Tài liệu Nghiên cứu chiết xuất hoạt chất từ nguồn giá thể sau thu hoạch nhộng trùng thảo (cordyceps militaris)

MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH.................................................................................................2 DANH MỤC BẢNG................................................................................................3 ĐẶT VẤN ĐỀ...........................................................................................................4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI.................................................................................................................................... 6 1.1. Tổng quan về nấm đông trùng hạ thảo (cordyceps sinensis).......................................6 1.2. Tổng quan về nấm nhộng trùng thảo (cordyceps militaris).......................................10 1.3. Phân biệt giữa nấm đông trùng hạ thảo (cordyceps sinensis) và nấm nhộng trùng thảo (cordyceps militaris)..................................................................................................13 1.4. Các phương pháp phân tích hoạt chất của đông trùng hạ thảo...................................14 1.5. Một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo................................................................16 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........17 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.............................................................................17 2.2. Vật liệu nghiên cứu...................................................................................................17 2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu.......................................................................18 2.4. Xử lý số liệu..............................................................................................................19 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ...........................................................20 3.1. Xử lý nguyên liệu......................................................................................................20 3.2. Phân tích và so sánh thành phần trong nguyên liệu (giá thể sau thu hoạch) với nhộng trùng thảo......................................................................................................................... 20 3.3. Xây dựng quy trình chiết hoạt chất từ giá thể............................................................25 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT...........................................................41 4.1. Kết luận..................................................................................................................... 41 4.2. Đề xuất...................................................................................................................... 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................42 1 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis)................................................7 Hình 1.2. Nấm Nhộng trùng thảo nuôi trồng (Cordyceps militaris)...............................11 Hình 1.3. Công thức hóa học của cordycepin.................................................................11 Hình 1.4. Công thức hóa học của adenosin....................................................................12 Hình 2.1. Giá thể Nhộng trùng thảo sau khi thu hoạch...................................................17 Hình 3.1. Sắc ký đồ TLC dịch chiết n-hexan của mẫu nấm và giá thể với hệ dung môi 1 ........................................................................................................................................ 21 Hình 3.2. Sắc ký đồ TLC dịch chiết n-hexan của mẫu nấm và giá thể với hệ dung môi 2 ........................................................................................................................................ 22 Hình 3.3. Sắc ký đồ TLC dịch chiết MeOH của mẫu nấm và giá thể với hệ dung môi 3... ........................................................................................................................................ 22 Hình 3.4. Sắc ký đồ TLC dịch chiết MeOH của mẫu nấm và giá thể với hệ dung môi 4... ........................................................................................................................................ 23 Hình 3.5. Sắc ký đồ TLC dịch chiết MeOH của mẫu nấm và giá thể với hệ dung môi 5... ........................................................................................................................................ 24 Hình 3.6. Biểu đồ hiệu suất chiết phân đoạn..................................................................26 Hình 3.7. Biểu đồ hiệu suất chiết theo nồng độ cồn và nước..........................................28 Hình 3.8. Biểu đồ hiệu suất kích thước nguyên liệu.......................................................30 Hình 3.9. Biểu đồ hiệu suất chiết theo thời gian............................................................31 Hình 3.10. Biểu đồ hiệu suất chiết với tỷ lệ nước cất khác nhau....................................33 Hình 3.11. Sơ đồ quy trình chiết xuất giá thể Nhộng trùng thảo...................................35 Hình 3.12. Sản phẩm thu được sau khi chiết.................................................................36 Hình 3.13. Biểu đồ khảo sát độ ổn định của quy trình....................................................36 Hình 3.14. Biểu đồ phân bố các chất tan trong cồn và polysaccharid trong sản phẩm. . .37 Hình 3.15. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cao chiết nấm Nhộng trùng thảo.........................40 Hình 3.16. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cao chiết giá thể sau thu hoạch Nhộng trùng thảo... ........................................................................................................................................ 40 2 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Khối lượng các phân đoạn chiết thu được từ 10g nguyên liệu.........................26 Bảng 3.2. Khối lượng sản phẩm chiết được bằng các dung môi từ 10 g nguyên liệu.......28 Bảng 3.3. Khối lượng sản phẩm chiết với các cỡ mẫu khác nhau (g)..............................29 Bảng 3.4. Khối lượng sản phẩm chiết với các thời gian mẫu khác nhau (g)....................31 Bảng 3.5. Khối lượng sản phẩm chiết với tỉ lệ nước cất khác nhau (g)............................33 Bảng 3.6. Khối lượng khảo sát độ ổn định của quy trình (g)...........................................36 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát sơ bộ polysaccharid trong sản phẩm cao chiết......................37 Bảng 3.8. Kết quả định lượng cordycepin và adenosin trong hai mẫu cao chiết nước từ nấm Nhộng trùng thảo và từ giá thể sau thu hoạch nấm...................................................39 3 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, được thiên nhiên ưu đãi nguồn tài nguyên sinh học phong phú và đa dạng. Bên cạnh hệ động thực vật quý hiếm, Việt Nam còn là nơi lưu trữ các giống nấm dược liệu da dạng, có hoạt tính sinh học cao, có nhiều tác dụng trong việc làm thuốc chữa bệnh, thực phẩm chức năng. Tuy nhiên, hiện nay chúng ta vẫn dựa trên khai thác tự nhiên do vậy không đáp ứng được nhu cầu, để có thể sản xuất và tạo ra nguồn lợi nhuận hàng năm từ việc lưu giữ, phát triển ứng dụng công nghệ sản xuất nấm dược liệu vẫn là một lĩnh vực mới của nước ta. Trong số tất cả các loài nấm dược liệu đang được nghiên cứu hiện nay, Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) được chú ý hơn cả bởi chúng là loại dược liệu quý, rất tốt cho sức khỏe con người, phù hợp với mọi lứa tuổi. Bên cạnh đó, Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) cũng được nghiên cứu nhiều như một nguồn thay thế cho Đông trùng hạ thảo bởi thành phần hóa học và dược tính của chúng tương tự nhau. Quả thể của cả hai loài C. sinensis và C. militaris rất có giá trị và có chứa những chất chuyển hóa khác với sợi nấm sinh dưỡng. Theo các tài liệu ghi chép về đông dược cổ và một số nghiên cứu hiện đại, Đông trùng hạ thảo và Nhộng trùng thảo là những vị thuốc bồi bổ hết sức quý giá, có tác dụng tích cực tới các bệnh như bệnh về hệ bài tiết, bệnh xương khớp, bệnh về đường hô hấp, nâng cao năng lực miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư, chống di căn, chống chất phóng xạ, và có tác dụng tốt đối với trẻ em bị còi xương chậm lớn,... Hơn nữa, trên thị trường xuất hiện nhiều loại sản phẩm thuốc và thực phẩm chức năng được chiết xuất từ Nhộng trùng thảo như Yến Nhộng trùng thảo, Pure cordyceps capsules… Hiện nay, Việt Nam đã tạo được quy trình và nuôi cấy Nhộng trùng thảo trong phòng thí nghiệm bằng cách nuôi cấy nấm trên giá thể bắp ngô mẻ trộn với bột nhộng tằm. Chúng tôi muốn tận thu những giá trị dinh dưỡng còn lại trong đế nấm sau khi thu hoạch nấm để nguồn dinh dưỡng có ích này không bị lãng phí. Chính vì những tính chất độc đáo về dược liệu như vậy đã thôi thúc chúng thôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất hoạt chất từ nguồn giá thể sau thu hoạch Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris)”. 4 Mục tiêu của đề tài là xây dựng được quy trình chiết xuất hoạt chất từ nguồn giá thể sau thu hoạch Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris). Để hoàn thành mục tiêu trên, đề tài đã thực hiện các nội dung sau: 1. Phân tích và so sánh thành phần trong nguyên liệu (giá thể sau thu hoạch) với Nhộng trùng thảo. 2. Khảo sát các điều kiện chiết xuất hoạt chất. 3. Xây dựng quy trình. 4. Đánh giá sản phẩm. 5 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 1.1. TỔNG QUAN VỀ NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps sinensis) 1.1.1. Vị trí phân loại Đông trùng hạ thảo có vị trí phân loại như sau: Giới (regnum): Fungi. Ngành (phylum): Ascomycota. Lớp (Class): Sordariomycetes. Bộ (ordo): Hypocreales. Họ (familia): Clavicipitaceae. Chi (genus): Cordyceps. Loài (species): C. sinensis. 1.1.2. Sơ lược lịch sử nghiên cứu về nấm Đông trùng hạ thảo Nấm Đông trùng hạ thảo được các nhà khoa học Trung Quốc xác định mới đầu xuất hiện từ vùng núi cao nguyên Tây Tạng, loại dược liệu này thực chất là hiện tượng ấu trùng các loài bướm thuộc chi Thitarodes bị nấm Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. ký sinh. Năm 1878 các nhà khoa học đã phát hiện ra nấm này ký sinh trên sâu non (ấu trùng) của một loài côn trùng thuộc chi Thitarodes. Thường dễ gặp nhất ở sâu non loài Thitarodes baimaensis hoặc Thitarodes armoricanus, ngoài ra còn 46 loài khác thuộc chi Thitarodes cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký sinh. Vào cuối mùa thu các chất trên da của sâu non họ Ngài đêm (Noctuidae) tương tác với các bào tử nấm và tạo ra các sợi nấm, các sợi nấm đã đâm sâu vào ấu trùng, coi chúng là chất dinh dưỡng để phát triển. Đến đầu mùa hè năm sau, nấm phát sinh mạnh và gây chết sâu, sau đó chúng hình thành chồi, phát triển chui ra khỏi mặt đất, nhưng gốc vẫn dính vào đầu sâu. Do đó nhiều người gọi là nấm Đông trùng hạ thảo bởi vì mùa đông nấm sống trong cơ thể côn trùng, mùa hè thì nấm phát triển ra ngoài cơ thể giống như cây cỏ. Đầu thế kỷ XVIII, những người truyền giáo Châu Âu đã đưa Đông trùng hạ thảo đến với nước Pháp để nghiên cứu, và họ coi nước Pháp là nước có nền y học hiện đại. Đến nay rất nhiều nước đã nghiên cứu, điều tra và thu thập nấm Đông trùng hạ thảo ngoài tự nhiên để làm nguyên liệu sản xuất ra thực phẩm chức năng phục vụ cho người. 6 Hình 1.1. Nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) 1.1.3. Sự phân bố và đặc điểm của nấm Đông trùng hạ thảo a. Phân bố Đông trùng hạ thảo chủ yếu tìm thấy được vào mùa hè, ở vùng núi cao trên 4.000m như cao nguyên Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc và Vân Nam,... Theo các nhà khoa học thì các chi nấm Cordiceps có tới 400 loài khác nhau, tính riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy khoảng 60 loài Đông trùng hạ thảo. Tuy nhiên cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu được 2 loài nấm Cordyceps siensis và Cordyceps militaris có giá trị dược liệu tốt với con người. Loài nấm này phân bố rộng ở châu Á với trung tâm đa dạng là vùng Đông Á và Châu Úc. b. Đặc điểm Loài nấm Cordyceps lây nhiễm vào cơ thể sâu hại đến nay vẫn chưa hiểu nguyên nhân. Những con sâu này có thể đã ăn phải bào tử nấm hoặc chúng mắc bệnh nấm ký sinh từ các lỗ thở. Đến khi sợi nấm phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào các mô của vật chủ, sử dụng hoàn toàn các chất dinh dưỡng trong cơ thể sâu. Đến một giai đoạn nhất định, nấm phát triển thành dạng cây (hình dạng giống thực vật) và phát tán bào tử. Nấm Đông trùng hạ thảo khi còn sống, người ta có thể trông rõ hình con sâu, với đuôi là một cành nhỏ, mọc lá. Khi sấy khô, nó có mùi tanh như cá, đốt lên có mùi thơm. Phần “lá” hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4 – 11cm do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành. Đầu sâu non giống như con tằm, dài chừng 3-5 cm, đường kính khoảng 0,3-0,8 cm. Bên ngoài có màu vàng sẫm hoặc nâu vàng với khoảng 20-30 vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn. Phần đầu có màu nâu đỏ, đuôi giống như đuôi con tằm, 7 có tất cả 8 cặp chân, nhưng 4 đôi ở giữa là rõ nhất. Chất đệm nấm hình que cong mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non một chút. Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng; chất đệm nấm khá dai và bên trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà [6,7]. 1.1.4. Thành phần hóa học của nấm Đông trùng hạ thảo Đông trùng hạ thảo chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học như: các ribonucleosid, mannitol, sterol, các acid hữu cơ, các loại đường mono-, di-, oligosaccharid và polysaccharid, các protein, polyamin, vitamin (E, K, B1, B2, B12…) và rất nhiều khoáng chất (K, Na, Ca, Mg, Cu, Mn, Zn, Se, Si…) trong đó nhóm hoạt chất có tác dụng quan trọng là HEAA (hydroxyl ethyl adenosin analogs). a. Các nucleosid Các nucleosid là một trong những thành phần có hoạt tính trong Đông trùng hạ thảo, trong đó adenosin, cordycepin được sử dụng là hoạt chất để đánh giá chất lượng của Đông trùng hạ thảo. Ngoài ra trong Đông trùng hạ thảo còn có các nucleosid khác như uridin, 2’-3’-dideoxyadenosin (cấu trúc này được đưa vào các hợp chất có hoạt tính antiretrovirus điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV như didanosin, hydroxyethyladenosin, guanidin, deoxyguanidin…, những hoạt chất này không thể tìm thấy ở trong các dược liệu khác trong tự nhiên). b. Các polysaccharid Đây cũng là thành phần chính góp phần vào các tác dụng sinh học của Đông trùng hạ thảo. Bản đồ saccharid của dược liệu này có đóng vai trò trong đánh giá chất lượng. Một số monosaccharid có trong Đông trùng hạ thảo như rhamnose, ribose, arabinnose, glucose, manitol, fructose… c. Các sterol Các phytosterol trong Đông trùng hạ thảo (cholesterol, campesterol, β-sitosterol) đóng vai trò quan trọng trong điều trị ung thư vú, tuyến tiền liệt và ung thư trực tràng. d. Các nhóm hoạt chất khác Đông trùng hạ thảo có chứa các acid amin thiết yếu như acid glutamic, acid aspartic, arginin… và các hợp chất kiểu poliamin như cadaverin, spermidin, spermin…, 8 các cyclodipeptid như cordycedipeptid A. Các hoạt chất này có hoạt chất chống viêm, chống nhiễm khuẩn, kháng virus. 1.1.5. Tác dụng của nấm Đông trùng hạ thảo Theo các ghi chép về đông dược cổ, Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc bồi bổ hết sức quý giá, có tác dụng tích cực với các bệnh như: - Chống lại tác dụng xấu của các tân dược đối với thận, thí dụ đối với độc tính của Cephalosporin A. - Bảo vệ thận trong trường hợp gặp tổn thương do thiếu máu. - Chống lại sự suy thoái của thận, xúc tiến việc tái sinh và phục hồi các tế bào tiểu quản ở thận. - Làm hạ huyết áp ở người cao huyết áp. - Chống lại hiện tượng thiếu máu ở cơ tim. - Giữ ổn định nhịp đập của tim. - Tăng cường tính miễn dịch không đặc hiệu. - Điều tiết tính miễn dịch đặc hiệu. - Tăng cường năng lực thực bào của các tế bào miễn dịch. - Tăng cường tác dụng của nội tiết tố tuyến thượng thận và làm trương nở các nhánh khí quản. - Tăng cường dịch tiết trong khí quản và trừ đờm. - Làm chậm quá trình lão hoá của cơ thể. - Hạn chế bệnh tật của tuổi già. - Nâng cao năng lực chống ung thư của cơ thể. - Chống lại tình trạng thiếu oxygen của cơ thể. - Tăng cường tác dụng lưu thông máu trong cơ thể. - Hạn chế tác hại của tia gamma đối với cơ thể. - Tăng cường tác dụng an thần, trấn tĩnh thần kinh. - Tăng cường việc điều tiết nồng độ đường trong máu. - Làm giảm cholesterol trong máu và chống xơ vữa động mạch. - Xúc tiến tác dụng của các nội tiết tố (hormone). - Tăng cường chức năng tiêu hoá và hấp thu các chất dinh dưỡng. 9 - Ức chế vi sinh vật có hại, kể cả vi khuẩn lao. - Kháng viêm và tiêu viêm. - Có tác dụng cường dương và chống liệt dương. Với những tác dụng trên thì nấm đông trùng hạ thảo còn trực tiếp ảnh hưởng đến một số hệ thống quan trọng trong cơ thể. 1.2. TỔNG QUAN VỀ NẤM NHỘNG TRÙNG THẢO (Cordyceps militaris) 1.2.1. Vị trí phân loại Nhộng trùng thảo có vị trí phân loại như sau: Giới (regnum): Fungi. Ngành (phylum): Ascomycota. Lớp (Class): Sordariomycetes. Bộ (ordo): Hypocreales. Họ (familia): Cordycipitaceae. Chi (genus): Cordyceps. Loài (species): C. militaris. 1.2.2. Đặc điểm của Nhộng trùng thảo Ngoài tự nhiên vào đầu mùa đông, nấm Cordyceps militaris ký sinh trên thân sâu non (con nhộng tằm), lấy chất dinh dưỡng trên nhộng tằm để sinh trưởng. Vào đầu mùa hè ấm áp, cây nấm bắt đầu mọc lên từ thân nhộng tằm, hút hết chất dinh dưỡng trong thân nhộng tằm, nhộng tằm chết và nấm vươn lên khỏi mặt đất. Vào tháng 5 và 6 (mùa hạ) nấm militaris đã phát triển “hoàn thiện”. Loại nấm này có màu cam rất bắt mắt, có thể gọi là “trùng thảo hoa”. Hiện nay, nấm Cordyceps militaris đã được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo, được dùng để thay thế cho Đông trùng hạ thảo tự nhiên ở Tây Tạng, đang ngày càng khan hiếm, có giá bán rất đắt đỏ do chưa thể nuôi trồng nhân tạo được. Việc nuôi trồng thành công nấm Cordyceps militaris ở trong môi trường nhân tạo là một thành công lớn của khoa học. Giúp con người tiếp cận dễ dàng hơn loại dược liệu quý hiếm này. Hiện nay hầu hết các sản phẩm liên quan đến Đông trùng hạ thảo hầu hết được chiết xuất ra từ nấm Cordyceps militaris nuôi trồng trong môi trường nhân tạo. Và loại nấm này có thể gọi là Đông trùng hạ thảo nhân tạo. 10 Thời gian nuôi trồng Nhộng trùng thảo phụ thuộc vào hình dạng và thể tích bình nuôi cấy. Quả thể thường được hình thành trong khoảng 35-70 ngày (Yue, 2010). Theo Zhang và Liu (1997) giai đoạn hình thành quả thể là 35 -45 ngày trên cơ chất chính là gạo và 40 -70 ngày trên các cơ chất khác như ngô, kê và gạo Tussah [5]. Thân nấm hình trụ mọc ra từ giá thể bắp ngô mẻ và bột nhộng tằm (hoặc bột đậu, lõi ngô, vỏ hạt bông, kê, lúa miến, lúa mì, ngũ gốc, hoa hướng dương và bột nhộng tằm), thân nấm thường dài 3-6 cm, khi nấm đạt đến độ trưởng thành nhất và thân nấm có màu vàng cam ngả hồng, đầu nấm dạng chùy. Hình 1.2. Nấm Nhộng trùng thảo nuôi trồng (Cordyceps militaris) 1.2.3. Thành phần hóa học trong Nhộng trùng thảo Nhộng cũng có chứa hoạt chất cordycepin, adenosin, polysaccharid, ergosterol và mannitol. Ngoài ra, nấm Cordyceps militaris còn chứa hàm lượng lớn protein và 17 loại acid amin, cùng các nguyên tố vi lượng, các vitamin: A, B1, B2, B6, B12, C, D, E… a) Cordycepin Cordycepin là hoạt chất đã được các trung tâm nghiên cứu phòng chống ung thư trên thế giới công bố có tác dụng phòng chống, tiêu hủy các tế bào ung thư. Có tác dụng làm tăng khả năng sinh lý nam và nữ, làm tăng miễn dịch cơ thể, chống lão hóa. Hình 1.3. Công thức hóa học của cordycepin b) Adenosin Adenosin là chất có tác dụng cơ bản dùng điều trị các bệnh như: tim mạch, huyết áp, phục hồi sức khỏe, hỗ trợ thận và gan rất tốt… 11 Hình 1.4. Công thức hóa học của adenosin 1.2.4. Tác dụng của nấm Nhộng trùng thảo - Đối với phụ nữ: Nhộng trùng thảo có tác dụng làm đẹp da, chống lão hóa, ngăn ngừa nếp nhăn. Ngoài ra, Nhộng trùng thảo còn rất tốt đối với phụ nữ mang thai và sau khi sinh em bé. Nhộng trùng thảo có tác dụng tăng sức đề kháng và bồi bổ toàn diện cho sức khỏe của các mẹ và bé. - Đối với người già: Nhộng trùng thảo giúp tăng sức đề kháng, tăng cường hệ miễn dịch, làm giảm cholesterol trong máu và chống xơ vữa động mạch. - Đối với nam giới: Nhộng trùng thảo giúp tăng cường chức năng sinh lý cho nam giới, hạn chế hiện tượng xuất tinh sớm. - Đối với trẻ em: Nhộng trùng thảo giúp tăng cường hệ miễn dịch, hỗ trợ chức năng tiêu hóa ổn định giúp cơ thể hấp thu đầy đủ lượng dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể để trẻ em phát triển khỏe mạnh. - Ngoài ra, còn các tác dụng chính khác như:  Tăng cường hệ thống miễn dịch cho cơ thể, chống viêm nhiễm, kháng viêm, kháng lại các loại virut như viêm gan B, Lao, AIDS.  Hỗ trợ điều trị ung thư nhờ cordycepin, hỗ trợ cho bệnh nhân điều trị xạ trị.  Bảo vệ thận, chống lại sự suy thoái thận, phục hồi tế bào thận.  Bảo vệ tim mạch, giữ ổn định nhịp tim, hạ huyết áp, chống lại sự thiếu máu cơ tim, tăng cường lưu thông máu trong cơ thể.  Hỗ trợ điều tiết lượng đường trong máu, kiểm soát bệnh tiểu đường.  Bảo vệ phổi, trị các bệnh về phổi, trừ đờm, hen suyễn, suy hô hấp, trị các chứng ho lâu ngày.  Tăng cường sinh lý, hỗ trợ điều trị vô sinh, sảy thai. 12  Phục hồi sức khỏe, tăng cường sự dẻo dai cơ bắp, kích thích tinh thần hưng phấn, sung mãn. 1.3.  Hạn chế các bệnh ở tuổi già.  Hạn chế tác hại của tia tử ngoại, chất phóng xạ.  Trị nhức mỏi, đau lưng, viêm khớp. PHÂN BIỆT GIỮA NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps sinensis) VÀ NẤM NHỘNG TRÙNG THẢO (Cordyceps militaris) Nấm Đông trùng hạ thảo Nấm Nhộng trùng thảo (Cordyceps sinensis) (Cordyceps militaris) - Nhộng trùng thảo cùng chi với Đông trùng hạ thảo, nhưng khác loài. Giống - Tác dụng tương tự giống nhau. nhau - Có nhiều thành phần đặc trưng giống nhau của loài nấm ký sinh Cordyceps như: Cordycepin, adenosin, protein, các nguyên tố vi lượng, các vitamin, acid amin,.. - Trong tự nhiên là một dạng ký- - Trong tự nhiên là dạng ký sinh trên sinh đặc biệt, nó là kết quả ký Khác nhau nhộng tằm. sinh của bào tử nấm Cordyceps - Môi trường nhân tạo mọc ra từ sinesis trên cơ thể ấu trùng của giá thể bắp ngô mẻ và bột nhộng một loại sâu bướm đặc biệt có tằm. tên Hepialus. - Sử dụng cả phần sâu và nấm - Người ta thường bỏ đi phần thân nhộng và chỉ sử dụng phần nấm ký sinh màu cam có chứa nhiều chất - Giá trị kinh tế đến 1.6 tỷ/1kg. dinh dưỡng nhất. - Giá trị kinh tế khoảng 100 - Mọc trên đầu con sâu màu nâu triệu/1kg. - Thân cây màu vàng cam ngả hồng, sẫm, dầu nấm như lưỡi mác. đầu nấm dạng chùy và mọc ở các bộ phận khác của con sâu. 13 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT CỦA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO 1.4.1. Phương pháp sắc kí lớp mỏng MA King Wah và cộng sự đã tiến hành xác định cordycepin và 7 nucleosid khác trong Cordyceps sinensis bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng sử dụng kĩ thuật rửa giải gradient. Dịch chiết nước của 11 sản phẩm chứa Đông trùng hạ thảo được phân tích trên bản mỏng silicagel GF254 được xử lí bằng hỗn hợp Na 2HPO4 0.05M : Carboxymethyl cellulose (4:1) sau đó đặt vào tủ sấy 8 phút ở 60 0C để hoạt hóa. Dung môi triển khai là hỗn hợp cloroform : ethyl acetat : isopropanol : nước (8:2:6:0,6 theo thể tích) với 2 giọt amoniac cho mỗi 10ml hỗn hợp. Quãng đường triển khai dung môi 18 cm, chạy lượt hai 9 cm trong hỗn hợp dung môi cloroform : ethylacetat : isopropanol : nước : dimethylfomamid (10:2:8:0,5:2 theo thể tích), phát hiện chất phân tích tại bước sóng 254 nm. Phương pháp cho độ thu hồi cordycepin 98,09%, độ thu hồi của adenosin là 97,88% [4]. 1.4.2. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao Sắc kí lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc kí lỏng – rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Cơ chế của quá trình sắc kí lỏng là hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ. Trong sắc kí lỏng hiệu năng cao, mẫu phân tích được tiêm qua buồng tiêm và được đi vào cột nhờ pha động, các thành phần trong mẫu phân tích được tách ra trên pha tĩnh chứa trong cột rồi đi qua detector để phát hiện và cho các tín hiệu được ghi trên sắc đồ. a. Pha tĩnh trong sắc ký lỏng hiệu năng cao Pha tĩnh hay dùng trong sắc kí lỏng hiệu năng cao là pha tĩnh mà trong đó các nhóm silanol trên bề mặt hạt silicagel (chất mang) đã được liên kết với các nhóm hóa học khác nhau tạo nên các hợp chất siloxan có độ phân cực khác nhau tùy theo nhóm liên kết: -Si-O-Si-R. Nếu R là các nhóm ít phân cực như octy (C8), octadecyl (C18), phenyl và pha động phân cực, ta có sắc kí pha đảo (RP-HPLC). Khi R là nhóm khá phân cực như alkylamin hay alkylnitrin, pha động là dung môi ít phân cực, ta có sắc kí pha thuận (NPHPLC). Hiện nay kĩ thuật RP-HPLC được sử dụng rộng rãi vì tách tốt được nhiều hợp 14 chất khác nhau, thành phần chính của pha động là nước nên rất kinh tế. Cột thông dụng là cột ODS (RP18), C8 với cỡ hạt 5 hay 10µm. Để cải thiện khả năng tách, tiết kiệm dung môi và thời gian, gần đây người ta đã đưa sắc ký lỏng nhanh (UPLC) vào ứng dụng rộng rãi. Trong UPLC, kích thước hạt chất mang nhỏ (thường từ 1,7 – 2,2 µm) và có thể sử dụng cột ngắn hơn (5 – 10 cm). b. Pha động trong sắc kí lỏng hiệu năng cao Pha động đóng góp một phần quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc kí đều có pha động rửa giải riêng cho nó để có hiệu quả tách tốt. Pha động có 2 loại phân cực và ít phân cực thường dùng cho sắc kí pha đảo và sắc ký pha thuận. Tuy nhiên, pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ. c. Detector trong sắc ký Có nhiều loại detector khác nhau, tùy thuộc bản chất lý hóa của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp: Detector quan phổ hấp thụ phân tử UV-VIS; detector huỳnh quang; detector khúc xạ; detector độ dẫn. d. Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. Thiết bị sắc kí lỏng hiệu năng cao gồm 3 thành phần chính:  Phần đầu vào gồm pha động, bơm, hệ thống tiêm mẫu.  Phần tách gồm cột tách, lò cột, có thể có cột phụ trợ.  Phần phát hiện và xử lí số liệu gồm detector, bộ phận ghi tín hiệu (máy tính). 1.4.3. Phương pháp sắc ký khí. Sắc ký khí (GC- Gas Chromatography) là một phương pháp sắc ký mà pha động là chất khí hoặc ở dạng hơi và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên bề mặt chất mang dạng rắn hay phủ đều lên thành phía trong của cột tạo lớp màng phim mỏng. Để thực hiện tách sắc kí người ta có thể sử dụng một trong ba phương pháp sau: + Phương pháp rửa giải. + Phương pháp tiền lưu. 15 + Phương pháp thế đẩy. 1.5. MỘT SỐ CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO Hiện nay không thể thống kê được có bao nhiêu chế phẩm chứa Đông trùng hạ thảo được bán trên thị trường. Đông trùng hạ thảo được đưa vào trong chế phẩm một số thành phần hóa học kết hợp với một số dược liệu bổ, quý hiếm khác như nhân sâm, tam thất, tổ yến. Các dạng bào chế thường gặp là dạng rắn (viên nang, viên hoàn, gói bột) và dạng lỏng (nước uống, cao lỏng). Có thể kể tên một vài chế phẩm chứa Đông trùng hạ thảo như sau: - Dạng rắn: viên nang Pure cordyceps capsule, viên Đông trùng hạ thảo Tenken, bột Cordyceps extract... - Dạng lỏng: cao lỏng Đông trùng hạ thảo tam thất, nước yến Đông trùng hạ thảo, nước uống Đông trùng hạ thảo He Yuan Tang – King of cordyceps, nước cốt gà Đông trùng hạ thảo... 16 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.1.1. Địa điểm Tại Phòng thí nghiệm Hợp chất tự nhiên – Khoa Hóa học – Trường Đại học Đà Lạt. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài thực hiện từ tháng 12 năm 2016 đến tháng 5 năm 2017. 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Giá thể Nhộng trùng thảo sau khi thu hoạch nấm Nhộng trùng thảo do Viện nghiên cứu ứng dụng nông nghiệp công nghệ cao – Đại học Đà Lạt cung cấp. Mẫu được sấy khô ở 60ºC để làm nghiên cứu. Hình 2.1. Giá thể Nhộng trùng thảo sau khi thu hoạch 2.2.2. Vật liệu nghiên cứu a. Một số hóa chất Dung môi: n-hexan, ethanol (30%, 50%, 70%, 80%), nước cất, chloroform, methanol, acid sulfuric 10%, toluen, aceton, acid formic. Bản mỏng silica gel GF254. b. Thiết bị và dụng cụ  Thiết bị: - Bộ chiết Soxhlet - Bể siêu âm Elma – tra 30 H Elmasonic - Máy cô quay chân không - Bộ chiết hồi lưu - Tủ sấy 17 - Cân phân tích AR 2410 – Ohaus - Cân kỹ thuật - Máy nghiền - Máy sấy  Dụng cụ - Cốc thủy tinh (50ml, 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml) - Phễu lọc, giấy lọc, đũa thủy tinh, đèn cồn, kẹp, bóp cao su - Ống đong (100ml, 1000ml),phễu chiết (100ml, 250ml) - Bình tam giác (50ml, 250ml, 500ml) - Bình cầu đáy tròn (250ml, 500ml, 1000ml) - Bút chì, kéo 2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Nội dung  Phân tích và so sánh thành phần trong nguyên liệu (giá thể sau thu hoạch) với Nhộng trùng thảo.  Khảo sát các điều kiện chiết xuất hoạt chất  Xây dựng quy trình  Đánh giá sản phẩm 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu - Tìm kiếm, phân tích và tổng hợp các tài liệu, các đánh giá liên quan đến vấn đề nghiên cứu. - So sánh thành phần của nguyên liệu giá thể sau thu hoạch với Nhộng trùng thảo và các sản phẩm chiết xuất bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. - Chiết xuất bằng các dung môi khác nhau. - Xây dựng quy trình chiết hoạt chất dựa trên khảo sát các điều kiện chiết xuất. Tiêu chí đánh giá và so sánh là hiệu suất chiết xuất. - Phân tích thành phần adenosin và cordycepin trong sản phẩm chiết xuất bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. 18 2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU  Công thức tính hiệu suất (%): H (%) = Số gam sản phẩm cao chiết thuđược ∗100 Số gam mẫu giá thể Nhộngtrùng thảo 19 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU Giá thể Nhộng trùng thảo sau khi thu hoạch đem vào tủ sấy, sấy khô ở nhiệt độ 60ºC. Sau đó, đóng gói vào bịch nilon kín để bảo quản. 3.2. PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH THÀNH PHẦN TRONG NGUYÊN LIỆU (GIÁ THỂ SAU THU HOẠCH) VỚI NHỘNG TRÙNG THẢO 3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chấm sắc ký a. Giá thể Nhộng trùng thảo + Dịch chiết n-hexan: Lấy 10g bột nguyên liệu cho vào túi vải, đặt trong bình chiết của bộ chiết Soxhlet. Rót n-hexan ngập bình để cho dung môi rút xuống bình cầu bên dưới, sau khi dung môi rút hết thì cho tiếp lượng dung môi vào vừa đến mức đủ ngập túi nguyên liệu. Lắp sinh hàn và chiết đến khi thấy dịch chiết không màu. Dịch thu được đem cô thu hồi dung môi đến cắn. Hòa cắn này trong 5ml n-hexan làm dung dịch chấm sắc ký. + Dịch chiết MeOH: Lấy 2g bột nguyên liệu cho vào bình nón 50ml, thêm vào đó 20ml MeOH, sau đó siêu âm ở 40̊C trong 15 phút. Làm tương tự thêm 1 lần nữa. Gạn, lọc lấy dịch chiết trong, đem cô cách thủy đến cắn, hòa cắn trong 2ml MeOH làm dung dịch chấm sắc ký. b. Nấm Cordyceps militaris + Dịch chiết n-hexan: Lấy 10g bột nấm nhộng trùng thảo. Thực hiện chiết tương tự mẫu giá thể sau thu hoạch. + Dịch chiết MeOH: Lấy 1g bột nấm cho vào bình nón 50ml, thêm vào đó 10ml MeOH, sau đó siêu âm ở 40̊C trong 15 phút. Làm tương tự thêm 1 lần nữa. Gạn, lọc lấy dịch chiết trong, đem cô cách thủy đến cắn, hòa cắn trong 2ml MeOH làm dung dịch chấm sắc ký. 3.2.2. Ký hiệu o 1 là mẫu nấm Nhộng trùng thảo Cordyceps militaris. o 2 là mẫu giá thể Nhộng trùng thảo sau khi thu hoạch. 20