ẩm bằng TGA ................................................... 47 3.4. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MONOTROPEIN TRONG BA KÍCH.................................................... 48 3.4.1. Chuẩn bị mẫu ............................................................................ 48 3.4.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký ........................................................ 48 3.4.3. Xây dựng phương pháp phân tích monotropein trong Ba kích ............................................................................................................... 51 3.4.4. Thẩm định phương pháp phân tích monotropein trong Ba kích ....................................................................................................... 52 3.5. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MONOTROPEIN TRONG CHẾ PHẨM CHỨA BA KÍCH ............... 60 3.5.1. Chuẩn bị mẫu ............................................................................ 60 3.5.2. Xây dựng phương pháp phân tích monotropein trong chế phẩm chứa Ba kích ............................................................................. 61 3.5.3. Thẩm định phương pháp phân tích monotropein trong chế phẩm chứa Ba kích ............................................................................. 62 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................. 68 4.1. NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ, PHƯƠNG PHÁP CỦA ĐỀ TÀI . 68 4.1.1. Về chiết xuất, phân lập và tinh chế ......................................... 68 4.1.2. Cấu trúc monotropein tinh chế được ...................................... 68 4.1.3. Định tính, định lượng monotropein trong Ba kích và chế phẩm chứa Ba kích bằng HPLC ........................................................ 68 4.2. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ............................................ 69 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 71 1. KẾT LUẬN ............................................................................................ 71 2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 72 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril DAD Detector Diod Array - Detector chuỗi (dãy) diốt phát quang DĐVN Dược điển Việt Nam DMFM Dung môi pha mẫu H3PO4 Acid phosphoric HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao KH2PO4 Kali dihydrophosphat LC-MS Sắc ký lỏng – khối phổ LOD Giới hạn phát hiện LOQ Giới hạn định lượng MeOH Methanol MS Phổ khối NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân PA Đạt tinh khiết phân tích RP-HPLC Sắc ký lỏng pha đảo RSD Độ lệch chuẩn tương đối SĐK Số đăng ký SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng TGA Phân tích nhiệt trọng lượng USP Dược điển Mỹ UV-VIS Quang phổ tử ngoại – khả kiến VKNTTW Viện Kiểm nghiệm thuốc TW VKNT TP.HCM Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng Nội dung Trang 1.1 Một số chất nhóm anthraquinon trong Ba kích 6 1.2 Một số chất nhóm iridoid trong Ba kích 7 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 30 2.2 Chương trình gia nhiệt của máy TGA 33 3.1 Kết quả xác định hàm ẩm monotropein bằng TGA 47 3.2 Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký 55 3.3 Kết quả khảo sát tính tuyến tính 56 3.4 Kết quả khảo sát độ lặp lại đối với mẫu Ba kích 57 3.5 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian với mẫu thử Ba 58 kích 3.6 Kết quả đánh giá độ đúng với mẫu thử Ba kích 59 3.7 Kết quả khảo sát LOD và LOQ 60 3.8 Kết quả khảo sát độ lặp lại với chế phẩm Hatkick 65 3.9 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian định lượng 66 monotropein trong chế phẩm Hatkick 3.10 Kết quả đánh giá độ đúng với chế phẩm Hatkick 67 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Nội dung Trang 1.1 Cây Ba kích (Morinda officinalis How) mẫu trồng tại Lục 4 Ngạn, Bắc Giang 1.2 Rễ Ba kích (Radix Morindae) mẫu trồng tại Lục Ngạn, Bắc 5 Giang 1.3 Công thức cấu tạo của monotropein 9 1.4 Đường nystose 16 1.5 Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 20 2.1 Chế phẩm HatKick 28 2.2 Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ và cộng hưởng từ hạt nhân 30 dùng trong nghiên cứu 3.1 SKĐ định tính Ba kích bằng sắc ký lớp mỏng 38 3.2 Phổ MS của phân đoạn A2 39 3.3 Phổ MS của phân đoạn B2 40 3.4 Sơ đồ chiết xuất monotropein từ Ba kích 41 3.5 Phổ 1H NMR của hợp chất monotropein 43 3.6 Phổ 13C NMR của hợp chất monotropein 43 3.7 Phổ khối phân giải cao của monotropein tinh chế được 44 3.8 Giá trị độ tinh khiết píc tại vị trí xuất hiện píc monotropein 45 3.9 SKĐ monotropein tinh chế so sánh với mẫu trắng 46 3.10 Phổ TGA của monotropein 47 3.11 Sắc ký đồ khảo sát hệ pha động 49 3.12 Kết quả quét phổ UV monotropein 50 3.13 SKĐ của mẫu chuẩn, mẫu thử Ba kích và mẫu trắng 52 3.14 Phổ tinh khiết píc mẫu chuẩn, mẫu thử Ba kích 53 3.15 Chồng phổ UV-Vis pic monotropein của chuẩn và pic 54 monotropein trong mẫu thử Ba kích 3.16 Độ phân giải giữa pic monotropein với pic tạp trên SKĐ 54 mẫu thử Ba kích 3.17 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích 56 pic monotropein 3.18 SKĐ giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng 60 (LOQ) 3.19 SKĐ của mẫu chuẩn, mẫu trắng, mẫu thử Hatkick và 62 placebo 3.20 Phổ tinh khiết píc mẫu chuẩn, mẫu thử Hatkick 63 3.21 Chồng phổ UV-Vis monotropein chuẩn và mẫu thử Hatkick 64 3.22 Độ phân giải giữa pic monotropein với pic tạp trên SKĐ chế 64 phẩm chứa Ba kích ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc có nguồn gốc từ thảo dược ngày càng được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới. Ngay tại Việt Nam, trong mấy năm gần đây việc sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu đã và đang gia tăng. Thị trường dược liệu và các sản phẩm từ dược liệu vì thế rất đa dạng và phong phú về nguồn gốc và chủng loại. Ngoài ra, các sản phẩm thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ dược liệu đã và đang phát triển mạnh mẽ. Dược liệu dùng làm thuốc được cung cấp từ nguồn thu hái tự nhiên, trồng trọt và nhập khẩu. Nguồn gốc dược liệu phức tạp, không rõ ràng, số lượng lại lớn khó kiểm soát dẫn đến tình trạng dược liệu giả mạo, nhầm lẫn, kém chất lượng vẫn được tự do lưu thông trên thị trường gây ảnh hưởng không tốt đến độ an toàn, hiệu lực và chất lượng của các chế phẩm từ dược liệu. Trong khi đó công tác kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu gặp nhiều khó khăn do thiếu chất chuẩn với vai trò là hoạt chất hoặc chất đặc trưng cho dược liệu. Chất chuẩn dùng cho dược liệu hiện nay thường được nhập từ Trung Quốc với giá thành tương đối cao và nguồn hàng thường không ổn định, ảnh hưởng đến công tác nghiên cứu và công tác kiểm tra chất lượng thuốc thảo dược, do đó việc tạo lập chất chuẩn là cần thiết. Dược liệu Ba kích (sau đây gọi chung là Ba kích) với những tác dụng sinh học quý giá như làm tăng sức dẻo dai, tăng sức đề kháng, chống viêm, tăng cường khả năng sinh dục… từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong dân gian theo phương thức truyền thống là ngâm rượu hoặc trong các bài thuốc đông y. Theo danh mục số đăng ký thuốc trong nước cấp SĐK từ 2010 đến hết tháng 4/2016 hiện có 36 chế phẩm có thành phần Ba kích gồm: dạng viên hoàn cứng, thuốc nước, viên nang cứng, cao lỏng, hoàn mềm và dược liệu, ngoài ra còn rất nhiều thực phẩm chức năng chứa Ba kích cũng đang được cấp phép lưu hành trên thị trường [4]. 1 Thành phần hóa học chính của Ba kích là anthranoid và irridoids, trong đó có một lượng đáng kể là monotropein (một chất thuộc nhóm iridoids). Tuy nhiên, hiện nay chúng ta chưa thiết lập được các chất chuẩn là hoạt chất đặc trưng cho Ba kích trong đó có monotropein để kiểm tra dược liệu này. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đòi hỏi phải có chất chuẩn nhằm bổ sung vào quỹ chất chuẩn quốc gia phục vụ công tác kiểm tra và quản lí chất lượng dược liệu nói chung và chế phẩm có chứa Ba kích nói riêng, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein từ Ba kích làm nguyên liệu thiết lập chuẩn” với các mục tiêu: - Chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein từ Ba kích có độ tinh khiết đáp ứng yêu cầu làm nguyên liệu thiết lập chuẩn. - Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng monotropein trong Ba kích và chế phẩm chứa Ba kích. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. BA KÍCH 1.1.1. Tên khoa học Cây Ba kích có tên khoa học là Morinda officinalis How., họ Cà phê Rubiaceae. Một số tên gọi khác: Ba kích thiên, dây ruột gà, chẩu phóng xì (Hải Ninh), thau tày cáy (Tày), chồi hoàng kim, sáy cày (Thái), chày kiang dòi (Dao), liên châu Ba kích, Medicinal indian mulberry (Anh) [5],[6],[8],[15]. 1.1.2. Mô tả cây Ba kích là một loại cây thân thảo, sống lâu năm, leo bằng thân quấn, dài hàng mét. Thân non màu tím, có lông, sau nhẵn. Cành non có cạnh. Lá mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, thuôn nhọn, dày và cứng, dài 6-14 cm, rộng 2,5-6 cm, cuống ngắn, lúc non có lông dày hơn ở mặt dưới, thường tập trung ở các gân và mép lá, màu xanh lục, sau già lá ít lông hơn và có màu trắng mốc; lá kèm mỏng, ôm sát vào thân. Hoa nhỏ, màu trắng sau hơi vàng, tập trung thành tán ở đầu cành, dài 0,8-1,5cm; đài hoa hình chén hay hình ống gồm những lá đài nhỏ phát triển không đều; tràng hoa hàn liền ở phía dưới thành ống ngắn, nhị 4, bầu hạ. Quả hình cầu, rời nhau hoặc dính liền thành khối, khi chín màu đỏ, mang đài còn lại ở đỉnh. Mùa hoa: tháng 5-6. Mùa quả: tháng 710 [5],[6],[8],[15]. Hiện nay Ba kích vẫn bị nhầm lẫn: do hình dáng giống với Ba kích lông (Morinda cochinchinensis Lour), cây mặt quỷ (Morinda villosa Hook), cây giang mủ (Zygostelma benthami Baillon var. lineare Cost) hoặc đôi khi do tên gọi Dây ruột gà còn dùng chỉ Sam trắng - Bacopa monnieri (L.) Pennell. (Herpestis monnieri (L.) Rothm.). Rau đắng biển, thyme - leaved gratiola (Anh), họ Hoa mõm chó Scrophulariaceae hoặc Mộc thông – Clematis chinensis Osbeck (C.minor L.). Họ Mao lương Ranunculaceae [16],[17]. 3 Hình 1.1: Cây Ba kích (Morinda officinalis How) mẫu trồng tại Lục Ngạn, Bắc Giang 1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến Ở Việt Nam: Cây mọc hoang ở ven rừng, phân bố phổ biến ở vùng đồi núi thấp của miền núi và trung du ở các tỉnh phía Bắc: Quảng Ninh, Vĩnh Phú, Hà Tây, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang. Ba kích cũng mọc nhiều ở phía nam Trung Quốc: Quảng Đông, Quảng Tây… Thời gian thu hoạch thường vào tháng 10-11, cũng có thể vào mùa xuân để tận dụng lấy giống trồng ngay. Bộ phận dùng: Rễ (Radix Morindae). Chế biến: Rễ được rửa sạch đất cát, loại bỏ rễ con, phơi khô tới khi không dính tay, đập nhẹ cho bẹt, phơi đến khô hoặc sấy nhẹ đến khô [3],[5], [16]. 4 Hình 1.2: Rễ Ba kích (Radix Morindae) mẫu trồng tại Lục Ngạn, Bắc Giang 1.1.4. Công dụng Theo Đông y: Ba kích là vị thuốc có tính ôn, vị ngọt hơi cay, quy kinh thận. Có tác dụng ôn thận trợ dương, mạnh gân cốt, trừ phong thấp [1],[15],[16],[29]. - Đối với bệnh nhân nam giới có hoạt động sinh dục không bình thường, Ba kích có tác dụng làm tăng khả năng giao hợp, đặc biệt đối với những trường hợp giao hợp yếu và thưa. Ba kích có tác dụng tăng cường sức dẻo dai, mặc dù nó không làm tăng đòi hỏi tình dục, không thấy có tác dụng kiểu androgen. Có tác dụng hỗ trợ và cải thiện hoạt động sinh dục cũng như điều trị vô sinh cho những nam giới có trạng thái vô sinh tương đối và suy nhược thể lực. - Đối với người tuổi già, bệnh nhân có biểu hiện mệt mỏi, kém ăn ít ngủ, người gầy yếu, Ba kích có tác dụng tăng lực rõ rệt thể hiện qua những cảm giác chủ quan như đỡ mệt mỏi, ngủ ngon, ăn ngon miệng và những dấu hiệu khách quan như tăng cân nặng, tăng cơ lực. Đối với bệnh nhân đau mỏi các khớp thì sau khi dùng Ba kích dài ngày các triệu chứng đau mỏi giảm rõ rệt. 5 Một số nghiên cứuu cho thấy th nhóm bệnh nhân dùng phốối hợp Ba kích và vitamin B1 có kếtt quả qu tốt hơn nhóm dùng Ba kích đơn thuầần. - Trong nhân dân, Ba kích là một m vị thuốc bổ trí não và tinh khí, dùng chữa các bệnh liệtt dương, dươ sớm xuất tinh, di mộng ng tinh, phụ ph nữ kinh nguyệt không đều phong thấấp cước khí, gân cốt yếu mềm, lưng gốii đau đ mỏi. 1.1.5. Thành phần Theo các nghiên cứu c đã được công bố, thành phầnn hóa học h chính của Ba kích là anthranoid nthranoid (anthraquinon) và iridoid [17],[23],[27],[28],[31],[32] [28],[31],[32],[33]. Ngoài ra trong Ba kích còn có một m số hợp chất đường, ng, hợp h chất sterol, hợp chấtt saponintriterpen kiểu ki ursan, 1 vài acid amin… Bảng ng 1.1: Một số chấtt nhóm anthraquinon trong Ba kích Stt Tên khoa học h Công thức phân tử C16H12O6 1 1,6-dihydroxy--2,4dimethoxyanthraquinone 2 1,6-dihydroxy--2methoxyanthraquinone C15H10O5 3 1-hydroxy-2methoxyanthraquinone C15H10O4 4 1-hydroxy-2methylanthraquinone C15H10O3 5 Physcion C16H12O5 6 Công thức th cấu tạo Bảng ng 1.2: Một số chấtt nhóm iridoid trong Ba kích Stt Tên khoa học h 1 Monotropein Công thức phân tử C16H22O11 2 Morindolid C15H22O8 3 Morofficinalosid C16H24O11 4 Asperulosid C18H22O11 5 Acid asperulosidic C18H24O12 7 Công thức th cấu tạo 1.2. NHÓM HOẠT CHẤT IRIDOID GLYCOSID Iridoid là một nhóm các monoterpenoid glycosid thường được gặp nhiều nhất trong thực vật, cho đến nay người ta đã biết đến trên 600 chất thuộc nhóm này [3]. Về cấu tạo Iridoid là những glycosid có bộ khung của phần aglycon gồm 2 đơn vị isopren. Chúng gồm một vòng cyclopentan nối với một vòng hydropyran. Khi tạo thành glucosid, phần đường thường gặp là glucose nối vào vị trí số 1 trên vòng hydropyran theo dây nối acetal [3],[7]. Iridoid gồm các nhóm: - Iridoid có aglycon gồm đủ 10 carbon: Geniposid, gardenosid, gardosid trong quả Dành dành (Gardenia jasminoides Ellis.), loganin trong lá Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.), monotropein trong rễ Ba kích (Morinda officinalis How)... - Iridoid có phần aglycon không đủ 10 carbon: Rehmaniosid, catalpol trong Sinh địa (Rehmania glutinosa (Gaertn.) Libosch. - Iridoid có phần aglycon trên 10 carbon: Plumericrin trong vỏ cây đại (Plumeria rubra L. var acutifolia (Poir) Bailay). Iridoid glycosid có tính chất dễ tan trong nước, cồn loãng, methanol. Thường dùng cồn 50% hoặc methanol để chiết xuất. Dưới tác dụng của enzyme có sẵn trong cây, iridoid glycosid bị biến đổi thành các sản phẩm màu đen. Ngoài enzyme, iridoid glycosid cũng dễ bị thủy phân bằng acid. Dưới tác dụng của kiềm NaOH, Ba(OH)2 thì các nhóm ester bị cắt. Để định tính nhóm hoạt chất này, người ta thường dùng phương pháp sắc ký giấy hay sắc ký lớp mỏng (SKLM), ngoài ra có thể đo quang phổ hồng ngoại. Phần lớn các hợp chất iridoid có nhóm mang màu –O-C=C-CO-O- nên thể hiện băng hấp thu trong vùng tử ngoại ở 233-238. Trên phổ IR các hợp 8 chất iridoid thường ng có tín hiệu hi ở 1722 cm-1 (-COCH3) và 1660 cm-1 (-C=C-O) [3]. Trong tự nhiên các hợp h chất iridoid hay gặpp trong các họ h thực vật: Rubiaceae (lá mơ ơ lông, Ba kích), Euphorbiaceae, Apocynaceae (thông thiên, bông sứ), ), Plantaginaceae (mã đề), Verbenaceae (cỏ roi ngự ựa), Cornaceae (sơn thù du), Valerinaceae, Gentianaceae (long đởm), m), Caprifoliaceae (kim ngân), Oleaceae, Ericaceae, Loganiaceae (mã tiền), ti n), Scrophulariaceae (sinh địa, huyền sâm)… [3]. 1.3.. MONOTROPEIN 1.3.1. Đặc điểm vàà tính chất ch - Công thứcc phân tử: t C16H22O11 [3]. - Khối lượng ng phân tử: t 390,34. - Tên khoa học: [1S-(1a,4aa,7b,7aa)]-1-(b-D-Glucopyranosyloxy) Glucopyranosyloxy)1,4a,7,7a-tetrahydro--7-hydroxy-7-(hydroxymethyl)cyclopenta[c]pyran (hydroxymethyl)cyclopenta[c]pyran-4carboxylic acid. ridoid [3]. - Thuộc nhóm iridoid - Monotropein có công thức th hóa học như sau [3]: Hình 1.3: Công thức cấu tạo củaa monotropein 9 - Tỷ trọng: 1,73 g/cm3. - Tính chất: + Bột kết tinh màu trắng. + Nhiệt độ nóng chảy: 175oC + Tan tốt trong nước, ethanol và methanol. + Cực đại hấp thụ (trong ethanol): 235nm. 1.3.2. Tác dụng dược lý của monotropein Các nghiên cứu gần đây cho thấy monotropein có tác dụng chống viêm. Monotropein được phát hiện ức chế biểu hiện của nitric oxid synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), yếu tố hoại tử u α (TNF-α) và interleukin-1β (IL-1β) mRNA trong các đại thực bào RAW 264.7 gây bởi lipopolysaccharide (LPS) [25]. Việc xử lý bằng monotropein đã làm giảm tác dụng kết dính ADN của nhân κB (NF-κB). Monotropein cũng ngăn chặn sự phosphoryl hóa và suy giảm ức chế κB-α (IκB-α) và do đó hoán vị NF-κB. Trong mô hình viêm ruột kết gây bởi dextran sulfate sodium (DSS), monotropein làm giảm chỉ số hoạt động bệnh (DAI), hoạt động myeloperoxidase (MPO) và các biểu hiện protein liên quan đến viêm thông qua ngăn chặn sự hoạt hóa NF-κB ở niêm mạc ruột [24]. Tóm lại, những phát hiện này gợi ý tác dụng chống viêm của monotropein chủ yếu liên quan đến sự ức chế các biểu hiện của chất trung gian gây viêm, thông qua khử hoạt tính NF-κB và hỗ trợ vai trò chữa bệnh của nó trong viêm ruột kết [24]. 10 1.4. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TỪ DƯỢC LIỆU 1.4.1. Vài nét về chiết xuất dược liệu Chiết xuất dược liệu có vai trò rất quan trọng trước hết là để lấy được các chất có trong dược liệu dưới dạng cần thiết (dung dịch, bột) toàn phần hoặc tinh khiết hơn cho mục đích nghiên cứu hoặc điều trị. Phương pháp chiết xuất dược liệu bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và phương pháp chiết. Có nhiều cách phân loại phương pháp chiết xuất dựa vào các yếu tố khác nhau [9],[11]: - Căn cứ vào nhiệt độ: Chiết nóng; Chiết nguội. - Căn cứ vào chế độ làm việc: Phương pháp chiết gián đoạn; Phương pháp chiết bán liên tục; Phương pháp chiết liên tục. - Căn cứ vào chuyển động tương hỗ giữa 2 pha: Phương pháp chiết ngược dòng; Phương pháp chiết xuôi dòng; Phương pháp chiết chéo dòng. - Căn cứ vào áp suất làm việc: Phương pháp chiết ở áp suất thường (áp suất khí quyển); Phương pháp chiết ở áp suất giảm (áp suất chân không); Phương pháp chiết ở áp suất cao (chế độ làm việc có áp lực). - Căn cứ vào trạng thái làm việc của 2 pha: Phương pháp ngâm; Phương pháp ngấm kiệt. - Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt: Phương pháp dùng siêu âm; Phương pháp khí hoá lỏng; Phương pháp tạo dòng xoáy. Các iridoid glycosid nói chung và monotropein nói riêng thường dễ tan trong nước, cồn loãng hoặc methanol. Thường dùng nước hoặc cồn 50% làm dung môi chiết xuất, sử dụng kết hợp các phương pháp: cô đặc, lọc, kết tinh, sắc ký, chiết dung môi... Ngoài ra, methanol cũng được dùng để hạn chế tạp. 11 Tùy theo mỗi loại iridoid glycosid mà có phương pháp phân lập và tinh chế khác nhau phù hợp. Thông thường, dùng phương pháp sắc ký cột, sắc ký chế hóa hoặc kết tinh phân đoạn trong các dung môi thích hợp. 1.4.2. Vài nét về phân lập và tinh chế Để phân lập và tinh chế ta có thể dùng các phương pháp sau [1],[9],[11]: - Tách phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau và không hòa lẫn nhau. - Tách bằng sắc ký cột. - Tách qua cột sắc ký nhiều lần với chất hấp phụ là polyamid, cellulose, silica gel, C-18, sephadex LH-20,... - Kết tinh lại trong dung môi thích hợp. - Tách bằng sắc ký lỏng điều chế. 1.5. CHẤT CHUẨN ĐẶC TRƯNG TỪ DƯỢC LIỆU 1.5.1. Vài nét về chất chuẩn Các chất chuẩn (chất đối chiếu) là chất đồng nhất đã được xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã được qui định về hóa học, vật lý, sinh học. Trong các phép thử đó, các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất cần thử. Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng. Chất đối chiếu được dùng trong các phép thử sau [2]: - Định tính bằng phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại. - Định tính, định lượng bằng phương pháp quang phổ tử ngoại - khả kiến, quang phổ huỳnh quang. - Các phép thử định tính, tạp chất và định lượng bằng phương pháp sắc ký. - Định lượng bằng phương pháp vi sinh vật. - Các phép chuẩn độ thể tích, phân tích trọng lượng. 12